CN116087503A - 一种实现elisa简易操作的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实现ELISA简易操作的方法，包括以下步骤:S1、准备梯度稀释的待检测蛋白的标准品，同时对待测样本进行预稀释；S2、在酶标板上设置标准品孔和样本孔，分别各加入100μl稀释后的标准品和样本，孵育，弃去液体，拍干后洗涤；S3、向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μlTMB显色底物，室温孵育，再向每孔中加入100μl终止液终止反应；S4、将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，根据标准品读取结果，绘制标准品的OD线，并计算出样本中目标物的浓度。本发明的有益效果为：本发明所述一种实现ELISA简易操作的方法，将检测抗体和/或HRP酶制成均一的微球并预先放置于酶标板内，将TMB显色之前的操作整合为一步，将整体操作时长最短控制在90min内。
Description
技术领域
本发明属于酶联免疫吸附测定实验技术领域，尤其涉及一种实现ELISA简易操作的酶标板及其应用。
背景技术
酶联免疫吸附测定实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是经典的免疫学检测方法，可对目标物质进行定性和定量检测，具有高灵敏度、高特异性和重复性好的特点。
根据操作的步骤差别和所检测目标物质的不同等因素，ELISA实验可以分为直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法等类型，其中最常用的为双抗夹心法ELISA。简要而言，该常用方法包括预先包被捕获抗体在酶标板上、添加标准品/样品、加入检测抗体、加入HRP(辣根过氧化物酶)酶、加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色底物、加入终止液、进行酶标仪读数等不同的步骤，且加入TMB显色底物前的每个步骤结束后均需进行多次洗涤的操作。由此，这也就导致传统的ELISA实验具有操作步骤繁琐、耗费时间长、容易造成实验人员疏忽等弊端。同时，检测抗体上可以进行生物素和HRP酶偶联，后者虽然可以减少加入HRP酶的步骤，但整体实验所耗费的时间依然很长，前述弊端依然存在。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种针对现有ELISA操作步骤繁琐且耗时长的问题，设计出一种可减少实验操作步骤、缩短操作时长的双抗夹心法ELISA操作方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种实现ELISA简易操作的方法，包括以下步骤:
S1、准备梯度稀释的待检测蛋白的标准品，同时对待测样本进行预稀释；
S2、在酶标板上设置标准品孔和样本孔，分别各加入100μl稀释后的标准品和样本，孵育，弃去液体，拍干后洗涤；
S3、向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μlTMB显色底物，室温孵育，再向每孔中加入100μl终止液终止反应；
S4、将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，根据标准品读取结果，绘制标准品的OD线，并计算出样本中目标物的浓度。
本申请所述实现ELISA简易操作的方法，将检测抗体和/或HRP酶制成均一的微球，预先放置于96孔板中，即将传统的ELISA操作方法的TMB显色之前的操作整合为一步，一次孵育抗体后也只需洗涤操作一次即可。将整体操作时长最短控制在90min内。
本方法使ELISA操作更加简单、便捷，大大减少了整体实验时间。此外，由于操作步骤的减少，这将会降低产生操作误差的几率，提高试剂盒的检测重复性。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤S1中，所述梯度稀释的具体操作为根据需要进行7个梯度的浓度稀释，所采用的稀释液为含0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤S2中，所述孵育的条件为：在37℃下孵育1h；所述洗涤采用的洗涤液为1×PBS-T溶液。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤S3中，所述孵育的条件为：室温孵育5-15min；所述终止液为浓度为1M的硫酸。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤S4中，所述双波长检测的主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、使用PBS缓冲液将待检测蛋白的捕获抗体稀释到工作浓度，以50μl/孔加入到96孔板中，在4℃下放置过夜进行包被；
步骤二、弃去多余液体，拍干，再向每孔中加入300μl 5％BSA溶液，室温放置2h；BSA溶液为牛血清蛋白溶液，在此处形成一层保护膜，该保护膜可溶于水中，以便暴漏出捕获抗体；
步骤三、弃去液体，拍干，每孔加入300μl含有蔗糖、海藻糖和明胶的水溶液，室温放置15min，弃去多余液体，拍干后干燥；
步骤四、使用抗体稳定剂将待检测蛋白的检测抗体稀释到工作浓度，制成抗体微球；将HRP酶制成HRP酶微球；
步骤五、将步骤四所得微球放入步骤三所得烘干后的96孔板中，得酶标板。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤一中，所述工作浓度为10ng-20ug/ml。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤三中，水溶液中蔗糖的质量浓度为30％、海藻糖的质量浓度为10％、明胶的质量浓度为5％。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤三中，所述干燥的温度为20℃，干燥时长为2h。
上述一种实现ELISA简易操作的方法，作为一种优选的实施方案，步骤四中，所述抗体稳定剂为BioStab Antibody Stabilizer抗体稳定剂，所述工作浓度为1ng/ml-100ng/ml；所述抗体微球的粒径为1-5mm，所述HRP酶微球的粒径为1-5mm。
一种实现ELISA简易操作的酶标板，包括孔板本体和覆盖于孔板本体上的密封膜，所述孔板本体的孔内覆盖有复合层，所述复合层由下至上依次包括待检测蛋白的捕获抗体层、蛋白保护层和糖胶保护膜。
所述96孔内包含有待检测抗体和HRP酶的微球；所述微球可为待检测抗体微球和HRP酶微球。同样的，微球可以为检测抗体与HRP酶偶联的微球。
即，
孔板本体的孔内设有一个抗体微球，或是抗体微球与HRP酶微球共计两个微球，或是检测抗体偶联HRP酶形成的一个微球
所述密封膜上对应孔的位置均设置有注液开口，注液开口为一字型、十字型或是米字型，为细小的开缝形式，易于后期检测时进行试剂添加。
本发明的有益效果为：本发明所述一种实现ELISA简易操作的方法，将检测抗体和/或HRP酶制成均一的微球并预先放置于酶标板内，将TMB显色之前的操作整合为一步，一次孵育抗体后也只需洗涤操作一次即可，将整体操作时长最短控制在90min内。
本方法使ELISA操作更加简单、便捷，大大减少了整体实验时间。此外，由于操作步骤的减少，这将会降低产生操作误差的几率，提高试剂盒的检测重复性。综上所述，本发明方法操作简单、省时省力，整体过程可控，且具有良好的产品性能
附图说明
图1为本发明实施例1应用本发明方法检测人PDGFR蛋白标准品的ELISA检测结果；
图2为本发明实施例3应用本发明方法检测人IFN-γ蛋白标准品的ELISA检测结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
采用本申请所述检测方法，可检测血清、血浆、细胞培养上清等类型，因不同样本中目标物含量存在差异，需要针对特定的样本做稀释、浓缩等预处理操作。
本申请所描述微球形状无特定要求，包括但不限于球形、椭圆形、不规则形等。
实施例1
本实施例预先将抗人PDGFR蛋白的捕获抗体包被在酶标板底部，将HRP酶和抗人PDGFR蛋白制成粒径为3mm的微球后预先放置在酶标板内，同时利用铝箔袋进行抽真空密封保存。
制作酶标板的具体操作方法为：
使用PBS缓冲液将抗人PDGFR蛋白的捕获抗体稀释到10ug/ml，以50μl/孔加入到96孔板中，在4℃下放置过夜进行包被(包被为在96孔板中形成一层捕获抗体的膜)；倒掉多余的液体，拍干(拍打96孔板的底部，使多余的液体完全被倒掉)，为捕获抗体层。
再向每孔中加入300μl 5％BSA溶液，室温放置2h(在形成包被的捕获抗体的表面形成一层蛋白保护膜，避免其余蛋白与捕获抗体接触)，然后倒掉液体，拍干，为蛋白保护层。
每孔再加入300ul含有蔗糖、海藻糖和明胶的水溶液，其中水溶液中蔗糖的质量浓度为30％、海藻糖的质量浓度为10％、明胶的质量浓度为5％，室温放置15min形成保护膜，倒掉多余液体，拍干，然后在20℃的条件下干燥2h，为糖胶保护膜。
使用BioStab Antibody Stabilizer抗体稳定剂(购买于德国Bitop公司)将抗人PDGFR蛋白的检测抗体稀释到10ng/ml制成粒径为3mm的抗体微球；将HRP酶制成粒径为3mm的HRP酶微球；
将抗体微球和HRP酶微球放入上述烘干后的96孔板中，得酶标板，并将酶标板放入铝箔袋内，抽真空密封在2-8℃下保存，备用。
采用本发明所述方法检测人PDGFR蛋白浓度的检测方法为：
(1)提前从2-8℃环境中拿出上述密封的酶标板，室温平衡至少15min后取出酶标板；
(2)准备7个梯度稀释的人PDGFR蛋白标准品(具体浓度见表1第一列)，同时对待测样本进行10倍预稀释；
(3)在酶标板上设置标准品孔、样本孔，分别各加入100μl稀释后的7个浓度的标准品或待测样本，37℃条件下孵育1h，弃去液体，拍干后采用1×PBS-T溶液洗涤3-6次；
(4)向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μlTMB显色底物，室温孵育10min；再向每孔中加入100μl浓度为1M的硫酸终止反应；
(5)将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；根据标准品读取结果，绘制标准品的OD曲线，并计算待测样本中人PDGFR蛋白的浓度。
本实施例标准曲线的OD值如表1所示，对应的标准曲线图如图1所示。
表1
从表1可以看出：本实施例标准曲线的OD值成等比例梯度，背景值(0浓度)低于0.1，对应的标准曲线拟合系数R2大于0.99，通过本发明方法的所绘制的标准曲线整体表现优异。
实施例2
本实施例预先将抗小鼠TNF-α蛋白偶联上HRP酶后制成微球，并放置于含有抗小鼠TNF-α蛋白的捕获抗体包被的酶标板中。
制作酶标板的具体操作方法为：
使用PBS缓冲液将抗小鼠TNF-α蛋白的捕获抗体稀释到20ug/ml，以50μl/孔加入到96孔板中，在4℃下放置过夜进行包被(包被为在96孔板中形成一层捕获抗体的膜)；倒掉多余的液体，拍干(拍打96孔板的底部，使多余的液体完全被倒掉)，再向每孔中加入300μl5％BSA溶液，室温放置2h(在形成包被的捕获抗体的表面形成一层蛋白保护膜，避免其余蛋白与捕获抗体接触)，然后倒掉液体，拍干。
每孔再加入300ul含有蔗糖、海藻糖和明胶的水溶液，其中水溶液中蔗糖的质量浓度为30％、海藻糖的质量浓度为10％、明胶的质量浓度为5％，室温放置15min形成一种保护膜，倒掉多余液体，拍干，然后在20℃的条件下干燥2h。
使用BioStab Antibody Stabilizer抗体稳定剂(购买于德国Bitop公司)将抗小鼠TNF-α蛋白的检测抗体(检测抗体已预先偶联上HRP酶)稀释到10ng/ml，制成粒径为3mm的微球；
将微球放入上述烘干后的96孔板中，得酶标板，并将酶标板放入铝箔袋内，抽真空密封在2-8℃下保存，备用。
采用本发明所述方法检测抗小鼠TNF-α蛋白浓度的检测方法为：
(1)提前从2-8℃环境中拿出上述密封的酶标板，室温平衡至少15min后取出酶标板；
(2)准备7个梯度稀释的小鼠TNF-α蛋白标准品(7个梯度稀释如表2所示)，同时对待测小鼠血清样本进行预稀释；
(3)在酶标板上设置标准品孔、样本孔，分别各加入100μl稀释后的7个浓度的标准品或待测样本，37℃条件下孵育1h，弃去液体，拍干后采用1×PBS-T溶液洗涤3-6次；
(4)向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μl TMB显色底物，室温孵育5-15min；再向每孔中加入100μl浓度为1M的硫酸终止反应；
(5)将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；根据标准品读取结果，绘制标准品的OD曲线，并计算待测样本中小鼠TNF-α蛋白的浓度。
同时使用未经本发明方法操作处理的酶标板和检测抗体，采用传统的进行多次操作和洗涤操作的方法去检测，并设置和检测与上述步骤中相同的7个梯度稀释的小鼠TNF-α蛋白标准品，以及待测小鼠血清样本。
传统的检测方法为：
步骤1.分别设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品&样本稀释液，其余孔加入100μL待测样本。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
步骤2.甩尽孔内液体，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；
步骤3.甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干。每孔加洗涤液350μL，浸泡1分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤3次。洗板完成后请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥；
步骤4.每孔加酶结合物工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育30分钟；
步骤5.甩尽孔内液体，洗板5次，方法同步骤3；
步骤6.每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。
步骤7.每孔加终止液50μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
步骤8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
两种方法所测得的标准曲线OD值如表2所示：
表2
从表2中可以看出：两种方法的标准曲线的OD值成等比例梯度，背景值(0浓度)低于0.1，对应的标准曲线拟合系数R2大于0.99。同时，采用本发明方法的标曲复孔的相对偏差平均CV值要比传统的方法小，即本发明方法检测结果的重复性要更优。
正常小鼠血清中，TNF-α的含量通常较低或不可测，必要时可使用炎症造模实验动物样本。
实施例3
本实施例预先将抗人IFN-γ蛋白的捕获抗体包被在酶标板底部，将生物素偶联的检测抗体和HRP酶制成微球后预先放置在酶标板内，同时利用铝箔袋进行抽真空密封保存。
制作酶标板的具体操作方法为：
使用PBS缓冲液将抗人IFN-γ蛋白的捕获抗体稀释到10ug/ml，以50μl/孔加入到96孔板中，在4℃下放置过夜进行包被(包被为在96孔板中形成一层捕获抗体的膜)；倒掉多余的液体，拍干(拍打96孔板的底部，使多余的液体完全被倒掉)，再向每孔中加入300μl5％BSA溶液，室温放置2h(在形成包被的捕获抗体的表面形成一层蛋白保护膜，避免其余蛋白与捕获抗体接触)，然后倒掉液体，拍干，每孔再加入300ul含有蔗糖、海藻糖和明胶的水溶液，其中水溶液中蔗糖的质量浓度为30％、海藻糖的质量浓度为10％、明胶的质量浓度为5％，室温放置15min形成保护膜，倒掉多余液体，拍干，然后在20℃的条件下干燥2h。
使用BioStab Antibody Stabilizer抗体稳定剂(购买于德国Bitop公司)将抗人IFN-γ蛋白检测抗体(检测抗体已预先偶联上HRP酶)稀释到50ng/ml，制成粒径为3mm的微球；
将微球放入上述烘干后的96孔板中，得酶标板，并将酶标板放入铝箔袋内，抽真空密封在2-8℃下保存，备用。
采用本发明所述方法检测人IFN-γ蛋白浓度的检测方法为：
(1)提前从2-8℃环境中拿出上述密封的酶标板，室温平衡15min后取出酶标板；
(2)准备7个梯度稀释的人IFN-γ蛋白标准品(稀释的7个梯度如表3所示)，同时对待测人IFN-γ蛋白样本进行预稀释；
(3)在酶标板上设置标准品孔、样本孔，分别各加入100μl稀释后的7个浓度的标准品或待测样本，37℃条件下孵育1h，弃去液体，拍干后采用1×PBS-T溶液洗涤3-6次；
(4)向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μl TMB显色底物，室温孵育5-15min；再向每孔中加入100μl浓度为1M的硫酸终止反应；
(5)将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；根据标准品读取结果，绘制标准品的OD曲线，并计算待测样本中人IFN-γ蛋白的浓度。
标准曲线的OD值如表3所示，对应的标准曲线图如图2所示。
表3
从表3可以看出：标准曲线的OD值成等比例梯度，背景值(0浓度)低于0.1，对应的标准曲线拟合系数R2大于0.99，该方法得到的结果符合实际检测的标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，包括以下步骤:
S1、准备梯度稀释的待检测蛋白的标准品，同时对待测样本进行预稀释；
S2、在酶标板上设置标准品孔和样本孔，分别各加入100μl稀释后的标准品和样本，孵育，弃去液体，拍干后洗涤；
S3、向上述标准品孔和样本孔中分别加入100μlTMB显色底物，室温孵育，再向每孔中加入100μl终止液终止反应；
S4、将上述酶标板放入酶标仪中进行双波长检测，根据标准品读取结果，绘制标准品的OD线，并计算出样本中目标物的浓度。
2.根据权利要求1所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤S1中，所述梯度稀释为7个梯度的浓度稀释。
3.根据权利要求1所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤S2中，所述孵育的条件为：在37℃下孵育1h；所述洗涤采用的洗涤液为1×PBS-T溶液。
4.根据权利要求1所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤S3中，所述孵育的条件为：室温孵育5-15min；所述终止液为浓度为1M的硫酸。
5.根据权利要求1所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤S4中，所述双波长检测的主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm。
6.根据权利要求1所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、使用PBS缓冲液将待检测蛋白的捕获抗体稀释到工作浓度，以50μl/孔加入到96孔板中，在4℃下放置过夜进行包被；
步骤二、弃去多余液体，拍干，再向每孔中加入300μl 5％BSA溶液，室温放置2h；
步骤三、弃去液体，拍干，每孔加入300μl含有蔗糖、海藻糖和明胶的水溶液，室温放置15min，弃去多余液体，拍干后干燥；
步骤四、使用抗体稳定剂将待检测蛋白的检测抗体稀释到工作浓度，制成抗体微球；将HRP酶制成HRP酶微球；
步骤五、将步骤四所得微球放入步骤三所得烘干后的96孔板中，得酶标板。
7.根据权利要求6所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤一中，所述工作浓度为10ng-20ug/ml。
8.根据权利要求6所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤三中，水溶液中蔗糖的质量浓度为30％、海藻糖的质量浓度为10％、明胶的质量浓度为5％。
9.根据权利要求6所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤三中，所述干燥的温度为20℃，干燥时长为2h。
10.根据权利要求6所述一种实现ELISA简易操作的方法，其特征在于，步骤四中，所述抗体稳定剂为BioStab Antibody Stabilizer抗体稳定剂，所述工作浓度为1ng/ml-100ng/ml；所述抗体微球的粒径为1-5mm，所述HRP酶微球的粒径为1-5mm。
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