CN115840038A - 检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及检测(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖含量的方法及其应用。本发明提供的检测方法包括对样本进行酶解处理、酸解处理和中和处理后，再利用抗BG的单克隆抗体建立的ELISA免疫检测方法检测样本中(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖的含量。该方法操作简单且灵敏度与鲎试剂相当，与全自动化学发光仪仪器配合使用，可实现对样本的随机自动化检测，具有操作简单、快速、准确的优点。

Description

检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用。

背景技术

β-D-葡聚糖(BG)是由多个葡萄糖分子通过β键结合的葡萄糖聚合物。葡萄糖的1位碳原子可与另一个葡萄糖的5个碳原子中的每一个结合，即1位碳原子、2位碳原子、3位碳原子、4位碳原子和6位碳原子。据报道，1位和3位(1→3)、1位和4位(1→4)或1位和6位(1→6)的结合组合经常出现在天然β-D-葡聚糖中。β-D-葡聚糖是真菌的细胞壁组成成分，是区别于其他微生物(如细菌)的特征性物质。由于此特征，β-D-葡聚糖分析法已用于深部真菌病的检测。深部真菌病是一种机会性感染，患者由于抵抗力减弱而导致免疫功能失调，患者陷入极为危急的状态。深部真菌病的典型致病真菌的实例包括念珠菌属(Candida)和真菌属(Aspergillus)。由于存在(1-3)-β-D-葡聚糖(BG)是这些致病生物的细胞壁所共有的，因此测量体液中的BG已用于深部真菌病感染的辅助诊断。

目前，检测深部真菌病主要利用鲎(Limulus)试剂对BG的保护反应。该鲎试剂被批准用作体外诊断。但是，使用这种鲎试剂的方法需要天然资源鲎的血液，因此除了生态资源枯竭的问题之外，维持特定品质的成本也很高。该方法的另一个缺点是由于该技术需要多个步骤，因此易于发生分散。

对于侵袭性真菌病的诊断，需要在样本中对BG进行敏感、特异的检测。因此一种简单、高效的检测方法可以用来监测侵袭性真菌病的治疗效果。化学发光法灵敏度高，线性范围宽，特异性高，操作快速简便，易于自动化，不存在环境污染等优点。化学发光技术依据其反应载体不同分为两种：一种基于微孔板反应的半自动化学发光技术，另一种基于磁微粒反应的全自动化学发光技术，更趋均相、更加快速、更易于自动化。目前国产的大部分产品为前者。国际主流的大型诊断公司，大多数采取基于磁微粒反应的化学发光技术。磁微粒化学发光检测技术必将成为检测方法的主要发展方向之一，成为BG血清学检测的主流技术，广泛用于真菌病等侵袭性真菌疾病的筛查与诊断。

磁微粒化学发光技术应用于侵袭性真菌病检测方面，具有高灵敏度、快速、准确、重复性好、线性范围宽、安全无毒、无放射性污染等优点，易于实现自动化检测，同时可以进一步缩短检测时间，适宜于急诊检测。但该方法在检测过程中容易受样品中生物素的干扰，降低BG的检测准确度。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用。本发明提供的检测样本中(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法包括先将样本用酶解溶液酶解处理，再用酸解溶液酸解处理，最后用中和溶液中和处理后，用抗BG的单克隆抗体进行免疫检测，能够提高待测样本的BG检出率。

本发明提供了一种免疫检测的预处理试剂，包括酶解溶液、酸解溶液和中和溶液；

所述酶解溶液中的酶为蛋白酶K、细胞壁裂解酶、蜗牛酶、蛋白水解酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、酰胺水解酶中的任意一种或多种；

所述酸解溶液中的酸为氨基磺酸、盐酸、硝酸或硫酸中的任意一种或多种；

所述中和溶液为磷酸盐溶液、碳酸盐溶液或Tris-HCl缓冲液和表面活性剂中的任意一种或多种。

在一些实施例中，本发明通过利用所述预处理试剂、单独酶解溶液、单独酸解溶液和单独中和溶液分别处理样本后分析免疫检测结果的准确性。结果表明，相比较单独酶解溶液、单独酸解溶液、单独中和溶液以及空白对照组相比，本发明提供的预处理试剂处理样本后的免疫检测结果准确性最高，并且变异系数小于3％，重复性良好。

具体的，所述酶解溶液中的酶优选为纤维素酶和/或蜗牛酶，更优选为纤维素酶和/或酰胺水解酶，缓冲液为磷酸盐缓冲液，其中酶的浓度为0.01～5U，优选为0.5U；

所述酸解溶液优选为氨基磺酸溶液，其浓度为0.1～6.0M，优选为2.0M，pH值为-1.0～3.0，优选为0；

所述中和溶液优选为磷酸三钠溶液或十二烷基硫酸钠，所述磷酸三钠溶液浓度为0.1～6.0M，优选为1.0M，pH值为7.0～14.0，所述十二烷基硫酸钠溶液浓度为0.1～3.0M，优选为1.0M，pH值为7.0～14.0，优选为8.0。

本发明提供了一个试剂组合，包括本发明所述的预处理试剂和免疫检测试剂；

所述免疫检测试剂包括ELISA检测试剂、酶免疫分析试剂、免疫组织化学染色试剂、表面等离子共振试剂、胶乳凝集免疫分析试剂、化学发光免疫分析试剂、电化学发光免疫分析试剂、荧光抗体检测试剂、放射免疫分析试剂、免疫沉淀检测试剂、Western Blot法检测试剂、免疫层析检测试剂或高效液相层析法检测试剂。

本发明的免疫检测试剂中使用的抗体，可以通过将BG例如还带三糖作为抗原(免疫原)溶解在溶剂例如磷酸盐缓冲盐水中，然后将该溶液施加至动物进行免疫。在根据需要向溶液中添加适当的佐剂后，可以使用乳剂进行免疫。本发明对佐剂不做限定，可以是广泛使用的佐剂，例如油包水乳剂、水包油包水乳剂、水包油乳剂、脂质体或氢氧化铝凝胶，以及来源于生物成分的蛋白质或肽类物质，可以优选使用弗氏不完全佐剂或完全佐剂。虽然没有特别限制，但期望的是，适当地选择佐剂的施用途径、施用剂量和施用时间，使得所期望的免疫应答可在通过抗原进行免疫的动物中增强。

本发明对免疫动物种类不做限定，但用于免疫的动物的类型优选是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊或羊驼，优选为小鼠或大鼠。可以根据常规技术对动物进行免疫，例如，可以通过将抗原溶液与佐剂的混合物皮下、皮内、静脉内或腹膜内注射给动物来实现免疫。由于免疫反应通常根据待免疫动物的类型和品系而不同，因此期望根据所用动物适当地设定免疫时间表。优选在初次免疫后重复几次抗原施用。

本发明对产生单克隆抗体的方法不做限定，因此用于本发明的免疫分析方法的抗体可以通过使用上述抗原产生。在克隆步骤之后，可以通过使用例如ELISA法、RIA法和荧光抗体法的方法来分析所产生的抗体与BG的结合能力，从而确认所选择的杂交瘤是否产生具有所需特性的单克隆抗体。

本发明提供了所述的预处理试剂或所述的试剂组合在制备(1-3)-β-D-葡聚糖含量检测的产品中的应用。

本发明还提供了(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂盒，包括所述的预处理试剂和BG的ELISA检测试剂，所述ELISA检测试剂中捕获抗体为固相抗BG抗体，检测抗体为生物素标记的抗BG抗体或HRP标记的抗BG抗体。

具体的，在一些实施例中，本发明采用抗BG抗体做为固相捕获抗体，HRP标记的抗BG抗体作为检测抗体，从而建立以磁性微粒为固相载体的ELISA方法。

本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括对样本进行预处理后进行免疫检测；

所述预处理包括酶解孵育处理、酸解孵育处理和中和处理；

所述酶解孵育处理的温度为2～40℃，时间为0.1～10min；

所述酸解孵育处理的温度为2～40℃，时间为0.1～10min。

具体的，在本发明的实施例中，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

向含有BG的样本中加入酶解溶液，37℃孵育酶解30S；

向酶解后的混合液中加入酸解溶液，37℃孵育酸解30S；

向酸解后的混合液中加入中和溶液，将含有BG的样本调节至中性。

进一步的，所述酶解孵育处理的酶解溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)，优选为1:1；

所述酸解孵育处理的酸解溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)，优选为1:1；

所述中和处理的中和溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)，优选为1:2。

本发明中所述的样本为组织液或体液，优选为体液，例如血液、血清、血浆、肺泡灌洗液、尿液或脑脊液。

利用本发明提供的试剂盒，对含有BG的样本进行酶解处理、酸解处理和中和处理后再进行免疫检测的结果不受干扰物的干扰，其受干扰率在4.2％以内。即使添加高浓度的干扰物，也不会产生假阳性的结果；此外，检测结果也不会被内源性干扰物质所影响，其受干扰率在5.6％以内，说明本发明提供的BG含量检测方法在检测不同样本的过程中抗干扰能力很强。

本发明还提供了检测体液中(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法，包括利用本发明所述的试剂盒。

本发明所述的检测方法包括诊断目的的，或者非诊断目的的。例如，包括对人体或动物体，或者离体的来自于人体或动物体的样品进行的以诊断为目的的检测方法；也包括对环境样品或者模拟样品进行的以科研或其他非诊断目的检测方法。

本发明取得的有益效果：

(1)本发明提供的检测方法先后将样本经过酶解、酸解和中和，使样本中的BG处理效果最佳，在37℃下处理样本1min，BG处复合物即发生解离，相较于现有检测方法具有更高效的处理，更好的重复性、且条件相对简单，与本公司发明的全自动化学发光仪仪器配合使用，能够实现全自动化操作。

(2)本发明中提供的BG单克隆抗体免疫检测方法，灵敏度高，特异性好，不与半乳甘露聚糖、甘露聚糖、肽聚糖、纤维素、内毒素(脂多糖)、多粘菌素等物质产生交叉反应。且不受血红蛋白、胆红素和甘油三酯内源干扰物影响，可以为临床提供更准确的检测结果，可以满足临床对侵袭性真菌感染早期诊断的要求，具有更高的临床应用价值。

附图说明

图1示本发明实施中Marker及纯化单抗IgG的HPLC测定结果图；

图2示本发明检测方法与鲎试剂法结果的相关性。

具体实施方式

本发明提供了检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

确认不同预处理(酶解、酸解或碱)对样品中BG测量灵敏度的影响。通过使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，以检测酶解、酸解、酶解+酸解或单独碱预处理对BG测量灵敏度的影响。1#抗体用作固相捕获抗体，HRP标记的2#抗体用作检测抗体。

1.1、酶解处理

向50μL人血清样本中，添加50μL酶解溶液，并在37℃下孵育15分钟。随后，将200μL中和溶液添加到酶解处理后的溶液(总计300μL，样品稀释6倍)。将其用作酶解处理的样本。

1.2、酸解处理

向50μL人体血清样品中加入150μL酸解溶液，在37℃下孵育15分钟(生成白色沉淀物)。随后，将孵育的样品离心(14000rpm，15分钟，4℃)以收集100μL上清液，并添加200μL的中和溶液以中和酸解溶液(总共300μL，样品稀释6倍；中和后的pH值小于7.4)。使样品回到室温，然后用作酸预处理的样品。

1.3、酶解+酸解处理

向50μL人血清样本中，添加50μL酶解溶液，并在37℃下孵育15分钟。随后，将50μL酸解溶液添加到酶解处理后的溶液，并在37℃下孵育15分钟。随后，将150μL中和溶液添加到酸解处理后的溶液(总计300μL，样品稀释6倍)。将其用作酶解+酸解处理的样本。

1.4、碱处理

向50μL人血清样品中，添加150μL碱性预处理溶液(150mM KOH：氢氧化钾)，并在37℃下孵育15分钟。随后，将100μL中和溶液添加到碱性处理溶液中和碱性处理溶液(总计300μL；样品稀释6倍；中和后的pH值小于7.9)。将其用作碱预处理的样品。

1.5、对照样本

向250μL的中和溶液中添加50μL的人血清样品，以获得具有相同溶液组成的对照的样本。

1.6、利用1#抗体用作固相捕获抗体，HRP标记的2#抗体用作检测抗体建立以磁性微粒为固相载体的ELISA方法。

(1)、磁性微粒洗涤

取30μL表面含羧基磁珠放在玻璃瓶中，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入300μL 0.02M PBS(pH 8.0)，重复以上操作3次。

(2)、磁性微粒活化

将抗BG捕获抗体加入含羧基磁珠的玻璃瓶中，充分混匀后室温轻轻震荡反应1-2h；用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清；再加入300μL 0.02M PBS(pH 8.0)，重复以上操作3次。

(3)、抗BG检测抗体酶结合物的制备

辣根过氧化物酶(HRP)用常规改良过碘酸钠法活化，加入抗BG检测抗体，2～8℃反应过夜，加硼氢化钠还原酶结合物，透析去除未反应的试剂，加50％体积甘油，置-20℃保存；使用时按照1:1000～1:5000的比例稀释在含20％小牛血清和0.1％ P300防腐剂的缓冲液中，2～8℃保存。

(4)、化学发光底物液

底物A液采用异鲁米诺衍生物，底物B液采用过氧化氢。

(5)使用本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus，检测真菌的BG含量：

在反应容器(以下简称“孔”)中依次加入校准品C1 2孔(用于定校准曲线)，校准品C2 2孔，50μL/孔；其余孔中每孔分别加入50μL预处理后的样本；

每孔分别加入磁微粒混悬液20μL；混匀后，37℃温育15分钟；然后用清洗液洗涤5次；

每孔分别再加入酶结合物100μL；混匀后37℃温育17分钟；清洗液洗涤5次；

最后每孔再加入底物A液和底物B液各50μL；混匀后1～5分钟检测发光强度；

1.7、BG包被捕获抗体与酶标记检测抗体的确定

包用常用的酶稀释液将标记物BG 1#和标记物BG 2#分别进行倍比稀释1:10K、1:5K，搭配100ng/测试的BG 1#和标记物BG 2#抗体包被固相磁微粒，对其样本反应性进行筛选确定。

样本：3份阳性样本，结果经同类已上市的厂家测定(通过1,3-β-D-葡聚糖试剂盒Fungitell Assay，Associates of Cape Cod)确认为阳性；3份阴性样本，均为健康人样本，结果经同类已上市的厂家测定确认为阴性。

表1捕获抗体1#与检测抗体2#反应性考核结果

由上表可知，阴阳反差(P/N)均不低于20，检测抗体2#浓度为1：5K,与捕获抗体1#搭配时，阴阳反差(P/N)最大，反应性较强，本底较低。因此选择1#抗体用作固相捕获抗体，HRP标记的2#抗体用作检测抗体。用于后续BG的单克隆抗体进行夹心ELISA检测方法的建立。

1.8、结果

利用以上方法处理含有BG的血清，分析1-1酶解溶液、酸解溶液、中和溶液以及单独碱溶液对其检测结果的影响。表2展示出了含有BG的样品测量结果(通过1,3-β-D-葡聚糖试剂盒Fungitell Assay，Associates of Cape Cod)。

含有BG的血清样品10份，进行中和溶液稀释对照、碱处理、酶解、酸解、酶解+酸解+中和溶液处理相比，与鲎试剂(Fungitell Assay)结果的相关性，数据统计结果显示：酶解+酸解组：99.94％，碱处理：94.04％，酶解：94.82％，酸解：74.89％，对照：54.65％。经过酶解+酸解+中和溶液处理的样品的测量准确性均得到了显著提高。

表2不同预处理溶液(BG检测结果(pg/mL)

1.9、酶解时间

利用以上方法处理含有BG的血清，在37℃解离温度下酶解1～10min，表3展示出了不同处理时间对含有BG的样品测量结果(通过1,3-β-D-葡聚糖试剂盒Fungitell Assay，Associates of Cape Cod)。

含有BG的血清样品10份，进行1、2、3、10min处理相比，与鲎试剂(FungitellAssay)结果相比较，发现37℃解离1min，即可实现最佳的处理效果，得到的检测结果与传统鲎试剂(1,3-β-D-葡聚糖试剂盒Fungitell Assay)的检测结果一致。结果见表3。

表3不同酶解+酸解处理时间(1-3)-β-D-葡聚糖检测结果

实施例2

样本中加入酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理方法对检测结果的影响。选择含有不同BG浓度的3份血清样本，向50μL人血清样本中，添加50μL酶解溶液，并在37℃下孵育30S。随后，将50μL酸解溶液添加到酶解处理后的溶液，并在37℃下孵育30S。随后，将150μL中和溶液添加到酸解处理后的溶液(总计300μL，样品稀释6倍)。将其用作酶解+酸解处理的样本。采用实施例1制备的检测方法，与本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumoA1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus配合使用，用以检测BG，每天检测4个重复，连续检测5天，变异系数CV<3％，结果见表4：

表4样本处理后(BG检测结果重复性(pg/mL)

从表4中结果可以看出：样本1的变异系数为0.45％，样本2的变异系数为0.21％，样本3的变异系数为0.13％，均小于行业要求的10％，证明其重复性良好。

实施例3

BG的样本经过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理结合使用BG单克隆抗体进行夹心ELISA，为了检测其方法特异性，通过采用实施例1制备的检测方法，与本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus配合使用，用以检测BG。本实施例中向含有98pg/mL和355pg/mL的BG临床样本中分别加入不同浓度的半乳甘露聚糖、甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、多粘菌素(具体添加浓度见表5)，添加干扰物的样本再次用实施例1所制的BG检测分析方法。

按照实施例1中的应用方法进行测定，并计算干扰物质对BG检测的干扰率，计算公式如下：干扰率(％)＝((添加干扰物后样本BG实测浓度-未添加干扰物时样本BG实际浓度)-(添加干扰物后样本BG实测浓度-仅添加干扰物溶剂时样本BG实际浓度)/未添加干扰物时样本BG葡聚糖实际浓度×100％。通过计算干扰物质对BG检测的干扰率，所得结果见下表5：

表5(1，3)-β-D葡聚糖检测方法的抗干扰率结果

通过上表可以看出，即使添加高浓度的干扰物后，采用本发明通过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液后的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，其受干扰率在4.2％以内，说明本发明BG免疫检测方法在检测临床样本的过程中抗干扰能力很强，不会发生因干扰物引起的假阳性结果，能为临床提供更精准的检测数据。

实施例4

样本中的内源性干扰物质可能会干扰检测结果，需要考核本试剂盒对内源性干扰物质的耐受浓度。BG的体液经过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，为了检测其方法特异性，通过采用实施例1制备的检测方法，与本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000Plus配合使用，用以检测真菌BG。本实施例中向含有98pg/mL和355pg/mL的BG临床样本中分别加入不同浓度的血红蛋白、胆红素和甘油三酯(具体添加浓度见表6)，添加干扰物的样本再次用实施例1所制的BG检测分析方法。按照实施例1中的应用方法进行测定，并计算干扰物质对BG检测的干扰率，计算公式同上：通过计算干扰物质对BG检测的干扰率，所得结果见下表6：

表6(1，3)-β-D葡聚糖检测方法的内源干扰率结果

/>

通过上表可以看出，即使添加高浓度的内源干扰物后，采用本发明通过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液后的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，其受干扰率在5.6％以内，说明本发明BG免疫检测方法在检测临床样本的过程中抗干扰能力很强，由于临床样本生理浓度和病理浓度均低于内源性干扰物考核浓度，因此不会发生因内源干扰物引起的假阳性结果，能为临床提供更佳更准确的检测数据。

实施例5

含BG的体液经过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，为了检测其方法准确性。通过采用实施例1制备的检测方法，与本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus配合使用，用以检测真菌BG。本实施同时采用鲎试剂法(通过(1-3)-β-D葡聚糖试剂盒Fungitell Assay，Associates of Cape Cod)检测相同样本的BG浓度。

结果如表7和图2所示，检测浓度≥80pg/mL的样本为BG阳性样本，可以看出，基于经过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA和鲎试剂法的检测结果相关性良好(R²>0.99)。对BG进行梯度稀释后，进行灵敏度检测。结果发现，随着BG浓度的上升，信号值也随之上升；检测限(LOD)达到20pg/mL，与市售试剂盒的比较如表7所示。

表7不同真菌BG试剂盒结果比对

实施例6

含BG的体液经过酶解溶液、酸解溶液、中和溶液处理体液的处理结合使用BG的单克隆抗体进行夹心ELISA，为了检测其方法特异性。通过采用实施例1制备的检测方法，与本公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A1000、AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus配合使用，用以检测真菌BG。本实施同时采用鲎试剂法(通过(1-3)-β-D葡聚糖试剂盒Fungitell Assay，Associates of Cape Cod)检测相同样本的真菌BG浓度。

与鲎试剂相比，本发明的鼠源单克隆抗体具有亲和性强和特异性好等优点，本发明的试剂盒与市售试剂盒的测试数据见表8，本发明的试剂盒的特异性优于市场上现有的真菌BG检测试剂盒。

表8不同真菌(BG方法的临床符合率

厂家	安图	金山川	丹娜(天津)
				方法	化学发光	显色法(鲎试剂)	显色法(鲎试剂)
检测时间	40min	80min	70min
				临床符合率	94％(175/186)	91％(169/186)	90％(167/186)

综上所述，本发明的待检体液先后经过酶解、酸解和中和，使其体液中的BG处理效果最佳，在37℃下处理样本1min，BG处复合物即发生解离，相较于现有检测方法具有更高效的处理，更好的重复性、且条件相对简单，与本公司发明的全自动化学发光仪仪器配合使用，能够实现全自动化操作；本发明中提供免疫检测方法的BG的单克隆抗体，抗体灵敏度高，特异性好，不与半乳甘露聚糖、甘露聚糖、肽聚糖、纤维素、内毒素(脂多糖)、多粘菌素等物质产生交叉反应。且不受血红蛋白、胆红素和甘油三酯内源干扰物影响，可以为临床提供更准确的检测结果，可以满足临床对侵袭性真菌感染早期诊断的要求。更有利于将检测时间缩短至40min以内；本发明的试剂盒特异性强，临床符合率达94％，灵敏度高，特异性好，优于市场上现有的试剂盒，在侵袭性真菌病的早期快速临床诊断方面具有广阔的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.免疫检测的预处理试剂，其特征在于，包括酶解溶液、酸解溶液和中和溶液；

所述酶解溶液中的酶为蛋白酶K、细胞壁裂解酶、蜗牛酶、蛋白水解酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、酰胺水解酶中的任意一种或多种；

所述酸解溶液中的酸为氨基磺酸、盐酸、硝酸或硫酸中的任意一种或多种；

所述中和溶液为磷酸盐溶液、碳酸盐溶液或Tris-HCl缓冲液和表面活性剂中的任意一种或多种。

2.根据权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，所述酶解溶液中的酶为纤维素酶和酰胺水解酶，缓冲液为磷酸盐溶液，其中酶的浓度为0.01～5U。

3.根据权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，所述酸解溶液为氨基磺酸溶液，其浓度为0.1～6.0M，pH值为-1.0～3.0。

4.根据权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，所述中和溶液为磷酸三钠溶液或十二烷基硫酸钠溶液，其浓度为0.1～6.0M，pH值为7.0～14.0。

5.试剂组合，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的预处理试剂和免疫检测试剂；

所述免疫检测试剂包括ELISA检测试剂、酶免疫分析试剂、免疫组织化学染色试剂、表面等离子共振试剂、胶乳凝集免疫分析试剂、化学发光免疫分析试剂、电化学发光免疫分析试剂、荧光抗体检测试剂、放射免疫分析试剂、免疫沉淀检测试剂、Western Blot法检测试剂、免疫层析检测试剂或高效液相层析法检测试剂。

6.权利要求1～4任一项所述的预处理试剂或权利要求5所述的试剂组合在制备(1-3)-β-D-葡聚糖含量检测的产品中的应用。

7.(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的预处理试剂和BG的ELISA检测试剂，所述ELISA检测试剂中捕获抗体为固相抗BG抗体，检测抗体为生物素标记的抗BG抗体或HRP标记的抗BG抗体。

8.权利要求7所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括对样本进行预处理后进行免疫检测；

所述预处理包括酶解孵育处理、酸解孵育处理和中和处理；

所述酶解孵育处理的温度为2～40℃，时间为0.1～10min；

所述酸解孵育处理的温度为2～40℃，时间为0.1～10min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶解孵育处理的温度为37℃，时间为1min；所述酸解孵育处理的温度为37℃，时间为30s。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述酶解孵育处理的酶解溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)；

所述酸解孵育处理的酸解溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)；

所述中和处理的中和溶液与样本的体积比为1:(0.2～10)。

Images