CN113030458A - 一种用于elisa检测试剂盒的样品稀释液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，包括血清白蛋白、动物IgG、蛋白稳定剂、金属离子交换剂、盐缓冲液、Tween 20、Proclin300和纯化水。本发明样品稀释液添加了蛋白稳定剂和金属离子交换剂，可以有效降低基质效应的干扰，去除非特异性吸附，加入了健康动物IgG，不但可对待测样本进行保护，而且可以模拟血清环境，降低血清血浆样本中的异嗜性抗体和类风湿因子的干扰，降低假阳性，提高了ELISA检测结果的准确性和重复性。
Description
技术领域
本发明涉及联酶免疫检测领域，尤其涉及一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液及其制备方法。
背景技术
ELISA(酶联免疫吸附试验)是对样本中可溶性目标蛋白进行定量的一种方法。样品稀释液作为ELISA试剂盒的核心组件之一，它的功能就是保证ELISA试剂盒的准确度。理论上样品稀释液的组分应该是除不含目标蛋白外其他组分与待检样本的组分完全相同，但实际情况是这是不可能的，特别是人的血清、血浆样本。
目前行业内使用的样品稀释液通用为PBST液，即0.5％BSA的PBS-T溶液，此溶液的优点是生产成本低廉，缺点是仅有盐缓冲液而无法对样本待测物进行有效保护，且与血清环境有较大区别，基质效应明显，用于细胞培养上清、组织研磨液、组织裂解液等低蛋白浓度的样本类型的应用效果还是可以的，加标回收率通常在80％-120％。但对于血清和血浆这样高蛋白、组分复杂的样本，加标回收率只有20％-50％，严重影响检测结果的准确性和重复性。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种加标回收率高、检测结果准确性和重复性好的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液及其制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，包括血清白蛋白、动物IgG、蛋白稳定剂、金属离子交换剂、盐缓冲液、Tween 20、Proclin300和纯化水。
在以上技术方案的基础上，优选的，按照质量百分比计算，所述样品稀释液包括2％-5％血清白蛋白、0.1％-0.3％动物IgG、5％-8％蛋白稳定剂、0.3％-1.5％金属离子交换剂、0.5％盐缓冲液、0.05％-0.1％Tween 20和0.03％-0.18％Proclin300，余量为纯化水。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述动物IgG为健康动物阴性血清Protein AG纯化后制得。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述健康动物为健康小鼠、健康兔和健康羊中的一种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述盐缓冲液为每升盐缓冲液中含12g无水磷酸二氢钠，9g氯化钠，溶剂为纯化水。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述蛋白稳定剂为麦芽糖或精氨酸。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述金属离子交换剂为咪唑或柠檬酸。
更进一步优选的，还包括一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，称取12g无水磷酸二氢钠和9g氯化钠置于500-700ml纯化水中，搅拌至完全溶解，得到盐缓冲液A；
S2，称取5-8g金属离子交换剂和40-60g蛋白稳定剂，依次加入盐缓冲液A中，搅拌3-5min，溶解后得到溶液B；
S3，称取8-13g血清白蛋白加入溶液B中，继续搅拌3-5min，得到溶液C；
S4，向溶液C中加入1-5mg动物IgG、0.5-1.5ml Tween 20和1-5ml Proclin300，搅拌至完全溶解，调节pH为7.4，最后加入纯化水定容至1L，制备得到ELISA用样品稀释液。
本发明的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液及其制备方法相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明添加了麦芽糖或精氨酸作为蛋白稳定剂，添加咪唑或柠檬酸作为离子交换剂，可以有效降低基质效应的干扰，去除非特异性吸附，提高血清和血浆样本检测结果的准确性和重复性。
(2)采用本发明的样品稀释液，将血清和血浆样本稀释2-10倍后，可降低样本基质效应的干扰，提高试剂盒的检测灵敏度。
(3)本发明的样品稀释液，加入了健康动物IgG，不但可对待测样本进行保护，而且可以模拟血清环境，降低血清血浆样本中的异嗜性抗体和类风湿因子的干扰，降低假阳性，提高了血清和血浆样本ELISA检测结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ELISA检测试剂盒采用本发明实施例一的稀释液，所绘制的标准曲线图；
图2为ELISA检测试剂盒采用本发明实施例二的稀释液，所绘制的标准曲线图；
图3为ELISA检测试剂盒采用本发明实施例三的稀释液，所绘制的标准曲线图；
图4为ELISA检测试剂盒采用对比例的稀释液，所绘制的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，按照质量百分比计算，包括2％牛血清白蛋白、0.1％动物IgG、5％麦芽糖、0.3％咪唑、0.5％盐缓冲液、0.05％Tween 20和0.03％Proclin300，余量为纯化水。
动物IgG为健康小鼠阴性血清ProteinAG纯化后制得；盐缓冲液为每升盐缓冲液中含12g无水磷酸二氢钠，9g氯化钠，溶剂为纯化水。
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液的制备方法，包括如下步骤：
S1，称取12g无水磷酸二氢钠和9g氯化钠置于500ml纯化水中，搅拌至完全溶解，得到盐缓冲液A；
S2，称取5g咪唑和40g麦芽糖，依次加入盐缓冲液A中，搅拌3min，溶解后得到溶液B；
S3，称取8g牛血清白蛋白加入溶液B中，继续搅拌3min，得到溶液C；
S4，向溶液C中加入1mg动物IgG、0.5ml Tween 20和1ml Proclin300，搅拌至完全溶解，调节pH为7.4，最后加入纯化水定容至1L，制备得到ELISA用样品稀释液。
实施例二
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，按照质量百分比计算，包括5％牛血清白蛋白、0.3％动物IgG、8％精氨酸、1.5％柠檬酸、0.5％盐缓冲液、0.1％Tween 20和0.18％Proclin300，余量为纯化水。
动物IgG为健康兔阴性血清ProteinAG纯化后制得；盐缓冲液为每升盐缓冲液中含12g无水磷酸二氢钠，9g氯化钠，溶剂为纯化水。
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液的制备方法，包括如下步骤：
S1，称取12g无水磷酸二氢钠和9g氯化钠置于700ml纯化水中，搅拌至完全溶解，得到盐缓冲液A；
S2，称取8g柠檬酸和60g精氨酸，依次加入盐缓冲液A中，搅拌5min，溶解后得到溶液B；
S3，称取13g兔血清白蛋白加入溶液B中，继续搅拌5min，得到溶液C；
S4，向溶液C中加入5mg动物IgG、1.5ml Tween 20和5ml Proclin300，搅拌至完全溶解，调节pH为7.4，最后加入纯化水定容至1L，制备得到ELISA用样品稀释液。
实施例三
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，按照质量百分比计算，包括4％牛血清白蛋白、0.2％动物IgG、6％精氨酸、1.0％咪唑、0.5％盐缓冲液、0.08％Tween 20和0.10％Proclin300，余量为纯化水。
动物IgG为健康羊阴性血清ProteinAG纯化后制得；盐缓冲液为每升盐缓冲液中含12g无水磷酸二氢钠，9g氯化钠，溶剂为纯化水。
一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，称取12g无水磷酸二氢钠和9g氯化钠置于600ml纯化水中，搅拌至完全溶解，得到盐缓冲液A；
S2，称取6g金属离子交换剂和50g蛋白稳定剂，依次加入盐缓冲液A中，搅拌4min，溶解后得到溶液B；
S3，称取10g鼠血清白蛋白加入溶液B中，继续搅拌4min，得到溶液C；
S4，向溶液C中加入3mg动物IgG、1.0ml Tween 20和3ml Proclin300，搅拌至完全溶解，调节pH为7.4，最后加入纯化水定容至1L，制备得到ELISA用样品稀释液。
对比例为行业内使用的通用样品稀释液即0.5％BSA的PBS-T溶液(成分为0.5％BSA、0.05％吐温20和PBS)。
(1)准确性实验
以人血清作为ELISA待测样品，并分别以实施例1-3和对比例的稀释液稀释血清，具体步骤为：全血样品于25℃放置2小时或4℃放置10小时后，于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热源，无内毒素试管。
实验开始前，各试剂均应平衡至25℃，试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。本发明样品稀释液在ELISA试剂盒中的具体使用方法为：
1.在加样前，所需板孔用洗液液洗板2次，甩干或吸干才能进一步试验。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔加标准品和样品稀释液100uI，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡。加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2.酶标板覆膜，在37℃条件下孵育90分钟。用洗涤液洗板2次，每次洗涤后吸去孔内液体。每个孔中加入配制好的生物素化抗体工作液100μL，酶标板覆膜，在37℃条件下孵育1小时。
3.弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，每次洗板时浸泡2分钟，将孔内残留的洗涤液在吸水纸上拍干。
4.每孔加SABC工作液100μL，覆膜，在37℃条件下孵育30分钟。
5.弃去孔内液体，用洗涤液洗板5次，方法同步骤3。每孔加90μL底物溶液(TMB)，在37℃条件下孵育30分钟。酶标板覆膜，37℃条件下避光孵育15分钟(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟，当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。
6.每孔加终止液50μL，终止反应，用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD450值)。
以本发明实施例1-3和对比例稀释液检测human PCT ELISA，以不同稀释浓度的标准品血清含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程，标准曲线如表1-4所示：
表1本发明实施例一稀释液标准曲线
| 标准品(pg/ml) | 空白 | 15.6 | 31.3 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | R |
| OD值(平均值) | 0.060 | 0.260 | 0.466 | 0.680 | 1.092 | 1.683 | 2.046 | 2.726 | 0.9982 |
表2本发明实施例二稀释液标准曲线
| 标准品(pg/ml) | 空白 | 15.6 | 31.3 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | R |
| OD值(平均值) | 0.067 | 0.338 | 0.495 | 0.811 | 1.321 | 1.708 | 2.062 | 2.673 | 0.9994 |
表3本发明实施例三稀释液标准曲线
| 标准品(pg/ml) | 空白 | 15.6 | 31.3 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | R |
| OD值(平均值) | 0.076 | 0.164 | 0.335 | 0.574 | 1.019 | 1.491 | 2.352 | 3.095 | 0.9990 |
表4对比例稀释液标准曲线
| 标准品(pg/ml) | 空白 | 15.6 | 31.3 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | R |
| OD值(平均值) | 0.039 | 0.244 | 0.445 | 0.637 | 1.139 | 2.01 | 2.673 | 3.255 | 0.9974 |
表1-4和图1-4结果所示，采用本发明的ELISA检测试剂盒的样品稀释液检测humanPCT elisa时绘制的标准曲线优于对比例，表明应用本发明的ELISA检测试剂盒的样品稀释液检测样本时，检测结果准确率高。
(2)重复性实验
回收率对比：在基质中加入一定量的PCT，通过将测定值与样品中PCT的预期含量进行比较，计算样本的回收率。
表5实施例和对比例回收率比较
| 实施例一 | 实施例二 | 实施例三 | 对比例 | |
| 基质n＝5 | 回收率％ | 回收率％ | 回收率％ | 回收率％ |
| 血清 | 85-99 | 88-103 | 87-110 | 25-76 |
| 血浆(EDTA) | 85-115 | 83-120 | 81-107 | 55-75 |
表5结果所示，本发明实施例1-3稀释液可以有效的提高血清血浆样本的回收率，血清样本回收率为85％-110％，血浆样本回收率在81％-120％；对比例的血清和血浆样本回收率仅为25％-76％和55％-75％，说明应用本发明稀释液，血清和血浆的回收率高，重复性好。
(3)基质效应干扰实验
将实施例1-3和对比例的稀释液，采用不同梯度稀释同一份血清和血浆样本，进行ELISA实验，检测吸光值(OD450)，步骤参照准确性实验，结果如表6所示。
表6实施例和对比例不同稀释倍数下检测结果对比
表6所示，本发明实施例1-3与对比例相比，不同稀释倍数下，血清和血浆的OD450值变化明显，表现出更好的线性，由此表明本发明的稀释液能更好的降低样本基质效应的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，样品稀释液包括血清白蛋白、动物IgG、蛋白稳定剂、金属离子交换剂、盐缓冲液、Tween 20、Proclin300和纯化水。
2.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，按照质量百分比计算，所述样品稀释液包括2％-5％血清白蛋白、0.1％-0.3％动物IgG、5％-8％蛋白稳定剂、0.3％-1.5％金属离子交换剂、0.5％盐缓冲液、0.05％-0.1％Tween 20和0.03％-0.18％Proclin300，余量为纯化水。
3.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。
4.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述动物IgG为健康动物阴性血清ProteinAG纯化后制得。
5.如权利要求4所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述健康动物为健康小鼠、健康兔和健康羊中的一种。
6.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述盐缓冲液为每升盐缓冲液中含12g无水磷酸二氢钠，9g氯化钠，溶剂为纯化水。
7.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述蛋白稳定剂为麦芽糖或精氨酸。
8.如权利要求1所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液，其特征在于，所述金属离子交换剂为咪唑或柠檬酸。
9.如权利要求1-8任一所述的一种用于ELISA检测试剂盒的样品稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，称取12g无水磷酸二氢钠和9g氯化钠置于500-700ml纯化水中，搅拌至完全溶解，得到盐缓冲液A；
S2，称取5-8g金属离子交换剂和40-60g蛋白稳定剂，依次加入盐缓冲液A中，搅拌3-5min，溶解后得到溶液B；
S3，称取8-13g血清白蛋白加入溶液B中，继续搅拌3-5min，得到溶液C；
S4，向溶液C中加入1-5mg动物IgG、0.5-1.5ml Tween 20和1-5ml Proclin300，搅拌至完全溶解，调节pH为7.4，最后加入纯化水定容至1L，制备得到ELISA用样品稀释液。
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