CN101482562A - 一种己烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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宓晓黎
李红
陆茂林
金坚
李利东
黄飚
袁建兴
司宏飞
杜姝莲
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Abstract

一种检测己烯雌酚的试剂盒及其检测方法,属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域,用于对动物源性食品、血液、尿液及饲料中己烯雌酚(DES)含量的检测。本发明配制的试剂盒,采用TRFIA检测DES,测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有DES-载体蛋白,加入DES标准或样品,再加入DES抗体。游离的DES与微孔板上的DES-载体蛋白竞争DES抗体,没有连接的DES抗体被洗涤除去,加入EU3+-羊抗兔抗体,标记免疫反应后没有连接的EU3+-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后,用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,荧光强度与样品中的DES浓度成反比,对照标准曲线即可确定被测样品中DES的含量。本发明提供的检测DES试剂盒结构简单,使用方便、廉价、灵敏度高,可以达到1ng/mL以上。

Description

一种己烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)的检测试剂盒及其检测方法,属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay,TRFIA)技术领域,用于食品和饲料中己烯雌酚药物残留量的检测。
背景技术
己烯雌酚是一种人工合成的具有酚羟基结构的二苯乙烯类雌性激素,从1938年起就在全世界范围广泛应用,在畜牧业主要作为生长促进剂用以提高饲料的利用率。动物通过食物获得的己烯雌酚一部分被排泄到环境中,一部分在动物体内残留,并通过食物链在人体内富集。激素类药物残留会使正常人的生理功能发生紊乱,更严重的是影响儿童正常的生长发育。20世纪70年代末,人们发现己烯雌酚能引发动物和人的癌症和致畸毒性,而且妊娠期间使用还能引起后代生殖系统疾病。
1972年,FAO/WHO禁止使用己烯雌酚。后来包括我国在内的世界各国都严格控制使用DES或禁止将其用作动物饲料添加剂。我国农业部农牧发[2002]1号文禁止DES及其盐、酯制剂用于所有食品动物的所有用途。对无公害食品水产品中渔药残留限量为不得检出。
己烯雌酚的检测方法主要有:高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和酶联免疫检测方法(ELISA)等。通常以ELISA作为在现场抽样快速筛选检验方法,HPLC或GC-MS作为确证性检验方法,目前,我国检测机构所用己烯雌酚ELISA检测试剂盒多为国外进口,其价格昂贵,很难在国内推广应用。国产己烯雌酚ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不高、假阳性率高、不稳定等问题。
时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂,其一端和镧系元素结合,另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接,制成EU3+标记抗体(抗原),它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下,测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量,但实际上这种复合物的荧光强度相当弱,只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution),使镧系元素从复合物中解离下来,并与增强液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊,在紫外光的激发下发射很强的荧光,增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,即可确定样品中抗原的量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种己烯雌酚试剂盒及检测方法,用于定性或定量地检测食品和饲料中己烯雌酚的残留量;检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小,并具有简便、快速、准确的特点。
本发明的技术方案:该检测己烯雌酚的试剂盒是由1、多孔包被板,2、缓冲液,3、己烯雌酚标准溶液,4、己烯雌酚的抗体冻干品,5、铕标记的羊抗兔抗体,6、洗涤液,7、增强液所组成。
本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测DES。采用TRFIA的技术主要有两个方面:第一,特异性多克隆抗体的制备,利用抗原免疫家兔,获得含有抗体的血清,经过生化提纯分离免疫球蛋白;第二,EU3+标记抗体的制备。
测定方法为:测定的基础是标记免疫反应。包被有DES-载体蛋白的微孔板,加入DES标准或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入DES抗体,振荡反应,游离的DES与微孔板上的DES-载体蛋白竞争DES抗体,洗涤液洗涤,没有连接的DES抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗兔抗体,进行标记免疫反应,再用洗涤液洗涤,反应后没有连接的EU3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后,在紫外光的激发下发射很强的荧光,用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,荧光强度与样品中的浓度成反比,对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。
本发明的有益效果:该试剂盒结构简单,使用方便、廉价、灵敏度高,可以达到1ng/mL以上。
附图说明
图1:检测己烯雌酚的试剂盒示意图。1、多孔包被板,2、缓冲液,3、己烯雌酚标准溶液,4、己烯雌酚的抗体冻干品,5、铕标记的羊抗兔抗体,6、洗涤液,7、增强液。
图2:DES-TRFIA标准曲线图。
具体实施方式
实施例1:制备试剂盒和检测动物组织样品
免疫抗原的制备:
本发明所述的人工免疫抗原为改造己烯雌酚(DES)成为己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS),再采用混合酸酐法与大分子载体蛋白结合,以合成的DES-HS-BSA作为免疫抗原进行动物免疫。
称取20mg~100mg己烯雌酚(DES),加入5mL吡啶后,加入10mg~50mg琥珀酸,室温,搅拌过夜,反应完成,用酸水洗涤,抽滤沉淀,干燥,得己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)。
载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg~300mg牛血清白蛋白,溶解于50%二氧六环水溶液6mL~10mL中,调pH值为9~10,为A液;称取10mg~50mg DES-HS,溶于2mL二氧六环中,置4℃10min,依次加入三正丁胺20μL和氯甲酸异丁酯10μL,于4℃搅拌30min,作为B液。将A液在4℃滴入B液,搅拌过夜。将反应液对蒸馏水透析72小时,期间换蒸馏水5次。或萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯,以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液,分装保存于-20℃作免疫原用。
己烯雌酚多克隆抗体的制备:
将上述合成的己烯雌酚-牛血清白蛋白结合物(DES-BSA)作免疫抗原,采用皮内或皮下多点注射方式,接种1kg~1.5kg雄性新西兰兔;每隔4周免疫1次,第一次免疫时,在免疫原中加等量福氏完全佐剂混匀制成乳剂,以后免疫均加等量福氏不完全佐剂;自第二次免疫开始,每次免疫后8~10天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况,达满意效价时将兔宰杀,取全血分离血清。
抗血清经过3次硫酸铵沉淀后,再用层析柱分离纯化,对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL,平衡至室温,加入等量的0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液,充分混匀,加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7.8),摇匀,4℃静止1小时后,以5000转/分钟离心5分钟,去上清液。沉淀物用20mL 0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解,然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.8),摇匀,4℃静止30分钟后,以5000转/分钟离心5分钟,去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物,装入透析袋,对2000mL 0.01moL/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液,加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52(取纤维素DEAE-52干粉10克,用500mL 0.01moL/L pH8.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜,抽滤)中,4℃平衡1小时,每10分钟搅拌一次,倾入布氏漏斗中,用pH8.0的0.2moL/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液,再对0.01moL/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液透析12小时,最后加入适量甘油-20℃保存。
Eu3+-羊抗兔抗体的制备:
取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2mL,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0.15mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260),用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500μL~1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2mg~0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中,30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析,A280监测收集蛋白峰,稀释分装备用。
包被板固相抗原制备:
将己烯雌酚-卵清白蛋白结合物(DES-OVA)用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液,96(或48)孔微孔板各孔加100μL,4℃放置过夜。弃去包被液,冲洗三次,加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭,4℃放置过夜。弃去封闭液,真空抽干,板条密封后置-20℃冷冻保存。
试剂的配制:
(1)己烯雌酚(DES)标准溶液:(0ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL),从DES纯品中稀释得到,稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。
(2)缓冲液:8mmol/L NaCl、0.1%BSA、0.2%牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mL/L Tween-80和0.1%NaN3的Tris-HCl pH7.8。
(3)洗涤液:14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2%NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。
(4)增强液的配制:1LpH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA),50μmol三正辛基氧化膦(TOPO),1mL曲拉通X-100(Triton X-100)。
试剂盒提供的试剂:
每一个盒中的试剂足够进行96个测量,盒中的材料如下:
(1)1×96孔板(8条×12孔,可以拆分为单孔)包被有DES-OVA。
(2)6×DES标准液,1.0mL/瓶,标准液浓度为:0,0.1,1,10,100,1000ng/mL。
(3)1×DES抗体冻干品,用时0.5mL蒸馏水溶解。
(4)1×EU3+-羊抗兔抗体冻干品,用时0.5mL蒸馏水溶解。
(5)1×增强液:15mL。
(6)1×洗涤液:30mL,用时以蒸馏水1:25稀释。
(7)1×缓冲液:30mL。
实验室应自备的试剂:
(1)蒸馏水或去离子水;
(2)无水乙醚;
(3)三氯甲烷;
(4)正己烷;
(5)氢氧化钠溶液:0.01mol/L;
(6)磷酸溶液:磷酸(85%)+水(1+1);
(7)甲醇;
(8)磷酸盐缓冲液:pH7.2,取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.1g磷酸二氢钾(无水)、8.0g氯化钠,溶解于水中并定溶至1000mL;
(9)甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液(1+4)。
测定之前注意事项:
(1)使用之前将所有试剂回升至室温(18℃~30℃)。
(2)使用之后立即将所有试剂放回2℃~8℃。
(3)如果样品量大,建议使用多通道移液器。
(4)在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔。
(5)取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中,并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2℃~8℃。
具体检测步骤如下:
称取4g试样(精确至0.1g),置于试管中,加入10mL无水乙醚振摇20min后,以3500r/min离心3min,将提取液转移至另一干净试管中,重复上述操作一次,合并乙醚提取液,于40℃水浴蒸发至近干。用4mL三氯甲烷溶解残渣,然后加4mL氢氧化钠溶液振摇20min,静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内,重复上述操作一次,合并氢氧化钠溶液层。加入8mL正己烷,剧烈振摇,待分层后弃去正己烷层。用磷酸溶液调整溶液pH至7.0。每次用8mL无水乙醚提取-2次,合并乙醚层并蒸发至近干。用4mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。
取DES-OVA板条,加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中,每个标准和样品必须使用新的吸头,加缓冲液1:20稀释的DES抗体50μL,25℃振荡1小时,洗涤液洗三次,加缓冲液1:20稀释的EU3+-羊抗兔抗体100μL,25℃振荡1小时,用洗涤液洗六次,加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DES含量,见表1和图2,该例的样品浓度为0.23ng/mL。
表1
Figure A200810242778D00101
实施实例2制备试剂盒
DES-BSA抗原制备:
称取20mg~100mg己烯雌酚(DES),加入5mL吡啶后,加入10mg~50mg琥珀酸,室温,搅拌过夜,反应完成,用酸水洗涤,抽滤沉淀,干燥,得己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)。
称取12mg DES-HS、40mgN-羟基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亚胺(EDC)溶于N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)中,室温搅拌24h,制成A液;称取50mgBSA溶于3mL 0.01mol/mL pH7.4 PBS中,制成B液。将A液逐滴加入B液,边加边搅拌,室温反应3h,将反应液蒸馏水中透析72小时,期间换蒸馏水5次。或经萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯,以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液,分装保存于-20℃作免疫原用。
多克隆己烯雌酚A抗体的制备:与实施例1相同,略。
Eu3+-羊抗兔抗体的制备:
取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体2mL,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0.15mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 H8.5缓冲液。收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260),用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取1000μL加入含0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中,30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析,A280监测收集蛋白峰,稀释分装备用。
固相抗原制备:与实施例1相同。
试剂的配制:与实施例1相同。
试剂盒提供的试剂:与实施例1相同。
实验室应自备的试剂:与实施例1相同。
测定之前注意事项:同实施例1。
具体检测步骤:同实施例1。
实施实例4
试剂盒提供的试剂与实施例1相同,用于检测饲料样品。
实验室应自备的试剂:
(1)0.2mol/L的乙酸铵缓冲液:15.4g乙酸铵溶解于900mL水中,用冰乙酸调节pH,使其至pH5.2p±H0.2,定容至1L;
(2)1.0mol/L氢氧化钠溶液;
(3)0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3);
(4)甲基叔丁醚+甲醇(9+1,含2%甲酸)溶液;
(5)固相萃取柱:OasisMAX柱(60mg,3mL)或相当者。
其它同实施例1。
具体检测步骤如下:
准确称取5.0g±0.1g动物饲料于50mL具盖的离心管中,加入10mL0.2mol/L的乙酸铵缓冲液,均质1min,加入10mL乙醚,漩涡震荡提取3min,于3500r/min离心5min,吸取乙醚层于另一试管中。重复乙醚提取一次,合并乙醚层,常温下用氮气吹干。加入2mL三氯甲烷溶解残余物,加入5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液,漩涡震荡1min,于1500r/min离心5min,上层水相移入另一试管中,重复氢氧化钠溶液提取一次,合并氢氧化钠提取液。
合并的氢氧化钠提取液过MAX固相萃取柱,流速2mL/min,依次用5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液和5mL0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3)淋洗小柱,待溶液流过固相萃取柱后,在65kPa的负压下,减压抽干。加入5mL甲基叔丁醚+甲醇(9+1,含2%甲酸)溶液洗脱,控制流速在2mL/min,收集洗脱液,蒸发至近干。用5mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。
取DES-OVA板条,加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中,每个标准和样品必须使用新的吸头,加缓冲液1:20稀释的DES抗体50μL,25℃振荡1小时,洗涤液洗三次,加缓冲液1:20稀释的EU3+-羊抗兔抗体100μL,25℃振荡1小时,用洗涤液洗六次,加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DES含量,见表2和图2,该例的样品浓度为0.17ng/mL。
表2
Figure A200810242778D00131

Claims (8)

1、一种检测己烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒,其特征是由多孔包被板(1),缓冲液(2),己烯雌酚标准溶液(3),己烯雌酚的抗体冻干品(4),铕标记的羊抗兔抗体(5),洗涤液(6)和增强液(7)所组成。
2、根据权利要求1所述的试剂盒,其中的包被板(1)包被固相抗原,用50mmol/L pH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将DES-OVA稀释至10mg/L做为包被液,96或48孔微孔板各孔加100μL,4℃放置过夜,弃去包被液,冲洗三次,加150μL含3g/L OVA的上述缓冲液封闭,4℃放置过夜,弃去封闭液,真空抽干,板条密封后置-20℃冷冻保存。
3、根据权利要求1所述的试剂盒,其中的己烯雌酚标准溶液(3),从DES纯品中稀释得到,稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液,共6瓶,DES浓度分别为:0ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL。
4、根据权利要求1所述的试剂盒,其中的己烯雌酚的抗体冻干品(4),用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mg DES-BSA,用匀浆器混合2小时,制得油包水抗原乳化剂,取600μL制备好的油包水抗原乳化剂,在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射,在免疫3~4次后,可进行鉴定,血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。
5、根据权利要求1所述的试剂盒,其中的铕标记的羊抗兔抗体(5),将购得的羊抗兔抗体,经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0,收集蛋白峰,取已转换的羊抗兔抗体加入Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸,反应过夜,反应液经柱层析,收集蛋白峰,稀释、分装备用。
6、根据权利要求5所述的试剂盒,其中的铕标记的羊抗兔抗体(5),取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2mL,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5-9.0缓冲液,收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量,用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L,取500-1000μL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中,28-30℃磁力搅拌反应16小时,反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析,收集蛋白峰,稀释、分装备用。
7、一种用权利要求1所述的试剂盒检测己烯雌酚的方法,其特征是取包被有DES-OVA的微孔包被板,加入DES标准或处理好的样品到各自的微孔中,再加入DES抗体,振荡反应,洗涤液洗涤,加铕标记的羊抗兔抗体,进行标记免疫反应,洗涤液洗涤,加增强液振荡后测量荧光强度cps,对照标准曲线计算样品中的DES含量。
8、根据权利要求8所述的检测己烯雌酚的方法,其操作为:取包被有DES-OVA的微孔包被板,加入50μL的DES标准或处理好的样品到各自的微孔中,加50μL以缓冲液(2)作稀释剂,1:20稀释DES抗体,25-37℃振荡0.5-1小时,洗涤液洗三次,加以缓冲液(2)1:20稀释的100μLEU3+-羊抗兔抗体,25-37℃振荡0.5-1小时,用洗涤液洗六次,加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,从标准曲线计算样品中的DES含量。
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