CN102174474A - 西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条 - Google Patents
西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药品检验领域，公开了西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。本发明西地那非单克隆抗体，由保藏号为CCTCC No.C2010123的杂交瘤细胞系产生。本发明所述的西地那非单克隆抗体理化特性高度均一、生物活性单一、与抗原西地那非结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，可在制备西地那非检测用胶体金层析试纸条中应用。一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其金标结合垫上包被的金标抗体是本发明所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。使用本发明胶体金层析检测试纸条，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，将样品用提取液混合后，取上清液进行检测，在5-10min即可判定检测结果简便、快速、时效性强。
Description
技术领域
本发明属于药品检验领域，涉及西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。
背景技术
西地那非(Sildenafil)，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍药物，一股以其商业用名Viagra(中国大陆注册名万艾可，台湾和香港注册名威而钢)广为人知。不过相对于商品名西地那非在中国的俗名“伟哥”使用的更广泛，影响也更大。目前，在国内好多中成药或保健品中非法添加西地那非以达到临床的疗效，作为患者，在长期不知情的情况下服用含有西地那非的中成药或保健品会引起严重的副作用。目前，检测中成药或保健品中是否含有伟哥成分，采用的是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行分析，或是使用大型的试验车，这样都很不方便，而且反应时间长，实验耗资较大。
西地那非属于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具备反应性和免疫原性，为了实现西地那非的免疫检测，不仅需要合成具备高效价的西地那非抗原，而且还需要筛选特异性强、敏感度高的西地那非单克隆抗体。但是目前尚没有有关西地那非单克隆抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的另一目的是提供该杂交瘤分泌的西地那非单克隆抗体及其应用。
本发明的有一目的是提供一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No.C2010123，保藏日期为2010年11月30日。
一种西地那非单克隆抗体，由保藏号为CCTCC No.C2010123的杂交瘤细胞系产生。
本发明利用人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA为免疫原，经过Balb/c小白鼠皮下免疫，加强免疫后取小白鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞做细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC No.C2010123。经ELISA、Western Blot、胶体金免疫层析方法的鉴定，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能特异识别西地那非。
本发明所述的西地那非单克隆抗体在制备西地那非胶体金检测试剂中的应用。
所述的西地那非检测试剂为西地那非检测用胶体金层析试纸条。
一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，包含衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附西地那非金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有N-乙酸西地那非-BSA抗原溶液包被的直线式检测线T线，和用羊抗鼠IgG溶液包被的直线式对照线C线，两条线竖向平行排列，所述的西地那非金标抗体是本发明所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。
所述的西地那非抗原为西地那非人工合成抗原。
所述的西地那非人工合成抗原为：
(1)，其中Pro为载体蛋白，优选牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血蓝蛋白，进一步优选牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白，特别优选牛血清白蛋白，即N-乙酸西地那非-BSA。
本发明所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条的制备方法，包含如下步骤：
(1)制备式(1)所示的西地那非人工合成抗原；
(2)制备西地那非单克隆抗体；
(3)制备含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液；
(4)利用步骤(3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫；
(5)在包被膜上用所述的西地那非人工合成抗原溶液包被直线式检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；
(6)组装试纸条。
其中，式(1)所示的西地那非人工合成抗原的制备方法详见中国专利201010248466.5。
步骤(3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液通过如下方法制备：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；用0.1mol/LK2CO3调节所述的胶体金溶液至最适pH 8.5-9.0，将纯化的本发明西地那非单克隆抗体纯水透析后，按3μg/ml量加入胶体金溶液中，室温电磁搅拌15-30min，然后按5μg/ml的量加入鼠IgG单克隆抗体，室温电磁搅拌15-30min，逐滴加入1％络蛋白溶液，使终浓度为0.1％，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20，4℃保存备用，即获得所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液，其中所述重悬液为含5％海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
步骤(4)所述的制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫的方法为：将1∶20-1∶10稀释的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥；
步骤(6)所述的组装试纸条的方法为：将样品垫、金标组合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在衬板上，样品垫置于衬板的一端，吸水垫置于衬板的另一端，包被膜置于衬板的中间，金标结合垫置于样品垫和包被膜之间，即得到用于免疫检测的西地那非胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明西地那非单克隆抗体理化特性高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。
2、本发明胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高特异性高亲和力静电吸附的单克隆抗体为基础制备而成，具有特异性强，敏感性高的优点，能够特异性的检测出样品中是否含有西地那非以及与西地那非具有相同母核的化合物。
3、使用本发明胶体金层析检测试纸条，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，将样品用提取液混合后，取上清液进行检测，在5min即可判定检测结果，操作简便、时效性强。
4、本发明胶体金层析检测试纸条结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被减样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确、简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
5、本发明试纸条的制备方法采用喷涂工艺，简单快速，喷涂均匀，干燥快。
生物材料保藏信息
本发明杂交瘤细胞株2H5B12C3，于2010年11月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2010123。
附图说明：
图1为本发明胶体金层析试纸条的剖面结构示意图；
1-样品垫、2-金标结合垫、3-包被膜、4-T线、5-C线、6-吸水垫、7-衬板。
图2为本发明胶体金层析试纸条的俯视结构示意图；
1-样品垫、2-金标结合垫、3-包被膜、4-T线、5-C线、6-吸水垫。
图3西地那非3.0mm检测卡检西地那非五个浓度梯度的结果。
图4：西地那非3.0mm检测卡检伐地那非五个浓度梯度的结果。
图5：西地那非3.0mm检测卡检红地那非五个浓度梯度的结果。
图6：西地那非3.0mm检测卡检他达拉非五个浓度梯度的结果。
图7、N-乙酸西地那非核磁共振图谱；
图8、N-乙酸西地那非质谱；
图9、N-乙酸西地那非HPLC图谱；
图10、Western Blot免疫印迹扫描图，M是Maker，1是N-乙酸西地那非-BSA，2是BSA作为阴性对照。
具体实施方式
实施例1
A合成N-乙酸西地那非(II-i)
(1)烷基化：往反应瓶中加入20ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及1.708g、3.6×10-3mol的西地那非(IV-i)，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快速称取0.173g、4.32×10-3mol、浓度为60％的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌60分钟，直至溶液无气泡产生，然后用1ml注射器吸取1.202g、7.2×10-3mol的溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌12小时，之后将反应液倾入60ml水中分散，以20ml×3的氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入6ml无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到1.722g新的固体，收率85.31％，此固体为西地那非的烷基化物(式(V-i))；
(2)水解：将15ml无水乙醇和上述步骤所得的1.682g、3.0×10-3mol的西地那非烷基化物(式(V-i))加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入10ml、1mol/L的NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入20ml水，以3N盐酸调节至pH值为8的液体，以15ml×3的氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得1.222g白色粉状固体，收率76.47％，此固体为N-乙酸西地那非(式(II-i))；
半抗原化合物N-乙酸西地那非分子量为532.6，熔点为136℃，核磁共振验证其结构为式(II-i)，详见图7；MS：533.22(M+H+)详见图8；HPLC检测纯度为99.78％，详见图9。
具体路线如下：
B、生成人工合成抗原：
(1)将上述步骤中所得的N-乙酸西地那非(式(II-i))、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、水溶性碳化二亚胺(EDC)平衡至室温；
(2)取N-乙酸西地那非(式(II-i))、EDC和NHS，三者的摩尔比为：N-乙酸西地那非∶EDC∶NHS＝1∶10∶15，将其置入预先洗干净的圆底烧瓶，加入上述步骤中所得的适量的二甲基甲酰胺溶解，一股根据上述混合液体的多少加入二甲基甲酰胺，二甲基甲酰胺的加入量对反应影响不大，一股加入2-4ml二甲基甲酰胺，能溶解样品即可，太多对下一步反应中的蛋白载体有影响，为保证反应完全，在室温避光的条件下搅拌24h，最后生成的溶液为含式(III-i)化合物的反应液，记为二号反应液。其中烧瓶中不能有水残留，用前需烘干并预冷至室温，以免影响反应物、产物的稳定性，影响反应效率；
(3)当N-乙酸西地那非、EDC和NHS在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液牛血清白蛋白溶液(BSA溶液)，将牛血清白蛋白与硼酸缓冲液按1∶0.15(100mg溶解在15ml硼酸缓冲液)的量溶解于另一干净容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一干净圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液，其中硼酸缓冲液和载体蛋白反应液必须现配现用，硼酸缓冲液为pH9.0；
(4)将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，其中载体蛋白BSA与式(III-i)化合物比例为：1∶20。先在室温避光的条件下搅拌2小时，之后在3-5℃条件下避光搅拌48小时，反应生成N-乙酸西地那非-BSA(式(I-i))即为西地那非的人工合成抗原。
(5)等所有反应结束后，将步骤(4)所得的反应液置于20000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下透析48h，每隔3小时换一次磷酸盐缓冲液；
(6)透析上述步骤中所得的样品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为经纯化的西地那非的人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA。
具体路线如下：
实施例2杂交瘤细胞系的建立
步骤1动物免疫
人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射0.2ml(1mg/ml)。3周后，N-乙酸西地那非-BSA加等量的弗氏不完全佐剂充分混匀后，分多点小鼠皮下注射0.2ml(1mg/ml)，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉给予无佐剂抗原N-乙酸西地那非-BSA0.1ml，3天后，杀死小鼠取脾做融合用。
小白鼠骨髓瘤系从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8～12周龄为宜。
脾细胞的制备如下：
(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈处死小白鼠。
(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5)直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
(6)以2.5％FCS-1640充满离心管，并以400g离心10min。
(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8)重复(6)、(7)步骤。
(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
步骤2细胞融合
(1)取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与3×107小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；
(2)弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴(一小烧杯中)，准备融合；
(3)将37℃水浴中保温的50％PEG1.0毫升用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；
(4)加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在3分钟内加入1毫升无血清的RPMI-1640培养基(37℃)，开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；
(5)再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；
(6)将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育，CO2含量为5％；
(7)每2天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。
步骤3ELISA实验筛选阳性杂交瘤细胞
(1)N-乙酸西地那非-BSA用包被液稀释至1-20ug/ml。
(2)以50ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。
(3)弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。
(4)每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。
(5)洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
(6)每孔加50ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。
(7)加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育2小时，洗涤，拍干。
(8)加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃30分钟。
(9)以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
(10)结果判定：以P/N≥2.1，或P≥N+3SD为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
步骤4阳性杂交瘤细胞的克隆化
(1)制备小鼠腹腔细胞，同“细胞融合”一节中的方法。
(2)制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3种不同的稀释度。
(3)按每毫升加入5×104细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
(4)每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
(5)37℃、5％CO2湿润培养9天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
(6)取抗体检测阳性孔的细胞，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，从而获得了稳定分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H5B12C3。杂交瘤细胞株2H5B12C3于2010年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2010123。
(7)本法中(2)、(3)、(4)也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。
实施例3体内诱生腹水法制备单抗
通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由Balb/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选Balb/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。操作方法如下：
(1)腹腔接种液体石蜡，每只小鼠(SPF级)0.5ml。
(2)8天后腹腔接种用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。
(3)间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一股可连续采2次，通常每只小鼠可采8ml腹水；
(4)将腹水离心(2000r/min 5分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。
实施例4单抗特性鉴定
4.1单抗的滴度测定
单抗的滴度测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法滴度不同，采用凝集反应，本发明单抗的腹水滴度可达5×104。而采用ELISA检查，本发明单抗的腹水滴度可达1.0×106。
4.2免疫球蛋白的类别和亚类鉴定
方法：以适宜浓度的抗原N-乙酸西地那非-BSA包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。洗涤后，加入待检的单抗样品，100ul/孔，37℃1小时；设阴性、阳性对照孔。洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100ul/孔，37℃避光显色15分钟；用2mol/L H2SO4终止反应后，阅读各孔的OD490值。
结果：杂交瘤细胞株分泌的西地那非单克隆抗体是IgG1亚类免疫球蛋白。
4.3单抗的纯化
单抗纯化之前，一股均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心(4℃)除去细胞残渣及小颗粒物质。
硫酸铵沉淀法：
盐析：吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS(0.01mol/L PH7.2)或Tris-HCl缓冲液中。
脱盐：常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。
d.蛋白质含量的测定：
(Pr)(mg/ml)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数；或(Pr)＝OD280×稀释倍数/1.3
e.分装冻存备用。
4.4单克隆抗体的鉴定
4.4.1单抗的稳定性
复苏杂交瘤细胞株2H5B12C3(CCTCC NO：C2010123)，收集不同传代次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果表明该细胞株能够稳定的产生单克隆抗体。
4.4.2单克隆抗体的反应特异性
(1)间接ELISA法(见免疫球蛋白亚类的鉴定)检测所得单克隆抗体与N-乙酸西地那非-BSA抗原反应特点
实验结果见表1。结果表明，杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能与N-乙酸西地那非-BSA发生特异性反应，而与载体牛血清白蛋白(BSA)无交叉反应。
表1.ELISA检测单克隆抗抗体与N-乙酸西地那非-BSA的特异性反应
(2)Western Blot免疫印迹实验检单克隆抗体与N-乙酸西地那非-BSA结合反应
N-乙酸西地那非-BSA进行12％SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉在4℃封闭过夜，一抗(西地那非单克隆抗体)孵育后，洗膜三次，每次5分钟，用带IRDye 800标记的羊抗鼠二抗(1∶5000，RocklandImmunochemicals，Boyertown，PA)室温下孵育2小时，洗膜三次，每次5分钟，将膜放在Odyssey仪器(LI-COR，Inc.，Lincoln，NE)中扫描并分析图片。
结果如图10所示，在68KD左右有特异条带，表明单克隆抗体能与N-乙酸西地那非-BSA发生特异性反应，而与载体牛血清白蛋白(BSA)无交叉反应。
ELISA和Western Blot的结果都证明杂交瘤细胞株分泌的单抗能与N-乙酸西地那非-BSA发生特异性结合反应，而与载体牛血清白蛋白(BSA)无交叉反应。
实施例5胶体金层析试纸条的制备
(1)制备式(I-i)所示的西地那非人工合成抗原，详见实施例1；
(2)制备西地那非单克隆抗体，详见实施例2和实施例3；
a、制备含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；用0.1mol/LK2CO3调节所述的胶体金溶液至最适pH 8.5-9.0，将纯化的本发明西地那非单克隆抗体纯水透析后，按3μg/ml量加入胶体金溶液中，室温电磁搅拌15-30min，然后按5μg/ml的量加入鼠IgG单克隆抗体，室温电磁搅拌15-30min，逐滴加入1％络蛋白溶液，使终浓度为0.1％，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20，4℃保存备用，即获得含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液，其中所述重悬液为含5％海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
(3)将1∶15稀释的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥，制备西地那非金标结合垫3，喷涂工艺简单快速，喷涂均匀，干燥快。
(4)在包被膜3上用实施例1制备的西地那非人工抗原溶液0.6mg/ml包被直线式检测线T线4，用羊抗鼠IgG溶液2.0mg/ml包被直线式对照线C线5，两条线竖向平行排列。
(5)试纸条的组装(图1～2)：将样品垫1、金标组合垫2、包被膜3和吸水垫6依次粘附在衬板7上，样品垫1置于衬板7的一端，吸水垫6置于衬板7的另一端，包被膜3置于衬板7的中间，金标结合垫2置于样品垫1和包被膜3之间，即得到用于免疫检测的西地那非胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
实施例6
用实施例5制备的西地那非胶体金试纸条检测浓度分别为5ppb、100μg/ml、500μg/ml的西地那非溶液及蒸馏水(即西地那非浓度0mg/ml)，结果见图3，由结果看出蒸馏水(含西地那非0mg/ml)结果阴性；5ppb西地那非溶液结果为阳性；100μg/ml西地那非溶液结果阳性；500μg/ml西地那非溶液结果阳性；1mg/ml西地那非结果阳性。
用实施例5制备的西地那非胶体金试纸条检测浓度分别为5ppb、100μg/ml、500μg/ml的伐地那非溶液及蒸馏水(即伐地那非浓度0mg/ml)，结果见图4，由结果看出蒸馏水(含伐地那非0mg/ml)结果阴性；5ppb伐地那非溶液结果为阳性；100μg/ml伐地那非溶液结果阳性；500μg/ml伐地那非溶液结果阳性；1mg/ml伐地那非结果阳性。说明西地那非胶体金检测试纸适用于与其具有相同母核的衍生物伐地那非的检测。
用实施例5制备的西地那非胶体金试纸条检测浓度分别为5ppb、100μg/ml、500μg/ml的红地那非溶液及蒸馏水(即红地那非浓度0mg/ml)，结果见图5，由结果看出蒸馏水(含红地那非0mg/ml)结果阴性；5ppb红地那非溶液结果为阳性；100μg/ml红地那非溶液结果阳性；500μg/ml红地那非溶液结果阳性；1mg/ml红地那非结果阳性。说明西地那非胶体金检测试纸适用于与其具有相同母核的衍生物红地那非的检测。
用实施例5制备的西地那非胶体金试纸条检测浓度分别为5ppb、100μg/ml、500μg/ml的他达拉非溶液及蒸馏水(即他达拉非浓度0mg/ml)，结果见图6，由结果看出蒸馏水(含他达拉非0mg/ml)结果阴性；5ppb他达拉非溶液结果为阴性；100μg/ml他达拉非溶液结果阴性；500μg/ml他达拉非溶液结果阴性；1mg/ml他达拉非结果阴性。说明西地那非胶体金检测试纸不适用于他达拉非的检测。
西地那非、伐地那非、红地那非、他达拉非的结构式依次如下：
西地那非；伐地那非
红地那非；他达拉非
由上述结构式可看出西地那非、伐地那非、红地那非均具有相同的母核，而他达拉非与前三者不具有相同母核，可见本发明西地那非胶体金试纸条可用于检测西地那非以及与西地那非具有相同母核的那非类化合物，而不能用于与西地那非母核不同的化合物。
本发明检测西地那非的胶体金层析试纸条的检测反应原理：
西地那非属于小分子物质，本发明采用竞争法，即样品中的西地那非或与其具有相同母核的结构类似物和固定在包被膜3上的包被抗原N-乙酸西地那非-BSA竞争胶体金标记的西地那非单克隆抗体。当试纸条以样品垫1末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的抗西地那非金标单克隆抗体，若待测样品中不存在待测药物，则西地那非金标单克隆抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的N-乙酸西地那非-BSA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，在检测线处形成红色线条。若待测样品中存在待测药品，则西地那非金标单克隆抗体会和样品中的检测物发生免疫反应而不会向前移动，由于没有西地那非金标单克隆抗体与检测线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。对照线(5)包被有羊抗鼠IgG，无论样品中是否存在待测药物，金标结合垫中的另一种金标抗体鼠IgG金标单克隆抗体都会因毛细管作用移动到对照线(5)与羊抗鼠IgG结合，发生免疫反应，胶体金颗粒发生聚集，形成红色线条。
本发明胶体金层析试纸条特异性强，敏感度高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在5-10分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。
Claims (10)
1.一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H5B12C3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2010123。
2.一种西地那非单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的保藏号为CCTCCNO：C2010123的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求2所述的西地那非单克隆抗体在制备西地那非检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的西地那非检测试剂为西地那非检测用胶体金层析试纸条。
5.一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，包含衬板(7)和在衬板(7)上依次衔接的样品垫(1)、金标结合垫(2)、包被膜(3)和吸水垫(6)组成，金标结合垫(2)为吸附西地那非单克隆抗体胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体胶体金标记物的聚酯纤维毡，在包被膜(3)上有用西地那非抗原溶液包被直线式检测线T线(4)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线(5)，两条线竖向平行排列，其特征在于所述的西地那非单克隆抗体胶体金标记物是权利要求2所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。
6.根据权利要求5所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的西地那非抗原为西地那非人工合成抗原。
7.根据权利要求6所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的西地那非人工合成抗原为：
(1)
8.根据权利要求7所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血蓝蛋白，优选牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白，进一步优选牛血清白蛋白。
9.权利要求5所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)制备式(1)所示的西地那非人工合成抗原；
(2)制备西地那非单克隆抗体；
(3)制备含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液；
(4)利用步骤(3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫；
(5)在包被膜上用所述的西地那非人工合成抗原溶液包被直线式检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；
(6)组装试纸条。
10.根据权利要求9所述的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于：
a、步骤(3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液通过如下方法制备：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；用0.1mol/LK2CO3调节所述的胶体金溶液至最适pH 8.5-9.0，将纯化的本发明西地那非单克隆抗体纯水透析后，按3μg/ml量加入胶体金溶液中，室温电磁搅拌15-30min，然后按5μg/ml的量加入鼠IgG单克隆抗体，室温电磁搅拌15-30min，逐滴加入1％络蛋白溶液，使终浓度为0.1％，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20，4℃保存备用，即获得所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液，其中所述重悬液为含5％海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
b、步骤(4)所述的制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫的方法为：将1∶20-1∶10稀释的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥；
c、步骤(6)所述的组装试纸条的方法为：将样品垫、金标组合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在衬板上，样品垫置于衬板的一端，吸水垫置于衬板的另一端，包被膜置于衬板的中间，金标结合垫置于样品垫和包被膜之间，即得到用于免疫检测的西地那非胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
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