CN110845624B

CN110845624B - 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN110845624B
Application number: CN201911141667.2A
Authority: CN
Inventors: 龚斌
Original assignee: Beibu Gulf University
Current assignee: Shandong Huayi Biotechnology Co ltd; Shanghai Zhicha Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN110845624A

Abstract

本发明公开了一种SUMO‑CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法。所述SUMO‑CP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其制备方法包括以下步骤：1)根据HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计正反向引物并进行PCR扩增，所得PCR产物与pSUMO载体连接，转化DH5α，筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，得到pSUMO‑sHPVCP重组质粒；2)所得重组质粒转染Rossetta(DE3)，得到诱导表达蛋白的菌液；3)所得菌液离心，沉淀经裂解破碎后再离心，沉淀再经溶解、透析后，上镍亲和层析柱纯化，即得。由上述融合蛋白免疫兔子所得的抗HPV‑CP多克隆抗体效价高。

Description

一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法，属于医学免疫技术领域。

背景技术

对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus,HPV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一。HPV可感染10多种对虾，病毒侵染处于幼体和稚虾期的中国对虾(Penaees chinensis)及处于幼体期的墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)、短沟对虾(Penaeessemisulcatus)等，会使幼虾在感染的4-8周死亡率达到50-100％。HPV的感染还与对虾生长停滞有关，使其最终长到6cm就停止生长，造成较大的经济损失。有该病毒报道存在的地理位置很广泛，从东非到韩国，包括澳大利亚、太平洋以及美国的大西洋海岸一带，中国、新加坡、科威特、菲律宾、印度尼西亚、朝鲜及泰国等均有相关对虾HPV的报道。

对虾HPV病毒在分类学上归为细小病毒科(Parvoviridae)、浓核症病毒亚科(Densovirinae)，病毒基因组为单股负链DNA，长约为6kb。HPV基因组有3个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，分别编码非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)和结构蛋白(Capsid protein，CP)。cp基因主要编码病毒的衣壳蛋白，是刺激机体产生免疫反应的成分，还可能与病毒的毒力及致病性有关。采用基因工程方法表达对虾HPV病毒衣壳蛋白并制备抗体，对于HPV病毒的致病机理研究、免疫制剂及诊断试剂的研究均具有很重要的意义。2006年Sukhumsirichart报道从泰国斑节对虾(Penaeus monodon)中分离的HPV病毒CP蛋白应该由一个编码818个氨基酸(大小92KD)的ORF3翻译得到，但是直接从纯化的病毒颗粒中检测的外壳蛋白的大小为57KD以及一个很弱的54KD的蛋白。据分析由ORF3翻译得到的蛋白靠近N端有一个序列在细小病毒中是非常保守的蛋白酶切位点，在此位点的选择性切割刚好能得到一个57KD和54KD的蛋白(Sukhumsirichart W,Attasart P,Boonsaeng V,etal.Complete nucleotic sequence and genomic organization of hepatopancreaticparvovirus(HPV)of Penaeus monodon.Virology,2006,346:266–77.)。2011年泰国Chutima报道尝试在大肠杆菌中表达57KD的外壳蛋白失败，他们分别做了N端和C端截短表达的GST融合蛋白，大小分别为67.2和56.7KD，并制备了单克隆抗体用于HPV的检测(Chutima S,Parin C,Wasana S,et al.Improved immuno detection of Penaeusmonodon densovirus with monoclonal antibodies raised against recombinantcapsid protein.Aquaculture,2011,311:19-24.)。2013年印度N.Madan报道利用HPV印度株相关序列克隆并在大肠杆菌中表达了一个34KD的重组外壳蛋白rHCP并制备了抗血清(Madan N,SundarRaj N,Farook M A,et al.Partial cloning and production ofpolyclonal antiserum against recombinant capsid protein of Hepatopancreaticparvovirus(HPV)and its application for diagnostics in penaeid shrimp.ProcessBiochemistry,2013,48:1893-1898.)。综上所述，由于各种原因，采用基因工程的方法表达cp基因并获得全长的CP蛋白是一个还没有克服的难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中存在的问题，提供一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法。

本发明所述的SUMO-CP融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供上述SUMO-CP融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)根据HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计正、反向引物，并进行PCR扩增，所得PCR产物与pSUMO载体分别酶切并连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，构建得到pSUMO-sHPVCP重组质粒；

2)将构建的pSUMO-sHPVCP重组质粒转染大肠杆菌Rossetta(DE3)，得到诱导表达蛋白的菌液；

3)所得诱导表达蛋白的菌液离心，沉淀经裂解破碎后再离心，收集沉淀，得到SUMO-CP融合蛋白包涵体；对所得SUMO-CP融合蛋白包涵体进行溶解、透析后，上Ni²⁺亲和层析柱纯化，得到纯化后的SUMO-CP融合蛋白。

更为具体的制备方法如下：

1)根据HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计正、反向引物，并进行PCR扩增，所得PCR产物与pSUMO载体分别经过HindIII/XhoI双酶切后用T4-DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素筛选阳性工程菌，提取质粒进行HindIII/XhoI双酶切及DNA测序验证，构建得到pSUMO-sHPVCP重组质粒；

2)将构建的pSUMO-sHPVCP重组质粒转染大肠杆菌Rossetta(DE3)，挑取单个转化的阳性菌落，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基()中，次日按1:100-1：50接种于含50μg/mL卡那霉素或氯霉素)的LB培养基中，振摇条件下培养至菌体OD₆₀₀为0.5-0.7；之后向其中加入IPTG(异丙基硫代-Β-D-半乳糖苷)至终浓度为0.5mM(即mmol/L，下同)，振摇培养，诱导SUMO-CP融合蛋白表达，得到诱导表达蛋白的菌液；经SDS-PAGE检测分析，目标蛋白(即SUMO-CP融合蛋白)主要存在于细胞裂解后不溶于水的沉淀中；

3)所得诱导表达蛋白的菌液离心，沉淀经裂解破碎后再离心，收集沉淀，得到SUMO-CP融合蛋白包涵体；用含5mM DTT(二硫代苏糖醇)和8M(即mol/L，下同)尿素的Tris缓冲液(pH＝7.5-8.2)溶解所得SUMO-CP融合蛋白包涵体，然后加入等体积的含0.15M NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5-8.2)进行复性，经透析后再上Ni²⁺亲和层析柱纯化，得到纯化后的SUMO-CP融合蛋白。所得融合蛋白采用Brandford法测定蛋白浓度。

上述制备方法的步骤是1)中，所述HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列为人工合成，具体如SEQ ID NO：2所示。针对HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

上述制备方法的步骤是3)中，所述的Ni²⁺亲和层析柱优选为Ni-IDA-SepharoseCl-6B亲和层析柱。

本发明还提供抗HPV-CP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

Ⅰ)将上述SUMO-CP融合蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，备用；

Ⅱ)选取合适的动物，以权利要求1所述的SUMO-CP融合蛋白为免疫原对其进行皮下免疫注射，直至动物的特异性抗血清滴度达标；

Ⅲ)采集动物的抗血清，过Ⅰ)制得的抗原亲和纯化层析柱，用甘氨酸缓冲液洗脱，得到纯化后的抗HPV-CP多克隆抗体。

上述抗HPV-CP多克隆抗体制备方法的步骤Ⅰ)中，采用现有常规方法将上述SUMO-CP融合蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，例如参考GE公司“HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱”使用说明进行。

上述抗HPV-CP多克隆抗体制备方法的步骤Ⅱ)中，通常选用新西兰兔进行皮下免疫。

上述抗HPV-CP多克隆抗体制备方法的步骤Ⅲ)中，所述甘氨酸缓冲液优选为0.1MGly-HCI(pH2.5-3.0)。

与现有技术相比，本发明将人工合成的中国对虾(P.chinensis)HPV病毒的cp基因亚克隆到pSUMO载体，再转化到Rossetta(DE3)菌株表达，进而纯化出包涵体蛋白SUMO-CP融合蛋白。进一步将所得融合蛋白免疫兔子获得了抗血清，之后经SUMO-CP融合蛋白与琼脂糖介质偶联制备成的抗原亲和纯化层析柱去除非特异性抗体成分，得到效价比较高的抗HPV病毒CP蛋白多克隆抗体，为后期进一步开展对虾HPV病毒致病机理、免疫制剂及诊断试剂的研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的pSUMO-sHPVCP重组质粒酶切前后鉴定图，其中M表示1KB DNAMarker，1表示HindIII-XhoI双酶切前质粒，2表示HindIII-XhoI双酶切后质粒；

图2为本发明实施例1中构建的pSUMO-sHPVCP重组质粒在Rossetta(DE3)中表达产物的SDS-PAGE检测图，其中M表示蛋白质分子质量标准，1表示pSumo-sHPVCP未诱导，2表示pSumo-sHPVCP诱导后，3表示pSumo-sHPVCP诱导破碎后上清，4表示pSumo-sHPVCP诱导破碎后沉淀；

图3为本发明实施例1制得的纯化后的SUMO-CP融合蛋白的SDS-PAGE检测图，其中M表示蛋白质分子质量标准，1表示流出液，2表示洗脱液；

图4为本发明实施例1制得的纯化后的SUMO-CP融合蛋白的WB分析图，其中M表示蛋白质分子质量标准，1表示纯化后的SUMO-CP融合蛋白；

图5为本发明实施例1中所得抗HPV-CP多克隆抗体的效价曲线，其中(a)为利用SUMO-CP融合蛋白与琼脂糖介质偶联，制备成的抗原亲和纯化层析柱，用该柱对抗血清进行纯化，得到的抗HPV-CP多克隆抗体的效价曲线，其中，

表示抗CP蛋白的多抗滴度，

表示抗SUMO的多抗滴度；(b)为上述抗体经过SUMO琼脂糖介质偶联亲和层析柱二次纯化后抗HPV-CP多克隆抗体的效价曲线，其中，

表示抗CP蛋白的多抗滴度，

表示抗SUMO的多抗滴度；

图6为本发明实施例1中所得抗HPV-CP多克隆抗体的WB分析图，其中M表示蛋白质分子质量标准，1表示Sumo-CP蛋白(1μL)，2表示Sumo-CP蛋白(2μL)，3表示Sumo-CP蛋白(4μL)，4表示Sumo-CP蛋白(6μL)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1材料方法

1.1材料

pSUMO载体为本实验室保存(也可直接从市场上购买)。对虾肝胰腺细小病毒(HPV病毒)的基因是利用GenBank中提供的中国对虾(P.chinensis)HPV病毒的基因组序列(AY008257)及其分析的ORF(AAG23868.2)，人工合成了包含cp基因的ORF(820bp)。BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工；新西兰实验兔2.5kg(江苏省农业科学院)，弗氏佐剂﹑SDS﹑Tris等购自Sigma，羊抗兔-HRP购于Thermo Fisher Scientific，其它试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1 pSUMO-sHPVCP重组质粒的构建

根据SEQ ID NO：2所示的HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列，设计正向引物和反向引物，其中正向引物为：cccaagcttgaaaccagtgaaccgggtgtg(下划线为HindIII酶切位点，SEQ ID NO：3)；反向引物为：ccgctcgagttacacgttggtcttatatttc(下划线为XhoI酶切位点，SEQ ID NO：4)；以合成的对虾HPV病毒衣壳蛋白基因为模板，采用Thermo Scientific

master mix高保真DNA聚合酶进行PCR扩增(Phusion DNA聚合酶1μL，2xPhusion HF Buffer 25μL，模板100ng，10μmoL/L正向与反向引物各1μL，无菌水20μL)，PCR反应条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环。取PCR产物进行检测并纯化回收。将纯化后的PCR产物与pSUMO载体分别经过HindIII/XhoI限制性内切酶(美国NewEngland Biolabs公司)双酶切后用T4-DNA连接酶连接(美国New England Biolabs公司)，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素(50μg/mL)筛选阳性克隆，提取重组质粒进行HindIII/XhoI双酶切和测序验证。

1.2.2 HPV-CP蛋白的表达及SDS-PAGE检测

pSUMO-sHPVCP重组质粒采用氯化钙转化法(参考黎孟枫《分子克隆实验指南》第二版中译本，1992年科学出版社出版)转至大肠杆菌Rossetta(DE3)。挑取单个转化的阳性菌落，接种至新鲜LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，次日按1:100接种于50μg/mL Kan/Chl的30mL LB培养液中，37℃200r/min振摇至菌体OD₆₀₀为0.6。取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，此为未经诱导表达的对照菌。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导SUMO-CP融合蛋白表达，得到诱导表达蛋白的菌液。从所得菌液中取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，此为经过诱导表达蛋白的菌体。上述菌体4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带观察。

1.2.3包涵体蛋白纯化及SDS-PAGE和Western Blot检测

所得诱导表达蛋白的菌液离心，沉淀重悬于裂解液超声破碎，4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀，该沉淀即为SUMO-CP融合蛋白包涵体；使用包涵体洗涤液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl,2％的Tween-20,2M尿素)洗涤包涵体3次。用缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min。将30mL上述溶液逐步滴加到30mL Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0)中进行复性，再透析过夜。透析后的上清样采用Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱纯化，收集流出液，得到纯化后的SUMO-CP融合蛋白。所得融合蛋白采用Brandford法测定蛋白浓度。进一步透析后进行12％SDS-PAGE分析。PAGE胶上的蛋白通过半干转移法转至PVDF膜(恒流250mA1 h)，转膜后PBST洗涤4次，每次5min，用5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h，加入一抗二抗各1h孵育。His抗体：1:1000稀释，二抗羊抗兔IgG-HRP：1:5 000稀释，ECL显影，曝光。

1.2.3抗HPV-CP多克隆抗体的制备

纯化后的SUMO-CP融合蛋白进行BCA浓度测定后，免疫4只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫1次，共免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对SUMO-CP蛋白的效价，待效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

将纯化后的SUMO-CP融合蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将前述所得抗血清与PBS缓冲液(1.44g Na₂HPO₄，8g NaCl，0.2gKCl，0.24g KH₂PO₄溶于800mlddH₂O中，用HCl调pH值至7.4，定容到1L，高压灭菌)等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸缓冲液(0.1M Gly-HCI(pH2.7))洗脱，即得到初步纯化的抗HPV-CP多克隆抗体。将其立即置于PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度﹑浓度和效价测定。用此抗体再通过SUMO蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，去除抗SUMO-CP蛋白多克隆抗体中的抗SUMO蛋白抗体成分，提高抗体的特异性。

1.2.4 ELISA法检测多抗的效价

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定。通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。通过ELISA检测纯化抗体的效价，用PBS包被液(pH7.4)将SUMO-CP融合蛋白和SUMO蛋白稀释成5μg/mL，按100μL/孔4℃冰箱过夜。次日弃包被液，PBST洗板3次，每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭液中37℃恒温箱封闭1h。取出酶标板，弃去内液，PBST洗板1次。纯化抗体按1:500，2倍稀释，每孔100μL，37℃恒温箱1h。弃去内液，PBST洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗(山羊抗兔-HRP，1:40000)，37℃恒温箱1h。弃去内液，PBST洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液。每孔加入100μL 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

1.2.5 Western blotting检测多抗的特异性

SUMO-CP融合蛋白样品稀释10倍，梯度上样。进行12％SDS-PAGE。电泳结束后，取下PAGE凝胶转PVDF膜，电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。用5％脱脂奶粉的封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。用含5％脱脂奶粉的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应45min。反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中PBST洗膜4次，每次5min。ECL显影，曝光。

2结果

2.1 pSUMO-sHPVCP重组质粒构建

通过PCR扩增肝胰腺细小病毒CP蛋白全长基因片段，得到1689bp的片段，经过琼脂糖凝胶电泳检测大小符合预期值。CP蛋白全长基因片段克隆进入pSUMO载体，经过菌落PCR筛选出重组克隆，pSUMO-sHPVCP重组质粒经过HindIII-XhoI双酶切结果显示，酶切产物分子量大小与预期一致(如图1所示)。重组质粒进一步通过测序进行鉴定，测序结果显示序列插入正确，说明pSUMO-sHPVCP重组质粒构建成功，可用于HPV-CP蛋白表达。

2.2 pSUMO-sHPVCP重组质粒的表达及检测

HPV-CP蛋白分子量大小为62.64kD，SUMO蛋白大小约为为20kD，因此SUMO-CP融合蛋白预期分子量约为84kD左右。利用IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析显示，目标蛋白主要存在于细胞裂解后不溶于水的沉淀中(如图2所示)，说明SUMO-CP融合蛋白在大肠杆菌中表达的蛋白是以包涵体形式存在的。

2.3 SUMO-CP包涵体蛋白纯化及SDS-PAGE和WB检测

对包涵体进行包涵体变复性，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％SDS-PAGE分析，结果如图3所示。结果表明，表达的SUMO-CP融合蛋白符合预期的大小，从SDS-PAGE凝胶的图像显示，纯化得到蛋白纯度可以达到90％以上，经过BSA试剂盒定量，得到的蛋白浓度为1mg/ml。本申请人制备了10mg的SUMO-CP融合蛋白用于制备HPV-CP蛋白抗体。通过WB检测，通过融合蛋白所带的His标签，采用抗His的HRP酶标二抗，可以在相应大小的地方检测到纯化的融合蛋白(如图4所示)。

2.4多克隆抗体的ELISA效价检测

效价曲线(如图5所示)显示，经过一次SUMO蛋白亲和柱去除抗SUMO的交叉反应抗体前，抗CP蛋白的多抗滴度为512,000左右，抗SUMO的多抗滴度为64,000；经过二次SUMO蛋白亲和柱去除抗SUMO的交叉反应抗体后，抗CP蛋白的多抗滴度为512,000以上，抗SUMO的多抗滴度为8,000。本研究所得到的抗HPV-CP多克隆抗体效价比较高，而且经过了SUMO蛋白亲和柱去除抗SUMO的交叉反应抗体后，抗血清的特异性明显增强。

2.5抗血清的Western blotting特异性检测

本研究获得纯化抗体得率达到5.4mg以上。Western blotting检测(如图6所示)显示，在兔抗血清被稀释3000倍，抗原浓度为100μg/mL，点样1μL的情况下，WB检测只有CP蛋白的单一的条带，随着CP蛋白量增大，在加大CP蛋白上样量的情况下，在30多和40多KD的地方可以看到两条杂带。

序列表

<110> 北部湾大学

<120> 一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法

<130> 2019

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 699

<212> PRT

<213> 中国对虾(Penaees chinensis)

<400> 1

Met Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Ser Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Gly His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp

20 25 30

Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys

35 40 45

Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile

50 55 60

Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala

65 70 75 80

Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr

85 90 95

Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met

100 105 110

Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Leu

115 120 125

Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Glu Thr Ser Glu Pro Gly Val Thr

130 135 140

Ala Ala Pro His Gln Lys Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Glu Thr Ala Gly Tyr Gly Lys Asn Thr Asn Asp Ala

165 170 175

Phe Gln Arg His Arg Asn Gln Pro Ile Asp Leu Lys His Ile Gly Asp

180 185 190

Asn Val Tyr Val Ala Gln Arg Val Tyr Lys Val Glu Ala Glu Cys Lys

195 200 205

Leu Ile His Asp Lys Leu Thr Trp Ser Ala Thr Ala Asp Asn Pro Phe

210 215 220

Val Arg Arg Leu Met Gly Leu Asn Glu Ser Ser Asn Ser Gly Asp Ile

225 230 235 240

Lys Tyr Ser Phe Asn Ala Leu Leu His Gly Ser Ile Gly Leu Gly Asn

245 250 255

Leu Ala Leu Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Trp Gly Ile Asp Asn Met Ala

260 265 270

Lys Ser Glu Asp Ser Trp Ala Ile Ile Ala Thr Arg Gly Lys Met Asn

275 280 285

His Leu Gln Ala Phe Glu Met Ile Pro Gln Met Gln Gly Glu Thr Ile

290 295 300

Val Gly Tyr Thr Ser Ala Pro Val Gln Phe Gly Lys Leu Leu Gly His

305 310 315 320

Ile Tyr Tyr Pro Asp Pro Lys Gly Glu Glu Lys Ile Lys Val Ala Asn

325 330 335

His Ser Asn Gly Gln Glu Tyr Arg Ile Phe Asp Gly Ala Leu Asp Gly

340 345 350

Tyr Thr Leu Asp Asp Asp Met Asn Gln Lys Lys Ile Thr Ala Asp Gln

355 360 365

His His Val Phe Met Phe Thr Asp Leu Arg Asp Ala Pro Met Ile Ser

370 375 380

Glu Val Thr Ala Tyr Leu Asn Thr Asp Asn Pro Ala Gln Ile Asn Gly

385 390 395 400

Ile Gly Ile Glu His Gln Gly Phe Asp Met Ser Asn Asp Ala Asn Thr

405 410 415

Ala Leu Ile Gly Val Met Pro Ser Asn Cys Ile Arg Lys Arg Lys Glu

420 425 430

Ile Gln Ser Gly Met Asp Asn Val Val Leu Trp Ser Met Gln Ser Asn

435 440 445

Arg Leu Ile Asp Lys Arg Phe Trp Thr Pro Glu Gly Trp Ser Leu Lys

450 455 460

Ser Val Asn Gly Met Ala Asn Asp Arg Ile Asp Met Pro Ser Glu Gly

465 470 475 480

Ala Ala Ile Phe Asp Glu Ala His Val Thr Arg Thr Ser Asn Tyr Ala

485 490 495

Glu Trp Ala Arg Asn Glu Ile Tyr Tyr Ser Ala Asp Thr Ser Asp Asn

500 505 510

Ala Phe Gly Pro Ser Asn Thr Gly Ala Phe Ala Gln Lys Tyr Asn Val

515 520 525

Ser Asn Gln Tyr Ala Thr Asn Ile Phe Phe Met Pro Tyr Ala His Thr

530 535 540

Gln Arg Gly Ala Ile Gln Asp Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Thr Leu

545 550 555 560

Gln Ile Met Val Lys Arg Ile Pro Arg Ser Val Tyr Asn Asp Phe Tyr

565 570 575

His Ile Asn Ala Arg Ala Val Val Pro Thr Val Tyr Asp Glu Tyr Lys

580 585 590

Asp Arg Thr Phe Gly Ala Thr Glu Ile Ser His Arg Gly Lys Asn Ile

595 600 605

His Val Asn Ile Thr Gly Thr His Gly Ser Lys Tyr Ser Asp Arg Gly

610 615 620

Gln Val Ser Arg Ile Gly Ala Thr Lys Lys Asn Phe Ala Thr Arg Ala

625 630 635 640

Tyr Gly Gln Lys Gln Leu Leu Leu Asn Glu Gly Ile Thr Arg Arg Lys

645 650 655

Thr Arg Ser Ser Ala Ala Ala Glu Asp Asp Ile Pro Glu Asp Cys Glu

660 665 670

Asp Phe Leu Glu Thr Ser Glu Met Glu Ser Pro Pro Gln Pro Gln Leu

675 680 685

Gln Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Lys Thr Asn Val

690 695

<210> 2

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gaaaccagtg aaccgggtgt gaccgccgca ccgcatcaga aaagcgccgc cggcggcggt 60

ggtggtggtg gcggtagcgg tggtgaaacc gcaggttatg gcaaaaatac caatgatgca 120

tttcagcgtc atcgcaatca gccgattgat ctgaaacata ttggtgacaa tgtttatgtt 180

gcccagcgtg tttataaagt tgaagcagaa tgcaaactga ttcatgataa actgacctgg 240

agtgcaaccg cagataatcc gtttgttcgc cgtctgatgg gtctgaatga aagtagtaat 300

agcggtgaca ttaagtatag ctttaatgca ctgctgcatg gcagtattgg tctgggtaat 360

ctggcactga gtaattatat taatgcatgg ggtattgaca acatggcaaa aagcgaagat 420

agttgggcaa ttattgccac ccgcggcaaa atgaatcatc tgcaggcctt tgaaatgatt 480

ccgcagatgc agggtgaaac cattgtgggt tataccagcg caccggtgca gtttggtaaa 540

ctgctgggcc atatctatta tccggatccg aaaggcgaag aaaaaattaa ggtggccaat 600

catagcaatg gtcaggaata tcgcattttt gatggcgccc tggatggtta taccctggat 660

gatgatatga atcagaaaaa gattaccgca gatcagcatc atgtttttat gtttaccgat 720

ctgcgtgatg ccccgatgat tagtgaagtg accgcatatc tgaataccga taatccggcc 780

cagattaatg gcattggtat tgaacatcag ggttttgata tgagtaatga tgcaaatacc 840

gcactgattg gtgtgatgcc gagcaattgt attcgtaaac gcaaagaaat tcagagtggt 900

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ccgagtgaag gtgcagcaat ttttgatgaa gcacatgtta cccgcaccag taattatgcc 1080

gaatgggcac gcaatgaaat ctattatagt gccgatacca gtgataatgc ctttggcccg 1140

agtaataccg gcgcatttgc ccagaaatat aatgttagca atcagtatgc caccaatatt 1200

ttctttatgc cgtatgcaca tacccagcgt ggtgccattc aggatattgt tattaatttt 1260

gacctgaccc tgcagattat ggtgaaacgc attccgcgca gcgtgtataa tgatttttat 1320

catattaacg cacgtgcagt tgttccgacc gtttatgatg aatataaaga tcgcaccttt 1380

ggcgccaccg aaattagcca tcgtggtaaa aatattcatg tgaatatcac cggtacccac 1440

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gcaacccgcg cctatggtca gaaacagctg ctgctgaatg aaggcattac ccgccgtaaa 1560

acccgtagca gcgccgccgc cgaagatgat attccggaag attgtgaaga ttttctggaa 1620

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<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cccaagcttg aaaccagtga accgggtgtg 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccgctcgagt tacacgttgg tcttatattt c 31

Claims

1.一种SUMO-CP融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)根据对虾肝胰腺细小病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计正、反向引物，并进行PCR扩增，所得PCR产物与pSUMO 载体分别酶切并连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，构建得到pSUMO-sHPVCP重组质粒；其中，所述对虾肝胰腺细小病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

2)将构建的pSUMO-sHPVCP重组质粒转染大肠杆菌Rossetta (DE3)，得到诱导表达蛋白的菌液；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤是3)中，所述的Ni²⁺亲和层析柱为Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

3.根据权利要求1或2所述制备方法制备得到的SUMO-CP融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.抗对虾肝胰腺细小病毒-CP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

Ⅰ)将SUMO蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，备用；

Ⅱ)选取合适的动物，以权利要求3所述的SUMO-CP融合蛋白为免疫原对其进行皮下免疫注射，直至动物的特异性抗血清滴度达标；

Ⅲ)采集动物的抗血清，过Ⅰ)制得的抗原亲和纯化层析柱，用甘氨酸缓冲液洗脱，得到纯化后的抗对虾肝胰腺细小病毒-CP多克隆抗体。