CN102830232A

CN102830232A - 检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102830232A
Application number: CN2012103517006A
Authority: CN
Inventors: 乐涛; 徐建; 何红秋; 牛小东; 陈雍; 秦建波; 王玉; 段小炼
Original assignee: Chongqing Academy of Science and Technology
Current assignee: Chongqing Academy of Science and Technology
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明公开了一种检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。所述检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒由多孔包被板、缓冲液、去碳霉糖泰乐菌素(DES)标准、抗DES的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：a、免疫原的制备；b、包被原的制备；c、单克隆抗体的制备；d、样品的前处理及检测。本发明检测方法不需要昂贵的仪器，检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、批内和批间误差小、灵敏度高和操作简单快速准确廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。

Description

检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)技术领域，用于动物源性食品中泰乐菌素和替米考星药物残留量的检测。

背景技术

泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)半合成大环内酯类畜禽专用抗生素，具有很强的抗菌活性，耐药性低，抗菌谱广，对所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用，尤其是对多种支原体及螺旋体也具有很强的抑制作用。在畜牧生产上，泰乐菌素(TYL)还用作饲料添加剂，促进动物生长。近年来，由于动物疾病流行，泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)在畜牧兽医上应用最多的药物，在兽用的抗生素中占有重要的地位。在生产中，由于不合理的使用剂量和不遵守休药期造成泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留，其残留对消费者可产生毒性作用。我国和欧盟分别对泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)在组织中残留也制定了最高残留限量(MRL)。为了控制泰乐菌素和替米考星残留，保障消费者健康，有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。

目前在动物性食品中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，其应用受到一定限制。

而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种检测动物可食性组织中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测动物可食性组织中泰乐菌素和替米考星残留的时间的分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测动物源性食品中泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)残留量。

本发明目的之一是这样实现的：检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、去碳霉糖泰乐菌素(DES)标准品溶液、抗DES的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。

本发明目的之二是这样实现的：检测泰乐菌素(TYL)和替米考星(TIL)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：

a、免疫原的制备：将半抗原去碳霉糖泰乐菌素(DES)与牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到免疫原(DES-BSA)；

b、包被原的制备：将半抗原去碳霉糖泰乐菌素(DES)与卵清蛋白(OVA)偶联，得到包被原(DES-OVA)；

c、单克隆抗体的制备：

(1)用步骤a的免疫原(DES-BSA)免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗DES的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(2)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗DES的单克隆抗体IgG，该抗体与TYL和TIL有很高交叉反应；

(3)用步骤b的包被原包被48或者96多孔包被板；

d、样品的前处理及检测：

取包被有包被原(DES-OVA)的多孔包被板，加入50μl的TYL或TIL到各自的微孔中，加50μl以缓冲液稀释的抗DES抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100μl Eu³⁺-兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的TYL或TIL含量。

上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多孔包被板作为固相载体。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测TYL和TIL。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面：第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗DES的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗DES的单克隆抗体IgG。第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有DES-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗DES抗体，振荡反应，游离的TYL或TIL与微孔板上的DES-OVA竞争抗DES抗体，洗涤液洗涤，没有连接的TYL或TIL抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-兔抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中TYL和TIL的量。

有益效果：本发明检测方法不需要昂贵的仪器，检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、批内和批间误差小、灵敏度高和操作简单快速准确廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。

附图说明

图1为本发明的TR-FIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例

1、免疫原与包被原制备

本发明免疫原(DES-BSA)和包被原(DES-OVA)合成方法。称取O-羧甲基羟胺半盐酸盐21.9mg、碳酸氢钠8.4mg溶解于三蒸水4mL中。将上述液逐滴加入到154mg DES溶解于4mL甲醇中配制得到的DES溶液中，室温磁力搅拌反应3h。反应后，减压旋转蒸发至含少量水，加入二氯甲烷4mL、无水乙醇2mL重新溶解，加入无水硫酸钠5g，振摇后静置过夜。过滤后，60℃减压旋转。称取上述蒸干物44.2mg、N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)12.4mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6.9mg溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)3mL中，室温下磁力搅拌反应12h。将上述反应液逐滴加入110mg BSA溶解于0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.0)配制得到的17mL的BSA溶液中，边加边搅拌，置室温下磁力搅拌反应过夜。离心后取上清，4℃生理盐水中透析3天，每天更换透析液2次，即得偶联物DES-BSA。2000rpm离心5mim后，取上清液分装，冷冻干燥后，-20℃冰箱保存。在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶联物DES-OVA，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。

2、单克隆抗体制备

2.1动物免疫

用步骤1制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原(DES-BSA)，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2～3点注射；加强免疫，用0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14～21天，第3次免疫后7～10天开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3～4天，腹腔注射DES-BSA抗原100μg/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。

2.2单克隆抗体制备

分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫睥细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75％酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，换一套镊子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪一小口。换一套镊子和剪刀，用剪刀剪开腹膜，露出脾脏，再换一套器械用镊子夹住脾脏，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基(RPMI-1640)，静置2min，将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作1次。1200r/min离心10min，除去上清。将10⁸个免疫脾细胞与1～2×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞按照1∶10或1∶5的比例加入50mL离心管中，进行混匀，然后于1500r/min水平离心10min，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37℃水浴锅中。在1min内缓慢将50％PEG 0.8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30sec后，静置1min，然后慢慢加入事先进行37℃预温的40mL基础培养基(RPMI-1640)。加基础培养基方法为：第1min内逐滴滴入1mL，第2min内加2mL，第3min内加3mL，第4min内加其余的4mL，在每次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的RPMI-1640培养基慢慢加入。1000r/min离心5min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150μL/孔。将培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆。选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆。并对其他阳性孔，进行24孔扩大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0细胞的染色体数目平均数为62～68条，而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在92～103条之间，平均为97.8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目，说明是两种细胞的杂交产物。取细胞株细胞分泌的培养上清液，进行1∶10稀释后，用夹心ELISA方法测定抗体亚型，该细胞株分泌的抗体亚型为IgG1。采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化。该单克隆抗体可用于制备时间分辨荧光检测试剂盒。

2.3单克隆抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化：取小鼠腹水10.0mL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心管中，4℃，1800r/min离心20min；取上清液18.0mL，加入36.0mL 0.06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCl调pH值至4.5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297μL；继续搅拌10min，然后转入4℃冰箱静置2h，4℃，15000r/min离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤后体积为50mL；加入5.0mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL；4℃冰箱静置2h后，4℃，12000r/min离心30min，弃上清；沉淀用5.0mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000mL0.01mol/L pH7.2PBS缓冲液充分透析后，再对2000mL蒸馏水透析，最后对3000mL三蒸去离子水透析；然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。作SDS-PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。

2.4兔抗鼠IgG抗体的制备

用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。

3、组织样品预处理方法

将猪肌肉、肝脏、肾脏等待检组织样品匀浆，取2g加入4mL乙酸乙酯振荡2min，室温3000r/min离心5min，取300μL上层液体于1.5mL离心管中80℃水浴蒸干(大约30min)或在氮气流下吹干，用150μL稀释液溶解残留物。

4、制备试剂盒和检测组织样品

4.1Eu³⁺-兔抗鼠抗体的制备

取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L兔抗鼠抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mmol/LNaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释兔抗鼠抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的兔抗鼠抗体加入含0.2mg-0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A₂₈₀监测收集蛋白峰，稀释分装备用。

4.2包被板固相抗原制备

将DES-OVA用50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃pH9.6缓冲液稀释至1mg/L的包被液，48(或96)孔包被板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

4.3试剂的配制

(1)DES标准品溶液配置：将DES标准品，稀释成为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.1ng/mL，0.25ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，100ng/mL系列浓度，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

(2)缓冲液：8mmol/L NaCl、0.2％OVA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN₃的Tris-HCl pH7.8。

(3)洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。

(4)增强液的配制：由15μmol β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100加入到pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液中，再定容至1升配制而成。

4.4试剂盒提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)2×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有DES-OVA。

(2)1×DES标准品溶液，1.0mg/mL/瓶。

(3)1×抗DES抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(4)1×Eu³⁺-兔抗鼠抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(5)1×增强液：15mL。

(6)1×洗涤液：30mL，用时以蒸馏水1∶25稀释。

(7)1×缓冲液：30mL。

4.5测定之前注意事项

(1)使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

(2)使用之后立即将所有试剂放回2℃-8℃。

(3)如果样品量大建议使用多通道移液器。

(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2℃-8℃。

4.6具体检测步骤如下

取DES-OVA板条，加入50μL的样品溶液到各自的微孔中，每个样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶5000稀释的抗DES抗体50μL，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1∶600稀释的Eu³⁺-兔抗鼠抗体100μL，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。根据标准抑制曲线(图1)计算样品中的TYL或TIL含量。表1为试剂盒标准曲线抑制率测定值。本试剂盒组织最低检测线(LOD)为：TYL的LOD为0.03ng/mL，TIL的LOD为0.05ng/mL；组织最低定量线(LOQ)为：TYL和TIL的LOQ分别为0.07和0.11ng ml^-1。

表1试剂盒标准曲线抑制率测定值

DES浓度ng/mL)	100	25	10	2.5	1	0.25	0.1	0.025	0.01	0
											抑制率B/B0(％)	3.5	6.5	13.3	26.1	45.8	73.1	90.2	96.1	99.1	100

5、本发明试剂盒的考核与应用

5.1特异性

采用间接竞争测定，按照常规方法计算抗体的交叉反应率，以交叉反应率指标判断抗体特异性。结果如表2所示，抗体除了与TYL、TIL和去碳霉糖泰乐菌素分别有57.1％、29.2％和2.6％的交叉反应率，与螺旋霉素、红霉素、吉他霉素、阿齐霉素、交沙霉素、竹桃霉素、罗红霉素、阿维菌素、伊维菌素无交叉反应。

表2本发明抗体特异性试验结果

5.2.准确度和精密度

将TYL和TIL标准液添加到组织中，使其浓度为50ng/g，100ng/g，200ng/g，每个浓度重复5次，重复3天，按照步骤4所述方法处理，采用时间分辨荧光免疫分析检测样品中的TYL或TIL浓度，并计算回收率和变异系数(结果见表3)。TYL回收率均在73.6％～108.5％之间，TIL回收率均在75.1％～120.5％之间，板内和板间变异系数<15.6％。

表3本发明方法的准确度和精密度(n=15)

5.3.本发明试剂盒的应用

试验选择18头15kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，即对照组和试验组。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含50mg/kg TYL的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。连续饲喂7d后，试验组停止饲喂加药饲料。于停药后0d、1d、3d分别屠宰试验组猪3头，对照组也分别在停药0d、1d、3d屠宰1头，采肌肉和肝脏，同时用试剂盒和ELISA方法、液相(HPLC)法同步测定。测定结果(如表4)显示：停药0天，TR-FIA方法测定肌肉、肝脏中TYL含量分别为185.2ng/g和485.6ng/g，而HPLC方法检测结果分别为186.4ng/g和487.5ng/g，ELISA方法检测结果分别为172.9ng/g和485.6ng/g；停药1天，TR-FIA方法测定肌肉、肝脏中TYL含量分别为77.9ng/g和132.2ng/g，而HPLC方法检测结果分别为78.3ng/g和136.2ng/g，ELISA方法检测结果分别为67.5ng/g和119.7ng/g；停药3天，TR-FIA方法测定肌肉、肝脏中TYL含量分别为18.7ng/g和61.8ng/g，而HPLC方法检测肌肉未检出、肝脏为61.4ng/g，ELISA方法检测肌肉未检出、肝脏为53.2ng/g。三种方法测定结果都能反映TYL在肌肉和肝脏中的残留量随时间的延长逐渐降低，阴性对照组检测结果均为阴性(<1ng/g)，加药组均为阳性(>1ng/g)，说明本发明试剂盒及其检测方法具有良好的实验检出能力，可以筛选出阳性(>1ng/g)样品。

表4猪肌肉和猪肝脏组织中TYL含量的测定

注：“-”表示不予计算

Claims

1.一种检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于由下列组分组成：

48或90孔包被板

抗DES的抗体冻干品

DES标准品溶液

铕标记的兔抗鼠抗体

缓冲液

洗涤液

增强液

所述DES标准品溶液浓度为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.1ng/mL，0.25ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，100ng/mL系列浓度。

2.根据权利要求1所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述缓冲液由8mmol/L NaCl、0.2％卵清蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN₃的Tris-HCl pH7.8配制而成。

3.根据权利要求1或2所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述洗涤液由14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.8配制而成。

4.根据权利要求3所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述增强液由15μmol β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100加入到pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液中，再定容至1升配制而成。

5.一种用权利要求1所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于按如下步骤进行：

a、免疫原的制备：将半抗原去碳霉糖泰乐菌素与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原DES-BSA；

b、包被原的制备：将半抗原去碳霉糖泰乐菌素与卵清蛋白偶联，得到包被原DES-OVA；

c、单克隆抗体的制备：

(1)用步骤a所述免疫原DES-BSA免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗DES的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(2)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗DES的单克隆抗体IgG；

(3)用步骤b所述包被原DES-OVA包被48或者96多孔包被板；

d、样品的前处理及检测：

取包被有包被原DES-OVA的48或者96多孔包被板，加入处理好的TYL或TIL到各自的微孔中，加入抗DES抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加入Eu³⁺-兔抗鼠抗体，振荡反应，用洗涤液洗涤，加增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的TYL或TIL含量。

6.根据权利要求5所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征要在于所述步骤d的具体操作为：取包被有DES-OVA的多孔包被板，加入50μl的处理好的TYL或TIL到各自的微孔中，加50μl以缓冲液稀释的抗DES抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100μl Eu³⁺-兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5～1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的TYL或TIL含量。

7.根据权利要求5或6所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于：所述DES标准品溶液浓度为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.1ng/mL，0.25ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，100ng/mL系列浓度。

8.根据权利要求7所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于：所述缓冲液由8mmol/LNaCl、0.2％卵清蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN₃的Tris-HClpH7.8配制而成。

9.根据权利要求5、6或8所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于：所述洗涤液由14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.8配制而成。

10.根据权利要求9所述检测泰乐菌素和替米考星的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于：所述增强液由15μmol β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100加入到pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液中，再定容至1升配制而成。