CN100482643C - 一种氨基脲衍生物及其单克隆抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫化学检测领域，涉及一种氨基脲衍生物，其作为半抗原的合成及其全抗原的制备方法，以及其抗体(单抗、多抗)的制备，以及一种适用于呋喃西林残留标示物氨基脲(SEM)残留检测的免疫学方法与应用。本发明建立了适用于检测食品中呋喃西林残留标示物SEM的免疫学方法，如间接竞争ELISA法，来定性和定量检测SEM；本发明还利用上述的抗原抗体制备适用于尤其是可食性动物组织的残留SEM检测的试剂盒(ELISA试剂盒、胶体金试纸条等)，该方法和试剂盒可以适合高通量样品SEM残留的检测，具有高特异性、高灵敏度、高精确度等特点。

Description

一种氨基脲衍生物及其单克隆抗体与应用

技术领域

本发明属于免疫化学检测领域，涉及一种氨基脲衍生物，其作为半抗原的合成及其全抗原的制备方法，以及其抗体(单抗、多抗)的制备，以及一种适用于呋喃西林残留标示物氨基脲(Semicarbazid，简称SEM)残留检测的免疫学方法与应用。

背景技术

呋喃西林(nitrofurazone)属于硝基呋喃类药物，是一种广谱抗菌药，因价格低廉、效果较好，被作为治疗药物和饲料添加剂用于畜、禽、水产养殖中控制疾病。由于呋喃西林分子中的药效基团——硝基，是其作为药理作用及毒性产生的主要原因，使得呋喃西林具有致畸、致癌性及诱发哺乳动物细胞染色体损伤等副作用(傅国，李宁毅，硝基呋喃类和硝基咪唑类药物的研究进展[J].青岛大学医学院学报，2003，39(4)：486～488.)，而且其毒性均大于同类药物呋喃妥因及呋喃唑酮(宋阳威，呋喃类药物检验检疫现状及对策[J]，中国动物检疫，2003，20(3)：37～38.)。欧盟于1995年将呋喃西林列为禁用药。在中国农业部2002年4月发布的第193号公告中，呋喃西林被列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中，在所有食品动物中禁用，2003年又将水产品硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划中。2006年农业部在《兽药地方标准废止目录》中禁止生产、经营、销售呋喃西林等六类药物。但由于呋喃西林具有很好的治疗及预防效果，目前仍在水产养殖、畜、禽中被广泛使用，从而导致食品中呋喃西林残留日趋严峻。因此，为保障动物性食品食用者的健康、增强中国动物性食品检疫力度、扩大贸易出口，对动物性食品中氨基脲残留的检测是非常必要的。

呋喃西林原型药在动物体内很快代谢成SEM，SEM最后离开机体，被视为呋喃西林残留的标示物，所以通常通过分析其代谢产物SEM来分析呋喃西林残留。瑞士联邦卫生局2002年颁布SEM检测限量1μg/kg，在2006年日本实施的《食品中残留农业化学品肯定列表制度》规定SEM为不得检出药，且最高残留限量为1μg/kg(田蕴，罗小群，水产品硝基呋喃类药物检测残留[J]，动物性食品安全检测，2006(7)：45～47.)。我国也规定呋喃西林在水产品中代谢物SEM不得检出；在2006年《无公害南美白对虾苗种》中质量安全要求规定呋喃西林残留标示物SEM为不得检出。

目前应用于呋喃西林残留标示物SEM的检测方法有液液萃取-高效液相色谱(液-液萃取-HPLC)、固相萃取-高效液相色谱法(简称SPE-HPLC)、液相色谱质谱联用仪(简称LC-MS)方法等，国家质量监督检验检疫总局在2005年发布了呋喃西林药残测定的标准方法——液相色谱-串联质谱法。

液质串联质谱法(LC-MS/MS)等仪器方法所需仪器价格昂贵，耗时长，对操作人员的要求较高，难于推广，不适合高通量的样品快速筛选。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。目前国内外均未见有SEM酶联免疫吸附分析技术(ELISA)报道，主要原因在于SEM分子量很小，需要经过衍生成半抗原(如CPSEM)，再经过制备全抗原和免疫得到对应的高质量抗体，同时，也缺乏检测可食性动物组织样本中残留SEM的快速检测方法和产品。因此，本领域迫切需要开发特异性检出呋喃西林药残标示物的抗体(单克隆、多克隆)，以及建立方便、灵敏、适合广泛推广的有效检测方法和制备可应用于可食性动物组织样本SEM残留检测的产品。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种合成氨基脲(SEM)的衍生物，并经过质谱鉴定。

本发明所述的一种氨基脲衍生物，是由氨基脲与对醛基苯甲酸通过酰胺键完全反应后生成的有机化合物4′-羧基-1-苯亚甲基氨基脲，缩写为CPSEM，其化学结构式为：

本发明同时提供了CPSEM与常规蛋白载体偶联得到的对应的免疫抗原和包被抗原。

免疫抗原：由所述的CPSEM与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛方法偶联成的复合物CPSEM-BSA。蛋白载体除了BSA，还可以是卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)等。

包被抗原(也称检测抗原)：由所述的CPSEM与卵清白蛋白(OVA)通过戊二醛方法偶联成的复合物CPSEM-OVA。蛋白载体除了OVA，还可以是牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)等。

本发明的第二个目的在于提供针对CPSEM的抗体。

本发明所述的一种多克隆抗体，是以所述的免疫抗原(如CPSEM-BSA)免疫动物取血制得的抗全血清，以所述的包被抗原(如CPSEM-OVA)检测该抗全血清，可以证明含抗CPSEM的多克隆抗体。例如，抗CPSEM多抗是由新西兰大白兔全血中分离获得的，是由上述免疫抗原刺激新西兰大白兔机体而产生的针对CPSEM的特异性抗体。

本发明所述的一种杂交瘤细胞株，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.C200640，是骨髓瘤细胞与产生抗氨基脲衍生物抗体的B细胞融合的细胞株，所述的B细胞得自以所述的CPSEM-BSA免疫的动物，所述的氨基脲衍生物是所述的CPSEM。

本发明所述的一种抗氨基脲衍生物的单克隆抗体，是由所述的杂交瘤细胞株GZHMD1F10(CCTCC NO.C200640)所产生的，对氨基脲衍生物CPSEM具有特异性的并含均一物质的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够有效特异的结合CPSEM，最高效价达到1.6×10⁶，同时具有很好的特异性。例如，所述的细胞株来自于SP2/0细胞与Balb/C小鼠(经上述免疫抗原免疫)脾细胞融合细胞，所述的免疫球蛋白来自于Balb/C小鼠，由杂交瘤细胞系GZHMD1F10(CCTCC NO：C200640)免疫其机体后产生腹水而纯化获得。

本发明的第三个目的在于提供一种基于上述制备获得的抗原及抗体特性且适用于SEM残留分析的酶联免疫(ELISA)检测方法，同时包括从样本中将残留的SEM进行衍生后形成CPSEM进行检测的方法。

本发明所述的一种检测样品中氨基脲残留的的方法，是用如本发明所述的单克隆抗体检测样品中通过衍生后的氨基脲。所述的检测方法，优选的是用间接竞争ELISA进行的。根据SEM与它的衍生物之间的分子量比例关系，即可推算出SEM的含量。

通过该方法(包括样本中SEM进行衍生后提取的方法)能够有效的检测SEM，该方法的灵敏度可以达到0.1ppb，样本添加回收率可达到84％以上。

本发明的第四个目的在于提供上述获得的CPSEM单克隆抗体在制备用于检测可食性动物组织样本SEM残留检测的试剂盒中的应用。

本发明所述的一种用于检测样品中氨基脲残留的试剂盒，包含所述的CPSEM的单克隆抗体。所述的试剂盒，优选的是，为一种适用于检测氨基脲即SEM的ELISA试剂盒。

该应用是基于所述的抗CPSEM单克隆抗体及建立的ELISA检测方法检测SEM的价值评定结果。该检测试剂盒可以很好的检测食品中呋喃西林的残留标示物SEM的含量，最低检测限可以达到0.1ppb，试剂盒的稳定性等相关指标都能达到国家行业标准，产品起到了很好的食品安全检测作用。

综合上述，本发明是将SEM衍生成带有酰胺键的衍生物CPSEM，以此所制备的对应全抗原(免疫抗原、包被抗原)，以及制备的由免疫抗原免疫获得的对应抗体(单抗、多抗)，并建立适用于检测食品中呋喃西林残留标示物SEM的免疫学方法，如间接竞争ELISA法，来定性和定量检测SEM；本发明还利用上述的抗原抗体制备适用于尤其是可食性动物组织的残留SEM检测的试剂盒(ELISA试剂盒、胶体金试纸条等)，该方法和试剂盒可以适合高通量样品SEM残留的检测，具有高特异性、高灵敏度、高精确度等特点，最低检测限达0.1ppb，具有良好的应用前景和重要的经济效益及社会效益。

附图说明

图1为氨基脲衍生物及其对应全抗原合成路线图。

图2为氨基脲与对醛基苯甲酸完全反应后的衍生物质谱检测图。

图3为CPSEM-OVA与CPSEM标准工作液间接竞争反应标准曲线。图中：X轴为CPSEM标准工作液的浓度对数值，Y轴为CPSEM标准液对光密度值的抑制百分率。

图4为二抗最佳工作时间的确定。

具体实施方式

本发明人经研究发现，以合成的高质量的氨基脲衍生物全抗原CPSEM-BSA作为免疫抗原，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体；免疫Balb/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0融合，获得分泌抗CPSEM抗体的杂交瘤细胞株GZHMD1F10(CCTCC NO：C200640)，杂交瘤细胞再免疫Balb/C小鼠获得的腹水经辛酸-饱和硫酸按的方法纯化得到单克隆抗体。用CPSEM与OVA偶联纯化得到的CPSEM-OVA作包被抗原包被聚乙烯板，用纯化的CPSEM抗体(单抗、多抗)与SEM或含SEM的待测样品经衍生反应后进行间接竞争ELISA。结果显示，检测方法灵敏度均可达0.1ppb，与4种同类药物及其它多种抗生素交叉反应率均小于0.01％，氨基脲样本(如猪肉)添加回收率在90％左右。三次重复灵敏度、交叉反应率及回收率实验，结果重复性、准确性好。表明制备获得的CPSEM相关抗原及其对应的抗体，建立的免疫学检测方法和产品均完全符合最高残留限量为1ppb的SEM的检测。具体实施方式概括如下：

首先，本发明人通过研究制备了具有良好免疫原性的免疫抗原和检测反应性的包被抗原。具体的，首先是用SEM与CBA通过甲醇重结晶即酰胺键反应的方法获得衍生物，经质谱鉴定得到CPSEM，再将SEM衍生物CPSEM以戊二醛法与蛋白载体BSA偶联，经紫外分光光度计扫描测定获得免疫抗原CPSEM-BSA，同理将SEM衍生物CPSEM以戊二醛法与蛋白载体OVA偶联，经紫外分光光度计扫描测定获得包被抗原CPSEM-OVA。综合而言，本发明建立了包括SEM衍生物CPSEM的合成、全抗原的制备方法以及对上述抗原或由该抗原衍生的各种有机化合物进行性质鉴定和免疫检测的方法。SEM衍生物、对应的免疫抗原和包被抗原均可由质谱仪、紫外分光光度计进行分析。

其次，本发明人通过实验，得到了由免疫抗原免疫获得的包括多克隆及单克隆的抗CPSEM抗体，建立适用于由SEM免疫抗原CPSEM-BSA获得针对CPSEM抗体(多抗、单抗)的制备方法、对获得抗体进行检测和筛选的方法等，如本领域人员共知，可测定抗体性质，例如：抗体效价、亲和力、特异性等。具体的，采用新西兰大白兔作为免疫动物，以上述合成的CPSEM-BSA为免疫原，获得多抗血清，经包被有CPSEM-OVA抗原的间接ELISA方法进行检测，结果表明，抗血清效价为5×10⁶，与其他抗生素交叉反应率均小于0.01％。

本发明通过实验(具体见实施例二)以上述合成的CPSEM-BSA为免疫原，通过免疫Balb/C小鼠，选择高效价血清的Balb/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过建立的杂交瘤细胞筛选鉴定方法得到分泌抗CPSEM抗体的杂交瘤细胞株GZHMD1F10(CCTCC NO：C200640)，杂交瘤细胞再免疫Balb/C小鼠获得的腹水经辛酸-饱和硫酸按的方法纯化得到单克隆抗体。经包被有CPSEM-OVA抗原的间接ELISA方法进行检测，结果表明，单克隆抗体效价为1.6×10⁶，与其他抗生素交叉反应率均小于0.01％。从理论出发，本发明涵盖具有含超变区的轻链和重链的蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明抗体的轻链和重链的超变区相同，或较佳的具有95％以上同源性。本发明还可涵盖与抗CPSEM单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。对于本发明的抗CPSEM单克隆抗体的重链和轻链，可用常规方法来进行测定。另外，本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还涵盖具有免疫活性的抗体片段，如：Fab、抗体重链、抗体轻链。本发明还涵盖了前述的免疫球蛋白或其片段的DNA分子，这些DNA分子序列可以按常规技术获得，并利用重组法大批量的进行表达，其通常是将片段克隆入载体，在转入原核或真核细胞，再利用常规方法，如本领域技术人员所熟知的蛋白表达等，然后从细胞中分离得到相关序列，或利用此活性蛋白或抗体片段以噬菌体展示技术获取与之相对应的抗原。

此外，本发明还通过实验建立了一种适用于SEM的检测方法，通过该方法，利用抗CPSEM单克隆抗体被CPSEM竞争的原理和价值评定，可检测出食品中的呋喃西林残留标示物SEM的含量。具体的，首先利用上述制备的CPSEM对应抗原及相关抗体建立了间接ELISA和间接竞争ELISA程序，通过试验CPSEM抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度，进一步优化包括酶标板品质、抗体加入体积、抗体(一抗、二抗)最佳反应时间等条件，最终建立竞争ELISA曲线，通过样本添加回收率等实验评价建立的免疫学方法(ELISA)对SEM或含SEM的待测样品进行检测的价值。结果表明，本发明检测方法的灵敏度为0.1ppb，与同类药物及其它多种抗生素交叉反应率均小于0.01％，与呋喃西林交叉反应率为21.4％，反应批内CV为2.7～5.6％，平均为3.7％，批间CV是3.9～6.8％，平均CV是5.2％。同时，建立的SEM样本添加回收方法检测结果显示，本发明建立的SEM检测方法中样品添加回收率达到84％以上。

最后，在以上试验的基础上，本发明提供了上述的CPSEM单克隆抗体在SEM残留检测试剂盒中的应用。利用本发明的CPSEM检测抗体及建立的SEM检测方法(包括样本添加回收方法、SEM衍生方法)，由此组成的试剂盒可用于确定食品中的SEM残留量。具体包括已封闭完全的含本发明中包被抗原CPSEM-OVA抗原的聚乙烯板、1000倍抗体工作液及稀释液、底物显色液等成分。通过抗SEM单克隆抗体建立的试剂盒，检测食品中SEM残留的灵敏度可达0.1ppb，批内和批间平均变异系数分别为3.7％，5.2％。该试剂盒的优点在于：灵敏度高、简便快捷，适于推广。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行，如：《现代免疫学技术》(湖北科学技术出版社)、《蛋白实验技术指南》、《分子克隆》等，或者按照厂商所建议的条件或操作方法进行。

材料：

(A)试剂：N，N-二环己碳二亚胺，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均为分析纯，氨基脲(SEM)，牛血清白蛋白(BSA)，卵清白蛋白(OVA)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，二环己基碳二亚胺(DCC)，1，4-二氧六环，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，PEG，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均为SIGMA产品，HAT(次黄嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶核苷T，简称为HAT培养基)及HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷T，简称为HT培养基)均为GIBCO产品。

(B)SPF级实验动物：雌性Balb/C小鼠，6-8周龄，购自广州中医药大学；雌性新西兰大白兔，12周龄，购自广东省医学实验动物中心。

(C)其他：酶标板是由支架和各自分开带孔穴的聚苯乙烯塑料条组成，购自深圳金灿华生物技术公司等国内厂家。ELISA试剂按照常规配制，其中底物显色液由过氧化氢或过氧化脲、二甲亚砜、四甲基联苯胺(TMB)，0.1mol/L的柠檬酸缓冲液组成；终止液为2mol/L的硫酸溶液；洗涤液为含吐温20的磷酸盐缓冲液；样品稀释溶液为含0.5％卵清蛋白的磷酸盐缓冲液(pH7.4)；上述配液所含及的化学试剂均为分析纯。

实施例1、人工全抗原(免疫抗原、包被抗原)的合成及多克隆抗体的制备

(1)氨基脲的衍生及人工全抗原的合成

氨基脲(SEM)衍生及以牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)为载体合成的人工免疫抗原和包被抗原的化学结构及合成路线如图1，如图所示，氨基脲与CBA通过酰胺键反应后形成其衍生物CPSEM，通过质谱鉴定后再分别与蛋白载体BSA、OVA偶联纯化后得到其对应的免疫抗原及包被抗原。

具体方法过程如下：

SEM衍生物CPSEM合成的具体过程为：取SEM 6g，CBA 9g，溶于pH7.4PBS中反应4℃过夜，用2M的HCL调pH值至3，过0.45μm滤纸收集析出沉淀物，将CPSEM沉淀物加入热(60℃)的甲醇中，搅拌溶解，配成饱和溶液，将此饱和溶液于-20℃过夜，析出晶体，收集此晶体，用液相质谱仪检测在CPSEM质谱解析特定离子峰处是否有高峰值的出现，若有表明合成CPSEM成功，峰值越高含量越大。

表.1CPSEM质谱解析结果

根据CPSEM质谱解析理论离子峰值(表1)，结合氨基脲与对醛基苯甲酸完全反应后的衍生物质谱检测结果，可以发现CPSEM分子碎片测量离子峰值(206.1，162.3，119.3)处的质谱检测峰(代表含量)最高(图2)，与预期结果相同，表明本发明成功合成了高纯度的CPSEM。

CPSEM-BSA与CPSEM-OVA的制备：取上述合成好的高纯度CPSEM0.0103g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.0232g，二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g加入到1.5ml1，4-二氧六环中室温反应过夜；5000rpm离心后取上清并加入0.34g BSA和5ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)缓冲溶液(2ml DMF，3ml PBS pH8.0)，4℃轻缓搅拌，反应过夜；次日，5000rpm离心后取上清液用分子截留孔径10000的透析袋以0.1mol/L，pH7.4PBS透析3天，取透析袋中的溶液冻干后置于4℃保存，经SDS-PAGE电泳后，CPSEM-BSA与BSA样品比较，因CPSEM-BSA分子量略大，所以该泳道显示条带有拖尾现象，而BSA泳道条带无拖尾现象，结果表明本发明实验成功合成了免疫抗原CPSEM-BSA。同理合成CPSEM-OVA。

(2)CPSEM多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以上述合成的CPSEM-BSA作为免疫抗原，免疫剂量为0.5mg/只。首次免疫时将免疫抗原(CPSEM)与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫抗原(CPSEM)加等量弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫。总共加强免疫6次，最后一次加强免疫不加佐剂，免疫期间监测血清抗体效价及特异性。于最后一次加强免疫7～10天后颈动脉放血，收集兔血清，37℃放置2h，再置于4℃2h后4000rpm离心收获上清。经包被有CPSEM-OVA抗原的间接ELISA方法检测其最终效价和特异性，结果表明，血清抗体效价为5×10⁶，与其他抗生素交叉反应率均小于0.01％。

实施例2、CPSEM单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

免疫5只雌性Balb/C小鼠，另取5只做阴性对照。每次免疫以50μg/只的CPSEM-BSA剂量免疫小鼠。

免疫程序采用两次基础免疫及三次加强免疫，免疫时间分别为：0d：基础免疫；15d：基础免疫；30d：加强免疫；45d：加强免疫；60d：加强免疫。将免疫抗原用生理盐水稀释，第一次基础免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内，第二次基础免疫取用弗氏不完全佐剂乳化好的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内，以后两次加强免疫同上述第二次基础免疫，最后一次加强免疫时取不加佐剂的抗原尾静脉或腹腔内注射。每次加强免疫后第8d尾部采血，分离血清，用间接ELISA方法来检测抗血清的效价，选择高效价血清的Balb/C小鼠，取其脾细胞进行细胞融合。

(2)杂交瘤细胞系的建立

细胞融合步骤：提前制备小鼠饲养细胞层，步骤为颈椎脱臼法将Balb/C小鼠处死，用眼科剪刀剪开腹部皮肤，利用一次性注射器将不完全1640培养液注入小鼠腹腔内，反复抽吸几次，最后将注入的液体全部吸出，放入50ml离心管中，3000rpm离心10min，用HAT培养液悬浮沉淀，混匀后以100μl/孔铺入96孔细胞培养板中。融合的具体方法：将SP2/0骨髓瘤细胞与前述免疫Balb/C小鼠脾细胞以1∶5的细胞个数比例，在50ml离心管中混匀，1000rpm，离心10min，弃上清(可用灭菌的滤纸吸干)；将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，然后在1min内慢慢滴入1ml预温至37℃的50％PEG，边加边轻轻用吸管尖搅拌；完全加完后继续搅拌30s，静置1min；然后慢慢加入37℃预温的1640基础培养液10ml。具体加入的方法：第1min逐滴滴入1ml，第2min加1ml，第3～4min加3ml，第5min加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻搅拌。最后缓慢加入30ml1640基础培养液，1000rpm离心7min，去上清，于37℃放置5min；用HAT完全培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮上述制备的饲养脾细胞，与上述融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT，接种于96孔细胞培养板中，约200μl/孔，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

杂交瘤细胞系的建立：提前制备饲养脾细胞(方法同上)，将杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板对活细胞进行计数；将细胞用1640完全培养基分别稀释到5、10、50个细胞/毫升，将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，使相应的孔平均分别含有0.5、1和5个细胞；培养第4天可换液一次，从第5～6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；在克隆后第7～9d，细胞克隆长满培养孔1/3～1/2时，即可用间接竞争法去进行抗体特异性的检测，如检出特异性抗体阳性的细胞孔，可选择抗体效价高、呈单个克隆生长、生长状况良好的细胞，继续进行再克隆。将阳性孔的细胞移至24孔培养板，并在相对应的原孔中补加新鲜培养基，以防二者同时污染或细胞死亡；待24孔板中的细胞生长良好时，可转至100ml细胞培养瓶中培养，并及时冻存。

动物体内诱生的方法制备腹水：在接种杂交瘤细胞前1～2周，先给Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡或弗氏不完全佐剂；将克隆成功的杂交瘤细胞1000rpm离心，弃上清，细胞用1640基础培养液悬浮，并将细胞数调至1×10⁶个/ml，以上每只小鼠腹腔注射0.5ml上述制备好的杂交瘤细胞悬液；接种杂交瘤细胞后约10d，可见小鼠腹部明显膨大，此时用碘酒、酒精棉球对小鼠腹部皮肤消毒后，用5ml注射器抽取腹水；将腹水于4℃1000rpm离心10min，取上清，分装后置-20℃保存。

(3)腹水的纯化

腹水的纯化：取上述制备的腹水3ml，加入0.06mol/L pH4.8的醋酸缓冲液6ml，混匀后在室温下边搅拌边加入99μl辛酸，持续搅拌30min，然后置于4℃静止2h以上。将溶液4℃1000rpm离心30min，取上清，用2mol/L的NaOH调节pH值至7.4，往上清溶液中边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，30min后，4℃静止2h以上。10000rpm离心30min，取沉淀溶于5ml0.01M，pH7.4PBS中，混匀后置入0.01M的PBS中透析，4℃透析两日，每8h换一次液，两日后取出透析袋中的溶液，收集后经紫外分光光度计测定其蛋白含量后，按5mg/ml分装冻存于-80℃。

(4)腹水的鉴定

4.1试剂的配制

按常规方法制备，其中包被稀释液：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，Na₂N₃0.2g，加双蒸水至1000ml，调pH至9.6；封闭液：卵清蛋白0.1g溶于100ml pH7.4PBS；洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，吐温20 0.5mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4；抗体稀释液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4；底物显色液(TMB-过氧化氢脲素溶液)：四甲基联苯胺(TMB)200mg，无水乙醇或二甲亚砜100ml，加双蒸水至1000ml配置成A液；Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调pH至5.0～5.4，配制成B液；最终按1∶1体积混合A、B液用于显色；终止液：18mol/L浓硫酸100ml，缓慢滴加到双蒸水至900ml。衍生化试剂为15.1mg2-硝基苯甲醛的溶液，加甲醇10ml溶解(浓度为10mM)。

4.2间接ELISA和间接竞争ELISA程序

间接ELISA的程序：取酶标板，每孔加用包被稀释液稀释的包被浓度的包被抗原CPSEM-OVA 100μl，4℃包被过夜后，用洗涤液洗板3次(下同)，每孔加入封闭液200μl，于37℃温箱中放置1h，取出洗涤后，每孔加入稀释的抗体100μl，在37℃反应1h，洗涤后，加入底物液100μl，37℃温箱中避光显色15min，最后加50μl终止液终止反应，半小时内在酶标仪上读取OD(450nm)值。

间接竞争ELISA的程序与间接ELISA程序大部分相同，不同之处在于：酶标板在用封闭液封闭并用洗涤液洗涤后，先加入所需浓度的CPSEM自制标准液50μl(例如：100ppb浓度是由1mg/ml标准工作液用灭菌水稀释10000倍配置而成)，再加入相同体积的稀释抗体50μl，在37℃温箱中反应1h，其余的步骤相同。

4.3抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定

采用方阵滴定法来确定包被抗原的最佳包被浓度和抗体最佳稀释的倍数，将包被抗原用包被稀释液倍比稀释成3.2μg/ml，0.8μg/ml，0.4μg/ml，0.2μg/ml，0.1μg/ml，0.05μg/ml等一系列的浓度，横向包被于96孔酶标板上。将抗体按照5μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.01μg/ml的稀释液纵向加入酶标板中，最后一列加入阴性对照抗体，按照间接ELISA程序，确定OD值在1.0左右并与阴性对照OD值相差最大，且相邻的OD值变化较大的孔所对应的包被抗原浓度和抗体稀释倍数即为抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释倍数。本发明试验结果确定，发明人制备的SEM抗原抗体在建立的检测方法中，选择包被抗原最佳包被浓度为0.4μg/ml，抗体的最佳工作浓度为0.05μg/mL。

4.4抗体效价的测定

用最佳包被浓度的包被抗原包被96孔酶标板，将抗体按照1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000等依次倍比稀释并将稀释好的抗体工作液纵向加入酶标板中，按照间接ELISA程序，结果以阴性平均值+3SD为临界值，大于此值之上时的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。

分别测定了上述免疫原产生的小鼠单克隆抗体的ELISA抗体效价，单抗的最高效价为1.6×10⁶。

4.5抗体特异性的鉴定

CPSEM 单克隆抗体的特异性通过对同类药物的代谢物及其它非同类药物(如抗生素等)进行交叉反应来检测，用交叉反应率CR50值来衡量其特异性。具体步骤为：用抗原最佳的包被浓度和抗体最佳作浓度，按照间接竞争ELISA步骤，测出抗体抑制药物的IC₅₀(药物的ELISA OD值降为其浓度为0时OD值的一半所对应的药物浓度)，交叉反应率(CR₅₀)即为IC₅₀(SEM)/IC₅₀(受试药物)×100％。结果表明，除了与呋喃西林CR₅₀为21.4％之外，与其它抗生素及同类药物交叉反应率均小于0.01％(表2)。

表2 本发明抗体的特异性试验

实施例3 一种适用于SEM检测的ELISA方法的建立

3.1酶标板的测定

在450nm波长下检测随机抽取的4种国内不同厂家的空白酶标板的吸光度，然后直接在四种酶标板上直接加酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1h，充分洗涤加底物溶液100μl，避光显色10min，加50μl 2mol/L硫酸溶液终止，在450nm波长下测定吸光度，并选取均匀度较好的酶标板。结果表明购自深圳金灿华公司的酶标板更适用于检测方法的建立。

3.2抗体最佳反应体积的确定

在与药物竞争反应中对抗体及药物设置5种不同的反应体积比(80μl∶20μl、65μl∶35μl、50μl∶50μl、35μl∶65μl、20μl∶80μl)，根据不同抗体与药物反应体积的配伍，选择灵敏度高、OD显示值最高的一组为最佳反应体积。结果表明抗体与药物以同体积进行反应最佳。

3.3一抗最佳反应时间的确定

在间接竞争ELISA加入反应抗体时，分别设置0.1ppb、0.5ppb、1ppb、10ppb4个药物衍生物(CPSEM)浓度，然后将4块酶标板分别以30min、60min、90min、120min的时限置放于37℃恒温箱中，再按照前述间接竞争ELISA检测步骤操作，测定各板的OD值，以最高OD测量值所需时间作为最佳反应时间。结果表明：工作液中的药物衍生物在lh竞争反应后，与抗体结合达到平衡状态，OD值达到最高。因此，一抗最佳反应时间为1h。

3.4酶标二抗最佳作用时间的确定

取4条含确定包被浓度包被抗原的聚苯乙烯塑料条，除了在加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗这一步骤后，分别取出一条在37℃恒温箱中孵育30min、45min、60min、90min，其它步骤按照前述间接竞争ELISA方法进行测定，并读取OD值。结果表明，二抗作用45min时，OD值为2.02(图4)，反应值较其他时间的OD值灵敏。由图4可知，在二抗加入后反应45min，二抗反应值均高于其它时间反应的OD值，因此，二抗最佳工作时间为45min，在该反应时间内，反应最灵敏，OD值最高。因此，确定45min为酶标二抗最佳作用时间。

3.5竞争ELISA曲线的建立和回收率实验

竞争ELISA的建立：按照前述中所确定的抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度，封闭完全后，分别取不同浓度的50μl CPSEM溶液(8.1，2.7，0.9，0.3，0.1，0ng/ml)，和50μl抗CPSEM单克隆抗体(1：80000)与包被在聚苯乙烯板条上的CPSEM-OVA检测抗原进行竞争，再加入1：5000稀释的HRP-酶标二抗，TMB-H₂O₂显色，绘制标准曲线，见图3。结果表明，用自制CPSEM标准品设定的其最低检测限为0.1ng/ml。

回收试验：取SEM药品标准液(0.5、1、2、4ng/ml)加入匀浆后的5g猪肉中，取出1g猪肉均质物，加入4ml的蒸馏水，0.5ml1 mol HCL和100ml衍生化试剂，37℃孵育过夜，再加入5ml的0.1 K₂HPO₄，0.4ml的1M的NaOH和5ml乙酸乙酯到另一干净的烧杯中在50℃下氮气吹干，获得的干粉物质用1ml正己烷溶解后添加已稀释好的0.1M PBS溶液，4000rpm离心10min后取下层液体进行分析。利用竞争法测定SEM的检测量，同时，按前述步骤做竞争曲线，结果根据测量的OD值通过曲线换算为理论值，以理论值和实际值之比做为其添加回收率结果，结果如表3，本发明建立的SEM检测方法中样品添加回收率达到84％以上。

表3 猪肉中回收率的测定

3.6灵敏度的测定

以IC₅₀(方法同前实施例2中的4.5)作为本发明检测方法的灵敏度评价指标。测定20次标准曲线的IC₅₀值，根据测定结果计算20个50％抑制时的均值。

结果表明：本发明检测方法的灵敏度为0.1ppb(图3)。

3.7特异性反应的测定

步骤同实施例2中的4.5内容。结果表明特异性较强，与同类药物交叉反应率小于0.01％，与呋喃西林交叉反应率为21.4％(表3)。

3.8精密度试验

按照本发明的间接竞争ELISA操作程序测定CPSEM标准溶液建立标准曲线，每个标准溶液设定5个孔，重复4次，根据测定的OD值计算其变异系数(CV)。结果，批内CV为2.7～5.6％，平均为3.7％。批间CV是3.9～6.8％，平均CV是5.2％。

实施例4 氨基脲ELISA检测试剂盒的组装及评价

在实施例3的基础上，本发明通过对酶标板的选择，抗原包被条件(包被浓度)，反应条件，一抗最佳反应时间，二抗最佳作用时间和检测样品处理条件等进行了优化，组装成氨基脲ELISA检测试剂盒，并对其检测结果的精确性和准确性进行了评估。结果显示：抗原(CPSEM-OVA)包被浓度为0.4μg/ml，上述CPSEM单克隆抗体工作浓度为1：50000；包被条件为4℃过夜，封闭液为1％的OVA，封闭条件为37℃孵育1h；二抗作用时间为45min，底物作用时间10min，制备的试剂盒按以上程序进行检测，其检测范围是0.1～10ppb之间，批内和批间平均变异系数分别为3.7％，5.2％。

本发明中所制备的试剂盒包括：包被有偶联抗原(CPSEM-OVA)的96孔酶标板1块，1ml/瓶的CPSEM标准液6瓶(0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb)，酶标二抗一瓶(10ml/瓶)，抗体浓缩液1ml，显色液各10ml、终止液7ml。在整个测定前，应用者须知(1)使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温(20-25℃)。(2)使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。(3)在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。在测定中，应按照下述程序进行正确操作：1.使用前将试剂盒置于室温(20～24℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2.取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2～8℃不要冷冻。3.编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。4.反应：往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液50μl，然后加入已稀释好的氯霉素单克隆抗体50μl，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应60min。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250μL洗涤液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。加入酶标记物100μl，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。5.显色：每孔加入A、B底物液各50μl，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色30min。6.测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定每孔吸光度值(OD值)。测定完毕进行结果判定，应采取百分率的计算方法来定量分析，即：标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B₀)，再乘以100％，公式如下：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0μg/L标准溶液的平均吸光度值

以氨基脲浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。

针对本发明人首次研制抗CPSEM的单克隆抗体的结果，其能与CPSEM特异的结合，与同类药物及其它常用的抗生素无交叉反应，并通过建立适宜的ELISA检测方法(包括SEM衍生的方法)对SEM及样品中SEM残留进行了检测。建立的检测方法结果与标准方法(GB/T 18932.24-2005蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法)相比，具有更高灵敏度，更低检测限，可达0.1ppb，且添加回收率的重复性及准确性均符合农畜产品的监控标准。根据此方法研制成的一种由CPSEM单克隆抗体建立的ELISA诊断试剂盒，其优点在于省时，省力，结果直观性好，灵敏度高，精确度高，可高效的监测SEM的残留。

利用CPSEM单克隆抗体建立的ELISA检测试剂盒不但可以定性，还可以半定量的测定出需检疫产品中SEM的含量，操作方法简单，价格较现行的标准方法所需费用低廉，可广泛适宜于进出口食品检测和国内农畜产品，食品检验检疫的需求。

Claims (9)

1、一种氨基脲衍生物，其特征在于：是由氨基脲与对醛基苯甲酸通过酰胺键完全反应后生成的有机化合物4′-羧基-1-苯亚甲基氨基脲，缩写为CPSEM，其化学结构式为：

2、一种多克隆抗体，其特征在于：以如权利要求1所述的氨基脲衍生物作为半抗原，与蛋白载体偶联获得的免疫抗原，经免疫动物，取血，分出抗全血清，纯化制得，并以如权利要求1所述的氨基脲衍生物与蛋白载体偶联获得的包被抗原检测该抗全血清，证明为含抗权利要求1所述的氨基脲衍生物的多克隆抗体。

3、一种杂交瘤细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心即CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：C200640，是以如权利要求1所述的氨基脲衍生物CPSEM与蛋白载体牛血清白蛋白BSA偶联形成的CPSEM-BSA作为免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合，获得分泌抗氨基脲衍生物CPSEM抗体的杂交瘤细胞株。

4、一种抗氨基脲衍生物的单克隆抗体，其特征在于：是由权利要求3所述的杂交瘤细胞株所产生的，对如权利要求1所述的氨基脲衍生物具有特异性的并含均一物质的抗体。

5、一种检测样品中氨基脲残留的的方法，其特征在于，用抗氨基脲衍生物的单克隆抗体检测样品中通过衍生后的氨基脲，其中，样品是可食性动物组织，所述的单克隆抗体是如权利要求4所述的单克隆抗体。

6、如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，该方法是用间接酶联免疫吸附分析或间接竞争酶联免疫吸附分析进行的。

7、一种用于检测样品中氨基脲残留的试剂盒，其特征在于：包含如权利要求4所述的单克隆抗体。

8、根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：为一种适用于检测氨基脲即SEM的酶联免疫吸附分析试剂盒。

9、如权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于检测样品中氨基脲残留的试剂盒的应用。

Images