CN102967710B

CN102967710B - 小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN102967710B
Application number: CN201210278970.9A
Authority: CN
Inventors: 才学鹏; 窦永喜; 蒙学莲; 毛立; 李辉; 骆学农
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102967710A

Abstract

本发明公开了一种检测小反刍兽疫病毒抗体的竞争ELISA试剂盒，所述试剂盒包含包被抗原反应液和单克隆抗体反应液构成的检测体系，属于生物技术领域。该试剂盒采用原核表达的小反刍兽疫Nigeria 75/1株N蛋白作为包被抗原，N蛋白单克隆抗体为竞争抗体，依据竞争ELISA原理检测羊血清中小反刍兽疫病毒的抗体。本发明的试剂盒可快速而特异地检测血清中小反刍兽疫病毒抗体，同时还具有规模性生产单克隆抗体的优势，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察，非常适用于羊的进出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的大批样品的筛查，易于大范围推广应用。

Description

小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明公开了一种检测小反刍兽疫病毒抗体的竞争ELISA试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含包被抗原反应液和单克隆抗体反应液构成的检测体系，属于生物技术领域。

背景技术

小反刍兽疫是一种急性、烈性、接触性A类传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，发病率和致死率均非常高，为一种重大跨国传播的动物疫病。自1940年发现以来，该病先后在大多数非洲国家、阿拉伯半岛、以色列、叙利亚、伊拉克、约旦和土耳其等中东地区、以及南亚的印度半岛流行。以前由于我国不存在该病，所以对其研究非常少。2007年7月26日，我国首次报道在西藏日土县热帮乡龙门卡村发生小反刍兽疫疫情，该病在我国西藏地区的出现，对我国每年饲养量为3.66亿只羊群(1.96亿只山羊，1.7亿只绵羊，2006年)构成严重威胁，控制和消灭该病在我国的蔓延和扩大是当前动物疫病的防控的主要任务，虽然及时采取有效手段扑灭了这次疫情，但也提醒我国必须加强相关研究以应对可能再次出现的疫情。因此，建立特异敏感的PPR诊断技术，对于本病的防制非常重要。我们必须加强对小反刍兽疫病毒的研究工作，特别是要加强小反刍兽疫的诊断技术，研发出具有快速、特异、敏感特性的诊断试剂盒，这对于控制小反刍兽疫在我国的流行和扩大，甚至彻底消灭该病都具有重要意义。N蛋白是构成核衣壳的主要成分，在病毒粒子和感染细胞中含量最丰富，分子量约为57.7ku，由N基因编码。N基因只有1个开放阅读框(open readingflame，ORF)，编码525个氨基酸。小反刍兽疫病毒N蛋白C端在核衣壳表面，且可能与囊膜蛋白相连，其氨基酸序列与麻疹病毒属中其他病毒的同源性较低，只有17％～14％。N蛋白有4个主要区域：氨基末段的I区、易变异的II区(123～144aa)、蛋白中部的III保守区以及IV区(421～525aa)。与麻疹病毒属其他成员相比，I区和III区比较保守，同源性约为75％～90％，而II区和IV区相对不保守，同源性只有17％～40％，研究发现针对N蛋白的单抗所识别的表位大多在IV区。

N蛋白在病毒的复制和转录中有重要作用。新合成的mRNA翻译蛋白时，可以由转录转变为复制，新生RNA和N蛋白结合，此结合物就是下一次转录的模板。此外，由N蛋白组成的核衣壳包裹着RNA，使核糖核酸酶I不能破坏病毒RNA。采用小剂量纯化的原核表达的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠，发现N蛋白中有一个细胞毒性T细胞(CTL)位点，只有9个氨基酸，能够诱导机体产生受MHC I类分子限制的CTL反应。N蛋白在病毒蛋白中免疫原性最强，免疫活性部位位于C末端，在动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，但是此类抗体不能中和病毒。在F和H蛋白的诱导下，N蛋白的保护性免疫可显著增强。N蛋白在PPR血清学诊断中具有重要作用，常作为检测抗原。例如用昆虫细胞表达的重组N蛋白建立了间接ELISA方法；用PPRV的N蛋白制备的单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA法，用于检测病毒抗原；用N蛋白的单抗也可建立检测PPRV抗体的竞争ELISA方法，目前该方法广泛应用于PPR检测。

诊断方法研究进展

除了传统的临床诊断方法，目前已经研究出多种针对PPRV的诊断技术，这些方法包括病毒中和试验(VN)、琼脂扩散(AGID)、免疫荧光抗体试验(IFAT)和对流免疫电泳(CIEP)等。随着免疫学和分子生物学的在动物疫病诊断中的应用和发展，目前已有PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)和其它分子生物学检测方法等多种PPR检测方法，其中间接竞争ELISA(cELISA)和PCR方法是OIE推荐的检测方法。

病毒抗体检测方法：

间接ELISA(Indirect ELISA，iELISA)

Balamurugan等(2007)建立的检测PPR血清抗体的iELISA，利用纯化的Sungri96PPR弱毒作为抗原。以标准cELISA试剂盒和iELISA同时检测1544份羊血清样品，与cELISA相比，iELISA的相对特异性和敏感性分别达到95.09％和90.81％；以VNT为对照检测658份羊血清样品，iELISA的相对特异性和敏感性分别为100％(388/388)和80％(216/270)。该研究结果表明建立的间接ELISA可快速检测大规模血清样本，比cELISA成本低，可替代cELISA用于PPRV抗体的血清流行病学调查。

贾凤芹等研究利用原核表达的PPRV核衣壳蛋白(N)作为标准抗原，建立了PPRV血清抗体检测方法。通过批内及批间重复性试验，重复变异系数CV％为3.1％，并能与赤羽病、蓝舌病进行鉴别。

竞争ELISA(complete ELISA，cELISA)

由于感染PPRV的动物血清中的抗体有相当一部分是针对N蛋白和H蛋白的，因此已经研制出许多针对PPRV和RPV的N、H蛋白的竞争ELISA试验方法，并且该方法已成为OIE的标准检测方法之一。Libeau G应用重组杆状病毒表达的N蛋白建立了cELISA检测方法，单抗和待检血清抗体竞争性地结合抗原，用于检测PPRV抗体，这样可以提高试验的特异性。Saliki等1993年建立了针对PPRV H蛋白的阻断ELISA(B-ELISA)方法，与竞争ELISA原理基本一致，都是两种抗体竞争结合同一抗原表位。但是在cELISA方法中，样品和检测抗体同时与抗原结合，而B-ELISA是先将样品和抗原反应，然后再加入检测单抗，所用的时间要比cELISA方法长。

Singh等于2004年又制备了一株针对PPRV H蛋白中和表位的单克隆抗体，建立了竞争ELISA的检测方法。与VNT相比，更加方便快捷。但也存在一些缺点，例如不能区分RPV与PRRV。其后韩国科学家Choi等(2005)又发展出了一种快速竞争ELISA(rapid cELISA)用来检测PPR。该方法是在包被了PPRV重组核衣壳蛋白(rPPRV-N)的反应皿中，将血清与单抗混合孵育30min，然后对单抗进行定量。检验了249个PPRV阳性血清和733个阴性血清样品，相对特异性与敏感性分别达到了98.5％和93.4％。用该方法检测免疫了RPV的高免血清，VNT≥1∶512时，检测结果呈阳性，但显示的抗体滴度非常低，只有1∶2-1∶16。如果VNT≤1∶128，则检测结果呈阴性，说明该方法能较好的区分PPRV与RPV感染。

Misbah Aslam等对琼脂糖凝胶免疫电泳方法(AGID)和cELISA两种血清学方法进行比较，发现与AGID相比，cELISA检测方法具有更高的特异性和敏感性。在对照正确的情况下，cELISA检测出的阳性样品用AGID法检测往往呈阴性。

发明内容

为了快速诊断小反刍兽疫病情，本发明采用如下的技术方案“

本发明一方面涉及一种小反刍兽疫重组N蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括：

采用上游引物5′CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT 3′和下游引物N-DN：5′ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3′，分别在上下游引物5′端引入酶切位点EcoR I和SalI；通过RT-PCR方法从小反刍兽疫细胞毒RNA中获得N基因的ORF，构建其原核表达载体pGEX-4T-1，将重组质粒转化BL-21宿主菌，进行小反刍兽疫重组N蛋白抗原表达并提取抗原。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于BL-21宿主菌在IPTG的诱导下进行表达。

本发明还涉及将所制备的小反刍兽疫重组N蛋白抗原在制备小反刍兽疫抗体检测试剂盒中的应用

本发明另一方面还设计一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒，包括采用上述方法所制备得到的小反刍兽疫重组N蛋白抗原、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A&B、终止液。

在本发明的一个优选实施方式中，试剂盒的盒体内装有酶标板8×12孔，小反刍兽疫重组N蛋白抗原1μg、封闭液4.5ml，单抗反应液5ml，酶结合物5ml，阳性血清0.1ml，阴性血清0.1ml，浓缩洗涤液125ml(25倍)，底物5ml，终止液5ml。上述各种液体分别装在小瓶内，其中所述的酶标封闭液为1％BSA溶液(1g BSA加入100ml PBS pH7.4)；单抗反应液为适合倍数稀释的小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体；酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠酶标二抗；浓缩洗涤液为含0.05％吐温-20的25倍浓缩的PBST液；底物为已加入H2O2的TMB溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的2mol/L H2SO4溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为11∶89。

采用本发明的试剂盒能够分别检测不同病毒阳性血清，包括羊痘、羊口疮、亚洲I型口蹄疫、O型口蹄疫阳性血清，计算PI值均小于50％，检测结果都是阴性，说明本方法与这些病毒阳性血清不发生交叉反应，特异性较好。

具体实施方式

一.小反刍兽疫重组N蛋白抗原的制备

设计N基因引物，N-UP：5′CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT 3′，N-DN：5′ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3′，分别在上下游引物5′端引入酶切位点EcoR I和SalI；通过RT-PCR方法从小反刍兽疫细胞毒RNA中获得N基因的ORF，构建其原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化BL-21宿主菌，在IPTG的诱导下进行高效表达并提取蛋白抗原。

二.针对PPRV N蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

1材料

1.1抗原、细胞系及试验动物

抗原：原核表达纯化的重组GST-N，PPRV疫苗株；细胞系：SP2/0株骨髓瘤细胞，由兰州兽医研究所保存；试验动物：清洁级5周龄雌性BALB/c小鼠，购自兰州生物制品研究所。

1.2试剂

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、8-氮鸟嘌呤、HAT购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自中衫金桥公司；RPMI-1640培养液购自海克隆公司；胎牛血清(FBS)，购自GIBCO公司；青霉素购自中诺药业有限公司，链霉素购自大连美罗药厂；酶标底物TMB购自promega公司；Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit，购自Roche公司；二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG2000)，购自Merck公司；各种型号细胞培养板，96孔酶标板，购自Costar公司；细胞冻存管购自CORNING公司。

1.3溶液及培养基

50％PEG2000溶液：称取10g PEG2000，10磅高压25min，冷却至50～60℃，加10mL不完全培养基RPMI-1640，混匀，调pH至7.0～7.4，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，4℃保存备用。A贮存液(氨基蝶呤液)：称取3.5mg Aminopterin，加高压过的三蒸水180mL，轻轻震荡至完全溶解，最后加水至200mL，0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mLeppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×，H：10-4mol/L；T：1.6×10-3mol/L)：称取0.054g Hypoxanthine，0.016g Aminopterin，加高压过的三蒸水40mL，待溶解后0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mLeppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

8-氮鸟嘌呤贮存液：称取20mg 8-azaguanine，加10mL水和约30μL氨水，待溶解后，0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

HAT选择培养液：78％RPMI-1640培养液，1％A储存液，1％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用。

HT培养液：79％RPMI-1640培养液，1％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用。

细胞冻存液：70％RPMI-1640培养液，20％小牛血清，10％二甲亚枫(DMSO)，4℃保存，混合均匀，4℃保存备用。

包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO32.9g，Na2CO31.5g，加双蒸水定容至1000ml，调pH至9.6，4℃保存备用。PBS：Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl 8g，溶解于950ml去离子水中，用NaOH调pH值至7.2后用容量瓶定量至1000ml

PBST溶液：在PBS溶液中加入再加0.05％Tween-20，摇匀即可使用。酶标封闭液(0.8％明胶-PBS溶液)：0.8g明胶加入100mL PBST(pH7.4)于37℃水浴中溶解，保存于4℃备用。

酶标终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：双蒸水89mL，浓硫酸11mL，将硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。

7.5％碳酸氢钠溶液：称取7.5g碳酸氢钠粉末，加入90mL蒸馏水充分溶解，再定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口保存于4℃备用。

20000U/mL双抗储备溶液：在购买的80万单位青霉素瓶中加入高压过的三蒸水4mL，100万单位链霉素瓶中加入高压过的三蒸水5mL，轻轻摇晃直至瓶内粉末完全溶解，分别取4mL加入32mL高压过的三蒸水中，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口后保存于-20℃备用。

2方法

2.1最佳抗原包被量及阳性血清最佳稀释度的确定

按方阵滴定试验方法进行，将小反刍兽疫病毒灭活后按1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200进行稀释，在酶标板上按100μL/孔包被，阴性、阳性血清从左到右按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀释，酶标二抗按1∶4000稀释。然后根据测定的OD450nm值确定最佳抗原包被量及阳性血清稀释度。

间接ELISA操作程序如下：

(1)用包被液按上述梯度稀释初纯病毒液，酶标板的每孔中加入100μL稀释抗原，置湿盒内4℃过夜；

(2)倒掉包被液，PBST洗板3次；

(3)用PBST将阴性、阳性血清按上述梯度稀释，每孔加100μL，置湿盒中37℃孵育1h，甩干后PBST洗涤；

(4)用PBST将羊抗鼠IgG-HRP稀释1∶4000，每孔加100μL。置湿盒中37℃孵育1h，甩干后PBST洗涤；

(5)每孔加入底物溶液TMB 100μL，置暗盒中37℃反应20min；

(6)每孔加入2M硫酸50μL，终止反应。

(7)用酶标检测仪检测各孔OD450nm值。

2.2动物免疫

将回收并测定浓度后的GST-N重组表达蛋白用灭菌PBS稀释到1mg/mL，取200μg蛋白溶液与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化。

选取健康的六周龄雌性小鼠6只，待其适应环境两天后，在背部皮下分点注射200μL乳化后的蛋白，后腿肌肉各注射100μL。然后分别在首次免疫后第15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫。三免后一周尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法确定每只小鼠的抗体水平。对免疫效果较好的小鼠融合前三天再次加强免疫一次，加强免疫时可用腹腔注射100μg不加佐剂的蛋白溶液。对免疫效果不理想的小鼠可以进行四免，免疫部位和方法与第三次相同。

2.3细胞融合

2.3.1复苏与培养骨髓瘤细胞

在融合前两周左右，开始复苏和培养骨髓瘤细胞sp2/0株。

(1)将超净台用酒精棉球擦拭干净，用紫外灯将超净台照射至少30min，同时打开超净台风机；

(2)从液氮罐中取出冻存的SP2/0细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使冻存管内液体完全融化；

(3)从烧杯中取出冻存管，1000r/min离心10min，用吸管轻轻吸取上清弃去；

(4)加入约1mL不完全RPMI-1640，轻轻悬起细胞，移入准备好的细胞瓶内，再补充9mL完全RPMI-1640培养液；

(5)轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞分布均匀，置37℃，含5％CO2细胞培养箱内培养，24h后观察，待细胞贴壁后更换细胞培养液继续培养。

在传代培养过程中如果出现细胞大小不均，细胞返祖等现象，可以用含有20ug/mL8-氮鸟嘌呤的完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT缺陷型。

在融合当天，将处于对数生长期，生长良好的SP2/0细胞吹打起来，移至灭菌离心管中，1000r/min离心10min，弃去上层培养基，收集细胞，加入20mL不完全RPMI-1640培养液洗涤一次，离心后将细胞重新悬浮，用台盼兰染色，计数板计数活细胞，备用。

2.3.2饲养细胞制备

取8-10周龄健康BALB/c小鼠一只，眼球采血，分离阴性血清，待小鼠失血死亡后，浸泡于75％酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤，注意不要剪破腹膜，将腹部皮肤拉开固定在塑料板上，使腹膜充分暴露。用无菌的一次性注射器吸取3～4mL完全培养基注射到小鼠腹腔内，保持注射器不动，用灭菌的小镊子轻揉腹部1～2min，再用注射器吸出腹腔内的培养液，此时培养液内含有巨噬细胞等可作为饲养细胞。调整培养基中饲养细胞的浓度，使其在1×105个/mL左右，将调整好浓度的培养基放在灭菌的平皿内，备用。

2.3.3脾细胞的制备

取3天前加强免疫的BALB/c小鼠，眼球采血，分离血清作为阳性对照；将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏，用无菌小镊子将其取下，放入盛有不完全RPMI-1640培养液的无菌平皿中稍作清冼，剥离表面脂肪和结缔组织。然后放在高压过的200目铜网上剪碎，用高压过的注射器芯研磨脾脏，便研磨边滴加不完全RPMI-1640培养液，直至脾脏完全磨碎，再用约20mL不完全RPMI-1640培养液冲洗筛网，使脾细胞完全通过筛网进入烧杯中。1000r/m离心10min收集脾细胞备用。

2.3.4细胞融合

脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量1∶5～1∶10混合均匀，1000r/m离心10min，倒掉上清，轻弹管底使其疏松。在一干净的烧杯中加入37℃蒸馏水，将含有混合细胞的离心管置于水浴中，在90s内加入800μL 37℃预热的PEG2000，边滴加边旋转离心管，静置1min，再在5min内加入37℃预热的不完全RPMI-1640培养液，先慢慢滴入，然后加快，不可将底部细胞冲起，稀释完PEG后1500r/min离心10min，倒掉上清。将细胞沉淀重悬于20％胎牛血清的HAT选择培养液中，混合均匀，同时将制备好的饲养细胞按相同体积加入，再次混合均匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μL，饱和湿度、5％CO2、37℃培养。

2.3阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆

2.4.1阳性杂交瘤细胞孔的筛选

融合后的细胞每隔2～4天更换一次培养基，更换的时候采用半换液方式，即弃去100μL培养基，再加入100μL新的HAT选择培养液。融合后7～8d时，开始观察细胞，标出有存活的杂交瘤细胞的细胞孔，待杂交瘤细胞长满孔底1/10以上时，取上清100μL作为一抗，用灭活的弱毒株病毒作为抗原，用间接ELISA检测方法筛选阳性克隆孔。

2.4.2阳性杂交瘤细胞的亚克隆

将间接ELISA检测阳性的细胞孔中的杂家瘤细胞吹起，并移入24孔细胞培养板中，待其长满后，重新吹起混匀并细胞计数。计数后，用含20％胎牛血清的HAT培养液将其稀释到10个细胞/mL，将此浓度的细胞悬液按照100μL/孔加入预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。筛选方法同上，同时要将每次克隆化后的剩余细胞扩大培养后冻存，以免丢失。经过3次亚克隆后，所有克隆化细胞孔内的上清经检测都呈阳性时，可以确定已经获得分泌单克隆抗体的细胞株。选取OD450nm值最高的几孔，扩大培养。

2.4.3细胞冻存

将形态良好，生长旺盛的杂交瘤细胞吹打均匀，1000r/min离心10min，收集细胞，用1mL细胞冻存液将细胞悬起，加入到细胞冻存管中，同时做好标记，将冻存管先放置于4℃30min，然后移至-20℃冷冻30min，再移至-70℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录。

2.5单克隆抗体腹水的制备

在接种阳性杂交瘤细胞株前一周，给每只8-12周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.2mL液体石蜡。在此期间，对阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养。一周后，将扩大培养的细胞从细胞瓶中吹下，用高压过的PBS重悬，洗涤两次遍，1000r/min离心10min，苔盼兰染色计数，将细胞密度调至1～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液。接种细胞后每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，行动困难时，将小鼠颈椎脱臼处死，用无菌注射器从小鼠腹部吸出暗红色的液体，3000r/min离心20min，取清亮的上清分装、标记，-20℃保存备用。

2.6杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定

2.6.1抗体亚类的测定

吸取杂交瘤细胞培养液上清200μL，用Isostrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit抗体亚类试剂盒对单抗进行亚型鉴定。取杂交瘤细胞上清20μL，加入pH7.2的PBS 180μL做1∶10稀释；取该稀释液150μL加入含有兰色粉末的实验管中，轻轻震荡混匀，至兰色粉末完全融化；将Isotrip胶体金试纸条插入管底，5～10min内观察结果。

2.6.2腹水效价的测定

为测定腹水中抗GST-N单克隆抗体效价，用初纯的1∶50倍稀释的小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1株作为包被抗原，将小鼠腹水作10倍梯度稀释，从1∶10～1∶109倍，用间接ELISA方法检测腹水效价。同时用SP2/0细胞上清、正常小鼠腹水作阴性对照，病毒阳性血清做阳性对照，具体判定标准为：P/N＞2.0时的腹水最大稀释倍数为腹水的ELISA效价。

2.6.3单克隆抗体对热稳定性试验

取粗纯的腹水用灭菌的PBS 1∶1000稀释，置56℃水浴中4h、8h、12h、24h、36h、48h，然后用间接ELISA检测其OD450值的变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。

2.6.4单克隆抗体对酸碱稳定性试验

酸稳定性试验：将腹水用pH2.2的盐酸溶液1∶10倍稀释，于4℃保存4h、8h、12h、24h、36h、48h，再用pH7.2的PBS稀释到1∶1000，ELISA检测其OD450值变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。

碱稳定性试验：用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)按上述方法进行碱稳定性试验。

2.6.5单克隆抗体识别抗原表位的测定

用间接ELISA相加法检测6株单克隆抗体的抗原表位。用初纯的病毒液1∶50倍稀释包被酶标板，先用间接ELISA法测定腹水中McAb与包被抗原反应达到饱和时的稀释度。然后进行间接ELISA相加实验，用上述浓度的抗原包被酶标板，现在酶标板上横向加入6株单抗腹水，反应2h后，再纵向依次加入上述腹水，反应2h后，OD450nm值记录为A1+2，在对照孔中只加入一株单抗的腹水，其值分别记录为A1～A6，计算相加指数时，按照下列公式：AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％，每组重复试验3次，取其平均值，AI值大于50％即可认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。

3结果

3.1最佳抗原包被量及阳性血清稀释滴度的确定

方阵滴定试验测定OD450nm值结果见表1。从表1可见，初纯病毒抗原最佳稀释度为1∶50，阴性、阳性血清稀释度为1∶100。

表1GST-N抗原包被量和阳性血清稀释滴度方阵试验结果

3.2BALB/c小鼠血清ELISA检测结果

第三次免疫15d后，小鼠尾静脉采血，分离血清，进行ELISA检测，OD_450nm平均值按P＞2.0N判为阳性，结果见表2，当血清稀释到1∶3200时仍为阳性。

3.3亚克隆和单克隆细胞株ELISA检测结果

前后共融合3次，用1∶50倍稀释的灭活病毒作为包被抗原，用间接ELISA检测方法筛选，最后筛选出了阳性细胞株6株，命名为13-3，39-2，40-1，57-3，60-3，64-1。这6株细胞三次亚克隆检测结果分别见表3、表4、表5、表6，之后各自选择OD_450nm值最高的细胞孔的杂交瘤细胞株扩大培养，扩大培养后上清OD_450nm值见表7。扩大培养后冻存。

表2GST-N三免后15d小鼠血清ELISA检测结果

表3融合后的杂交瘤阳性细胞株的筛选ELISA检测结果

表4第一次亚克隆后的ELISA检测结果

表5第二次亚克隆后的ELISA检测结果

表6第三次亚克隆后的ELISA检测结果

表7杂交瘤克隆化后ELISA检测结果

3.4杂交瘤细胞及单抗特性鉴定

3.4.1单抗的亚型鉴定

6株单抗经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit检测后，39-2株单克隆抗体亚型鉴定为IgM，轻链类型为κ，其余五株单抗亚型鉴定均为IgG 2b，轻链类型为κ(见图4-1)。

3.4.2腹水效价的测定

将6株杂交瘤细胞株的腹水梯度稀释后用间接ELISA检测方法测定效价，从表8可知：13-3株单抗的腹水效价为10⁵，39-2株单抗的腹水效价为10⁴，40-1株单抗的腹水效价为10⁵，57-3株单抗的腹水效价为10⁸，60-3，64-1株单抗的腹水效价均为10⁹以上。

表8杂交瘤细胞株的腹水效价的检测结果

3.4.3单抗腹水稳定性试验

(1)单抗腹水热稳定性实验

两株杂交瘤细胞株的腹水经热稳定性试验结果见表9。

(2)单抗腹水酸碱稳定性实验

两株杂交瘤细胞株的腹水经酸碱稳定性试验结果见表10、表11。

表9杂交瘤细胞株的腹水热稳定性实验结果

*表中的列出的对照均为鼠腹水处理4h时的结果

表10杂交瘤细胞株的腹水酸稳定性实验结果

*表中的列出的小鼠腹水对照均为处理4h时的结果

表11杂交瘤细胞株的腹水碱稳定性实验结果

*表中的列出的小鼠腹水对照均为4℃处理4h时的结果

3.4单抗识别抗原表位分析

经测定腹水中的McAb与包被抗原反应的饱和浓度。根据McAb饱和浓度用间接ELISA法相加实验进行6株单抗识别抗原表位分析，检测结果见表12和表13。根据表中数据计算：AI＝(A₁₊₂-A₁)/A₂×100％。式中：A₁为McAb1的OD₄₅₀值；A₂为McAb2的OD₄₅₀值；A₁₊₂为McAb1叠加McAb2的OD₄₅₀值。AI＜50％为针对同一抗原位点，AI≥50％为针对不同抗原位点，AI值越大，抗原位点重叠的可能性越小。计算结果显示，39-2株单克隆抗体与其他5株的所识别的抗原表位均不同，计算其AI值均大于50％，除39-2株以外，其他5株都识别同一抗原表位，计算其AI值均小于50％。

表12单抗腹水饱和度实验

表13抗原表位分析检测结果

三.竞争ELISA的建立

1材料

1.1抗原、抗体

抗原：本发明所制备的原核表达的N蛋白；田间羊血清采自青海省海北州和内蒙古鄂尔多斯市。

1.2试剂及耗材

英国商品化PPRV cELISA试剂盒，购自BDSL公司；96孔酶标板，购自Costar公司；山羊抗小鼠酶标二抗，购自中衫金桥公司；酶标底物TMB购自promega公司，明胶，购自德国SIGEMA公司；小牛血清，购自THERMO公司。

1.3溶液及培养基

包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO₃2.9g，Na₂CO₃1.5g，加双蒸水定容至1000ml，调pH至9.6，4℃保存备用。酶标封闭液1(0.8％明胶-PBS溶液)：0.8g明胶加入100mL PBS(pH7.4)于37℃水浴中溶解，保存于4℃备用。

酶标封闭液2(1％BSA溶液)：1g明胶加入100mL PBS(pH7.4)轻轻震荡至溶解，保存于4℃备用。

酶标封闭液3(0.5％小牛血清溶液)：0.5mL明胶加入100mL PBS(pH7.4)，保存于4℃备用。

2方法

2.1商品化cELISA试剂盒操作方法

(1)将PPRV抗原用PBS 1∶3000倍稀释，包被酶标板，每孔50μL，置湿盒37℃包被1h；

(2)PBST洗涤3次，按照说明书内铺板方式，在孔内分别加入阳性血清，阴性血清，弱阳性血清和待检血清。每孔加入血清5μL，封闭液45μL，最后加入1∶150倍稀释的单抗稀释液50μL，震荡至液体混合均匀，置湿盒内37℃反应1h；

(3)PBST洗涤3次，每孔加入1∶1000倍稀释的二抗稀释液50μL，置湿盒内37℃反应1h；

(4)每孔加入底物溶液OPD 50μL，置暗盒中37℃反应20分钟；

(5)每孔加入2M硫酸50μL，终止反应。

(6)用酶标检测仪检测各孔OD_492nm值，根据够公式计算各样品抑制率(PI)值，PI＝[1-样品孔的OD₄₉₂/单抗对照孔的OD₄₉₂]x100％，阴阳性结果判断标准为：PI＞50％，抗体阳性；PI＜50％，抗体阴性；PI＝50％，判定阳性可疑，重复检测一次，如果仍然为50％，判定为阳性，如果不等于50％需再次检测，或用其它方法检测。

2.25株单抗用于cELISA检测

参照上述商品化cELISA试剂盒的操作方法，以本发明所制备的重组N蛋白作为抗原，自制的5株单抗作为检测抗体，分别检测强阳性，弱阳性和阴性血清，比较5株单抗的检测效果。

2.3最佳抗原抗体反应浓度的检测

(1)将重组N蛋白以0.05，0.1，0.5，1μg包被酶标板，置湿盒内包被过夜；

(2)PBST洗涤3次，在孔内分别加1∶5×10³，1∶10⁴，1∶2×10⁴，1∶5×10⁴，1∶10⁵倍稀释的单抗稀释液50μL，置湿盒内37℃反应1h；

(4)每孔加入底物溶液TMB 50μL，置暗盒中37℃反应20min；

(5)每孔加入2M硫酸50μL，终止反应；

(6)用酶标检测仪检测各孔OD_450nm值，根据OD_450nm值筛选出最佳反应浓度。

2.4样品加入量检测

cELISA操作方法与2.1相同，在加入待检血清时上样量分别为2μL，4μL，6μL，8μL。用酶标检测仪检测各孔OD_450nm值，根据OD_450nm值筛选出最佳上样量。

2.5最佳封闭液选择

cELISA操作方法与2.1相同，封闭液分别为PBST，0.8％明胶-PBS溶液，1％BSA溶液，0.5％小牛血清溶液。用酶标检测仪检测各孔OD_450nm值，根据OD_450nm值筛选出最佳封闭液。

2.6最佳反应时间检测

cELISA操作方法与2.1相同，竞争反应时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h。用酶标检测仪检测各孔OD_450nm值，根据OD_450nm值筛选出最佳反应时间。

2.7cELISA检测方法标准操作步骤的确定

根据以上优化的条件确定建立的cELISA操作步骤。

2.8特异性试验

用建立的cELISA检测方法检测羊痘、羊口疮、亚洲I型口蹄疫、O型口蹄疫阳性血清，根据测得的OD值计算其PI值。

2.9建立的cELISA与商品化试剂盒的符合性试验

用建立的cELISA检测方法与商品化试剂盒同时检测血清样品176份，计算出各自PI值，检测本方法的特异性和敏感性。

3试验结果

3.1商品化ELISA检测结果

经商品化cELISA试剂盒检测，选择出本实验室保存的血清样品中的阳性样品3份，阴性样品2份，用于后续cELISA检测方法的建立。

3.2最佳反应浓度

将N蛋白和单抗分别梯度稀释后作方阵检测最佳反应浓度，从表14可见，最佳抗原包被量为0.1μg/孔，而最佳单抗稀释度为1∶5×104。

表14最佳反应浓度方阵检测结果

3.4最佳封闭液

分别用PBST、0.8％明胶-PBS溶液、1％BSA溶液、0.5％小牛血清溶液作为封闭液，检测结果见表15。经比较发现，使用1％BSA溶液作为封闭液时，OD值最稳定。

表15最佳封闭液检测结果

3.5反应时间检测

在试验中，将竞争反应时间分别设为0.5h、1h、1.5h、2h，发现反应0.5-2h均可，均不影响结果判断，从节省时间，快速测定结果的角度看，以0.5h为佳，但是反应1h时，阴阳性样品PI值相差最大，最利于结果判定。

3.6cELISA检测方法操作步骤的确定

(1)将重组N蛋白用包被液稀释0.1ug/孔，包被酶标板，每孔50μL，置湿盒内37℃包被1h或4℃包被过夜；

(2)PBST洗涤3次，加入封闭液100μL，置湿盒内37℃孵育1h；

(3)PBST洗涤3次，在孔内加入封闭液45μL，之后再分别加入阳性血清，阴性血清，弱阳性血清和待检血清，每孔加5μL，震荡使液体混合均匀，置湿盒37℃孵育30min；孵育后取出加入5×10^-4倍稀释的13-3株单抗稀释液50μL，震荡使液体混合均匀，置湿盒内37℃反应1h；

(4)PBST洗涤3次，每孔加入1∶1000倍稀释的酶标二抗稀释液50μL，置湿盒内37℃反应1h；

(5)每孔加入底物溶液TMB 50μL，置暗盒中37℃反应10分钟；

(6)每孔加入2M硫酸50μL，终止反应。

(7)用酶标检测仪检测各孔OD_450nm值并计算PI值，。

(8)判定标准：根据够公式计算各样品抑制率(PI)值，PI＝【1-(样品孔的OD₄₅₀/单抗对照孔的OD₄₅₀)】×100％，阴阳性结果判断标准为：①PI＞50％，抗体阳性；②PI＜50％，抗体阴性；③PI＝50％，判定阳性可疑；重复检测一次，如果仍大于或仍然为50％，判定为阳性；如果小于50％需再次检测，或用其它方法(如病毒中和试验)检测。

3.7特异性试验

经检测羊痘、羊口疮、亚洲I型口蹄疫、O型口蹄疫阳性血清，检测结果显示，PI值均小于50％(表16)，能够与这些病毒的阳性血清区分。

表16特异性试验结果

3.9与商品化cELISA试剂盒对比的符合性试验

与商品化cELISA试剂盒对比检测176份样品，共有4份样品漏检(表17)。与商品化试剂盒检出25份阳性样品相比，试验cELISA方法共检出21份阳性血清，其相对敏感性为92％(23/25)，相对特异性为98.8％(174/176)。

表17对比结果

用间接ELISA对抗原与单抗的反应条件进行优化，发现最佳抗原包被量为Xug/孔，而最佳单抗稀释度为1∶5×10⁴，此时的ELISA结果在1.0-1.5之间，而酶标仪最敏感的OD值就在此范围内。改变加入待检血清的量和反应时间，经检测发现，待检血清的加入量在2-8μL之间都不影响结果的判定，都能明显的区分阴阳性样品，随着样品量的增加，PI值也随之变大，分析原因可能为样品量增加，非特异性结合也随之增加。反应时间在0.5-2h之间均可，但是根据试验结果，在反应1h左右阴阳性之间的PI值差距最大，因此，为利于结果判定，以反应1h为宜。分别用PBST、0.8％明胶-PBS溶液、1％BSA溶液、0.5％小牛血清溶液作为封闭液，封闭液的选择以OD值稳定，能降低非特异性反应为标准，经比较检测结果，以1％BSA溶液作为封闭液时，检测结果最稳定。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA 试剂盒的制备方法，包括制备得到的小反刍兽疫重组N 蛋白抗原、N 蛋白单克隆抗体、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A&B、终止液，所述的小反刍兽疫重组N 蛋白抗原的制备方法包括：采用上游引物5'CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT3'和下游引物N-DN：5'ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3'，分别在上下游引物5'端引入酶切位点EcoR I 和SalI；通过RT-PCR 方法从小反刍兽疫细胞毒RNA中获得N基因的ORF，构建其原核表达载体pGEX-4T-1，将重组质粒转化BL-21宿主菌，进行小反刍兽疫重组N蛋白抗原表达并提取小反刍兽疫重组N蛋白抗原；

所述试剂盒中还包括小反刍兽疫重组N 蛋白单克隆抗体，其中所述的N 蛋白单克隆抗体的制备方法包括：以重组N 蛋白免疫小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0 细胞融合，通过筛选获得可稳定分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，以该细胞株小鼠腹腔注射进行制备N 蛋白单克隆抗体；

所述试剂盒的盒体内装有酶标板8×12孔，小反刍兽疫重组N 蛋白抗原1μg、封闭液4.5ml，单抗反应液5ml，酶结合物5ml，阳性血清0.1ml，阴性血清0.1ml，浓缩洗涤液125ml，底物5ml，终止液5ml，上述各种液体分别装在小瓶内，其中所述的酶标封闭液为1%BSA 溶液，通过将1g BSA 加入100 ml PBS pH7.4制得；单抗反应液为1:5×10⁴稀释的小反刍兽疫病毒N 蛋白的单克隆抗体；酶结合物为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠酶标二抗；浓缩洗涤液为含0.05%吐温-20 的25 倍浓缩的PBST 液；底物为已加入H2O2 的TMB 溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的2mol/L H2SO4 溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为11:89；待检血清的加入量在2-8μL 之间。