CN113484306B - 一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用,属于化学发光分析技术领域。所述磁微粒化学发光清洗液包括缓冲液、盐离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和消泡剂。本发明提供的磁微粒化学发光清洗液,通过对清洗液成分等的优化筛选,从而有效解决现有技术中的清洗液所存在的清洗液清洗背景值高,灵敏度、精密度不佳以及成本高等问题,从而可应用于磁微粒化学发光体系中,因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学发光分析技术领域,具体涉及一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
磁微粒化学发光免疫分析是将磁微粒技术、发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性,且检测范围宽,检测时间短等优点,可以用于各种抗原、抗体、激素、脂肪酸和维生素等的检测分析,是一种新型的体外检测技术。
磁微粒化学发光免疫分析技术的检测步骤是:加样、孵育、清洗、读数。其中清洗的主要目的是去除未结合的抗原、抗体以及游离的结合物,终止抗原抗体的继续结合,减少非特异性吸附物质对检测结果的影响。
发明人发现,现有的磁微粒化学发光清洗液清洗效果差,背景值较高,造成携带污染,从而影响检测的灵敏度、精密度,甚至造成假阳性。
CN111607465A公开了一种化学发光清洗液及其制备方法和应用,其组分包括:Tris、钠离子、CHAPS、Triton-100、PC300、BND、尼泊金内脂和硅油型消泡剂,该清洗液成分复杂,所用防腐剂包含三种,其中BND难溶于水,配制过程较为复杂。表面活性剂选择CHAPS,其是一种两性表面活性剂,可裂解蛋白质,洗涤能力强,检测过程中容易发生特异性结合的抗原和抗体被清洗掉,造成检测结果不准确。
CN112159733A公开了一种磁微粒化学发光免疫分析用清洗液及其配制方法,其组分包括:TRIS-HCl、氯化钠和吐温20。该种清洗液使用了单一的比较温和的非离子型表面活性剂吐温20,清洗能力较弱,在检测灵敏度较低的临床项目上应用时,由于无法完全清洗掉未参加特异性反应的蛋白或者其他非特异性吸附物质,而造成结果假阳性。另外,该种清洗液没有使用任何防腐剂,无法满足防腐效果的要求。
发明内容
基于上述现有技术的不足,本发明提供一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用。本发明通过筛选优化磁微粒化学发光用清洗液成分、用量、pH等,从而制备出一种清洗液,具有清洗背景值低,灵敏度和精密度较高,同时成本低廉的磁微粒化学发光清洗液。
本发明的第一个方面,提供一种磁微粒化学发光清洗液,所述磁微粒化学发光清洗液包括缓冲液、盐离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和消泡剂。
其中,所述缓冲液为PBS缓冲液,采用PBS缓冲液作为化学发光清洗液的缓冲液,成本更低,且清洗效果更好。
所述盐离子为钠离子(如氯化钠),盐离子的加入能够为免疫反应提供适宜的电解质,保证免疫反应的正常进行,并且钠离子成本较低,降低整个清洗液的成本。
所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠。
所述表面活性剂可以为非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂,进一步优选为十二烷基硫酸钠(SDS)和/或吐温20。
所述防腐剂为PC300,叠氮钠或者Bronidox中的一种。优选防腐剂为叠氮钠。
所述消泡剂为硅油型消泡剂或者聚醚型消泡剂。
上述磁微粒化学发光清洗液的pH为弱碱性,进一步为7.0-7.5。
本发明的第二个方面,提供上述磁微粒化学发光清洗液的制备方法,所述制备方法包括:向上述缓冲液中依次加入盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂,混合均匀后再加入消泡剂,调节pH至弱碱性即得。
本发明的第三个方面,提供上述磁微粒化学发光清洗液在化学发光免疫分析中的应用。
具体的,所述应用包括:将上述磁微粒化学发光清洗液稀释后用于磁微粒化学发光免疫分析的清洗步骤,用于去除未结合的抗原、抗体以及游离的结合物,终止抗原抗体的继续结合。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果:
上述技术方案提供一种磁微粒化学发光清洗液,通过对清洗液成分等的优化筛选,从而有效解决现有技术中的清洗液所存在的清洗背景值高,灵敏度、精密度不佳以及成本高等问题,从而可应用于磁微粒化学发光体系中,因此具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述,现有的磁微粒化学发光清洗液清洗效果差,背景值较高,造成携带污染,从而影响检测的灵敏度、精密度,甚至造成假阳性。
本发明的一个典型具体实施方式中,提供一种磁微粒化学发光清洗液,所述磁微粒化学发光清洗液包括缓冲液、盐离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和消泡剂。
本发明又一具体实施方式中,所述缓冲液为PBS缓冲液,采用PBS缓冲液作为化学发光清洗液的缓冲液,成本更低,且清洗效果更好。所述缓冲液的浓度为100mM-1000mM,例如可以为,但不限于100mM,300mM,500mM,800mM或者1000mM,当缓冲液的浓度在上述范围内时,均能够起到缓冲液作用,保证反应的正常进行。
本发明又一具体实施方式中,本发明通过试验验证,当所述缓冲液浓度为500mM时,其发光值CV最小,本底值最低,说明清洗液清洗效果最好,可有效的去除免疫反应中的多余组分。
本发明又一具体实施方式中,所述盐离子为钠离子(如氯化钠),盐离子的加入能够为免疫反应提供适宜的电解质,保证免疫反应的正常进行,并且钠离子成本较低,降低整个清洗液的成本。所述的钠离子的浓度为10%-20%,例如可以为,但不限于10%、12%、14%、16%、18%或者20%,当钠离子的浓度在上述范围内时,均能够为免疫反应提供充分的电解质。
本发明又一具体实施方式中,本发明通过试验验证,所述钠离子的浓度为12%时,发光值CV最小,同时避免浪费,有效节约成本。
本发明又一具体实施方式中,所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠,乙二胺四乙酸二钠作为一种络合剂,能够螯合钙、镁等离子,有效的去除样本中可能存在的金属离子;同时乙二胺四乙酸二钠可作为稳定剂,能够防止化学发光剂的提前激发;其作为清洗液的有效成分,尤其是针对磁性微球的非特异性结合,具有优异的清洗效果。
所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.5%-1%。例如可以为,但不限于0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或者1%。当乙二胺二乙酸二钠的浓度在上述范围时,均能够起到稳定整个清洗体系的作用。优选的,乙二胺四乙酸的浓度为0.8%。
本发明又一具体实施方式中,所述表面活性剂可以为非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂,进一步优选为十二烷基硫酸钠(SDS)和/或吐温20,所述吐温20浓度为1.0%-3.0%,包括但不限于,1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,所述SDS浓度为0.1%-1.0%,包括但不限于,0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%,进一步优选的,采用非离子表面活性剂和离子型表面活性剂相结合的方法,清洗液清洗效果更好,可以大大减少非特异性吸附对检测结果的影响,提高了检测的准确度。因此当所述吐温20浓度为1.5%,SDS浓度为0.5%时,经实验验证,清洗效果最好,CV最小,可有效的去除免疫反应中非特异性吸附的干扰物质,且样本的重复性较好,准确度较高,能够有效的区分含待测物样本与不含待测物样本,更真实的反应样本中待测物的含量。
本发明又一具体实施方式中,所述防腐剂为PC300,叠氮钠或者Bronidox中的一种。优选防腐剂为叠氮钠,防腐剂的浓度为0.05%-0.15%。例如可以为,但不限于0.05%、0.08%、0.1%、0.12%或者0.15%。当防腐剂在上述浓度范围内时,能够保证磁微粒化学发光清洗液的长期保存。
通过对防腐剂浓度的筛选,清洗液室温放置14个月,当防腐剂叠氮钠的浓度为0.1%时,空白CV依旧能在8%以内,发光值变化最小,说明清洗液的抑菌效果最好。若清洗液抑菌效果差,清洗液会出现染菌现象,则会导致空白清洗液发光值上升,且容易出现跳值现象,CV超过10%。
本发明又一具体实施方式中,所述消泡剂为硅油型消泡剂或者聚醚型消泡剂,加入消泡剂,防止在添加清洗液或者洗涤过程中产生气泡,从而防止跳值现象的发生,提高检测精密度和准确度。
本发明又一具体实施方式中,所述消泡剂为硅油型消泡剂,消泡剂的浓度为0.05%-0.5%。例如可以为,但不限于0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或者0.5%。进一步优选地,消泡剂浓度为0.1%。加入0.1%消泡剂的清洗液在IL-8项目上,CV更小,信噪比更高。说明清洗液中加入消泡剂后,可有效的减少气泡的产生,提高试剂检测的精密度和准确度。
本发明又一具体实施方式中,上述磁微粒化学发光清洗液的pH为弱碱性,进一步为7.0-7.5,例如可以为,但不限于7.1、7.2、7.3、7.4或者7.5。进一步优选的,当所述磁微粒化学发光清洗液的pH为7.2时,能够为整个反应体系提供适宜的酸碱环境。
本发明又一具体实施方式中,所述磁微粒化学发光清洗液包括:500mM PBS缓冲液,12%钠离子,0.8%乙二胺四乙酸二钠,0.5%的SDS,1.5%吐温20,0.1%叠氮钠,0.1%硅油型消泡剂,pH7.2。
本发明又一具体实施方式中,提供上述磁微粒化学发光清洗液的制备方法,所述制备方法包括:向上述缓冲液中依次加入盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂,混合均匀后再加入消泡剂,调节pH至弱碱性即得。
本发明又一具体实施方式中,提供上述磁微粒化学发光清洗液在化学发光免疫分析中的应用。
具体的,所述应用包括:将上述磁微粒化学发光清洗液稀释后用于磁微粒化学发光免疫分析的清洗步骤,用于去除未结合的抗原、抗体以及游离的结合物,终止抗原抗体的继续结合。
稀释倍数为5-15倍,包括,但不限于,5倍、8倍、10倍、12倍和15倍,进一步优选为10倍。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种磁微粒化学光浓缩清洗液,包括:500mM PBS缓冲液,12%氯化钠,0.8%乙二胺四乙酸二钠,0.5%的SDS,1%吐温20,0.1%叠氮钠,0.1%硅油型消泡剂,pH7.2。稀释10倍后,用于磁微粒化学发光实验的清洗。
对比例1
一种磁微粒化学光浓缩清洗液,包括:500mM PBS缓冲液,12%氯化钠,0.8%乙二胺四乙酸二钠,1%吐温20,0.1%叠氮钠,0.1%硅油型消泡剂,pH7.2。稀释10倍后,用于磁微粒化学发光实验的清洗。
对比例2
一种磁微粒化学光浓缩清洗液,包括:500mM PBS缓冲液,16%氯化钠,0.5%乙二胺四乙酸二钠,0.5%吐温20,0.1%叠氮钠,0.5%硅油型消泡剂,pH7.2。稀释10倍后,用于磁微粒化学发光实验的清洗。
对比例3
如CN111896731A专利所述,本对比例提供了一种化学发光免疫分析用清洗液包括:
PBS 30mM
吐温20 0.1wt%
酪蛋白酸纳 0.75wt%
乙二胺四乙酸二钠 0.1wt%
脱氧胆酸钠 0.05wt%
叠氮钠 0.05wt%
对比例4
如CN110862881A专利所述,本对比例提供了一种全自动化学发光仪专用的清洗液:
氯化钠 35g
氯化钾 185g
十二水合磷酸氢二钠 53.72g
磷酸二氢钾 0.13g
吐温20 24g
月硅酸钠 0.5g
Proclin300 10g
Bronidox 0.4g
使用时稀释倍数 15
对比例5
原装贝克曼Access冲洗缓冲液。
对比例
性能测试
1、线性测试
将实施例1的本发明清洗液和对比例中的1-5清洗液按照说明书所示比例进行稀释,然后采用Shinei2900型全自动化学发光仪分别对6种清洗液进行对比验证,选用夹心法项目白介素8(IL-8),测定这个项目的线性。
表1使用实施例1和对比例1-5清洗液的IL-8校准曲线
浓度 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
pg/mL RLU RLU RLU RLU RLU RLU
0 632 876 942 1042 972 1003
2.5 1327 1664 1790 1980 1847 2012
10 5176 5825 6264 6929 6464 7032
50 25363 27379 29442 32568 30380 31380
250 121741 131421 141323 156325 145823 155833
1000 477226 515170 553985 612794 571627 571877
3000 1369639 1478539 1440360 1593264 1486231 1586230
7500 3355617 3430211 3197599 3712306 3433194 3533194
r 0.9999 0.9995 0.9984 0.9993 0.9995 0.9987
由表1可以看出,使用实施例1以及对比例1-5清洗液清洗反应复合物,获得的IL-8校准曲线线性相关性较好,可以用于其他性能验证。
2、精密度验证
将实施例1的本发明清洗液和对比例中的1-5清洗液按照说明书所示比例进行稀释,然后采用Shinei2900型全自动化学发光仪分别对6种清洗液进行对比验证,选用夹心法项目白介素8(IL-8)和竞争法项目甲状腺球蛋白抗体(Anti-Tg),测定这两个项目的精密度,每个项目测定1例样本,每个样本做10次重复。
表2使用实施例1和对比例1-5清洗液的IL-8和Anti-Tg的精密度
Figure BDA0003145458690000071
本发明清洗液精密度检测项目的精密度均在2%以内,其他对比例清洗液的精密度均在2%-4%以内,以上结果说明本发明清洗液检测的精密度度及反应性良好,在该反应体系中,本发明清洗液明显优于对比清洗液。
3、稳定性验证
将实施例1的本发明清洗液和对比例1-5清洗液分别分装成4瓶,室温放置0天,6个月,12个月,14个月进行检测。检测前按照说明书所示比例进行稀释,然后采用Shinei2900型全自动化学发光仪分别对6种清洗液进行空白测定及IL-8项目测定,重复检测10次,实验结果如表3和表4所示。
表3实施例1清洗液和对比例1-5清洗液长期稳定性空白检测结果
Figure BDA0003145458690000081
表4实施例1清洗液和对比例1-5清洗液长期稳定性IL-8精密度检测结果
Figure BDA0003145458690000091
结果表明:室温下,对比例1-5在第12个月均出现本底升高的现象,清洗液空白发光值均出现升高的现象,且精密度变差,原因是清洗液长期存放可能出现染菌,而本发明提供的清洗液在放置14个月时空白值检测依旧保持稳定,说明本发明提供的清洗液在14个月内仍可保持稳定。在项目IL-8检测上,本发明提供清洗液在14个月CV在2%左右,对比例清洗液CV明显升高。说明本发明清洗液在14个月内依旧保持稳定,且性能优于对比例。
经过实施例和对比例实验数据可知,本发明缓冲液从清洗液效果,存放稳定性,项目性能测试均优于对比例,解决了现有清洗液清洗效果较差,本底较高,稳定性差的情况。
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (6)

1.一种磁微粒化学发光清洗液,其特征在于,所述磁微粒化学发光清洗液包括缓冲液、盐离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和消泡剂;
所述缓冲液为PBS缓冲液,浓度为100mM-1000mM;
所述盐离子为钠离子,浓度为10%-20%;
所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠,浓度为0.5%-1%;
所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂,所述非离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠,所述阴离子表面活性剂为 吐温20,吐温20浓度为1.0%-3.0%,十二烷基硫酸钠浓度为0.1%-1.0%;
所述防腐剂为叠氮钠,浓度为0.05%-0.15%;
所述消泡剂为硅油型消泡剂,浓度为0.05%-0.5%;
所述磁微粒化学发光清洗液的pH为7.0-7.5。
2.如权利要求1所述的磁微粒化学发光清洗液,其特征在于,所述磁微粒化学发光清洗液包括:500mM PBS缓冲液,12%钠离子,0.8%乙二胺四乙酸二钠,0.5%的SDS,1.5%吐温20,0.1%叠氮钠,0.1%硅油型消泡剂,pH7.2。
3.权利要求1或2所述磁微粒化学发光清洗液的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:向缓冲液中依次加入盐离子、表面活性剂、稳定剂、防腐剂,混合均匀后再加入消泡剂,调节pH至弱碱性即得。
4.权利要求1或2所述磁微粒化学发光清洗液在化学发光免疫分析中的应用。
5.如权利要求4所述应用,其特征在于,所述应用包括:将上述磁微粒化学发光清洗液稀释后用于磁微粒化学发光免疫分析的清洗步骤,用于去除未结合的抗原、抗体以及游离的结合物,终止抗原抗体的继续结合;稀释倍数为5-15倍。
6.如权利要求5所述应用,其特征在于,稀释倍数为10倍。
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