CN113512098B - 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用 - Google Patents

鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及鉴别猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)血清抗体间接ELISA方法及其应用。本申请基于CSFV E2和BVDV E2蛋白截短保守区域进行原核表达纯化，获得了高纯度的CSFV‑tE2和BVDV‑tE2蛋白，建立了血清学抗体ELISA检测方法。包被CSFV‑tE2蛋白，检测猪血清样本抗体的灵敏度和特异性分别为95.5％和90.9％；包被BVDV‑tE2蛋白，检测猪血清样本抗体的灵敏度和特异性分别为95.0％和96.0％；ELISA检测抗体滴度与病毒中和试验结果相符。上述结果表明，本发明建立的ELISA方法具有很高的灵敏度与特异性，可以用于猪血清样本的CSFV及BVDV抗体检测及鉴别诊断。

Description

鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用。
背景技术
猪瘟(classical swine fever,CSF)是一种猪的传染性发热性疾病，具有很高的致死率，给养猪业带来巨大的经济损失。猪瘟的病原体为猪瘟病毒(classical swinefever virus,CSFV)。同属的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)与其高度同源。BVDV也感染猪引起临床疾病。BVDV和CSFV抗体存在交叉反应，给猪瘟的诊断带来困难。E2蛋白是瘟病毒一种结构蛋白，为主要的抗原，可以诱导宿主产生病毒中和抗体，对疫苗研发和检测方法建立具有重要的作用。
接种疫苗依然是目前控制猪瘟的最主要的方法之一。因为无法区分接种疫苗的动物和感染CSFV野毒株的动物(DIVA)是有效防控和最终根除猪瘟的主要困难。由于DIVA检测的需要，一系列的标记疫苗和相关血清学检测技术得到了发展。目前上市的嵌合的标记疫苗CP7-E2alf也会诱导产生抗体的交叉反应。腺病毒/甲病毒复制载体疫苗和E2亚单位疫苗虽然具有避免抗体交叉反应的优势，但是它们的保护效果低于标记减毒活疫苗。研发新的标记疫苗需要有一种合适的DIVA检测方法，能够将接种疫苗的动物和感染野毒株的动物区分开，然而实施可靠的血清学DIVA检测仍然存在问题。基于Erns建立的ELISA方法可以用于标记疫苗的DIVA检测，但是依然会与BVDV Erns发生抗体的交叉反应；目前基于CSFV全长E2蛋白建立的ELISA方法也无法区分CSFV和BVDV血清抗体。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用，目的在于解决现有技术中的问题或至少解决现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种瘟病毒蛋白，所述瘟病毒蛋白为核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示序列编码的CSFV E2截短蛋白CSFV-tE2，和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列编码的BVDV E2截短蛋白BVDV-tE2。
本发明还提供了如上述的一种瘟病毒蛋白在制备抗猪瘟病毒和/或牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体试剂中的应用。
本发明还提供了如上述的一种瘟病毒蛋白在制备检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂或试剂盒中的应用，特别是猪血清、兔血清和小鼠血清抗体。
本发明还提供了一种检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂盒，包含如上述的瘟病毒蛋白。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测CSFV和/或BVDV抗体的ELISA检测方法，
S1：CSFV-tE2蛋白或BVDV-tE2蛋白于低温条件下包被；
S2：甩干包被液后，加入PBST洗板，之后加入封闭液封闭；
S3：去除封闭液，加入PBST洗板，加入待测样品，孵育；
S4：去除样品后，加入PBST洗板，之后加入酶标二抗，孵育；
S5：弃掉二抗，加入PBST洗板，加入TMB溶液，恒温箱遮光显色；
S6：加入H2SO4终止液，用酶标仪测量在波长450nm处的吸收值，即OD450nm值。
进一步地，蛋白包被浓度为2.5μg/mL-15μg/mL。
进一步地，待测样品为血清，稀释倍数为1：250-4000。
进一步地，酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗或兔抗猪酶标二抗。
本发明还提供了如上述的检测方法在非诊断目的的区分感染CSFV和BVDV的血清样品中的应用。
本发明还提供了如上述的检测方法在非诊断目的的区分接种用CSFV疫苗株的E2替换为BVDV的E2构建的重组嵌合疫苗株CSFV/BVDV-E2的动物和感染CSFV野毒株的动物血清样品中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、CSFV和BVDV的E2蛋白有约65％的氨基酸序列相同，是一种重要的抗原，能够诱导机体产生免疫反应以及抗体的交叉反应。目前，基于CSFV E2全部结构设计的ELSIA方法无法区分抗CSFV血清抗体和抗BVDV的血清抗体。
本申请中选择了CSFV E2第690～977位氨基酸区域以及BVDV E2第690～865位氨基酸区域，包含了各自保守的特异性抗原表位。选择大肠杆菌原核表达系统表达CSFV-tE2(690～977)和BVDV-tE2(690～865)两种目的蛋白。Western blot检测结果显示，CSFV-tE2(690～977)和BVDV-tE2(690～865)均正确表达。获得了高浓度、高纯度的两种蛋白并制备了抗CSFV-tE2和抗BVDV-tE2多克隆抗体。间接免疫荧光检测结果和Western blot结果均表明，制备的抗CSFV-tE2和抗BVDV-tE2多克隆抗体均具有良好的特异性。
Western blot结果证明了纯化的CSFV-tE2能与CSFV抗体特异性结合，可用作包被抗原来检测猪血清、兔血清和小鼠血清的CSFV特异性抗体；纯化的BVDV-tE2能与BVDV抗体特异性结合，可用作包被抗原来检测猪血清和小鼠血清的BVDV特异性抗体。
2、由于瘟病毒属的成员在基因组组成和抗原结构上具有很高的同源性，因此在检测CSFV和BVDV感染时，会发生血清交叉反应。检测病毒的金标准方法，如病毒分离，虽然可靠，但是耗时耗力，不适合筛选大量样本。目前可用的检测猪瘟的ELISA试剂盒大多基于CSFV E2全长设计的，会出现抗体的交叉反应，无法区分CSFV和BVDV的感染。
本申请中建立了一种新的ELISA方法，并对相关实验条件进行优化。本申请中获得了免疫后的小鼠血清以及从猪场采集的猪血清样本，确定了ELISA检测的Cut-off值。包被CSFV-tE2蛋白，ELISA检测小鼠血清的Cut-off值为0.124，其灵敏度和特异性均为100％；ELISA检测猪血清样本的Cut-off值为0.306，其灵敏度和特异性分别为95.5％和90.9％。包被BVDV-tE2蛋白，ELISA检测小鼠血清的Cut-off值为0.194，其灵敏度和特异性均为100％；ELISA检测猪血清样本的Cut-off值为0.298，其灵敏度和特异性分别为95.0％和96.0％。上述数据表明，基于CSFV-tE2和BVDV-tE2蛋白建立的ELISA方法都具有很高的灵敏度与特异性，可以用于小鼠血清和猪血清样本的CSFV及BVDV抗体检测及血清学鉴别诊断。
为了评估建立的ELISA方法的特异性以及分析CSFV-tE2和BVDV-tE2抗原与抗体的交叉反应，我们分别检测了CSFV和BVDV接种小鼠的血清抗体与重组抗原CSFV-tE2和BVDV-tE2的交叉反应，以及重组蛋白CSFV-tE2和BVDV-tE2免疫小鼠血清抗体与重组抗原CSFV-tE2和BVDV-tE2的交叉反应。检测结果表明，包被CSFV-tE2抗原，ELISA检测小鼠BVDV和BVDV-tE2血清抗体的OD450值均低于Cut-off值；包被BVDV-tE2抗原，ELISA检测小鼠CSFV和CSFV-tE2血清抗体的OD450值均低于Cut-off值。上述结果表明，基于CSFV-tE2和BVDV-tE2重组蛋白建立的ELISA方法能有效区分小鼠接种CSFV和BVDV诱导的血清抗体以及小鼠接种CSFV-tE2和BVDV-tE2诱导的血清抗体。通过比较血清抗体OD450与Cut-off值的大小，我们发现，基于BVDV-tE2重组蛋白建立的ELISA方法具有更高的特异性，能够更有效区分CSFV和BVDV接种/或感染动物的血清抗体。
本申请中基于CSFV-tE2和BVDV-tE2蛋白建立的ELISA方法检测猪血清样本的CSFV和BVDV抗体的特异性和灵敏度较高。该方法不仅可以检测猪血清中是否存在CSFV或BVDV抗体，还可以鉴定猪是否存在CSFV和BVDV同时感染的血清样本。我们的实验证明该方法可以区分CSFV和BVDV血清抗体，检测两种抗体无交叉反应，降低血清检测的假阳性以及交叉反应带来的干扰。这也为后续基于E2的标记疫苗发展和相关可靠的DIVA检测奠定了基础。
3、目前还没有研究报告以小鼠为实验动物来检测CSFV和BVDV的血清抗体，从而评估建立的ELISA方法。我们通过小鼠实验来评估建立的ELISA方法在血清诊断的应用，为后续的猪体实验以及猪血清样本检测提供了实验数据支持，从而提高了实验的成功率和检测的准确性。此外，也没有实验利用BVDV E2建立ELISA方法检测猪血清样本的BVDV感染。我们选取了BVDV E2蛋白的保守抗原区建立的ELISA方法能够有效鉴定猪血清样本中的BVDV感染，不仅能够检测感染BVDV猪血清样本，也为研发含有BVDV E2的标记疫苗提供了相应的准确的DIVA检测。
我们用病毒CSFV、BVDV以及嵌合病毒CSFV/BVDV-E2免疫小鼠获得了相应的特异性血清抗体。ELISA检测了以上三组小鼠血清抗体效价，均位于1:2000-1:10000之间。用纯化的CSFV-tE2和BVDV-tE2免疫小鼠，获得了相应的血清抗体。ELISA检测了以上两组小鼠血清抗体效价，位于1:4万-1:32万之间，纯化蛋白免疫小鼠血清抗体效价与病毒接种小鼠血清抗体效价相符。上述结果说明建立的ELISA方法可以检测动物血清病毒特异性IgG抗体效价。
为了评估ELISA方法在鉴别嵌合病毒CSFV/BVDV-E2潜在标记疫苗与CSFV野毒株感染中的应用价值，我们检测了小鼠CSFV/BVDV-E2血清抗体与抗原CSFV-tE2和BVDV-tE2的反应性。结果表明，小鼠CSFV/BVDV-E2血清抗体只能与抗原BVDV-tE2发生反应，不能与抗原CSFV-tE2发生反应。因此，我们可以利用基于BVDV-tE2建立的ELISA方法进行标记疫苗的DIVA检测，可以将接种嵌合病毒CSFV/BVDV-E2接种的动物和感染CSFV野毒株的动物区分开。
我们从猪场获得了180份血清，用ELISA方法检测猪血清样本，鉴定其感染CSFV和BVDV的情况。检测结果表明，猪血清样本中同时存在CSFV和BVDV抗体的比例占11.7％；CSFV抗体阳性同时BVDV抗体阴性样本占28.3％；CSFV抗体和BVDV抗体均为阴性的为60％；未检测到BVDV抗体阳性同时CSFV抗体阴性的样本。我们比较了猪血清样本的ELISA检测的抗体滴度与病毒中和试验(VNT)检测的中和抗体滴度，CSFV和BVDV阳性血清的ELISA效价均高于中和抗体效价，但两者存在良好的相关性。结果表明，基于CSFV-tE2和BVDV-tE2建立的ELISA方法具有较高的灵敏度，其检测的结果与VNT的结果高度一致。
上述结果表明，BVDV和CSFV在猪群中存在共感染，这会增加CSFV抗体检测的假阳性率，从而干扰了猪瘟的实验诊断。由于用BVDV E2替换猪瘟疫苗E2或在猪瘟疫苗中引入其它E2负选择标记是极具潜力发猪瘟标记疫苗。因此，本发明所建立的ELISA方法能够鉴定出CSFV和BVDV的感染，有助于含有BVDV E2标记疫苗的研发及应用。
附图说明
图1是PCR扩增CSFV-tE2目的片段M：DL5000 DNA marker；1：CSFV-tE2目的片段(877bp)；
图2是重组质粒pET28a-CSFV-tE2载体构建示意图；
图3是SDS-PAGE检测CSFV-tE2蛋白表达效果图；M：Protein marker 1：BL21/pET28a未诱导(对照)；2：BL21/pET28a诱导(对照)；3：BL21/CSFV-tE2未诱导全菌体；4：BL21/CSFV-tE2诱导全菌体；5：BL21/CSFV-tE2诱导上清；6：BL21/CSFV-tE2诱导沉淀；
图4是SDS-PAGE鉴定纯化的CSFV-tE2；M；Protein marker；1：结合后的上清；2-4：杂蛋白洗脱液；5-8：目的蛋白洗脱液；
图5是PCR扩增BVDV-tE2目的片段；
图6是重组质粒pET28a-BVDV-tE2载体构建示意图；
图7是单、双酶切鉴定重组质粒pET28a-BVDV-tE2，1、4：pET28a-BVDV-tE2重组质粒(5767bp)；2、5：pET28a-BVDV-tE2重组质粒单酶切(使用Xho I,5767bp)；3、6：pET28a-BVDV-tE2重组质粒双酶切(使用Nco I、Xho I，5231bp,536bp)M：1Kb DNA ladder(左)、D2000(右)DNA marker；
图8是SDS-PAGE检测BVDV-tE2蛋白表达；M：Protein marker；1：BL21/pET28a未诱导(对照)；2：BL21/pET28a诱导(对照)；3：BL21/BVDV-tE2未诱导全菌体；4：BL21/BVDV-tE2诱导全菌体；5：BL21/BVDV-tE2诱导上清；6：BL21/BVDV-tE2诱导沉淀；
图9是SDS-PAGE鉴定纯化的BVDV-tE2；M；Protein marker，1：结合后的上清；2、3、4：杂蛋白洗脱液；5、6、7、8：目的蛋白洗脱液；
图10是IFA鉴定兔血清BVDV-tE2多克隆抗体的特异性；(A)感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2多抗；(B)感染BVDV的MDBK细胞，一抗为兔阴性血清；(C)未感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2多抗；
图11是Western blot效果图；
(A)Western blot鉴定抗BVDV-tE2兔血清与纯化的BVDV-tE2特异性反应；M：Protein marker；1：诱导后的含pET-28a空载体的全菌体，孵育的一抗为抗BVDV-tE2兔血清；2：BVDV-tE2全菌体，孵育的一抗为抗BVDV-tE2兔血清；3：BVDV-tE2全菌体，孵育的一抗为兔阴性血清；
(B)Western blot鉴定兔抗BVDV-tE2血清与BVDV毒株特异性反应；1：未感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2兔多抗；2：感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2兔多抗；3：感染BVDV的MDBK细胞，一抗为阴性血清；
图12是Western blot效果图；
A，Western blot鉴定纯化的CSFV-tE2蛋白与猪血清CSFV抗体特异性反应；B，Western blot鉴定纯化的CSFV-tE2蛋白与小鼠血清CSFV抗体特异性反应；1：诱导后的含pET-28a空载体的全菌体；2：纯化的CSFV-tE2蛋白；
C，Western blot鉴定纯化的BVDV-tE2蛋白与猪血清BVDV抗体特异性反应；B，Western blot鉴定纯化的BVDV-tE2蛋白与小鼠血清BVDV抗体特异性反应；1：诱导后的含pET-28a空载体的全菌体；2：纯化的BVDV-tE2蛋白；
图13是ELISA检测小鼠血清CSFV特异性IgG抗体；
图14左图是ELISA检测猪血清样本感染CSFV；右图是ELISA检测猪血清样本感染BVDV；
图15是ELISA检测抗BVDV鼠血清；
图16是包被CSFV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV-tE2(n＝6)和BVDV-tE2(n＝6)特异性抗体的OD450值；
图17是包被BVDV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV-tE2(n＝6)和BVDV-tE2(n＝6)特异性抗体的OD450值；
图18是包被CSFV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV(n＝6)和BVDV(n＝6)特异性抗体的OD450值；
图19是包被BVDV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV(n＝6)和BVDV(n＝6)特异性抗体的OD450值；
图20是包被CSFV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV-tE2特异性抗体效价(A和B)，M表示小鼠，P/N表示待测血清与阴性血清的OD450nm比值，括号里的数值表示抗体效价；
图21是包被BVDV-tE2，ELISA检测小鼠血清BVDV-tE2特异性抗体效价(A和B)，M表示小鼠，P/N表示待测血清与阴性血清的OD450nm比值，括号里的数值表示抗体效价；
图22是包被CSFV-tE2，ELISA检测小鼠血清CSFV特异性抗体效价，M表示小鼠，P/N表示待测血清与阴性血清的OD450nm比值，括号里的数值表示抗体效价；
图23是包被BVDV-tE2，ELISA检测小鼠血清BVDV特异性抗体效价，M表示小鼠，P/N表示待测血清与阴性血清的OD450nm比值，括号里的数值表示抗体效价；
图24是包被CSFV-tE2，ELISA检测四份猪血清样本的CSFV抗体效价；N1表示CSFV阴性血清；P1、P2、P3表示三份CSFV阳性血清；括号的数字表示血清的中和抗体效价；
图25是包被BVDV-tE2，ELISA检测四份猪血清样本的BVDV抗体效价；N1表示BVDV阴性血清；P1、P2、P3表示三份BVDV阳性血清；括号的数字表示血清的中和抗体效价。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用。
本申请中涉及的质粒、菌株、细胞和病毒除特殊说明外，均能够从市场购买得到：猪肾细胞系PK15(porcine kidney 15cell line)、牛肾细胞MDBK(bovinekidney cell)均购于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC,Wuhan,China)。病毒BVDV-1NADL和CSFV石门株(CSFV-SM)由本实验室保存(来自CCTCC)。基因和相关引物的合成均来自上海生物工程有限公司。
本实验使用的新西兰大白兔为雌性，12周龄大，体重约2kg，购自并饲养在湖北省预防医学科学院食品药品安全评价中心。本实验使用的小鼠为雌性BALB/c小鼠，SPF级，6周龄大，购买于湖北省实验动物研究中心，在武汉大学生命科学学院动物实验中心饲养。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1CSFV E2蛋白保守抗原区表达纯化与多克隆抗体制备
1、pCSFV-tE2原核表达质粒的构建及鉴定
本申请根据解析的BVDV-E2晶体结构，预测CSFV-E2的空间三维结构，选择了第690～977位氨基酸区域，该区域共288个氨基酸，包括了BCDA四个抗原表位区，除去了疏水跨膜区，便于表达纯化。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列优化后通过人工合成插入到pUC质粒，得到pUC-CSFV-tE2重组质粒。
PCR扩增引物如下：
F-E2(288)：CACCATGGCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC(NcoI),SEQ ID NO.3；
R-E2(288)：GTCTCGAGAGGTCCTGCACTAGAGACAATC(XhoI),SEQ ID NO.4；
通过引物扩增，在序列的5'端引入了Nco I限制酶，在序列的3'端引入了Xho I限制酶。提取CSFV毒株基因组RNA，作为模板，使用上述特异性引物进行RT-PCR，得到CSFV-tE2目的DNA，全长877bp，如图1所示，条带大小符合预期。
反应体系如下(50μL)：ddH2O，33μL；10×KOD buffer，5μL；dNTP，5μL；Mg2+，3μL；模板DNA，1μL；KOD酶，1μL；Primer F(10μM)，1μL；Primer R(10μM)，1μL。
反应条件如下：
Figure BDA0003165227250000081
对扩增的CSFV-tE2目的片段胶回收。用Nco I和Xho I限制酶分别对回收的CSFV-tE2和pET-28a表达载体进行酶切连接，得到pET-28a-CSFV-tE2原核表达质粒。构建pET-28a-CSFV-tE2重组质粒部分示意图如图2所示。将质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，使用NcoI和XhoI限制酶进行双酶切鉴定，使用XhoI限制酶进行单酶切鉴定。双酶切后，载体片段大小为5231bp，目的片段大小为872bp；单酶切后，片段大小为6103bp，均符合预期。对酶切鉴定正确的pET-28a-CSFV-tE2质粒送公司测序，鉴定正确。
酶切体系(20μL)如下：
Figure BDA0003165227250000091
在37℃水浴中反应1小时，限制酶切割后的目的DNA片段和载体片段使用胶回收试剂盒进行回收。
使用T4 DNA连接酶将回收后的目的基因片段和载体片段连接，选择的摩尔比为载体片段:目的片段＝1:5。T4 DNA连接酶连接体系(10μL)如下：
Figure BDA0003165227250000092
在PCR仪中，设置22℃，反应1小时。
2、CSFV-tE2蛋白诱导表达及鉴定
选择测序正确的pET-28a-CSFV-tE2重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中。在37℃含有卡那霉素的LB培养基中震荡培养14h，当OD600nm值处于0.6～0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG，并将温度调节为25℃继续诱导培养约4h。参照本领域的常规方法，利用SDS-PAGE和Western blot分析诱导后的菌体上清和沉淀是否表达了CSFV-tE2。
使用网站https://web.expasy.org/compute_pi/对CSFV-tE2蛋白相对分子质量进行预测，大小约为31.4kDa。如图3所示，与对照组相比，pET-28a-CSFV-tE2成功诱导表达，大小在26kDa附近，几乎全部存在于裂解菌体的沉淀中，形成了包涵体。
pET-28a表达载体含有His标签，表达产生的CSFV-tE2在氨基酸C端会携带6个His氨基酸。可以通过抗His单抗来进行Western blot鉴定是否正确表达了目的蛋白。Westernblot呈现出的条带与SDS-PAGE的目的条带大小一致，说明CSFV-tE2蛋白正确表达。
3、CSFV-tE2蛋白纯化
取一个洗净的容积为3L的锥形瓶，加入1L含有卡那霉素的LB培养基，取上述鉴定正确表达的菌液，以1：100的比例接种，再加入终浓度为1mM的IPTG诱导，大量培养。诱导培养结束后，对菌液离心，弃上清，收集沉淀。用裂解缓冲液洗涤菌体沉淀2次，然后加入一定体积的裂解缓冲液，重悬沉淀，用50ml离心管分装，放置于-80℃冻存。
取一管冻存的菌液，使用Ni-His树脂亲和填料对CSFV-tE2蛋白纯化。将纯化后的洗脱液进行SDS-PAGE分析，如图4所示，泳道2、3、4洗脱下来的缓冲液中几乎没有目的蛋白条带，为杂蛋白；泳道5、6、7、8洗脱下来的缓冲液在26kDa位置有一条单一且含量高的条带，即为纯化的CSFV-tE2目的蛋白。
依据SDS-PAGE分析结果，收集含有CSFV-tE2目的蛋白的洗脱液，再进行透析复性。根据CSFV-tE2目的蛋白大小，选择规格为MW3500透析袋，处理后加入目的蛋白洗脱液，夹紧后，放入蛋白复性液，在4℃环境中缓慢搅拌透析。间隔四小时换一次复性液，梯度稀释，缓慢除掉蛋白液中的尿素。收集复性后的目的蛋白，取少量用于SDS-PAGE分析，结果显示，透析复性后的CSFV-tE2大小与菌体表达的CSFV-tE2大小相近，纯度也较高。
另取少量透析复性后的样品，稀释5倍后测定蛋白质浓度，制作标准曲线计算出CSFV-tE2目的蛋白浓度为1276μg/mL。
4、抗CSFV-tE2多克隆抗体制备及鉴定
取上述测定浓度的CSFV-tE2目的蛋白用来免疫新西兰大白兔。在免疫前，通过耳缘静脉采集新西兰大白兔血清，用作阴性对照。三次免疫后，对新西兰大白兔心脏取血，获得血清，然后通过耳缘静脉注射空气处死新西兰大白兔。
免疫方法：将新西兰大白兔分组，每组三只。本实验免疫注射的蛋白包括纯化的CSFV-E2，采用背部皮下多点注射，首次注射剂量为1mg/只，后期免疫注射剂量为0.5mg/只。本实验免疫注射的病毒包括纯化的CSFV、。通过耳缘静脉注射，注射的剂量为106TCID50/只。初次免疫时，将免疫蛋白与等体积的完全弗氏佐剂震荡混匀，直至出现油包水，即混合液在水面上不发生扩散，混合完全。两周后加强免疫，共免疫三次。后两次免疫，使用等体积的不完全弗氏佐剂与蛋白震荡混匀。
免疫期间检测时，从耳缘静脉处采集新西兰大白兔血样。免疫结束后，通过心脏取血采集新西兰大白兔血样。将采集的血样放入37℃恒温箱中静置一小时，然后放入4℃静置过夜。第二天，在4℃，5000rpm条件下离心20min，收集血清，分装后于-80℃保存。
我们用ELISA方法对获得的兔血清检测抗体效价。用浓缩纯化后的CSFV病毒包被酶标板，包被浓度为105TCID50/ml，检测兔血清CSFV-tE2抗体效价。结果显示，兔血清CSFV-tE2抗体效价为1:10000。
ELISA步骤如下：
①CSFV-tE2蛋白用包被液稀释至适宜浓度，按100μL/孔加入酶标板中，于4℃包被12～16h。
②甩干包被缓冲液，用排枪向每孔加入350μL PBST，摇晃洗板3次，每次用时2min；甩干，每孔加入350μL的3％的BSA封闭液，放入37℃恒温箱封闭1h。
③弃掉封闭液，PBST摇晃洗板3次，每孔加入100μL倍比稀释的待测血清，每个稀释度选用三个平行孔，于37℃孵育1h。
④弃掉待测血清，PBST摇晃洗板3次，加入100μL优化稀释倍数的HRP标记二抗，放入37℃恒温箱孵育1h。
⑤弃掉二抗，PBST摇晃洗板4-5次；将TMB底物溶液A和B等体积均匀混合，每孔加100μL混合液，在37℃恒温箱遮光显色15min。
⑥每孔加入100μL浓度为2M的H2SO4终止液，用酶标仪测量在波长450nm处的吸收值，即OD450nm值。
⑦当待测血清OD450nm/阴性血清OD450nm(P/N)＞2，作为判断阳性血清的标准，此时待测血清最大稀释倍数即为该血清的抗体效价。
用CSFV-tE2包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测兔血清CSFV-tE2抗体效价，结果显示，抗体效价可以达到1:800万。
用间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)来检测CSFV-tE2多克隆抗体的特异性。分别用制备的兔血清CSFV-tE2抗体和兔阴性血清作为一抗，按1:1000稀释，检测感染CSFV和未感染CSFV的PK15细胞。
间接免疫荧光实验步骤如下：
①吸出并弃掉培养基，用PBS洗涤待检测的细胞3次，加入-20℃冷冻的固定液，在-20℃低温下固定30min。
②用PBS洗涤细胞3次，弃掉洗涤液，加入质量体积分数为3％的BSA，37℃封闭60min。
③用PBS洗涤细胞3次，弃掉洗涤液，加入用1％BSA稀释的对应病毒的多克隆抗体，在37℃反应60min。
④用PBS洗涤细胞3次，弃掉洗涤液，避光加入按一定比例稀释的Alexa 488标记的羊抗兔二抗，在37℃反应60min。
⑤再次用PBS洗涤细胞3次，弃掉洗涤液，用荧光显微镜观察统计。
使用蛋白免疫印记(Western blot)鉴定兔抗CSFV-tE2血清与纯化的CSFV-tE2以及CSFV毒株特异性反应。分别用制备的兔血清CSFV-tE2抗体和兔阴性血清作为一抗(1:5000稀释)，HRP-羊抗兔抗体作为二抗(1:10000稀释)。
实验结果显示，兔血清CSFV-tE2多克隆抗体特异性较差。
实施例2BVDV E2蛋白保守抗原区表达纯化与多克隆抗体制备
1、pBVDV-tE2原核表达质粒的构建及鉴定
本申请本实施例中选择BVDV-E2蛋白的主要抗原区，位于第690～865位氨基酸。该区域主要包括BVDV-E2的B区、A区以及部分C区。本申请中还对该序列进行了优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
将优化的核苷酸序列送往上海生工合成，连接到pUC57载体上。然后以合成的BVDV-tE2片段为模板DNA，选用高保真KOD酶进行PCR扩增，PCR引物序列如下：
Figure BDA0003165227250000121
PCR体系及程序同实施例1。
如图5所示，扩增出的BVDV-tE2片段长度为536bp，其凝胶电泳的条带大小符合预期。
对扩增的BVDV-tE2目的片段胶回收。用Nco I和Xho I限制酶分别对回收的BVDV-tE2和pET-28a表达载体进行酶切连接，得到pET-28a-BVDV-tE2原核表达质粒。构建pET-28a-BVDV-tE2重组质粒部分示意图如图6所示。将质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，使用Nco I和Xho I限制酶进行双酶切鉴定，使用XhoI限制酶进行单酶切鉴定。如图7所示，双酶切后，载体片段大小为5231bp，目的片段大小为536bp；单酶切后，片段大小为5767bp，均符合预期。对酶切鉴定正确的pET-28a-BVDV-tE2质粒送公司测序，鉴定正确。
2、BVDV-tE2蛋白诱导表达及鉴定
选择测序正确的pET-28a-BVDV-tE2重组质粒，转化到大肠杆菌感受态细胞中。在37℃含有卡那霉素的LB培养基中震荡培养14h，当OD600nm值处于0.6～0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG，并将温度调节为25℃继续诱导培养约4h。SDS-PAGE和Western blot分析诱导后的菌体上清和沉淀。
我们使用网站https://web.expasy.org/compute_pi/对BVDV-tE2蛋白相对分子质量进行预测，大小约为21.2kDa。如图8所示，与对照组相比，pET-28a-BVDV-tE2成功诱导表达，大小在17～26kDa之间，与预测的大小接近。BVDV-tE2目的蛋白几乎全部存在于裂解菌体的沉淀中，形成了不溶的包涵体。
pET-28a表达载体含有His标签，表达产生的BVDV-tE2在氨基酸C端会携带6个His氨基酸。可以通过抗His单抗来进行Western blot鉴定是否正确表达了目的蛋白。结果显示Western blot呈现出的条带与SDS-PAGE的目的条带大小一致，说明BVDV-tE2蛋白正确表达，经过诱导后的表达量高于未诱导，且大部分蛋白存在沉淀中。
3、BVDV-tE2蛋白纯化
取一个洗净的容积为3L的锥形瓶，加入1L含有卡那霉素的LB培养基，取上述鉴定正确表达的菌液，以1：100的比例接种，再加入终浓度为1mM的IPTG诱导，大量培养。诱导条件同BVDV-tE2小量诱导表达的条件。诱导培养结束后，对菌液离心，弃上清，收集沉淀。用裂解缓冲液洗涤菌体沉淀2次，然后加入一定体积的裂解缓冲液，重悬沉淀，用50ml离心管分装，放置于-80℃冻存。
取一管冻存的菌液，使用Ni-His树脂亲和填料对BVDV-tE2蛋白纯化。将纯化后的洗脱液进行SDS-PAGE分析，如图9所示，泳道2、3、4洗脱下来的缓冲液中几乎没有目的蛋白条带，为杂蛋白；泳道5、6、7、8洗脱下来的缓冲液在17～26kDa之间有一条单一且含量高的条带，即为纯化的BVDV-tE2目的蛋白。
依据SDS-PAGE分析结果，收集含有BVDV-tE2目的蛋白的洗脱液，再进行透析复性。根据BVDV-tE2目的蛋白大小，选择规格为MW3500透析袋，处理后加入目的蛋白洗脱液，夹紧后，放入蛋白复性液，在4℃环境中缓慢搅拌透析。间隔四小时换一次复性液，梯度稀释，缓慢除掉蛋白也中的尿素。收集复性后的目的蛋白，取少量用于SDS-PAGE分析，结果显示，透析复性后的BVDV-tE2大小与菌体表达的BVDV-tE2大小相近，纯度也较高。
另取少量样品，测定蛋白质浓度，制作标准曲线计算出BVDV-tE2目的蛋白浓度为200.9μg/mL。
4、抗BVDV-tE2多克隆抗体制备及鉴定
取上述测定浓度的BVDV-tE2目的蛋白分别用来免疫新西兰大白兔，免疫方法同实施例1。在免疫前，通过耳缘静脉采集新西兰大白兔血清，用作阴性对照。三次免疫后，对新西兰大白兔心脏取血，获得血清，然后通过耳缘静脉注射空气处死新西兰大白兔。
用ELISA方法对获得的抗BVDV-tE2兔血清进行检测抗体效价，方法同实施例1。用浓缩纯化后的BVDV病毒包被酶标板，包被浓度为105TCID50/ml，检测兔血清BVDV-tE2特异性抗体效价。结果显示，其效价为1:2000。用纯化的BVDV-tE2蛋白包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测兔血清BVDV-tE2特异性抗体效价，结果显示，其效价为1:10万。
用间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Westernblot来检测抗BVDV-tE2多克隆抗体的特异性。间接免疫荧光法同实施例1。分别用制备的抗BVDV-tE2兔血清和兔阴性血清作为一抗，按1:1000稀释，检测感染BVDV和未感染BVDV的MDBK细胞，结果如图10所示，其中，(A)感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2多抗；(B)感染BVDV的MDBK细胞，一抗为兔阴性血清；(C)未感染BVDV的MDBK细胞，一抗为抗BVDV-tE2多抗。只有(A)有荧光产生，说明纯化的BVDV-tE2蛋白免疫新西兰大白兔获得的血清抗体是抗BVDV-tE2蛋白的特异性多克隆抗体。
使用蛋白免疫印记(Western blot)鉴定兔抗BVDV-tE2多克隆抗体与纯化的BVDV-tE2蛋白以及BVDV毒株特异性反应。分别用制备的抗BVDV-tE2兔血清和兔阴性血清作为一抗，按1:1000稀释，HRP-羊抗兔抗体作为二抗(1:10000稀释)，Western blot结果如图11所示，兔血清BVDV-tE2抗体能够与纯化的BVDV-tE2蛋白(约21.2kDa)(图11A)以及BVDV病毒的E2蛋白(约53kDa)(图11B)结合，目的条带大小正确，说明制备的抗BVDV-tE2多克隆抗体具有良好的抗原特异性。
图12是纯化的目标蛋白CSFV-tE2蛋白、BVDV-tE2蛋白与猪血清抗体特异性反应、小鼠血清抗体特异性反应的Western blot效果图。
实施例3CSFV血清特异性抗体ELISA方法的建立
1、ELISA检测参数的优化
为了建立有效的ELISA检测方法，需要优化抗原包被浓度以及不同的检测参数。我们采用棋盘滴定法对抗原包被浓度、一抗血清稀释倍数以及酶标二抗稀释倍数进行优化。将CSFV-tE2蛋白包被ELISA板，选择以下几个浓度梯度包被：2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL。将ELISA板密封，置于4℃包被16h。选择1:250、1:500、1:1000、1:2000稀释倍数稀释抗CSFV鼠血清和阴性血清。选择1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释倍数稀释猪血清临床样本。在37℃孵育1h。羊抗鼠酶标二抗按1:2500、1:5000、1:10000稀释倍数稀释，兔抗猪酶标二抗按1:10000、1:20000、1:30000、1:40000稀释倍数稀释，在37℃孵育1h。通过比较阳性血清OD450值(P)与阴性血清OD450值(N)的比值(P/N)以及不同包被浓度的OD450值变化来确定最佳检测参数。
1)ELISA检测抗CSFV鼠血清
结果显示，ELISA检测小鼠血清的优化参数为：包被CSFV-tE2最佳浓度为10μg/mL，抗CSFV鼠血清最佳稀释倍数为1:500，羊抗鼠酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000。
2)ELISA检测猪血清样本
结果显示，ELISA检测猪血清样本的优化参数为：包被CSFV-tE2最佳浓度为7.5μg/mL，猪血清样本最佳稀释倍数为1:400，兔抗猪酶标二抗最佳稀释倍数为1:20000。
2、确定ELISA检测的Cut-off值
1)抗CSFV鼠血清ELISA检测的Cut-off值确定
为了确定ELISA方法检测的Cut-off值，我们选择6份小鼠阳性血清(CSFV)和6份小鼠阴性血清(PBS)，用建立的ELISA方法检测OD450值，检测重复三次。然后利用SPSS软件对数据进行受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic,ROC)分析，计算出Cut-off值，结果如图13所示，包被CSFV-tE2蛋白，ELISA检测抗CSFV鼠血清的Cut-off值为0.124。
2)猪血清样本ELISA检测CSFV感染的Cut-off值确定
为了确定ELISA方法检测猪血清样本感染CSFV的Cut-off值，我们先通过病毒中和测试确定了22份猪阳性血清(CSFV)和11份猪阴性血清。然后用建立的ELISA方法检测上述猪血清样本的OD450值，检测重复三次。然后利用SPSS软件对数据进行受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic,ROC)分析，计算出Cut-off值，结果如图14所示，包被CSFV-tE2蛋白，ELISA检测猪血清样本感染CSFV的Cut-off值设定为0.306，此时ELISA检测的灵敏度为95.5％，特异性为90.9％，ROC曲线面积(AUC)为0.979。
实施例4BVDV血清特异性抗体ELISA方法的建立
1、ELISA检测参数的优化
为了建立有效的ELISA检测方法，需要优化抗原包被浓度以及不同的检测参数。我们采用棋盘滴定法对抗原包被浓度、一抗血清稀释倍数以及酶标二抗稀释倍数进行优化。将BVDV-tE2蛋白包被ELISA板，选择以下几个浓度梯度包被：2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL。将ELISA板密封，置于4℃包被16h。选择1:250、1:500、1:1000、1:2000稀释倍数稀释抗BVDV鼠血清和阴性血清。选择1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释倍数稀释猪血清临床样本。在37℃孵育1h。羊抗鼠酶标二抗按1:2500、1:5000、1:10000稀释倍数稀释，兔抗猪酶标二抗按1:10000、1:20000、1:30000、1:40000稀释倍数稀释，在37℃孵育1h。通过比较阳性血清OD450值(P)与阴性血清OD450值(N)的比值(P/N)以及不同包被浓度的OD450值变化来确定最佳检测参数。
1)ELISA检测鼠抗BVDV血清
结果显示，ELISA检测小鼠血清的优化参数为：包被BVDV-tE2最佳浓度为10μg/mL。由于250倍和500倍血清稀释倍数对应的P/N值差别不大，且250倍稀释倍数的阴性血清OD450值较高，所以选择500倍为一抗血清的最佳稀释倍数。羊抗鼠酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000。
2)ELISA检测猪血清样本
结果显示，ELISA检测猪血清样本的优化参数为：包被BVDV-tE2最佳浓度为7.5μg/mL，猪血清样本最佳稀释倍数为1:400，兔抗猪酶标二抗最佳稀释倍数为1:20000。
2、确定ELISA检测的Cut-off值
1)抗BVDV鼠血清ELISA检测的Cut-off值确定
为了确定ELISA方法检测的Cut-off值，我们选择6份小鼠阳性血清(BVDV)和6份小鼠阴性血清(PBS)，用建立的ELISA方法检测OD450值，检测重复三次。然后利用SPSS软件对数据进行受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic,ROC)分析，计算出Cut-off值，结果如图15所示，包被BVDV-tE2蛋白，ELISA检测抗BVDV鼠血清的Cut-off值为0.194。
2)猪血清样本ELISA检测BVDV感染的Cut-off值确定
为了确定ELISA方法检测猪血清样本感染BVDV的Cut-off值，我们先通过病毒中和测试确定了20份猪阳性血清(BVDV)和25份猪阴性血清。然后用建立的ELISA方法检测上述猪血清样本的OD450值，检测重复三次。然后利用SPSS软件对数据进行受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic,ROC)分析，计算出Cut-off值，结果如图14所示，包被BVDV-tE2蛋白，ELISA检测猪血清样本感染BVDV的Cut-off值为0.298，此时ELISA检测的灵敏度为95.0％，特异性为96.0％，ROC曲线的面积为0.965。
实施例5ELISA方法的特异性评价
1、重组CSFV-tE2和BVDV-tE2免疫血清与重组抗原的交叉反应性
我们用纯化的CSFV-tE2和BVDV-tE2分别免疫小鼠，免疫方法同前，分别获得了抗CSFV-tE2鼠血清和抗BVDV-tE2鼠血清。
为了评估基于CSFV-tE2蛋白和BVDV-tE2蛋白建立的ELISA方法的特异性，根据实施例3和4中确定的优化条件，包被纯化的CSFV-tE2蛋白和BVDV-tE2蛋白，包被浓度为10μg/mL，一抗血清按1:40000稀释，酶标二抗按1:5000稀释，ELISA检测两种血清的OD450值。
包被CSFV-tE2蛋白的ELISA检测结果如图16所示。免疫BVDV-tE2蛋白的六只小鼠的OD450值均低于cut-off值，说明CSFV-tE2蛋白不与抗BVDV-tE2小鼠血清发生交叉反应，通过包被CSFV-tE2蛋白建立的ELISA方法可以有效鉴定小鼠CSFV-tE2血清抗体和小鼠BVDV-tE2血清抗体。
包被BVDV-tE2蛋白的ELISA检测结果如图17所示。免疫CSFV-tE2蛋白的六只小鼠的OD450值均低于cut-off值，说明BVDV-tE2蛋白不与抗CSFV-tE2小鼠血清发生交叉反应，通过包被BVDV-tE2蛋白建立的ELISA方法可以有效鉴定小鼠CSFV-tE2血清抗体和小鼠BVDV-tE2血清抗体。
2、CSFV和BVDV免疫血清与重组抗原的交叉反应性
我们用纯化的CSFV和BVDV病毒分别免疫小鼠，每组六只。分别获得了抗CSFV和BVDV鼠血清。用建立的ELISA方法来检测抗CSFV鼠血清是否与BVDV-tE2重组抗原发生交叉反应以及抗BVDV鼠血清是否与CSFV-tE2发生交叉反应。
小鼠免疫方法：将BALB/c小鼠分组，每组6只。蛋白免疫采用腹腔注射。本实验免疫注射的蛋白包括纯化的CSFV-tE2和BVDV-tE2，注射的剂量为60μg/只。病毒免疫采用肌肉注射。本实验免疫注射的病毒包括纯化的CSFV、BVDV。注射的剂量为105TCID50/只。初次免疫时，将免疫蛋白与等体积的完全弗氏佐剂震荡混匀，直至出现油包水，即混合液在水面上不发生扩散，混合完全。每只小鼠注射体积不超过200μL。两周后加强免疫，共免疫三次。后两次免疫，使用等体积的不完全弗氏佐剂与蛋白震荡混匀。第三次免疫结束后的一周采血。
免疫期间检测时，采用断尾法采集BALB/c小鼠血样。免疫结束后，通过眼眶取血采集BALB/c小鼠血样。将采集的血样放入37℃恒温箱中静置一小时，然后放入4℃静置过夜。第二天，在4℃，5000rpm条件下离心20min，收集血清，分装后于-80℃保存。
根据实施例3和4中确定的优化条件，包被纯化的CSFV-tE2蛋白和BVDV-tE2蛋白，包被浓度为10μg/mL，一抗血清按1:1000稀释，酶标二抗按1:5000稀释，ELISA检测两种血清的OD450值。
包被CSFV-tE2蛋白的ELISA检测结果如图18所示。ELISA检测六只小鼠的BVDV抗体OD450值均低于cut-off值，说明CSFV-tE2蛋白不与抗BVDV小鼠血清发生交叉反应，通过包被CSFV-tE2蛋白建立的ELISA方法可以有效鉴定小鼠CSFV血清抗体和小鼠BVDV血清抗体。
包被BVDV-tE2蛋白的ELISA结果如图19所示。ELISA检测六只小鼠的CSFV抗体OD450值均低于cut-off值，说明BVDV-tE2蛋白不与抗CSFV鼠血清发生交叉反应，通过包被BVDV-tE2蛋白建立的ELISA方法可以有效鉴定小鼠CSFV血清抗体和小鼠BVDV血清抗体。
实施例6ELISA方法在区分检测小鼠免疫血清中CSFV和BVDV抗体的应用
1、重组CSFV-tE2和BVDV-tE2蛋白免疫小鼠血清抗体ELISA检测与效价
我们用纯化的重组CSFV-tE2和BVDV-tE2蛋白分别免疫小鼠，获得了对应的血清抗体，然后通过实施例3和4中建立的ELISA方法来检测小鼠血清抗体效价。
用CSFV-tE2蛋白包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测小鼠血清CSFV-tE2抗体效价，。结果如图20所示，六只小鼠的血清CSFV-tE2抗体效价在1:8万至1:20万之间。3、4、6号小鼠血清抗体效价为1:8万，2号小鼠血清抗体效价为1:10万，1、5号小鼠血清抗体效价为1:20万。
用BVDV-tE2蛋白包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测小鼠血清BVDV-tE2抗体效价。结果图21所示，六只小鼠的血清BVDV-tE2抗体效价在1:4万至1:32万之间。3、4、5号小鼠血清抗体效价为1:8万，1号小鼠血清抗体效价为1:16万，2号小鼠血清抗体效价为1:32万，6号小鼠血清抗体效价为1:4万。
2、CSFV和BVDV病毒粒子免疫小鼠血清抗体ELISA检测与效价
我们用纯化的CSFV和BVDV病毒粒子分别免疫小鼠，获得了对应的血清抗体，然后通过建立的ELISA方法来检测小鼠血清抗体效价。
用CSFV-tE2蛋白包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测小鼠血清CSFV抗体效价，。结果如图22所示，六只小鼠的血清抗体效价在1:2000至1:8000之间。1、2、3、4号小鼠血清抗体效价为1:2000，5号小鼠血清抗体效价为1:8000，6号小鼠血清抗体效价为1:4000。
用BVDV-tE2蛋白包被酶标板，包被浓度为10μg/mL，检测小鼠血清BVDV抗体效价。结果如图23所示，六只小鼠的血清抗体效价在1:4000至1:8000之间。1、3、4、5、6号小鼠血清抗体效价为1:4000，2号小鼠血清抗体效价为1:8000。
实施例7ELISA方法在区分检测临床猪血清样本CSFV和BVDV抗体的应用
1、我们从猪场获得了180份猪血清样本，用建立的ELISA方法来检测血清样本中CSFV和BVDV抗体OD450值，根据确定的Cut-off值来鉴定猪群感染CSFV和BVDV情况。分别包被的CSFV-tE2和BVDV-tE2蛋白，对180份猪血清样本进行ELISA检测。根据ELISA检测的CSFV和BVDV抗体OD450值，将180份猪血清样本分为四类：CSFV阳性，BVDV阳性；CSFV阳性，BVDV阴性；CSFV阴性，BVDV阴性；CSFV阴性，BVDV阳性。统计分析如下表所示，有21份猪血清样本为CSFV、BVDV双阳性，占11.7％(21/180)；有108份猪血清样本为CSFV、BVDV双阴性，占60％(108/180)；有51份猪血清样本为CSFV阳性、BVDV阴性，占28.3％(51/180)；未检测到CSFV阴性、BVDV阳性的猪血清样本。统计一种病毒的感染率：CSFV的感染率为40％(72/180)，BVDV的感染率为11.7％(21/180)。上述结果说明，在自然养殖的猪场中，CSFV和BVDV在猪群的感染率都很高。猪群在感染CSFV的同时会伴随着BVDV的感染，这类感染在感染CSFV的猪群中占了41.2％(21/51)，给猪瘟的检测带来了干扰。
表5.1猪血清样本感染CSFV和BVDV统计
Figure BDA0003165227250000191
2、猪血清样本抗体ELISA效价与病毒中和效价一致性评价
我们通过病毒中和测试(VNT)来检测猪血清的CSFV和BVDV中和抗体滴度(NAb)。根据世界动物健康组织报告，VNT是检测猪瘟病毒抗体最灵敏、最可靠的方法，是用于动物个体或群体血清学检测的首选方法。我们用VNT来确定猪血清样本中CSFV抗体阳性和阴性以及BVDV抗体阳性和阴性。将ELISA检测的结果与VNT检测的结果作比较，可以评估建立的ELISA方法在临床应用的价值。
为了评估ELISA检测方法的灵敏度，我们选取了三份CSFV阳性血清、三份BVDV阳性血清以及一份CSFV阴性、一份BVDV阴性血清，检测了这些血清的ELISA抗体效价和NAb效价。结果图24和25所示，阳性血清的ELISA效价均高于NAb效价，但是ELISA抗体效价与NAb效价并无线性关系。结果表明，基于CSFV-tE2和BVDV-tE2建立的ELISA方法具有较高的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 864
<212> DNA
<213> 猪瘟病毒(classical swine fever virus)
<400> 1
cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcaatatcat caaccaatga gatagggcta 60
ctcggggccg gaggtctcac taccacctgg aaagaataca gccacgattt gcagctgaat 120
gacgggaccg ttaaggccat ttgcgtggca ggttccttta aagtcacagc acttaatgtg 180
gtcagtagga ggtatttggc atcattgcat aagggggctt tactcacttc cgtgacattc 240
gagctcctgt tcgacgggac caacccatca accgaagaaa tgggagatga cttcgggttc 300
gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gtcaagggaa agtacaatac aaccttgttg 360
aacggtagtg ctttctacct tgtctgccca atagggtgga cgggtgttat agagtgcaca 420
gcagtgagcc caacaactct gagaacagaa gtggtaaaga ccttcaggag agagaagcct 480
tttccacaca gaatggattg tgtgaccacc acagtggaaa atgaagatct attctactgt 540
aagttggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggtgaaccag tggtctacac aggggggcaa 600
gtaaaacaat gcaaatggtg tggcttcgac ttcaacgagc ctgacggact cccacactac 660
cccataggta agtgcatttt ggcaaatgag acaggttaca gaatagtaga ttcaacggac 720
tgtaacagag atggcgttgt aatcagcgca gaggggagtc atgagtgctt gatcggcaac 780
acaactgtca aggtgcatgc atcagatgag agactgggcc ctatgccatg cagacctaaa 840
gagattgtct ctagtgcagg acct 864
<210> 2
<211> 528
<212> DNA
<213> 牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus)
<400> 2
cacctggatt gcaaaccgga attctcttat gcaatcgcga aagatgaacg tatcggtcag 60
ctgggtgcgg aaggcctgac caccacctgg aaagaatact ctccgggtat gaaactggaa 120
gatactatgg tgatcgcatg gtgcgaagat ggtaaactga tgtatctgca gcgttgtacc 180
cgcgaaaccc gttacctggc gatcctgcac acccgtgctc tgccgacttc tgttgttttc 240
aaaaaactgt tcgatggtcg taaacaggaa gatgttgttg aaatgaacga taacttcgaa 300
tttggtctgt gtccgtgtga tgctaaaccg atcgttcgtg gcaaattcaa caccaccctg 360
ctgaacggtc cggctttcca gatggtttgc ccgatcggtt ggactggtac tgtttcttgt 420
acctctttca acatggatac cctggcgact accgttgttc gtacctaccg tcgttctaaa 480
ccgttcccgc accgtcaggg ttgcatcacc cagaaaaacc tgggtgaa 528
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccatggcc cggctagcct gcaaggaaga ttac 34
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtctcgagag gtcctgcact agagacaatc 30
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccatggca cacctggatt gcaaaccgga attc 34
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctcgagtt cacccaggtt tttctgggtg atg 33

Claims (9)

1.一种瘟病毒蛋白，其特征在于：所述瘟病毒蛋白为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的BVDV E2截短蛋白BVDV-tE2编码序列。
2.如权利要求1所述的一种瘟病毒蛋白在制备牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体试剂中的应用。
3.如权利要求1所述的一种瘟病毒蛋白在制备检测BVDV抗体的试剂或试剂盒中的应用。
4.一种检测BVDV抗体的试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1中所述的瘟病毒蛋白。
5.一种非诊断目的的检测如权利要求1所述瘟病毒蛋白中BVDV抗体的ELISA检测方法，其特征在于：
S1： BVDV-tE2蛋白于低温条件下包被；
S2：甩干包被液后，加入PBST洗板，之后加入封闭液封闭；
S3：去除封闭液，加入PBST洗板，加入待测样品，孵育；
S4：去除样品后，加入PBST洗板，之后加入酶标二抗，孵育；
S5：弃掉二抗，加入PBST洗板，加入TMB溶液，恒温箱遮光显色；
S6：加入H2SO4终止液，用酶标仪测量在波长450nm处的吸收值，即OD450nm值。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的检测BVDV抗体的ELISA检测方法，其特征在于：蛋白包被浓度为2.5 μg/mL-15 μg/mL。
7.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的检测BVDV抗体的ELISA检测方法，其特征在于：待测样品为血清，稀释倍数为1：250-4000。
8.如权利要求5-7任一所述的检测方法在非诊断目的的区分感染CSFV和BVDV的血清样品中的应用。
9.如权利要求5-7任一所述的检测方法在非诊断目的的区分感染重组嵌合病毒CSFV/BVDV-E2和感染CSFV野毒株的样品中的应用。
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