CN101482562A - 一种己烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测己烯雌酚的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对动物源性食品、血液、尿液及饲料中己烯雌酚(DES)含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测DES，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有DES－载体蛋白，加入DES标准或样品，再加入DES抗体。游离的DES与微孔板上的DES－载体蛋白竞争DES抗体，没有连接的DES抗体被洗涤除去，加入EU³⁺－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的EU³⁺－羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的DES浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中DES的含量。本发明提供的检测DES试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到1ng/mL以上。

Description

一种己烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)技术领域，用于食品和饲料中己烯雌酚药物残留量的检测。

背景技术

己烯雌酚是一种人工合成的具有酚羟基结构的二苯乙烯类雌性激素，从1938年起就在全世界范围广泛应用，在畜牧业主要作为生长促进剂用以提高饲料的利用率。动物通过食物获得的己烯雌酚一部分被排泄到环境中，一部分在动物体内残留，并通过食物链在人体内富集。激素类药物残留会使正常人的生理功能发生紊乱，更严重的是影响儿童正常的生长发育。20世纪70年代末，人们发现己烯雌酚能引发动物和人的癌症和致畸毒性，而且妊娠期间使用还能引起后代生殖系统疾病。

1972年，FAO/WHO禁止使用己烯雌酚。后来包括我国在内的世界各国都严格控制使用DES或禁止将其用作动物饲料添加剂。我国农业部农牧发[2002]1号文禁止DES及其盐、酯制剂用于所有食品动物的所有用途。对无公害食品水产品中渔药残留限量为不得检出。

己烯雌酚的检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和酶联免疫检测方法(ELISA)等。通常以ELISA作为在现场抽样快速筛选检验方法，HPLC或GC-MS作为确证性检验方法，目前，我国检测机构所用己烯雌酚ELISA检测试剂盒多为国外进口，其价格昂贵，很难在国内推广应用。国产己烯雌酚ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不高、假阳性率高、不稳定等问题。

时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成EU³⁺标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种己烯雌酚试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测食品和饲料中己烯雌酚的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。

本发明的技术方案：该检测己烯雌酚的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、己烯雌酚标准溶液，4、己烯雌酚的抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测DES。采用TRFIA的技术主要有两个方面：第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，EU³⁺标记抗体的制备。

测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。包被有DES-载体蛋白的微孔板，加入DES标准或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入DES抗体，振荡反应，游离的DES与微孔板上的DES-载体蛋白竞争DES抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DES抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU³⁺-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的EU³⁺-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到1ng/mL以上。

附图说明

图1：检测己烯雌酚的试剂盒示意图。1、多孔包被板，2、缓冲液，3、己烯雌酚标准溶液，4、己烯雌酚的抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。

图2：DES-TRFIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：制备试剂盒和检测动物组织样品

免疫抗原的制备：

本发明所述的人工免疫抗原为改造己烯雌酚(DES)成为己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)，再采用混合酸酐法与大分子载体蛋白结合，以合成的DES-HS-BSA作为免疫抗原进行动物免疫。

称取20mg～100mg己烯雌酚(DES)，加入5mL吡啶后，加入10mg～50mg琥珀酸，室温，搅拌过夜，反应完成，用酸水洗涤，抽滤沉淀，干燥，得己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)。

载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg～300mg牛血清白蛋白，溶解于50％二氧六环水溶液6mL～10mL中，调pH值为9～10，为A液；称取10mg～50mg DES-HS，溶于2mL二氧六环中，置4℃10min，依次加入三正丁胺20μL和氯甲酸异丁酯10μL，于4℃搅拌30min，作为B液。将A液在4℃滴入B液，搅拌过夜。将反应液对蒸馏水透析72小时，期间换蒸馏水5次。或萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯，以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-20℃作免疫原用。

己烯雌酚多克隆抗体的制备：

将上述合成的己烯雌酚-牛血清白蛋白结合物(DES-BSA)作免疫抗原，采用皮内或皮下多点注射方式，接种1kg～1.5kg雄性新西兰兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫时，在免疫原中加等量福氏完全佐剂混匀制成乳剂，以后免疫均加等量福氏不完全佐剂；自第二次免疫开始，每次免疫后8～10天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况，达满意效价时将兔宰杀，取全血分离血清。

抗血清经过3次硫酸铵沉淀后，再用层析柱分离纯化，对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室温，加入等量的0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7.8)，摇匀，4℃静止1小时后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。沉淀物用20mL 0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解，然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.8)，摇匀，4℃静止30分钟后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，装入透析袋，对2000mL 0.01moL/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液，加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52(取纤维素DEAE-52干粉10克，用500mL 0.01moL/L pH8.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜，抽滤)中，4℃平衡1小时，每10分钟搅拌一次，倾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2moL/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液，再对0.01moL/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液透析12小时，最后加入适量甘油-20℃保存。

Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备：

取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.15mol/L NaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500μL～1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2mg～0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A₂₈₀监测收集蛋白峰，稀释分装备用。

包被板固相抗原制备：

将己烯雌酚-卵清白蛋白结合物(DES-OVA)用50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

试剂的配制：

(1)己烯雌酚(DES)标准溶液：(0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)，从DES纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

(2)缓冲液：8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN₃的Tris-HCl pH7.8。

(3)洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。

(4)增强液的配制：1LpH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1mL曲拉通X-100(Triton X-100)。

试剂盒提供的试剂：

每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有DES-OVA。

(2)6×DES标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，0.1，1，10，100，1000ng/mL。

(3)1×DES抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(4)1×EU³⁺-羊抗兔抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(5)1×增强液：15mL。

(6)1×洗涤液：30mL，用时以蒸馏水1：25稀释。

(7)1×缓冲液：30mL。

实验室应自备的试剂：

(1)蒸馏水或去离子水；

(2)无水乙醚；

(3)三氯甲烷；

(4)正己烷；

(5)氢氧化钠溶液：0.01mol/L；

(6)磷酸溶液：磷酸(85％)+水(1+1)；

(7)甲醇；

(8)磷酸盐缓冲液：pH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.1g磷酸二氢钾(无水)、8.0g氯化钠，溶解于水中并定溶至1000mL；

(9)甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液(1+4)。

测定之前注意事项：

(1)使用之前将所有试剂回升至室温(18℃～30℃)。

(2)使用之后立即将所有试剂放回2℃～8℃。

(3)如果样品量大，建议使用多通道移液器。

(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中，并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2℃～8℃。

具体检测步骤如下：

称取4g试样(精确至0.1g)，置于试管中，加入10mL无水乙醚振摇20min后，以3500r/min离心3min，将提取液转移至另一干净试管中，重复上述操作一次，合并乙醚提取液，于40℃水浴蒸发至近干。用4mL三氯甲烷溶解残渣，然后加4mL氢氧化钠溶液振摇20min，静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内，重复上述操作一次，合并氢氧化钠溶液层。加入8mL正己烷，剧烈振摇，待分层后弃去正己烷层。用磷酸溶液调整溶液pH至7.0。每次用8mL无水乙醚提取-2次，合并乙醚层并蒸发至近干。用4mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。

取DES-OVA板条，加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1：20稀释的DES抗体50μL，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1：20稀释的EU³⁺-羊抗兔抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DES含量，见表1和图2，该例的样品浓度为0.23ng/mL。

表1

实施实例2制备试剂盒

DES-BSA抗原制备：

称取20mg～100mg己烯雌酚(DES)，加入5mL吡啶后，加入10mg～50mg琥珀酸，室温，搅拌过夜，反应完成，用酸水洗涤，抽滤沉淀，干燥，得己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)。

称取12mg DES-HS、40mgN-羟基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亚胺(EDC)溶于N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌24h，制成A液；称取50mgBSA溶于3mL 0.01mol/mL pH7.4 PBS中，制成B液。将A液逐滴加入B液，边加边搅拌，室温反应3h，将反应液蒸馏水中透析72小时，期间换蒸馏水5次。或经萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯，以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-20℃作免疫原用。

多克隆己烯雌酚A抗体的制备：与实施例1相同，略。

Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备：

取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.15mol/L NaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ H8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取1000μL加入含0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A₂₈₀监测收集蛋白峰，稀释分装备用。

固相抗原制备：与实施例1相同。

试剂的配制：与实施例1相同。

试剂盒提供的试剂：与实施例1相同。

实验室应自备的试剂：与实施例1相同。

测定之前注意事项：同实施例1。

具体检测步骤：同实施例1。

实施实例4

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测饲料样品。

实验室应自备的试剂：

(1)0.2mol/L的乙酸铵缓冲液：15.4g乙酸铵溶解于900mL水中，用冰乙酸调节pH，使其至pH5.2p±H0.2，定容至1L；

(2)1.0mol/L氢氧化钠溶液；

(3)0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3)；

(4)甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2％甲酸)溶液；

(5)固相萃取柱：OasisMAX柱(60mg，3mL)或相当者。

其它同实施例1。

具体检测步骤如下：

准确称取5.0g±0.1g动物饲料于50mL具盖的离心管中，加入10mL0.2mol/L的乙酸铵缓冲液，均质1min，加入10mL乙醚，漩涡震荡提取3min，于3500r/min离心5min，吸取乙醚层于另一试管中。重复乙醚提取一次，合并乙醚层，常温下用氮气吹干。加入2mL三氯甲烷溶解残余物，加入5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液，漩涡震荡1min，于1500r/min离心5min，上层水相移入另一试管中，重复氢氧化钠溶液提取一次，合并氢氧化钠提取液。

合并的氢氧化钠提取液过MAX固相萃取柱，流速2mL/min，依次用5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液和5mL0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3)淋洗小柱，待溶液流过固相萃取柱后，在65kPa的负压下，减压抽干。加入5mL甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2％甲酸)溶液洗脱，控制流速在2mL/min，收集洗脱液，蒸发至近干。用5mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。

取DES-OVA板条，加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1：20稀释的DES抗体50μL，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1：20稀释的EU³⁺-羊抗兔抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DES含量，见表2和图2，该例的样品浓度为0.17ng/mL。

表2

Claims (8)

1、一种检测己烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板(1)，缓冲液(2)，己烯雌酚标准溶液(3)，己烯雌酚的抗体冻干品(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将DES-OVA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的己烯雌酚标准溶液(3)，从DES纯品中稀释得到，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，共6瓶，DES浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的己烯雌酚的抗体冻干品(4)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mg DES-BSA，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μL制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。

5、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

6、根据权利要求5所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃pH8.5-9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500-1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16小时，反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

7、一种用权利要求1所述的试剂盒检测己烯雌酚的方法，其特征是取包被有DES-OVA的微孔包被板，加入DES标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入DES抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的DES含量。

8、根据权利要求8所述的检测己烯雌酚的方法，其操作为：取包被有DES-OVA的微孔包被板，加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL以缓冲液(2)作稀释剂，1：20稀释DES抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1：20稀释的100μLEU³⁺-羊抗兔抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的DES含量。

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