CN108196047A - 一种固相抗体双夹心免疫反应体系及其试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相抗体双夹心免疫反应体系及其试剂盒与应用，所述免疫反应体系采用全固相待反应组分，通过将检测抗体固相化，预置到反应孔或反应管中，待样本加入反应孔或反应管后，孵育后即可一步完成免疫反应，所述检测抗体固相化的方法为：将检测抗体预制微球或将检测抗体冻干；所述免疫反应体系的试剂盒应用与免疫检测方面，可以简化实验操作，同时提高免疫反应体系稳定性，降低基质效应，由此可以大大提高借助于免疫反应体系的实验效率，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫反应检测技术领域，更具体地，涉及一种固相抗体双夹心免疫反应体系及其试剂盒与应用。
背景技术
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzyme linkedimmunosorbent assay, ELISA）后，该方法在科研和诊断领域得到了广泛的应用。根据检测对象和方法原理的不同，ELISA又可以分为直接发、间接法、双抗体夹心法、竞争法等多种形式。其中，双抗体夹心法由于适合测定目标抗原的浓度，在检测和诊断领域被应用的最为广泛。在此基础上，通过更换抗体标记物、标记酶或者反应底物，又衍生出了荧光法、化学发光法、上转发光、时间分辨等方法学，但本质上，还是通过双抗体夹心反应原理来检测抗原浓度。
现有的双抗体夹心免疫反应体系一般是将捕获抗体包被于固相载体上，待测抗原与之反应后，再加入检测抗体与被捕获的抗原反应。检测抗体一般需要以液体形式存在，可以提供浓缩液供在使用时临时稀释，或者直接提供稀释好的工作浓度检测抗体。然而，这两种方式都有其明显缺点：若以浓缩液提供，需要在用时临时稀释，操作繁琐，稀释后的抗体不能长期保存，容易浪费；若以稀释好的工作浓度提供，抗体在低浓度下容易不稳定。此外，无论采用上述何种形式，用户都需要进行两次加液或孵育，增加了操作复杂度。
因此，急需开发一种可以简化操作同时提高稳定性，降低基质效应的免疫反应体系，由此可以大大提高借助于免疫反应体系的实验效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有双抗体夹心免疫反应体系操作复杂，容易造成抗体浪费及抗体稀释后不够稳定的技术不足，提供一种操作简单，效果稳定，基质效应低的固相抗体双夹心免疫反应体系。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种固相抗体双夹心免疫反应试剂盒。
本发明还一要解决的技术问题是提供所述固相抗体双夹心免疫反应试剂盒的制备方法。
本发明还一要解决的技术问题是提供所述固相抗体双夹心免疫反应试剂盒在免疫检测方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种固相抗体双夹心免疫反应体系，所述免疫反应体系采用全固相待反应组分，通过将检测抗体固相化，预置到反应孔或反应管中，待样本加入反应孔或反应管后，孵育后即可完成免疫反应；
所述检测抗体固相化的方法为：将检测抗体预制微球或将检测抗体冻干。
进一步地，所述将检测抗体预制微球或将检测抗体冻干的方法包括以下步骤：
S01. 将检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A于-5～-196℃冷冻
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥0.5～48小时，得固相检测抗体。
更进一步地，所述检测抗体固相化的方法还包括将检测抗体表面包裹薄膜。
进一步地，所述将检测抗体表面包裹薄膜的方法为：对冻干后的或微球化的抗体表面进行喷金处理。
优选地，所述喷金处理的条件为电流10～50mA，时间20～300秒；所述喷金处理采用的设备为离子溅射镀膜仪。
优选地，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 0.5%～10%；
牛血清白蛋白 0.5%～10%；
蔗糖 0.5%～10%；
海藻糖 0.5%～10%；
聚乙二醇（PEG） 0.5%～10%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 0.5%～10%。
优选地，所述检测抗体为酶联抗体、荧光标记抗体、吖啶脂标记抗体或生物素标记抗体。
提供一种固相抗体双夹心免疫反应试剂盒，所述试剂盒采用上述固相抗体双夹心免疫反应体系，所述试剂盒包括：反应孔或反应管、反应底物、抗原标准品、洗涤液、稀释液。
提供上述试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S11. 制备固相化的检测抗体；
S12. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S13. 将步骤S11制备的检测抗体预置到反应孔或反应管中；
S14. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
提供上述试剂盒在免疫检测方面的应用，所述应用的方法为包括以下步骤：
S21. 在反应孔或反应管中加入待测样品，孵育；
S22. 弃去多余样品，洗涤，加入反应底物；
S23. 观察或检测反应结果。
本发明具有以下有益效果：
1. 操作简单：采用本发明固相抗体双夹心免疫反应体系，加入样本一步反应即可完成双抗体夹心免疫反应，大大简化实验流程，大大缩短试验时间；其次，本发明提供了将检测抗体固相化的方法，操作简单，效果稳定，可用于工业化生产；
2. 稳定性高：本发明固相抗体双夹心免疫反应体系或本发明固相抗体双夹心免疫反应试剂盒将检测抗体以干粉或者微球形式预置在反应孔或反应管中，一方面使得抗体的稳定性大大高于液态形式，另一方面，固态的检测抗体方便储存、运输，具有广阔的应用前景；
3. 灵敏度高：由于固相形式的检测抗体避免了液体形式检测抗体与待测样本的互相稀释，所以在相同浓度的情况下，显色OD值显著高于传统液体形式，提高了抗体的灵敏度。
4. 基质效应低：固相检测抗体干粉或者微球本身含有相应的缓冲液和蛋白、多糖等成分，对于不同的检测样本，具有一定的缓冲能力，避免了反应体系的剧烈变化，一定程度上可以减轻基质效应。
附图说明
图1 干粉形式的IL-1β检测抗体免疫反应结果。
图2 微球形式的IL-1β检测抗体免疫反应结果。
图3 传统双抗夹心IL-1β ELISA免疫反应结果。
图4 干粉形式的IFN-γ检测抗体免疫反应结果。
图5 微球形式的IFN-γ检测抗体免疫反应结果。
图6 传统双抗夹心IFN-γ ELISA免疫反应结果。
图7 IL-1β检测抗体与对照抗体稳定性试验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料及仪器为常规市购或商业途径获得的试剂原料。
特殊说明：在抗体冷冻的过程中，-5～-20℃的冷冻温度采用普通冰箱冷冻室；-20℃～-40℃的冷冻温度采用冷冻干燥机；-60℃～-80℃的冷冻温度采用超低温冰箱；-80～-196℃的冷冻温度采用液氮进行冷冻。
检测反应结果的方法：将固相的检测抗体取一定量溶解后，分别加入浓度为（15.625~500pg/mL）的反应底物，用紫外分光光度计检测抗体浓度。
实施例1干粉形式的IL-1β检测试剂盒
按以下步骤制备干粉形式IL-1β检测抗及干粉形式的IL-1β检测试剂盒：
S01. 将IL-1β检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-5℃冷冻；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥48小时，得固相检测抗体；
S05. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S06. 将检测抗体预置到孔板中。
S07. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 5%；
牛血清白蛋白 5%；
蔗糖 5%；
海藻糖 5%；
聚乙二醇（PEG）5%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 5%。
之后，按以下步骤使用制备好的IL-1β检测试剂盒检测标准品中IL-1β抗原浓度：
S21. 在反应装置中加入含IL-1β的待测样品，孵育1 h；
S22. 弃去多余样品，洗涤3次，加入反应底物TMB；
S23.检测反应结果。结果如附图1所示。
对比附图3所示的传统形式的IL-1β抗体，由于固相的检测抗体避免了液态检测抗体试剂对于检测样本的稀释，干粉形式在线性度满足要求的条件下（R²>0.99），显色的OD值高于传统形式，除了操作的简便，还提高了灵敏度。
实施例2微球形式的IL-1β检测试剂盒
按以下步骤制备微球形式IL-1β检测抗体及微球形式的IL-1β检测试剂盒：
S01. 将IL-1β检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-196℃液氮中冷冻成微球；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥0.5小时，得固相检测抗体；
S05. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S06. 将检测抗体预置到孔板中。
S07. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 0.5%；
牛血清白蛋白 1%；
蔗糖 0.5%；
海藻糖 0.5%；
聚乙二醇（PEG）1%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 1%。
之后，按以下步骤使用制备好的IL-1β检测试剂盒检测标准品中IL-1β抗原浓度：
S21. 在反应装置中加入含IL-1β的待测样品，孵育1 h；
S22. 弃去多余样品，洗涤3次，加入反应底物TMB；
S23.检测反应结果。结果如附图2所示。
对比附图3所示的传统形式的IL-1β抗体，由于固相的检测抗体避免了液态检测抗体试剂对于检测样本的稀释，微球形式在线性度满足要求的条件下（R²>0.99），显色的OD值高于传统形式，除了操作的简便，还提高了灵敏度。
实施例3 干粉形式的IFN-γ检测试剂盒
按以下步骤制备干粉形式IFN-γ检测抗体及干粉形式的IFN-γ检测试剂盒：
S01. 将IFN-γ检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-30℃冷冻；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥24小时，得固相检测抗体；
S05. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S06. 将检测抗体预置到孔板中；
S07. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素0.5%；
牛血清白蛋白 0.5%；
蔗糖 0.5%；
海藻糖 0.5%；
聚乙二醇（PEG）0.5%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.5%。
之后，按以下步骤使用制备好的IFN-γ检测试剂盒检测标准品中IFN-γ抗原浓度：
S21. 在反应装置中加入含IFN-γ的待测样品，孵育1 h；
S22. 弃去多余样品，洗涤3次，加入反应底物TMB；
S23. 检测反应结果。结果如附图4所示。
对比附图6所示的传统形式的IFN-γ抗体，由于固相的检测抗体避免了液态检测抗体试剂对于检测样本的稀释，干粉形式在线性度满足要求的条件下（R²>0.99），显色的OD值高于传统形式，除了操作的简便，还提高了灵敏度。
实施例4 微球形式的IFN-γ检测试剂盒
按以下步骤制备干粉形式IFN-γ检测抗体及干粉形式的IFN-γ检测试剂盒：
S01. 将IFN-γ检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-196℃液氮中冷冻成微球；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥12小时，得固相检测抗体；
S05. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S06. 将检测抗体预置到孔板中；
S07. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 10%；
牛血清白蛋白 10%；
蔗糖 10%；
海藻糖 10%；
聚乙二醇（PEG）10%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 10%。
之后，按以下步骤使用制备好的IFN-γ检测试剂盒检测标准品中IFN-γ抗原浓度：
S21. 在反应装置中加入含IFN-γ的待测样品，孵育1 h；
S22. 弃去多余样品，洗涤3次，加入反应底物TMB；
S23. 检测反应结果。结果如附图5所示。
对比附图6所示的传统形式的IFN-γ抗体，由于固相的检测抗体避免了液态检测抗体试剂对于检测样本的稀释，微球形式在线性度满足要求的条件下（R²>0.99），显色的OD值高于传统形式，除了操作的简便，还提高了灵敏度。
实施例5 表面包裹薄膜形式的IL-1β检测试剂盒
按以下步骤制备表面包裹薄膜形式的IL-1β检测抗体及表面包裹薄膜形式的IL-1β检测试剂盒：
S01. 将IL-1β检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-196℃液氮中冷冻成微球；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥10小时，得固相检测抗体；
S05. 用离子溅射镀膜仪对步骤S04制备的固相检测抗体进行喷金处理，处理条件：电流10mA，时间300秒；
S06. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S07. 将检测抗体预置到孔板中。
S08. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 5%；
牛血清白蛋白 5%；
蔗糖 5%；
海藻糖 5%；
聚乙二醇（PEG）5%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 5%。
实施例6表面包裹薄膜形式的IFN-γ检测试剂盒
按以下步骤制备干粉形式IFN-γ检测抗体及干粉形式的IFN-γ检测试剂盒：
S01. 将IFN-γ检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A置于-75℃冷冻；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥15小时，得固相检测抗体；
S05. 用离子溅射镀膜仪对步骤S04制备的固相检测抗体进行喷金处理，处理条件：电流30mA，时间20秒；
S06. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S07. 将检测抗体预置到孔板中；
S08. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
其中，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 5%；
牛血清白蛋白 5%；
蔗糖 5%；
海藻糖 5%；
聚乙二醇（PEG）5%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 5%。
实施例7 IL-1β检测抗体稳定性试验
试验检测抗体：实施例1及实施例2中使用的IL-1β检测抗体
对照抗体：传统液体形式的IL-1β检测抗体
将上述两种固相检测抗体和传统液体形式的检测抗体在37℃±2℃的条件下放置，于实验起始、试验第0、1、3、7、10、15、20、30天取样，通过考察250pg/mL浓度的IL-1β抗原的显色OD值，考察抗体活性的损失程度，结果见附图7。
实验结果表明，本发明实施例1、实施例2中IL-1β检测抗体在37℃、为期30天的老化过程中，活性非常稳定，只在30天时有轻微下降；而传统液体形式的检测抗体从第3天活性就开始下降，第30天的时候活性下降接近50%，稳定性显著高于普通液体IL-1β抗体。
另外，由于固相形式的检测抗体避免了液体形式检测抗体与待测样本的互相稀释，所以在相同浓度的情况下，显色OD值显著高于传统液体形式，提高了抗体的灵敏度。
此外，固相检测抗体干粉或者微球本身含有相应的缓冲液和蛋白、多糖等成分，对于不同的检测样本，具有一定的缓冲能力，避免了反应体系的剧烈变化，一定程度上可以减轻基质效应。
Claims (10)
1.一种固相抗体双夹心免疫反应体系，其特征在于，所述免疫反应体系采用全固相待反应组分，通过将检测抗体固相化，预置到反应孔或反应管中，待样本加入反应孔或反应管后，孵育后即可完成免疫反应；
所述检测抗体固相化的方法为：将检测抗体预制微球或将检测抗体冻干。
2.根据权利要求1所述的免疫反应体系，其特征在于，所述将检测抗体预制微球或将检测抗体冻干的方法包括以下步骤：
S01. 将检测抗体与保护剂混合得混合物A；
S02. 将混合物A于-5～-196℃冷冻；
S03. 将步骤S02中冷冻的混合物A保持温度在0℃以下，抽真空；
S04. 将步骤S03中抽真空后的混合物A干燥0.5～48小时，得固相检测抗体。
3.根据权利要求1所述的免疫反应体系，其特征在于，所述检测抗体固相化的方法还包括将检测抗体表面包裹薄膜。
4.根据权利要求3所述的免疫反应体系，其特征在于，所述将检测抗体表面包裹薄膜的方法为：对冻干后的或微球化的抗体表面进行喷金处理。
5.根据权利要求4所述的免疫反应体系，其特征在于，所述喷金处理的条件为电流10～50mA，时间20～300秒；所述喷金处理采用的设备为离子溅射镀膜仪。
6.根据权利要求2所述的免疫反应体系，其特征在于，步骤S01所述保护剂的配方为：
干酪素 0.5%～10%；
牛血清白蛋白 0.5%～10%；
蔗糖 0.5%～10%；
海藻糖 0.5%～10%；
聚乙二醇（PEG） 0.5%～10%；
聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 0.5%～10%。
7.根据权利要求1所述的免疫反应体系，其特征在于，所述检测抗体为酶联抗体、荧光标记抗体、吖啶脂标记抗体或生物素标记抗体。
8.一种固相抗体双夹心免疫反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1至7任一所述固相抗体双夹心免疫反应体系，所述试剂盒包括：反应孔或反应管、反应底物、抗原标准品、洗涤液、稀释液。
9.权利要求8所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S11. 制备固相化的检测抗体；
S12. 将含有捕获抗体的缓冲液加入反应装置中，使捕获抗体吸附于反应孔或反应管中；
S13. 将步骤S11制备的检测抗体预置到反应孔或反应管中；
S14. 配制抗原标准品、洗涤液、稀释液。
10.权利要求8所述试剂盒在免疫检测方面的应用，其特征在于，所述应用的方法为包括以下步骤：
S21. 在反应孔或反应管中加入待测样品，孵育；
S22. 弃去多余样品，洗涤，加入反应底物；
S23. 观察或检测反应结果。
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| CN201711462115.2A CN108196047A (zh) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | 一种固相抗体双夹心免疫反应体系及其试剂盒与应用 |
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