CN102654500A - 一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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何红秋
李滨
牛小东
陈雍
王玉
段小炼
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Abstract

本发明公开了一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒及其检测方法，由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。通过测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。本发明具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，阀芯对中性能好，运动灵活可靠，能够起到良好的堵水效果。

Description

一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法。
背景技术
卡巴氧作为抗菌促生长剂，广泛应用于畜禽养殖，能促进动物生长、提高饲料转化率、预防和控制猪痢疾和细菌性肠炎。代谢研究和毒理学研究表明，卡巴氧在猪体内迅速转化成脱一氧和脱二氧化合物，其原形和脱氧化合物对人和动物有一定的毒性作用，主要表现为诱癌性、致突变作用、繁殖毒性。因此，1999年欧盟禁止卡巴氧在食品动物中应用，2001年加拿大也颁布法令禁止卡巴氧在市面上销售，2003年食品添加剂联合专家委员会（JECFA）对卡巴氧进行了再评价，委员会决定对卡巴氧撤销其最大残留限量(MRLs)，该残留限量由JECFA于1999年规定，肌肉和肝脏分别为5和30μg/kg。喹噁啉-2-羧酸是卡巴氧在猪体内最稳定的代谢产物，被欧盟法定为卡巴氧在猪食用组织中的残留标识物。目前在动物性食品中喹噁啉-2-羧酸的分析检测方法有很多,包括高效液相色谱法（HPLC）、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。
而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对喹噁啉-2-羧酸残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒。
本发明的目的之二在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的时间的分辨荧光免疫检测用方法。
本发明目的之一是这样实现的：一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其关键在于由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。
本发明目的之二是这样实现的：一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其关键在于：
（1）将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；
（2）将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原；
（3）用步骤（1）的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
（4）以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG；
（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；
（6）将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；
（7）将步骤（6）的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。
上述的衍生试剂是丁胺。
上述的催化剂剂是腈基磷酸二乙酯。
上述步骤（6）和（7）具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50μl的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl以缓冲液稀释的喹噁啉-2-羧酸抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100μl Eu3+-羊抗鼠抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测喹噁啉-2-羧酸。采用时间分辨荧光免疫的技术主要有两个方面：第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG。第二，Eu3+标记抗体的制备。
本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有QCA-OVA的多孔板，加入QCA-ABA或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入抗喹噁啉-2-羧酸抗体，振荡反应，游离的喹噁啉-2-羧酸与微孔板上的QCA-OVA竞争喹噁啉-2-羧酸抗体，洗涤液洗涤，没有连接的喹噁啉-2-羧酸抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中喹噁啉-2-羧酸的量。
有益效果：本发明检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。
附图说明
图1为本发明的喹噁啉-2-羧酸标准品与抗体的TR-FIA标准抑制曲线图。
实施例
1喹噁啉-2-羧酸（QCA-载体蛋白偶联物的制备
免疫原(QCA-BSA)的合成：准确称取喹噁啉-2-羧酸348mg溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pH10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入BSA溶液中（340mgBSA溶于5mL生理盐水），再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)23mg，N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)43.4mg，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液（PBS）透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用。
免疫原(QCA-OVA)的合成：准确称取喹噁啉-2-羧酸348mg溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pH10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入OVA溶液中（230mgOVA溶于5mL生理盐水），再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)23mg，N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)43.4mg，4°C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液（PBS）透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用。
2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备
2.1动物免疫
用实施例1制备的免疫原(QCA-BSA)分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2~3点注射；加强免疫，用0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14~21d，第3次免疫后7~10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3~4d，腹腔注射QCA-BSA抗原100μg/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。
2.2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备
分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫睥细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上用剪刀(操作时要换一套镊子和剪刀)剪一小口(在腹部中央)。剪开腹膜(换1套镊子和剪刀)，露出脾脏，用镊子夹住脾脏(再换1套器械)，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基(RPMI-1640)，静置2min，将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作1次。1200r/min离心10min，除去上清。将108个免疫脾细胞与1~2×107个SP2/0骨髓瘤细胞按照1∶10或1∶5的比例加入50mL离心管中，进行混匀，然后于1500r/min水平离心10min，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37℃水浴锅中。在1min内缓慢将50%PEG 0.8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30sec后，静置1min，然后慢慢加入40mL 1640基础培养基(事先进行37℃预温)。加基础培养基方法为：第1min内逐滴滴入1mL，第2min内加2mL，第3min内加3mL，第4min内加其余的4mL，在每次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的1640培养基慢慢加入。1000r/min离心5min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150μL/孔。将培养板置于37°C、5%CO2饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆。选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆。并对其他阳性孔，进行24孔扩大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0细胞的染色体数目平均数为62~68条，而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在92~103条之间，平均为97.8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目，说明是两种细胞的杂交产物。取细胞株细胞分泌的培养上清液，进行1∶10稀释后，用夹心ELISA方法测定抗体亚型，该细胞株分泌的抗体亚型为IgG1。采用辛酸－硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化。该单克隆抗体可用于制备时间分辨荧光检测试剂盒。
2.3抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的纯化
采用辛酸－硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化：取小鼠腹水10.0mL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心管中，4℃，1,800r/min离心20min；取上清液18.0mL，加入36.0mL 0.06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297μL；继续搅拌10min，然后转入4℃冰箱静置2h，4℃，15,000r/min离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤后体积为50mL；加入5.0mL0.1mol/L的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL；4℃冰箱静置2h后，4℃，12,000r/min离心30min，弃上清；沉淀用5.0mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5,000mL 0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液充分透析后，再对2,000mL蒸馏水透析，最后对3,000mL三蒸去离子水透析；然后4℃，12,000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。作SDS-PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。
2.3兔抗鼠IgG抗体的制备
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。
3组织样品预处理方法的建立
取2g动物组织（肉、肝）均质物，加入5％偏磷酸10％甲醇溶液5mL，振荡2min，4800r/min离心10min，取上清液，再按上述步骤重复提取一次，合并两次提取液。在提取液中加入乙酸乙酯6mL，振荡2min，4800r/min离心10min，取上清液，重复萃取一次，合并乙酸乙酯层。加入0.5mol/L磷酸盐缓冲液5mL反萃取，振荡1min，提取下清液，再按上述步骤重复提取一次，合并水相。取MAX柱子（60mg，3mL）净化，活化MAX柱子（3mL甲醇，3mL水）。样品提取液全部流出后，分别用0.05mol/LNaOH溶液3mL、甲醇3mL淋洗，除去杂质干扰。最后用2％甲酸甲醇溶液3mL洗脱，收集洗脱液，45℃左后氮气吹干，加入2mL二氯甲烷溶解残渣。分别向试管加入稀释后的衍生化试剂盒催化剂各10uL，置37℃水浴锅避光反应5h。反应完毕47℃氮气吹干，向离心管中加入样本稀释液2mL，振荡30s，作为试样溶液，供时间分辨荧光检测方法测定。
4制备试剂盒和检测组织样品
4.1Eu3+-羊抗鼠抗体的制备
取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5gL羊抗鼠抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mmol/LNaC1的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量（1.46A280-0.74A260），用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2mg-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HC1pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1×40cm）层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
4.2包被板固相抗原制备
将QCA-OVA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至1mg/L的包被液，48（或96）孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
4.3试剂的配制
(1)标准喹噁啉-2-羧酸（QCA）：将喹噁啉-2-羧酸标准品衍生化后，得到QCA-ABA稀释成为0ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL系列浓度，从喹噁啉-2-羧酸纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。
（2）缓冲液：8mmol/L NaC1、0.2％OVA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的Tris-HC1pH7.8。
（3）洗涤液：14.5mmol/LNaC1、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HC1pH7.8.
（4）增强液的配制：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA），50μmol三正辛基氧化膦（TOPO），1mL曲拉通X-100（TritonX-100）。
4.4试剂盒提供的试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：
（1）1×96孔板（8条×12孔，可以拆分为单孔）包被有QCA-OVA。
（2）6×喹噁啉-2-羧酸标准液，1.0mg/mL/瓶。
（3）1×喹噁啉-2-羧酸抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。
（4）1×Eu3+-羊抗鼠抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。
（5）1×增强液：15mL。
（6）1×洗涤液：30mL，用时以蒸馏水1∶25稀释。
（7）1×缓冲液：30mL。
4.5测定之前注意事项
（1）使用之前将所有试剂回升至室温（18-30℃）。
（2）使用之后立即将所有试剂放回2℃-8℃。
（3）如果样品量大建议使用多通道移液器。
（4）在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。
（5）取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2℃-8℃。
4.6具体检测步骤如下
取QCA-OVA板条，加入50μL的喹噁啉-2-羧酸标准与γ-氨基丁酸的衍生物（QCA-ABA）或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶5000稀释的喹噁啉-2-羧酸抗体50μL，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1∶600稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100μL，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准抑制曲线（附图1）计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。表1为试剂盒标准曲线抑制率测定值，本试剂盒灵敏度IC50=1.48ng/mL，在猪肌肉和猪肝脏检测线分别为0.26ng/g和0.22ng/g。
表1，试剂盒标准曲线的测定
Figure BDA00001650935100101
5本发明试剂盒的考核与应用
5.1特异性
采用间接竞争测定，按照常规方法计算抗体的交叉反应率，以交叉反应率为指标判断抗体特异性。结果如表2所示，抗体除了与3-甲基喹喔啉-2-羧酸有36.8%的交叉反应率，与喹乙醇、卡巴氧、喹赛多、喹烯酮、丁胺、四环素、红霉素无交叉反应
表2本发明抗体特异性试验结果
Figure BDA00001650935100111
5.2.准确度和精密度
将QCA标准液添加到猪肌肉或肝脏组织中，使其浓度为2.5ng/g，10ng/g，50ng/g，每个浓度重复8次，重复8天，按照实施例4所述方法提取、净化、衍生，采用时间分辨荧光免疫检测样品中的QCA浓度，并计算回收率和变异系数（结果见表3）。回收率均在96.1%~112.2%之间，板内和板间变异系数<20%.
表3本发明方法的准确度和精密度(n=8).
Figure BDA00001650935100112
5.3.本发明试剂盒的应用
本试验选择96头15kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，即对照组和试验组。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含50mg/kg喹噁啉-2-羧酸的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。连续饲喂7d后，试验组停止饲喂加药饲料。于停药后0d、4d、10d、14d分别屠宰试验组猪2头，对照组也分别在停药0d、4d、10d、14d屠宰1头，采肌肉和肝脏，同时用试剂盒和液相（HPLC）法同步测定。测定结果见表4。试验结果表明试纸具有更高的灵敏度，可用于定量检测动物性食品中的喹噁啉-2-羧酸残留。表4本发明试剂盒和HPLC法对猪肉、猪肝脏中喹噁啉-2-羧酸药物残留测试比较
Figure BDA00001650935100121

Claims (6)

1.一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。
2.一种根据权利要求1所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：
（1）将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；
（2）将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原；
（3）用步骤（1）的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
（4）以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG；
（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；
（6）将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；
（7）将步骤（6）的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
3.根据权利要求1所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。
4.根据权利要求1所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的衍生试剂是丁胺。
5.根据权利要求1所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的催化剂剂是腈基磷酸二乙酯。
6.根据权利要求1所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤（6）和（7）具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50μl的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl以缓冲液稀释的喹噁啉-2-羧酸抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100μl Eu3+-羊抗鼠抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
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