CN112522210B - 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用 - Google Patents

一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112522210B
CN112522210B CN202011516349.2A CN202011516349A CN112522210B CN 112522210 B CN112522210 B CN 112522210B CN 202011516349 A CN202011516349 A CN 202011516349A CN 112522210 B CN112522210 B CN 112522210B
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
pprv
hybridoma cell
peste des
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011516349.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112522210A (zh
Inventor
毛立
刘茂军
李文良
张纹纹
李基棕
杨蕾蕾
孙敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202011516349.2A priority Critical patent/CN112522210B/zh
Publication of CN112522210A publication Critical patent/CN112522210A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112522210B publication Critical patent/CN112522210B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用，所述的杂交瘤细胞株为4B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020266。本发明所提供的单克隆抗体可用于检测PPRV，特异性强，不与羊疱疹病毒1型、山羊副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型等常见羊病毒发生反应。且本发明的提出为建立一种快速、简易、准确的检测方法，以及在免疫机制研究、免疫功能研究、检测方法建立等方面提供技术手段，对PPRV的防控及实验室研究都具有重要意义。

Description

一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其 单抗与应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus，PPRV)引起的一种高度接触性病毒性传染病，主要感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等小反刍动物，其中山羊高度易感，发病率高达100％，严重暴发时致死率为100％，为养殖业造成严重的经济损失。PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属，根据N基因和F基因可分为4个谱系，但只有一个血清型。
PPR为一种重大跨国动物疫病，自1940年发现以来，先后在大多数非洲国家、阿拉伯半岛、以色列、叙利亚、伊拉克、约旦和土耳其等中东地区、以及南亚的印度半岛流行。2003年以来，我国周边的老挝、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和缅甸等国爆发大规模PPR疫情。目前国内已发生两次流行，第一次流行于2007年发生在西藏阿里地区，经流行病学和血清学方法分析，感染可追溯到2005年11月到2006年3月，由于当地兽医人员及牧民不认识该病，PPR可能在西藏地区存在了数年，而且该病与其它呼吸道传染病混合感染使得PPR更难鉴别。经进化分析，西藏地区流行毒株属于Ⅳ系，与印度2005年流行毒株及塔吉克斯坦2004年流行毒株的亲缘关系极近。由于该地区不控制小反刍动物在我国和PPR疫情爆发国家之间的交易，通过购入PPR患病动物传播到我国成为最可能的途径。第二次PPR疫情为一次全国范围内的流行，2013年11月5日，新疆霍城地区首次报道爆发PPR，随后甘肃、内蒙古、宁夏、山东、江西、湖南、江苏等地区相继报道爆发PPR。目前已经证实了国内目前存在的毒株主要都是Ⅳ系，虽然PPRV疫苗毒株属于Ⅱ系，但是该疫苗毒株免疫保护效果良好，通过制定合理的防疫措施，该病有望从国内清除。
建立快速、有效、高通量的PPRV检测方法，能够为消灭小反刍兽疫提供技术支撑。此前对PPRV病原的检测多用常规RT-PCR和qRT-PCR检测方法，需要进行病毒RNA提取等操作，操作繁杂、耗时长、成本较高，且不能高通量检测。单克隆抗体在动物病毒的诊断和防治中起重要作用。利用单克隆抗体建立的检测病原的双抗体夹心ELISA检测方法或间接免疫荧光方法，都在病原的临床监测和实验室检测中发挥着重要作用。目前国内尚无针对PPRV病原N蛋白的高通量检测方法，因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好的有效检测手段对大量样品进行PPRV病原检测。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述杂交瘤细胞株分泌的单抗及其制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述单抗的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种分泌抗小反刍兽疫病毒(PPRV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中，所述的杂交瘤细胞株为4B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020266，保藏日期为2020年12月14日，保藏地址为武汉大学。
其中，所述分泌PPRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的抗原为重组表达的PPRVNigeria 75/1株N蛋白。
在一些实施方式中，所述重组表达的PPRV Nigeria 75/1株N蛋白的制备方法是在大肠杆菌表达系统表达PPRV Nigeria 75/1株N蛋白，纯化。
在一些实施方式中，所述重组表达的PPRV Nigeria 75/1株N蛋白的制备方法包括如下步骤：
(i)以PPRV Nigeria 75/1提取的RNA为模板，进行PCR扩增；
(ii)将步骤(i)扩增所得基因克隆到表达载体中，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，培养，得到重组质粒pET30a-N；
(iii)将步骤(ii)所得到重组质粒pET30a-N转化大肠杆菌感受态细胞中，培养、超声破碎并纯化，即得。
步骤(i)中，所述PCR扩增的上下游引物，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。
步骤(ii)中，所述的大肠杆菌感受态细胞为E.coli DH5α感受态细胞。
步骤(iii)中，所述的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
进一步地，本发明还提供了上述分泌PPRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，即将小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾脏细胞融合得到。
在一些实施方式中，所述的小鼠脾脏细胞为免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞。
在一些实施方式中，所述的免疫Balb/c小鼠是将重组PPRV-N蛋白皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠后得到的。
在一些实施方式中，所述的免疫分3次进行。
在一些实施方式中，每次免疫间隔2周。
在一些实施方式中，首免使用纯化的重组PPRV-N蛋白与等量完全弗氏佐剂免疫。
在一些实施方式中，第二次免疫使用纯化的重组PPRV-N蛋白与等量的不完全弗氏佐剂混合免疫。
在一些实施方式中，第三次免疫使用纯化的重组PPRV-N蛋白与等量的不完全弗氏佐剂混合免疫。
在一些实施方式中，第三次免疫2周后采血，检测小鼠的免疫血清效价。
在一些实施方式中，在三次免疫后，用纯化的重组PPRV-N蛋白腹腔注射加强免疫一次。
在一些实施方式中，在三次免疫后，细胞融合前4天用纯化的重组PPRV-N蛋白腹腔注射免疫小鼠，加强免疫一次。
在一些实施方式中，所述的细胞融合为采用PEG细胞融合的方法。
在一些实施方式中，所述PEG为PEG2000。
在一些实施方式中，所述的鼠骨髓瘤细胞为鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)。
在一些实施方式中，小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾脏细胞的用量比(细胞数量比)为1：3-1：5。
在一些实施方式中，细胞融合包括将小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞充分混匀。
在一些实施方式中，细胞融合包括将小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1：3-1：5的比例(细胞数量比)充分混匀。
在一些实施方式中，在小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞混匀后进行离心。
在一些实施方式中，在小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞混匀后，以2000rpm的转速进行离心。
在一些实施方式中，在小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞混匀后，在2000rpm，25℃的条件下进行离心。
在一些实施方式中，在小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞混匀后，在2000rpm，25℃的条件下进行离心5min。
在一些实施方式中，加入PEG前，离心后的小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞用无血清RPMI-1640培养基重悬。
在一些实施方式中，加入PEG前，离心后的小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞用无血清RPMI-1640培养基重悬，离心，弃上清。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要在水浴中预热。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要在37℃水浴中预热。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要边加边振荡。
在一些实施方式中，在加入PEG后，继续二次加入无血清RPMI-1640培养基。
在一些实施方式中，加入PEG后加入的RPMI-1640培养基需要预热。
在一些实施方式中，加入PEG后加入的RPMI-1640培养基需要预热至37℃。
在一些实施方式中，加入PEG前加入的RPMI-1640培养基不需要预热。
在一些实施方式中，二次加入无血清RPMI-1640培养基，离心后的小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞用加入含15％FBS和HAT的RPMI-1640培养基重悬。
在一些实施方式中，采用OD450nm的值对杂交瘤细胞株进行选择。
在一些实施方式中，检测孔的阴阳性的标准为阴性血清OD450nm值≤0.1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2.1。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株采用含15％FBS的RPMI-1640培养基进行稀释。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株采用含15％FBS的RPMI-1640培养基进行稀释，稀释成100个细胞/10mL培养基。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株采用含15％FBS的RPMI-1640培养基进行稀释，稀释成100个细胞/10mL培养基，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，进行检测。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株进行间接ELISA方法检测。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种抗小反刍兽疫病毒的单克隆抗体，其是由上述保藏编号为CCTCC NO：C2020266的杂交瘤细胞株分泌获得。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体的抗原表位位于小反刍兽疫病毒N蛋白的N端。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体不与羊疱疹病毒1型发生反应。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体不与山羊副流感病毒3型发生反应。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体不与牛病毒性腹泻病毒1型发生反应。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体不与牛病毒性腹泻病毒2型发生反应。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体的制备方法为将上述杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔来制备小鼠腹水，收集，离心。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体的制备方法为将上述杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(2×106～3×106个杂交瘤细胞)，7～10d后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了一种抗小反刍兽疫病毒抗原检测试剂盒，其包含上述单克隆抗体。
进一步地，本发明还公开了上述单克隆抗体在制备检测小反刍兽疫病毒的试剂或试纸中的应用。
本领域技术人员可以根据常规技术手段在上述试剂盒、试剂、试纸中加入其它辅助试剂，且采用常规方法即可制备得到。
其中，所述的检测包括但不限于间接免疫荧光检测、夹心ELISA检测和免疫印迹法检测。
本发明中所述的“重组表达的PPRV Nigeria 75/1株N蛋白”，以及“重组PPRV-N蛋白”均指的是表达之后的蛋白，是同一种蛋白。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本单克隆抗体可用于检测PPRV，特异性强，抗体滴度高，其与感染小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的Vero细胞发生特异性的荧光反应，不与正常Vero细胞及羊疱疹病毒1型、山羊副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型等常见羊病毒发生反应。
(2)本发明的提出为建立一种快速、简易、准确的检测方法，以及在免疫机制研究、免疫功能研究、检测方法建立等方面提供技术手段，对PPRV的防控及实验室研究都具有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为pET30a-PPRV-N重组蛋白的鉴定结果。A：SDS-PAGE电泳检测纯化的重组N蛋白；B：抗HIS单抗经Western blot检测PPRV N蛋白。
图2为含小反刍兽疫病毒的间接免疫荧光检测结果。A：感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞；B：正常Vero细胞。
图3为间接免疫荧光实验检测单克隆抗体4B2株与PPRV反应。泳道1：Vero细胞；泳道2：感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1重组PPRV-N蛋白的制备
1.PPRV N基因的PCR扩增
根据PPRV Nigeria 75/1株基因序列(KY628761.1)，比较N基因序列的抗原性、疏水性等特征，选择抗原性高的区域，设计引物。上下游引物各引入EcoRⅠ和SalⅠ位点，扩增N基因片段。引物序列如下：F：GAATTCATGGCGACTCTCCTTAAAAGC；R：GTCGACGGCTGAGGAGATCCTTGT(预期扩增片段1578bp)；以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。根据Trizol试剂说明书，提取PPRV Nigeria 75/1疫苗株病毒RNA，溶于无RNase水中。用反转录试剂盒Easyscript one-step RT-PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)进行一步法RT-PCR扩增。采用50μL反应体系，反应程序如下：45℃50min；94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，反应35个循环；72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
根据凝胶回收试剂盒说明回收目的条带。用EcoRⅠ和SalⅠ(大连宝生物)对该目的基因进行双酶切，回收纯化之后克隆到同样酶切处理的pET-30a(+)原核表达载体中，连接反应在4℃过夜进行。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落，在含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，提取质粒，经PCR和EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。阳性质粒送南京思普金生物科技有限公司进行测序。
2.重组表达菌株BL21-N的构建与蛋白表达
经序列测定正确的重组质粒pET30a-N转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液接种于新的培养基中，37℃培养至OD600约0.6-0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达4h，离心后超声裂解细菌，沉淀与上清分别进行SDS-PAGE鉴定。蛋白纯化方法参照GE公司HisTrapHP亲和纯化柱操作说明进行。包涵体经镍柱进行亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳，在60kDa左右有明显的目的蛋白表达条带(图1A)。
3.重组蛋白的Western blot鉴定
SDS-PAGE结束后，采用半干转印法将重组蛋白转印至NC膜(Pall)上，用含50g/L脱脂乳的PBST封闭2h；加入1：1000稀释的Anti-HIS单克隆抗体，室温孵育2h；PBST洗涤3次；加入1：2000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP，室温轻摇1.5h；PBST洗涤3次，DAB显色试剂盒显色。结果表明，在60kDa可检测到特异条带，证明重组蛋白成功表达及纯化(图1B)。经BCA法测定蛋白浓度为0.61mg/mL，-20℃保存备用。
实施例2抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
1.免疫Balb/c小鼠：将纯化的重组PPRV-N蛋白皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，一共免疫3次，每次免疫间隔2周，首免使用100μg纯化的重组PPRV-N蛋白与等体积完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)免疫，后两次均使用100μg纯化的重组PPRV-N蛋白与等体积不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合免疫；第三次免疫2周后采血，检测小鼠的免疫血清效价，选取ELISA抗体效价>106的小鼠，细胞融合前4d加强免疫一次，采用100μg纯化的重组PPRV-N蛋白腹腔注射。
2.细胞融合：细胞融合采取PEG细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1：3-1：5的比例(细胞数量比)充分混匀，2000rpm 25℃离心5min，弃上清，再加入适量的无血清RPMI-1640培养基重悬，2000rpm 25℃离心5min以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀，置37℃水浴预热1min，再向其中加入0.8mL提前在37℃水浴中预热的PEG2000，边加边振荡。加完后继续振荡1min，然后在5min内按照1、2、3、3、3mL/min分别加入12mL预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基，37℃静置10min，2 000rpm25℃离心5min，弃上清，加入含15％FBS和HAT的RPMI-1640培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔板中，于5％CO2培养箱培养。期间观察孔中细胞情况，待融合7d后，细胞生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，取上清进行抗体检测。
3.杂交瘤细胞的筛选：以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以1μg/μL倍稀释的纯化PPRV-N蛋白为包被抗原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清，1：1000(v/v)稀释的Balb/c免疫小鼠阳性血清以及1：1000(v/v)稀释的小鼠阴性血清加入相应的孔内，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1：4000(v/v)稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自北京全式金生物技术有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD450nm值，P为各检测孔的OD450nm值，N为阴性血清的OD450nm值，当阴性血清OD450nm值≤0.1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2.1，即阴、阳性对照均成立的前提下，以P/N≥2.1判定为阳性孔的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株进行亚克隆。
4.杂交瘤细胞的克隆化：将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含15％FBS的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入提前铺有饲养细胞的96孔板，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养，期间观察细胞株，待生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，按照之前建立的间接ELISA方法及时进行ELISA检测。记录单克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆细胞株上清检测均为阳性且各孔检测的OD450nm值较接近。将克隆化的CPIV3特异单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，冻存。
实施例3单克隆抗体的制备与纯化
采用腹水制备法：将灭菌的液体石蜡腹腔注射10～12周龄的Balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.3mL/只，7d后，将杂交瘤细胞株2E6注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(2×106～3×106个杂交瘤细胞)。7～10d后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，3000rpm离心20min，收集腹水上清，分装，标记并保存至-20℃备用。
实施例4抗体特性分析
1.单抗效价检测
用间接ELISA方法分别检测实施例3所得的杂交瘤细胞培养上清效价和腹水效价，结果见表1，诱导小鼠产生的腹水效价为1：51200，杂交瘤细胞培养细胞上清效价为1：320。
表1单克隆抗体效价检测
细胞株 腹水效价 杂交瘤细胞培养上清
4B2 1:51200 1:320
2.单抗针对表位的检测
根据PPRV Nigeria 75/1株基因序列(KY628761.1)，将该病毒N蛋白分成两段进行表达，分别为N端1-360氨基酸序列和C端301-525氨基酸序列。扩增两段序列后连接到pET-28a载体，利用大肠杆菌表达系统进行表达。以纯化表达的重组蛋白PPRV-N1-360和PPRV-N301-525作为抗原，分别包被酶标板，检测4B2所针对的表位。结果见表2，表明4B2单抗所针对的表位位于PPRV N蛋白N端1-300氨基酸序列。
表2单抗表位检测
表位 PPRV-N1-360 PPRV-N301-525
OD<sub>450nm</sub>值 1.203 0.081
3.间接免疫荧光实验(IFA)
将PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞分别培养5天后，弃上清，经PBS洗涤3次后，用100μL/孔固定液(碧云天生物科技有限公司)4℃固定过夜，PBS洗涤3次；100μL/孔封闭液(碧云天生物科技有限公司)37℃封闭2h，弃封闭液，PBS洗涤3次；每孔加入杂交瘤细胞上清100μL，同时以SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清，免疫后小鼠血清作为阴性、阳性对照，37℃反应1h；经PBS洗涤3次，用FITC标记的羊抗鼠IgG(1：800，碧云天生物科技有限公司)于37℃反应1h；经PBS洗涤3次后拍干，于荧光显微镜下观察。
间接免疫荧光实验表明，SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清与PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞反应均无特异性荧光，重组PPRV-N蛋白免疫后小鼠血清与PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞反应产生特异性荧光，说明阴性、阳性对照均成立。单克隆抗体4B2与感染小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的Vero细胞发生反应，可观察到明显的特异性荧光反应，而不与正常Vero细胞发生反应，结果见图2。
4.特异性实验
用间接免疫荧光实验分别对本实验室保存的羊疱疹病毒1型(CHpV-1)、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)进行特异性试验，结果表明该单克隆抗体4B2与PPRV反应呈阳性，而不与其它病毒发生反应，说明该方法具有很好的特异性。详细结果见表3。
表3特异性实验检测结果
PPRV CPIV3 BVDV-1 BVDV-2 CHpV-1
IFA + — — — —
5.免疫印迹法检测
将PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞分别培养5天后，弃上清，经PBS洗涤3次后，用100μL/孔裂解液(碧云天生物科技有限公司)裂解细胞，然后加入蛋白电泳上样缓冲液，煮沸5min，制备电泳用蛋白样品。采用半干转印法分别将蛋白转印至NC膜(Pall)上，用含50g/L脱脂乳的PBST封闭2h；分别加入1：5稀释的4B2单克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗涤3次；加入1：2000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP，室温轻摇1.5h；PBST洗涤3次，化学发光法显色后拍照保存。
检测结果显示，4B2单抗孵育后，感染PPRV的Vero细胞样品在50-70kDa处出现明显的条带，但正常Vero细胞样品无条带(图3)。说明该单抗可用于实验室Western blot检测。
6.单克隆抗体用于小反刍兽疫病毒抗原的夹心ELISA方法检测
使用包被液(碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将兔抗小反刍兽疫病毒的多克隆抗体(用PPRV免疫兔子获得的多克隆抗体)进行适度稀释后100μL/孔包被到酶标板，4℃包被12h。PBST洗涤3次，拍干，1％BSA 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，拍干；加入待检样品(包括Vero细胞培养的PPRV病毒培养物，PPRV裂解液、PPRV感染后的采集的鼻拭子、Vero细胞裂解产物、羊主要常见病毒等)，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1：1000稀释的4B2单抗腹水，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自北京全式金生物技术有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应，酶标仪测定酶标板OD450nm值。
结果表明(表4，表5)，4B2单抗可以特异性地与PPRV病毒培养物、病毒裂解液及鼻分泌物反应，而不与细胞裂解产物、其它羊常见病毒如羊疱疹病毒1型(CHpV-1)、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)发生反应。说明该单抗用于小反刍兽病毒夹心ELISA试剂盒可灵敏、特异地检测口鼻腔分泌物、病毒培养物等样品中完整或裂解小反刍兽疫病毒抗原。同理也可以推测，该单抗可用于小反刍兽病毒抗原检测试纸条的制备。
表4夹心ELISA检测结果
Figure BDA0002848049310000111
表5特异性实验检测结果
PPRV CPIV3 BVDV-1 BVDV-2 CHpV-1
OD<sub>450nm</sub> 0.513 0.088 0.067 0.083 0.071
综上，间接免疫荧光检测和夹心ELISA检测结果表明，本发明中的单克隆抗体能与感染Nigeria 75/1株的Vero细胞发生特异性的荧光反应，而不与正常Vero细胞发生反应，说明本发明获得的单克隆抗体能与PPRV发生特异性反应。进一步地发现，本发明中获得的单克隆抗体不与羊疱疹病毒、山羊副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型发生反应，说明本发明中的单克隆抗体具有良好的特异性。
本发明提供了一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 300
<212> PRT
<213> 抗原表位(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Leu Leu Lys Ser Leu Ala Leu Phe Lys Arg Asn Lys Asp
1 5 10 15
Lys Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Arg Gly Ile Lys
20 25 30
Asn Val Ile Ile Val Pro Ile Pro Gly Asp Ser Ser Ile Ile Thr Arg
35 40 45
Ser Arg Leu Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Asp Pro Asp Ile
50 55 60
Asn Gly Ser Lys Leu Thr Gly Val Met Ile Ser Met Leu Ser Leu Phe
65 70 75 80
Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Thr Asp Asp Pro Asp
85 90 95
Val Ser Ile Arg Leu Val Glu Val Val Gln Ser Thr Arg Ser Gln Ser
100 105 110
Gly Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ala Asp Leu Asp Asn Glu Ala Asp
115 120 125
Met Tyr Phe Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ser Gly Ser Lys Lys Arg Ile
130 135 140
Asn Trp Phe Glu Asn Arg Glu Ile Ile Asp Ile Glu Val Gln Asp Ala
145 150 155 160
Glu Glu Phe Asn Met Leu Leu Ala Ser Ile Leu Ala Gln Val Trp Ile
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Asp Ser Glu
180 185 190
Leu Arg Arg Trp Val Lys Tyr Thr Gln Gln Arg Arg Val Ile Gly Glu
195 200 205
Phe Arg Leu Asp Lys Gly Trp Leu Asp Ala Val Arg Asn Arg Ile Ala
210 215 220
Glu Asp Leu Ser Leu Arg Arg Phe Met Val Ser Leu Ile Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Arg Thr Pro Gly Asn Lys Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp
245 250 255
Ile Asp Asn Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Ile Leu Thr
260 265 270
Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Met Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu
275 280 285
Phe Ala Gly Glu Leu Ser Thr Ile Glu Ser Leu Met
290 295 300
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 上游引物(F)
<400> 2
gaattcatgg cgactctcct taaaagc 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 下游引物(R)
<400> 3
gtcgacggct gaggagatcc ttgt 24

Claims (10)

1.一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为4B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：C2020266。
2.一种抗小反刍兽疫病毒的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌获得。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位位于小反刍兽疫病毒N蛋白的N端。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体不与羊疱疹病毒1型发生反应。
6.据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体不与山羊副流感病毒3型发生反应。
7.据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体不与牛病毒性腹泻病毒1型发生反应。
8.据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体不与牛病毒性腹泻病毒2型发生反应。
9.一种小反刍兽疫病毒抗原检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的单克隆抗体。
10.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测小反刍兽疫病毒的试剂或试纸中的应用。
CN202011516349.2A 2020-12-21 2020-12-21 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用 Active CN112522210B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011516349.2A CN112522210B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011516349.2A CN112522210B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112522210A CN112522210A (zh) 2021-03-19
CN112522210B true CN112522210B (zh) 2022-08-19

Family

ID=75001802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011516349.2A Active CN112522210B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112522210B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100593213B1 (ko) * 2004-11-05 2006-06-28 대한민국 곤충세포발현 재조합 ｎ 단백질 및 ｎ 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 가성우역의 신속진단방법
CN102967710B (zh) * 2012-08-03 2016-12-21 中国农业科学院兰州兽医研究所 小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法
CN105968175B (zh) * 2016-04-14 2019-11-08 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种重组小反刍兽疫病毒n蛋白及其表达方法和应用
GB201820983D0 (en) * 2018-12-21 2019-02-06 Pirbright Inst Virus

Also Published As

Publication number Publication date
CN112522210A (zh) 2021-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109796531B (zh) 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用
CN109970851B (zh) Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法
CN108912213B (zh) 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
CN112921005B (zh) 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
WO2020238458A1 (zh) 用于表达e2蛋白的细胞株及其应用，e2蛋白及其应用
CN107586322B (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用
CN114874995B (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
CN112190705A (zh) 一种rsv-sh亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN110642927A (zh) 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用
CN113249334B (zh) 一种分泌抗发热伴血小板减少综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sftsn5g12
CN108822192B (zh) 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白apjl_1976及其应用
CN108840913B (zh) 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白apjl_0922及其应用
CN110257405B (zh) 牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用
CN108794584B (zh) 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白apjl_1380及其应用
CN112522210B (zh) 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用
CN111041000A (zh) 一株分泌抗裂谷热病毒NSs蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN106397546B (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
KR101080071B1 (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
CN115850501A (zh) 非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用
CN107098980A (zh) 一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白及其制备方法
CN113861277A (zh) 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用
CN111606979A (zh) 一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用
CN105754952B (zh) 抗羊痘病毒k3l蛋白c末端的单克隆抗体及其应用
CN114957477B (zh) 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用
CN113512098B (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant