CN117487006B - 一种抗a型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用 - Google Patents

一种抗a型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用，属于生物抗体技术领域。本发明为了提供一种能够特异性识别SVA VP2蛋白的抗体序列，及该抗体识别的抗原位点序列。本发明提供一株抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。为进一步合理设计表位疫苗，开发SVA感染特异性血清学诊断方法提供依据。

Description

一种抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用
技术领域
本发明属生物抗体技术领域，具体涉一种抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用。
背景技术
A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）又称塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV），是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，是小RNA病毒科、塞内卡病毒属的唯一成员，只有一个血清型。SVA是一种新发的动物水泡性疾病，猪被认为是该病毒的天然宿主，SVA可以感染各年龄阶段的猪，导致猪原发性水疱病。患病猪临床症状主要表现为肌肉无力、嗜睡、跛行、厌食、鼻部和蹄部冠状带出现水泡甚至溃疡，新生仔猪发病率高达70%，死亡率介于15%~30%，成年猪多表现为无症状感染或症状轻微。与其他水泡病病毒，如口蹄疫病毒（FMDV）、猪水泡病病毒（SVDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、猪水泡性疱疹病毒（VESV）临床症状相似难以区分，严重影响母猪的生产效率及新生仔猪存活率，是养猪业的潜在威胁。
SVA最早发现于2002年，早期分离到的塞内卡病毒被认为是非致病性的病毒，但近年来包括中国在内的不同国家和地区均出现A型塞内卡病毒的感染和流行。传播特性与口蹄疫病毒类似，且与口蹄疫病毒存在混合感染，严重困扰我国口蹄疫的防控，需要进行鉴别诊断。SVA的实验室诊断多采用病原学和血清学方法，目前有多种检测技术可用于诊断塞内卡病毒感染。分子检测技术（如RT-PCR）具有敏感性和特异性高的特点，可从不同的生物样本中检测塞内卡病毒病原。此外，病毒中和试验（VNT）、间接免疫荧光实验（IFA）、阻断酶联免疫吸附试验（bELISA）、竞争性酶联免疫吸附试验（C-ELISA）和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）均可用于猪塞内卡病毒血清学实验室筛查。VNT和IFA的敏感性和特异性更高，但因其操作繁琐，存在散毒风险，试验操作要求高，时间长，所以不利于SVA的快速诊断。ELISA方法简单易行、灵敏度高、成本低，适用大规模的样品检验，与其他检测方法相比，特异性和敏感性较高，但需要制备全病毒抗原或使用纯化的重组蛋白作为包被抗原。此外，免疫组织化学和原位杂交等技术也可用于SVA的实验室诊断。
由于我国针对SVA的商品化检测试剂盒数量较少，仍主要依赖于进口检测试剂盒进行血清学监测和病原学检测。因此，针对SVA抗体的筛选为SVA的血清学检测、病原体检测以及开发快速鉴别诊断试剂提供重要的研究材料。此外，我国SVA疫苗仍在研制中，无商品化SVA疫苗可以用于该疾病的预防。因此，深入挖掘保守的SVA优势抗原表位，不仅可以了解抗原表位的结构与功能，而且对诊断试剂研发、药物合成和表位疫苗设计等也具有指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够特异性识别SVA VP2蛋白的抗体序列，及该抗体识别的抗原位点序列及它们在SVA血清学检测及多肽疫苗创制领域中的应用。
本发明提供一株抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR-L2的氨基酸序列为QDIKKY；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
进一步地限定，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供一种编码权上述单克隆抗体的基因序列，克隆抗体的重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示；所示单克隆抗体的轻链可变区的编码基因序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明提供一种编码上述的单克隆抗体的基因序列，所述单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的编码基因序列如SEQ ID NO.13所示，CDR-H2的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示；CDR-H3的编码基因序列如SEQ ID NO.15所示；
所述单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的编码基因序列如SEQ ID NO.16所示，CDR-L2的编码基因序列为TACACATCT；CDR-L3的编码基因序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明提供一种携带上述的基因序列的重组载体或重组微生物细胞。
本发明提供一种上述单克隆抗体或上述的重组载体或重组微生物细胞在制备检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供一种上述的单克隆抗体识别的抗原表位序列，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明提供一种编码上述的抗原表位序列的基因。
本发明提供一种携带上述的基因的重组载体或重组微生物细胞。
本发明提供一种上述的抗原表位序列或上述的重组载体或重组微生物细胞在制备抗A型塞内卡病毒的抗体或疫苗或治疗或预防A型塞内卡病毒引发的疾病中的应用。
有益效果：本发明筛选出一株针对猪塞内卡病毒主要结构蛋白VP2的单克隆抗体，通过基因测序获得其重链和轻链可变区序列，并鉴定出该单克隆抗体识别的一个新的保守抗原表位，并进一步分析了其抗原性和免疫原性。为进一步合理设计表位疫苗，开发SVA感染特异性血清学诊断方法提供依据。
附图说明
图1 SVA VP2蛋白诱导表达、纯化SDS-PAGE电泳图及Western blot鉴定；（A）是SVAVP2重组蛋白表达、纯化；（B）是SDS-PAGE鉴定；和（C）是western blot鉴定；M：蛋白分子标准；1：pET-28a-SUMO-VP2未诱导全菌；2：pET-28a-SUMO-VP2诱导后全菌；3：pET-28a-SUMO-VP2裂解后的上清；4：pET-28a-SUMO-VP2裂解后的沉淀；5：镍柱亲和层析纯化后的重组VP2蛋白；6-12：分子筛凝胶过滤层析纯化后的重组VP2蛋白；
13：pET-28a-SUMO-VP2重组蛋白；14：pET-28a-SUMO空载蛋白；
图2 间接ELISA检测免疫小鼠的血清效价；
图3单克隆抗体间接免疫荧光、Western blot鉴定结果；图A是1B8单克隆抗体Western blot鉴定结果，M：蛋白分子标准；1：SVA感染BHK-21细胞上清；2：BHK-21细胞裂解液；3： pET-28a-SUMO-VP2重组蛋白；4：pET-28a-SUMO空载蛋白；图B是1B8和2E4单克隆抗体间接免疫荧光鉴定结果，1B8和2E4均能够特异性识别SVA感染BHK-21细胞；
图4 1B8单克隆抗体重链和轻链可变区序列分析；图A是重链3个互补决定区（CDR1-3）的氨基酸和cDNA序列示意图；图B是轻链3个互补决定区（CDR1-3）的氨基酸和cDNA序列示意图；
图5 单克隆抗体的表位识别间接ELISA和Western blot鉴定；图A.1B8单克隆抗体识别VP2-17、VP2-18、VP2-19合成肽的间接ELISA检测结果（左图）；2E4单克隆抗体识别VP2-14、VP2-15、VP2-16合成肽的间接ELISA检测结果（右图）；图B是构建截短表达VP2蛋白S1、S2、S3及VP2全长模式图；图C是HA标签抗体与截短表达蛋白的western blot鉴定图，M：蛋白分子标准；1：截短蛋白S1（1-177aa）；2：截短蛋白S2（1-185aa）；3：截短蛋白S3（184-284aa）；4：VP2全长蛋白；5：pCAGGS-HA空载蛋白；图D是1B8单克隆抗体与截短表达蛋白的westernblot鉴定图，M：蛋白分子标准；6：截短蛋白S1（1-177aa）；7：截短蛋白S2（1-185aa）；8：截短蛋白S3（184-284aa）；9：VP2全长蛋白；10：pCAGGS-HA空载蛋白；图E是HA标签抗体与1B8单克隆抗体与丙氨酸单点突变蛋白western blot鉴定图；
图6 1B8单克隆抗体识别表位的保守性及空间结构特点分析结果图；A是 1B8单克隆抗体识别表位的保守性结果图；B是1B8单克隆抗体识别表位的空间结构特点分析结果图；
图71B8单克隆抗体识别表位的抗原性和免疫原性分析；图A是间接ELISA鉴定1B8和2E4单克隆抗体与纯化SVA病毒离子的亲和力；图B是1B8单克隆抗体与VP2全长蛋白和表位合成肽（LGTYYR）结合的间接ELISA结果图；图C是表位合成肽（LGTYYR）检测临床阳性血清样品的间接ELISA结果图；图D是纯化的纳米颗粒-LGTYYR电镜鉴定图；图E是纳米颗粒-LGTYYR免疫小鼠血清的IFA鉴定图。
具体实施方式
本发明首先将SVA VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，经过3次免疫后分离小鼠的脾脏淋巴细胞，并与骨髓瘤SP2/0进行融合，细胞融合第10天后，用VP2重组蛋白包被在酶标板上，利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，阳性杂交瘤细胞经3次亚克隆后，获得了稳定分泌特异性针对VP2的单克隆抗体。
提取该阳性杂交瘤细胞的基因组，通过基因测序获得单克隆抗体重链和轻链可变区序列。通过蛋白截短表达的方法鉴定出该单克隆抗体所识别的抗原位点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
SP2/0骨髓瘤细胞记载在文献Wang S, Wen Y, An T, Duan G, Sun M, Ge J, LiX, Yang K, Cai X. Development of an Immunochromatographic Strip for RapidDetection of Canine Adenovirus. Front Microbiol. 2019 Dec 11;10:2882. doi:10.3389/fmicb.2019.02882. PMID: 31921060; PMCID: PMC6917642.中。
re-SVA-EGFP病毒记载在Jia, M., Sun, M., Tang, Y.D., Zhang, Y.Y., Wang,H., Cai, X*., Meng, F*., 2022. Senecavirus A Entry Into Host Cells IsDependent on the Cholesterol-Mediated Endocytic Pathway. Frontiers inveterinary science 9, 840655.中。
pET28a-SpyCatcher-mi3记载在Bruun TUJ, Andersson AC, Draper SJ,Howarth M. Engineering a Rugged Nanoscaffold To Enhance Plug-and-DisplayVaccination. ACS Nano. 2018 Sep 25;12(9):8855-8866. doi: 10.1021/acsnano.8b02805.中。
实施例1.
一、A型塞内卡病毒VP2结构蛋白1B8单克隆抗体的筛选及鉴定
1、材料与方法
1.1病毒、细胞和实验动物
SVA-HLJ/swine/2016 (GeneBank：KY419132.1)毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离并保存；re-SVA-EGFP病毒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建并保存；乳仓鼠肾细胞BHK-21和293T人胚胎肾细胞系均购自ATCC（货号为CCL-10和CRL-3216），SP2/0骨髓瘤细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购于辽宁长生生物技术有限公司。
1.2载体、菌株和主要试剂
原核表达载体pET-28a(+)和真核表达载体pCAGGS/HA购自索莱宝公司。pET28a-SpyCatcher-mi3序列（GeneBank：MH425515）。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自于南京诺唯赞生物科技有限公司，限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和同源重组酶购自ThermoFisher公司；法国白油佐剂MONTANIDE ISA201VG购自SEPPIC公司；IPTG、HAT、HT、PEG均购自Sigma公司；RPMI-DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基联苯胺TMB显色液购自于abm公司；HRP标记的金黄色葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）购自博士德生物技术有限公司；Dylight 800荧光标记的羊抗鼠IgG购自美国Abbkine公司；AlexaFluor 568羊抗鼠荧光二抗购自于Thermo Fisher公司；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
2．rVP2重组蛋白的表达与纯化
2.1重组质粒的构建
参考GenBank数据库中SVA-HLJ/swine/2016 (GeneBank：KY419132.1)毒株的VP2基因序列设计并合成含有酶切位点EcoRⅠ、XhoⅠ的PCR引物用于扩增VP2基因，利用同源重组酶连接目的基因至带SUMO标签和6×His融合标签的pET-28a(+)表达载体上获得pET-28a-SUMO-VP2载体。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定后送测序公司测序，将测序正确的质粒命名为pET-28a-SUMO-VP2并置于-20℃保存备用。
VP2基因序列：SEQ ID NO .1 GATCACAATACCGAAGAAATGGAAAACTCTGCTGATCGGGTCATAACGCAAACAGCGGGCAACACTGCCATAAACACGCAATCATCACTGGGTGTGTTGTGTGCCTACGTTGAAGACCCGACCAAATCTGACCCTCCGTCCAGCAGCACAGACCAACCCACCACCACTTTTACTGCCATCGACAGGTGGTACACTGGACGCCTTAATTCTTGGACAAAAGCTGTAAAAACCTTCTCTTTTCAGGCCGTCCCGCTCCCTGGAGCCTTCCTGTCTAGACAGGGAGGCCTCAACGGAGGGGCCTTCACGGCTACCCTACATAGACATTTCTTGATGAAGTGCGGGTGGCAGGTGCAGGTCCAATGCAATTTGACGCAATTCCACCAAGGTGCTCTTCTTGTTGCTATGGTCCCCGAGACCACCCTTGATGTCAGACCTGACGGCAAGGCAAAGAGCTTAGAAGAGCTGAATGAAGAGCAGTGGGTAGAAATGTCTGACGATTACCGGACCGGGAAAAACATGCCTTTTCAGTCTCTTGGCACATACTATCGGCCCCCTAACTGGACTTGGGGCCCCAATTTTATCAACCCCTATCAAGTAACAGTTTTCCCACACCAAATTCTGAACGCGAGAACCTCTACCTCGGTAGACATAAGTGTCCCATACATCGGGGAGACTCCTACACAATCCTCAGAGACACAGAACTCCTGGACCCTCCTCGTTATGGTGCTTGTCCCCTTAGACTACAAGGAGGGAGCCACAACTGACCCAGAAATTACATTCTCTGTAAGGCCTACAAGTCCTTACTTCAATGGGCTTCGTAACCGTTTCACGACCGGGACGGACGAGGAACAG。
VP2氨基酸序列：SEQ ID NO .75
DHNTEEMENSADRVTTQTAGNTAINTQSSLGVLCAYVEDPTKSDPPSSSTDQPTTTFTAIDRWYTGRLNSWTKAVKTFSFQAVPLPGAFLSRQGGLNGGAFTATLHRHFLMKCGWQVQVQCNLTQFHQGALLVAMVPETTLDVKPDGKAKSLQELNEEQWVEMSDDYRTGKNMPFQSLGTYYRPPNWTWGPNFINPYQVTVFPHQILNARTSTSVDINVPYIGETPTQSSETQNSWTLLVMVLVPLDYKEGATTDPEITFSVRPTSPYFNGLRNRYTAGTDEEQ。
2.2重组蛋白的诱导表达与纯化
将重组质粒pET-28a-SUMO-VP2转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落于37℃、200r/min摇床振荡培养16h，再将菌液按1:100的比例接种于200mL液体LB培养基(含有50μg/mL的卡那霉素)于37℃、200r/min摇床振荡培养至菌液OD600值为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.1mM/L的IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃苷)于16℃、200r/min低温水平摇床中诱导蛋白表达，待摇菌诱导16h后取菌液8,000×g离心10min，PBS重悬菌体后超声裂解，12,000r/min离心后分别收集超声后的菌液上清和沉淀，经SDS-PAGE试验分析rVP2重组蛋白的表达情况。将获得的可溶性重组蛋白用Ni柱亲和层析法进行初步纯化，除去大部分杂蛋白后再使用凝胶过滤层析纯化系统（分子筛）进一步纯化，将制备的样品进行12% SDS-PAGE电泳鉴定。纯化后的重组蛋白用抗SVA的小鼠多克隆抗体为一抗，Dylight 800荧光标记的羊抗鼠IgG（1：10000）为二抗，通过Western blot鉴定rVP2重组蛋白与SVA多抗血清的反应原性。纯化后的rVP2重组蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，-80℃冻存备用。
rVP2重组蛋白序列：SEQ ID NO .2
HHHHHHSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGISIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGDHNTEEMENSADRVTTQTAGNTAINTQSSLGVLCAYVEDPTKSDPPSSSTDQPTTTFTAIDRWYTGRLNSWTKAVKTFSFQAVPLPGAFLSRQGGLNGGAFTATLHRHFLMKCGWQVQVQCNLTQFHQGALLVAMVPETTLDVKPDGKAKSLQELNEEQWVEMSDDYRTGKNMPFQSLGTYYRPPNWTWGPNFINPYQVTVFPHQILNARTSTSVDINVPYIGETPTQSSETQNSWTLLVMVLVPLDYKEGATTDPEITFSVRPTSPYFNGLRNRYTAGTDEEQHHHHHH。
rVP2 重组蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO .3
CATCATCATCATCATCACTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGCATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGATCACAATACCGAAGAAATGGAAAACTCTGCTGATCGGGTCATAACGCAAACAGCGGGCAACACTGCCATAAACACGCAATCATCACTGGGTGTGTTGTGTGCCTACGTTGAAGACCCGACCAAATCTGACCCTCCGTCCAGCAGCACAGACCAACCCACCACCACTTTTACTGCCATCGACAGGTGGTACACTGGACGCCTTAATTCTTGGACAAAAGCTGTAAAAACCTTCTCTTTTCAGGCCGTCCCGCTCCCTGGAGCCTTCCTGTCTAGACAGGGAGGCCTCAACGGAGGGGCCTTCACGGCTACCCTACATAGACATTTCTTGATGAAGTGCGGGTGGCAGGTGCAGGTCCAATGCAATTTGACGCAATTCCACCAAGGTGCTCTTCTTGTTGCTATGGTCCCCGAGACCACCCTTGATGTCAGACCTGACGGCAAGGCAAAGAGCTTAGAAGAGCTGAATGAAGAGCAGTGGGTAGAAATGTCTGACGATTACCGGACCGGGAAAAACATGCCTTTTCAGTCTCTTGGCACATACTATCGGCCCCCTAACTGGACTTGGGGCCCCAATTTTATCAACCCCTATCAAGTAACAGTTTTCCCACACCAAATTCTGAACGCGAGAACCTCTACCTCGGTAGACATAAGTGTCCCATACATCGGGGAGACTCCTACACAATCCTCAGAGACACAGAACTCCTGGACCCTCCTCGTTATGGTGCTTGTCCCCTTAGACTACAAGGAGGGAGCCACAACTGACCCAGAAATTACATTCTCTGTAAGGCCTACAAGTCCTTACTTCAATGGGCTTCGTAACCGTTTCACGACCGGGACGGACGAGGAACAGCACCACCACCACCACCACTGA。
结果：对测序鉴定正确的pET-28a-SUMO-VP2质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达，超声后对菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果显示成功表达了SVA rVP2重组蛋白，其分子质量约为57kDa，与预期大小相符，对超声裂解后的菌体上清和沉淀进行分析，发现原核表达的SVA rVP2重组蛋白主要为可溶性表达（图1A）；可溶性rVP2重组蛋白采用镍柱亲和层析法纯化后除去了大部分杂蛋白，经过分子筛凝胶过滤层析纯化后获得了较为纯净的目的蛋白（图1B）；western-blot结果显示SVA鼠多克隆抗体能在57kDa处检测到rVP2重组蛋白特异性条带，而对照组未出现相应的条带，表明rVP2重组蛋白具有良好反应原性。
3.单克隆抗体的制备和筛选
3.1小鼠免疫和血清效价检测
用纯化的rVP2重组蛋白作为抗原按照100µg/100µL加等体积法国白油佐剂ISA201VG，充分乳化后经颈背部皮下多点注射6周龄雌性BALB/c小鼠（50µg/只）；2周后进行第2次免疫；再次间隔2周后，进行第3次免疫。第3次免疫后1周对小鼠进行眼眶静脉采血，分离血清并检测抗体效价水平。并于融合前3d采用不加佐剂经腹腔注射免疫方式进行加强免疫（100µg/只）。通过棋盘法确定抗原的最佳rVP2重组蛋白包被浓度及血清最佳稀释倍数，用于小鼠血清抗体效价检测和阳性杂交瘤细胞的筛选。
在4℃条件下用rVP2重组蛋白包被酶标板包被过夜（最佳包被浓度1µg/ml），将第3次免疫后小鼠血清和空白小鼠阴性血清从1:200倍开始依次2倍倍比稀释至1:25600作为一抗，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤3次，加入1:10000倍稀释的HRP-SPA二抗，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤5min，重复3次，每孔加入TMB底物液100μL，室温避光静置10min后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。当待检血清与阴性血清的OD450nm比值（P/N）≥2.1，且待检血清的OD450nm≥0.4时的最大稀释倍数为该免疫小鼠的血清效价。若免疫小鼠血清效价达到1：12800，则可将小鼠安乐死后分离脾脏淋巴细胞进行杂交瘤细胞融合实验。
结果：1.纯化的rVP2重组蛋白稀释至5个不同的包被浓度纵向包被96孔酶标板，阳性小鼠血清及阴性小鼠血清从1:200倍比稀释至1:25600并依序横向加入酶标板内。通过间接ELISA方法，底物显色后读取OD450nm值，结果表明，阳性小鼠血清稀释倍数在1：12800时，OD450nm值大于等于1.0，且阴性小鼠OD值较低，此纵向抗原浓度1μg/mL即为最佳包被浓度。（表1）
表1 棋盘滴定法确定的最佳包被浓度
2.免疫小鼠血清效价检测
在第三次小鼠免疫后1周，将免疫小鼠通过眼眶静脉采血法收集血液200μL，利用上述所测的抗原最佳包被浓度1μg/mL包被96孔酶标板，使用间接ELISA方法检测阳性血清的效价。检测结果证明：免疫了rVP2重组蛋白的3只BABL/C小鼠血清效价全都达到了1:12800（图2），都达到了做细胞融合的要求，而1号免疫鼠的血清效价水平相对较高，因此选择1号免疫鼠进行细胞融合实验。
3.2杂交瘤细胞融合、筛选和克隆
取加强免疫后的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离出血清，即为阳性血清。将小鼠安乐死后，无菌获得脾脏，并采用注射器吹洗的方式分离脾脏淋巴细胞。将处于对数生长期的SP2/0细胞与上述分离得到的脾脏淋巴细胞按照2:1的比例加入50mL离心管中混匀，1000r/min离心10min后弃去上清后，缓慢加入37℃ 50％PEG溶液1mL进行细胞融合，随后由慢至快地加入30mL DMEM培养基终止细胞融合作用，经1000r/min离心10min后，弃去上清。将收获的细胞用50mL HAT培养基重悬，接于含有饲养细胞的96孔板内，每孔100μL，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。在融合后的第10天，利用rVP2重组蛋白（最佳包被浓度1µg/ml）包被酶标板，收集杂交瘤细胞上清液作为一抗，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤5min，重复3次，加入1:10000倍稀释的HRP-SPA，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤5min，重复3次，每孔加入TMB底物液100μL，室温避光静置10min后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。当杂交瘤细胞上清与SP2/0细胞上清的OD450nm比值（P/N）≥2时，判定为阳性孔。并采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。以上筛选和克隆过程重复3次，待各株杂交瘤细胞阳性率达到100%时，即可进行扩大培养和单克隆抗体特性鉴定。
4.单克隆抗体的鉴定
4.1间接免疫荧光鉴定
将BHK-21细胞接种至96孔细胞培养板，待细胞长至70%-80%满时，用0.1 MOI的re-SVA-EGFP病毒感染细胞，同时设不接毒细胞作为阴性对照，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养10h。弃掉旧培养基，用PBS洗涤3次，加入3.7%甲醛固定，100μL/孔，于室温20min。用PBS洗涤3次，用0.2% TritonX 100室温处理20min，PBS洗3次后，加入含1% BSA的PBS缓冲液100μL/孔，于室温封闭30min。用PBS洗涤3次，然后将阳性杂交瘤细胞1B8上清作为一抗，室温孵育1h；用PBS洗涤3次，避光加入AlexaFluor 568羊抗鼠荧光二抗（1:1000），100μL/孔，室温避光孵育1h。用PBS洗涤3次，最后在倒置荧光显微镜下观察荧光。
4.2 Western blot鉴定
为了检测单克隆抗体与病毒和rVP2重组蛋白的反应性，以感染SVA的BHK-21细胞上清和纯化的rVP2重组蛋白作为检测抗原，同时以BHK-21细胞裂解液及pET-28a-SUMO空载蛋白作为阴性对照，进行SDS-PAGE凝胶电泳。将目的蛋白转印至PVDF膜，用5%的脱脂乳室温封闭2h。将筛选得到的阳性1B8杂交瘤细胞上清作为一抗，室温孵育1h，PBST洗三次，Dylight800荧光标记的羊抗鼠IgG用PBST稀释（1﹕10000）作为二抗，室温孵育1h，PBST洗三次，使用BIORAD照膜成像系统进行扫描。
结果：取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合得到的杂交瘤细胞培养上清，用间接ELISA方法进行检测，阳性判定标准为杂交瘤培养上清对rVP2重组蛋白的OD450nm光吸收值大于等于1.0、而正常BALB/c小鼠阴性血清、SP2/0细胞上清对rVP2重组蛋白的OD450nm值接近于0.06。经筛选和三次有限稀释法克隆，获得2株阳性杂交瘤细胞，命名为1B8和2E4。
用杂交瘤上清鉴定1B8和2E4杂交瘤细胞分泌抗体的免疫球蛋白亚类，判定1B8重链类型为IgG1、轻链为κ类型。
并且利用Western blot分析了1B8单克隆抗体对SVA全病毒及rVP2重组蛋白的结合能力，结果显示，该杂交瘤细胞上清能够识别SVA感染的BHK-21细胞上清和rVP2重组蛋白（图3A），而与BHK-21裂解细胞及pET-28a-SUMO空载蛋白对照不反应；通过IFA方法，检测1B8和2E4杂交瘤细胞上清特异性识别SVA病毒感染细胞。re-SVA-EGFP病毒感染BHK-21细胞表达的绿色荧光蛋白与1B8和2E4杂交瘤细胞上清识别的SVA VP2蛋白（红色）存在共定位，判定1B8和2E4杂交瘤细胞为阳性杂交瘤细胞（图3B），而阴性对照组只能够检测SVA感染的BHK-21细胞表达绿色荧光信号。
实施例2.1B8单克隆抗体重链和轻链可变区克隆和测序
1、材料与方法
细胞总RNA提取试剂盒购自天根生化科技公司；反转录酶RT Mix购自于宝生物有限公司；KOD FX NEO高保真扩增酶购自于东洋纺（上海）生物科技有限公司；
2、1B8单克隆抗体的测序
2.1 可变区cDNA RT-PCR克隆
细胞总RNA提取及cDNA制备：按天根试剂盒提供的操作手册提取1B8杂交瘤细胞总RNA并经紫外分光光度计定量。按照宝生物反转录酶说明书中的方法，反转录制备cDNA。引物合成：参照Boehmer提供的鼠 IgG 抗体测序方法，在轻链和重链可变区两端的框架区设计合成引物（表2）。
表2小鼠抗体重链和轻链可变区引物
重链cDNA序列：SEQ ID NO .4
CCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAGTCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACCTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGCCTACCATGATAACTACGCGGGTGTGGCTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAG；
重链氨基酸序列：SEQ ID NO .5
PGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYFSPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAYHDNYAGVANWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVT；
轻链cDNA序列：SEQ ID NO .6
TGGCTATGCTGTTCGTGTGACATCCAGATGTCACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGTAAGGCAAGCCAAGACATTAAGAAGTATATAGGTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATACATTACACATCTATATTAGAGCCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATAGTGCAACGTATTATTGTCTACAGTATGGTAACCTTCTATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGGGCCCTCAGTA；
轻链氨基酸序列：SEQ ID NO .7
WLCCSCDIQMSQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIGWYQHKPGKGPRLLIHYTSILEPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDSATYYCLQYGNLLFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGALS；
2.2 PCR扩增及序列分析
采用KOD Supermix进行PCR扩增。对每个样品按照不同引物组合，设置21个不同PCR反应（分别用11条IgH上游引物和1mRG (Gamma)下游引物配对；10条IgK上游引物和1mRK(Kappa)下游引物配对）。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，预计扩增产物大小450bp。采用MEGA7软件包进行序列分析、比较，比对正确的序列利用NCBI抗体数据库IgBlast进行CDR区的分析。
结果：引物对1mFK_IV、1mRK*(Kappa)，1mFK_VI、1mRK*(Kappa)和1mFK_VII、1mRK*(Kappa)对1B8单克隆抗体轻链可变区cDNA扩增结果均为强阳性，引物对1mFH_I、1mRG*(Gamma)，1mFH_VI、1mRG*(Gamma)，1mFH_VII1mRG*(Gamma)和1mFH_IX、1mRG*(Gamma)对重链可变区cDNA扩增结果均为强阳性，产物大小约为450bp。其余引物对扩增结果均为阴性。测序结果比对分析显示在1B8单克隆抗体重链和轻链可变区cDNA核酸序列中均包含3个轻重链可变区内的互补决定区（CDR）；其中轻链的CDR1为QDIKKY，共6个氨基酸，CDR2为YTS，共3个氨基酸，CDR3为LQYGNLLFT，共9个氨基酸（图4A）；重链的CDR1为GYTFTNYV，共8个氨基酸，CDR2为FSPYNDGT，共8个氨基酸，CDR3为ARGAYHDNYAGVAN，共14个氨基酸(图4B)。
实施例3. 1B8单克隆抗体识别VP2抗原表位的鉴定
3.1抗原表位的初步鉴定
使用交叠合成多肽法来执行VP2结构蛋白的B细胞表位定位。根据SVA-HLJ/swine/2016VP2的284个氨基酸组成的序列设计合成了总共28条多肽，每条多肽片段由20个氨基酸组成、相邻的两条多肽有10个氨基酸相互重叠，委托南京森微生物技术有限公司合成并纯化。利用这些多肽片段包板进行ELISA分析，以定义B细胞表位识别VP2表位的位置。将合成的28条多肽用ddH2O稀释溶解后作为包被抗原，多肽片段以1ug/ml包被ELISA板，1B8单克隆抗体作为一抗，同时设置阳性对照(rVP2重组蛋白)和阴性对照(无关肽段)用ELISA方法检测各多肽段与1B8和2E4单克隆抗体的免疫反应性。分析检测结果，以确定阳性反应肽段。
结果：使用28段VP2合成短肽作为包被抗原，利用间接ELISA分别检测1B8和2E4单克隆抗体识别VP2蛋白表位氨基酸的序列，根据测定的OD450nm值表明1B8单克隆抗体能与VP2-17、VP2-18、VP2-19三条短肽反应，而VP2-18肽OD450nm值最高，而2E4单克隆抗体不能与VP2-14和VP2-16两条短肽反应，只能够与VP2-15肽反应（图5A），初步定位1B8单克隆抗体与VP2-18短肽（171-190：KNMPFQSLGTYYRPPNWTWG，SEQ ID NO .69）反应，2E4单克隆抗体与VP2-15短肽（141-160：LDVRPDGKAKSLEELNEEQW，SEQ ID NO .70）反应，而VP2-15短肽包含文献报道的识别优势表位（150KSLQELN156，SEQ ID NO .71）。
VP2-14 (131-150aa) ：SEQ ID NO .72
LLVAMVPETTLDVRPDGKAK；
VP2-15 (141-160aa) ：SEQ ID NO .73
LDVRPDGKAKSLEELNEEQW；
VP2-16 (151-170aa) ：SEQ ID NO .74
SLEELNEEQWVEMSDDYRTG；
VP2-17 (161-180aa) ：SEQ ID NO .20
VEMSDDYRTGKNMPFQSLGT；
VP2-18 (171-190aa) ：SEQ ID NO .21
KNMPFQSLGTYYRPPNWTWG；
VP2-19 (181-200aa) ：SEQ ID NO .22
YYRPPNWTWGPNFINPYQVT。
3.2抗原表位的精确定位
根据合成肽间接ELISA检测结果，初步定位所制备1B8单克隆抗体表位位于VP2-18（171-190：KNMPFQSLGTYYRPPNWTWG）肽段；为了进一步鉴定1B8单克隆抗体识别SVA VP2蛋白的精确氨基酸序列，利用真核表达系统将VP2-18肽段在不同氨基酸的位置分别截短表达，设计了1对引物用于扩增VP2结构蛋白全长及3对引物用于扩增不同位置截短表达VP2-18肽段（表3）。PCR扩增后利用同源重组方法，分别将4段目的基因连接至真核表达载体pCAGGS/HA，测序正确后提取质粒，使用PEI转染试剂，以质粒(μg)：剂量(μl)为1:3的比例将4个重组质粒转染至293T细胞中，24h后收取并裂解细胞提取蛋白；分别用HA-Tag检测抗体（1：5000）和单抗细胞培养上清为一抗，Dylight800荧光标记的羊抗鼠IgG（1：10000），利用BIORAD照膜成像系统，进行Western-blot鉴定1B8单克隆抗体所识别的表位。
表3表位氨基酸鉴定相关短肽及引物
3.3关键性氨基酸位点鉴定
为进一步了解1B8单克隆抗体识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，以1B8单克隆抗体表位基序178LGTYYR183为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端进行逐个氨基酸替换，以pCAGGS/HA-VP2作为阳性对照，构建6个单点突变重组质粒。首先设计6对单点突变引物（见表4），以pCAGGS/HA-VP2质粒作为模板，使用KOD高保真酶进行PCR扩增整个环状质粒，PCR产物加入无水乙醇使其沉淀10min后12000r/min离心10min；之后使用DPN1限制性内切酶消化未突变质粒模板，最后转化至E.coliDH5α感受态细胞中涂板，待16h后挑取单菌落进行测序，比对结果无误后大提质粒，转染至293T细胞中，收获重组蛋白后按照前述同样的步骤进行SDS-PAGE电泳，每孔上样20μL，以pCAGGS/HA空载体表达产物为空白对照，pCAGGS/HA-VP2表达产物为阳性对照，分别以HA-Tag（1：5000）和单抗细胞培养上清为一抗，Dylight800荧光标记的羊抗鼠IgG为二抗（1：10000），利用BIORAD照膜成像系统，进行Western-blot鉴定出1B8单克隆抗体识别表位的关键性氨基酸位点。
表4单点突变引物表
利用真核表达系统将VP2-18肽段在不同氨基酸的位置分别截短表达（S1、S2、S3）（图5B），Western-blot结果表明截短表达蛋白均能够与HA抗体反应，说明S1-S3截短蛋白成功表达（如图5C）； 1B8单克隆抗体只与S2截短蛋白和全长的rVP2重组蛋白反应，而不与S1和S3蛋白反应，因此判定1B8单克隆抗体识别SVA VP2蛋白的精确氨基酸序列为178LGTYYR183（图5D）。利用丙氨酸单点突变法将178LGTYYR183六个氨基酸依次突变，使用与截短表达蛋白相同的表达载体分别构建6个单点突变质粒（L178、G179、T180、Y181、Y182、R183），Western-blot结果显示单点突变的蛋白均能够与HA标签抗体反应，说明各单点突变蛋白成功表达；但是1B8单克隆抗体能够与全长rVP2重组蛋白反应而与6个点突变蛋白均不反应，该结果说明，这些突变导致1B8单克隆抗体无法识别VP2蛋白，表明此六个活性单元对1B8单克隆抗体都至关重要，均为关键氨基酸位点（图5E）。
S1 (1-177aa)：SEQ ID NO .66
DHNTEEMENSADRVTTQTAGNTAINTQSSLGVLCAYVEDPTKSDPPSSSTDQPTTTFTAIDRWYTGRLNSWTKAVKTFSFQAVPLPGAFLSRQGGLNGGAFTATLHRHFLMKCGWQVQVQCNLTQFHQGALLVAMVPETTLDVKPDGKAKSLQELNEEQWVEMSDDYRTGKNMPFQS；
S2 (1-185aa)：SEQ ID NO .67
DHNTEEMENSADRVTTQTAGNTAINTQSSLGVLCAYVEDPTKSDPPSSSTDQPTTTFTAIDRWYTGRLNSWTKAVKTFSFQAVPLPGAFLSRQGGLNGGAFTATLHRHFLMKCGWQVQVQCNLTQFHQGALLVAMVPETTLDVKPDGKAKSLQELNEEQWVEMSDDYRTGKNMPFQSLGTYYRPP；
S3 (184-284aa)：SEQ ID NO .68
PNWTWGPNFINPYQVTVFPHQILNARTSTSVDINVPYIGETPTQSSETQNSWTLLVMVLVPLDYKEGATTDPEITFSVRPTSPYFNGLRNRYTAGTDEEQ。
3.4 1B8单克隆抗体识别表位的保守性分析及空间结构特点分析
使用BioEdit软件比对30株SVA参考毒株的VP2氨基酸序列，分析上述抗原表位在不同毒株中的保守性。氨基酸比对结果（图6A）所示，不同的氨基酸用不同颜色进行标注,表明178LGTYYR183抗原表位在各毒株中均高度保守。利用PyMol软件展示VP2蛋白(PDB:3CJI)的空间构象，抗原表位的空间分布结果（图6B）表明178LGTYYR183抗原表位呈无规则卷曲状，并且部分裸露于VP2蛋白表面，是VP2“Puff”环突出部的重要位点，SVA衣壳表面的突出环结构涉及受体结合和细胞嗜性，在受体识别和免疫逃逸中发挥关键作用。综合以上结果，我们推测178LGTYYR183抗原表位很可能是VP2蛋白中重要的线性B细胞表位。
3.5 1B8单克隆抗体与SVA病毒粒子亲和力鉴定。
通过间接ELISA方法检测1B8和2E4单克隆抗体与SVA病毒粒子亲和力。用纯化后的SVA病毒粒子（最佳包被浓度1ug/mL）包被酶标板，在4℃条件下包被过夜。分别用小鼠阳性血清（1：10000稀释），SP2/0细胞培养上清为阴性对照，1B8和2E4杂交瘤细胞上清作为一抗，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤3次，加入1:10000倍稀释的HRP-SPA，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤5min，重复3次，每孔加入TMB底物液100μL，室温避光静置10min后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
结果：利用纯化的SVA病毒粒子作为包被抗原进行亲和力效价检测，同时以小鼠阴阳性血清作为对照，对比本实验获得（2E4单克隆抗体）的与文献报到一致的识别优势表位（150KSLQELN156）的单克隆抗体细胞上清，间接ELISA结果显示本株1B8单克隆抗体与SVA全病毒颗粒反应性良好且与其效价与识别表位150KSLQELN156 2E4单克隆抗体及阳性血清相当，表明1B8单克隆抗体与SVA具有较高的亲和力（图7A）。
3.6抗原表位抗原性鉴定
3.6.1为了比较1B8单克隆抗体表位基序178LGTYYR183与VP2蛋白的抗原性，分别用LGTYYR合成短肽、rVP2重组蛋白包被酶标板（最佳包被浓度均为1ug/ml），进行间接ELISA检测。用1B8单克隆抗体作为一抗，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤3次，加入1:10000倍稀释的HRP-SPA，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入TMB底物液100μL，室温避光静置10min后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
3.6.2为了分析1B8单克隆抗体表位基序178LGTYYR183作为检测抗原检测猪临床血清的效果，分别用LGTYYR合成短肽和纯化的SVA病毒粒子及rVP2重组蛋白（最佳包被浓度均为1ug/ml）包被酶标板，进行间接ELISA检测。分别用7份编号为101-107的临床阳性猪血清和1份SPF猪阴性血清（稀释倍数1:50）作为一抗，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤3次，加入1:10000倍稀释的HRP-SPA，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入TMB底物液100μL，室温避光静置10min后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
结果：合成1B8单克隆抗体识别最短的表位氨基酸LGTYYR多肽，将其作为检测抗原包被至酶标板，同时包被rVP2重组蛋白作为对照。用1B8单克隆抗体作为一抗，进行间接ELISA检测，从而对比最短表位与rVP2 重组蛋白的抗原性。结果显示（图7B）单一的表位多肽LGTYYR和rVP2 重组蛋白与1B8单克隆抗体均显示出强烈的阳性反应。进一步将LGTYYR多肽作为包被抗原检测7份不同的临床阳性猪血清，同时包被纯化的SVA病毒和全长rVP2重组蛋白进行对比，ELLISA检测结果（图7C）显示LGTYYR表位多肽、SVA病毒及rVP2重组蛋白均能够与7份阳性猪血清产生阳性反应，而与SPF阴性猪血清不反应。该结果说明，LGTYYR多肽与SVA病毒粒子和VP2蛋白具有相似的抗原性，能够用于临床猪血清样品中抗体的检测。
3.7抗原表位免疫原性鉴定
由于表位肽太短，无法引发足够的免疫反应，因此，为了鉴定1B8单克隆抗体表位基序178LGTYYR183的免疫原性，利用原核表达的自组纳米颗粒作为载体将表位氨基酸178LGTYYR183展示在纳米颗粒表面来增加其免疫原性。首先，将178LGTYYR183对应的核酸序列PCR扩增后利用同源重组酶连接目的基因连接至能够组装成纳米颗粒的pET28a-SpyCatcher-mi3表达载体上获得pET28a-SpyCatcher-LGTYYR (pET-28a-LGTYYR)载体。然后，将测序构建成功的表达载体转化至表达菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落进行转接，待菌液OD值达06-0.8时加入0.1nmol/L的IPTG于16℃、200r/min低温水平摇床中诱导蛋白表达并进行纯化。用免疫电镜对纯化后的纳米颗粒进行表征，并以50ug/只的纳米颗粒加等体积法国白油佐剂ISA201VG肌肉注射6周龄雌性BALB/c小鼠。经过3次免疫后，将小鼠安乐死后采血。通过IFA检测表达LGTYYR基序的纳米颗粒诱导小鼠产生针对SVA特异性抗体的免疫原性。
结果：融合表达LGTYYR表位至自组装的纳米颗粒表面，通过电镜对自组装纳米颗粒进行表征，结果表明（图7D）表明该纳米颗粒蛋白成功组装；取纯化后的纳米颗粒与佐剂等体积混合乳化后免疫小鼠，在第三免疫后1周采取小鼠血液，制备表位肽抗血清。通过SVA感染的BHK-21细胞进行IFA检测，结果表明（图7F）LGTYYR表位免疫的小鼠血清可以检测到SVA感染细胞，与rVP2重组蛋白免疫的阳性小鼠血清产生相当的荧光强度，而纳米颗粒空载体（阴性对照组）中检测不到荧光信号，说明LGTYYR表位可以特异性地诱导小鼠产生体液免疫反应。
以上结果证明LGTYYR表位具有与全长VP2蛋白和SVA天然病毒相当的抗原性及免疫原性，因此本表位有望成为作为表位疫苗或诊断工具的候选靶点。
4.抗原表位的保守性及空间结构特点分析
从GenBank上下载30株国内外SVA分离株结构蛋白VP2基因的氨基酸序列（表5），根据1B8单克隆抗体所识别的抗原表位，利用生物学软件BioEidt对其识别的相应区域进行氨基酸序列比对分析，利用PyMol软件展示VP2蛋白(PDB:3CJI)的空间构象，并对1B8单克隆抗体所识别抗原表位的空间分布进行分析。
表5 SVA参考毒株信息
SEQ ID NO .8：单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的氨基酸序列，
GYTFTNYV；
SEQ ID NO .9：CDR-H2的氨基酸序列
FSPYNDGT；
SEQ ID NO .10：CDR-H3的氨基酸序列
ARGAYHDNYAGVAN；
SEQ ID NO .11：单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的氨基酸序列
QDIKKY；
CDR-L2的氨基酸序列如
YTS；
SEQ ID NO .12：CDR-L3的氨基酸序列。
LQYGNLLFT；
SEQ ID NO .13：单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的核苷酸序列，
GGATACACATTCACTAACTATGTT；
SEQ ID NO .14：CDR-H2的核苷酸序列
TTTAGTCCTTACAATGATGGTACT；
SEQ ID NO .15：CDR-H3的核苷酸序列
GCAAGAGGGGCCTACCATGATAACTACGCGGGTGTGGCTAAC；
SEQ ID NO .16：单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的核苷酸序列
CAAGACATTAAGAAGTAT；
CDR-L2的核苷酸序列
TACACATCT；
SEQ ID NO .17：CDR-L3的核苷酸序列
CTACAGTATGGTAACCTTCTATTCACG；
SEQ ID NO .18：单克隆抗体识别的抗原表位氨基酸序列
LGTYYR；
SEQ ID NO .19：单克隆抗体识别的抗原表位核苷酸序列
CTTGGCACATACTATCGG。

Claims (10)

1.一株抗A型塞内卡病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR-L2的氨基酸序列为QDIKKY；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.编码权利要求2所述单克隆抗体的基因，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示；所示单克隆抗体的轻链可变区的编码基因序列如SEQ IDNO.6所示。
4.编码权利要求1所述的单克隆抗体的基因，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区CDR-H1的编码基因序列如SEQ ID NO.13所示，CDR-H2的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示；CDR-H3的编码基因序列如SEQ ID NO.15所示；
所述单克隆抗体的轻链可变区CDR-L1的编码基因序列如SEQ ID NO.16所示，CDR-L2的编码基因序列为TACACATCT；CDR-L3的编码基因序列如SEQ ID NO.17所示。
5.携带权利要求3或4所述的基因的重组载体或重组微生物细胞。
6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求5所述的重组载体或重组微生物细胞在制备检测A型塞内卡病毒的试剂或试剂盒中的应用。
7.一种权利要求1所述的单克隆抗体识别的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
8.编码权利要求7所述的抗原表位肽的基因。
9.含有权利要求8所述的基因的重组载体或重组微生物细胞。
10.权利要求7所述的抗原表位肽或权利要求9所述的重组载体或重组微生物细胞在制备抗A型塞内卡病毒的抗体或疫苗中的应用。
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