CN104849459B - Psa的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。

Description

PSA的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及PSA的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
前列腺特异抗原(prostatespecificantigen，PSA)是与前列腺癌相关的一种抗原，属糖蛋白类物质，分子量约为34KD，pH为6.8～7.5，等电点为6.9，半衰期为2.2士0.8天。PSA存在于前列腺内质网和前列腺上皮细胞及分泌物当中，正常前列腺及病变前列腺组织内均含有PSA。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物，其诊断前列腺癌的特异性为82％-97％。前列腺癌在男性所有类型癌中占10％～20％，是男性最常见的癌肿。该病进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位。流行病学调查表明，随着我国居民生活水平的改善，环境污染的加剧以及饮食结构的改变，前列腺癌的发病率日趋上升，已引起临床上的高度重视。美国FDA已批准将PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。研究显示，PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。正常男性的PSA值<4ug/L。
PSA在血液中以游离和结合两种形式存在。其中游离PSA(freePSA，F-PSA)只占小部分，结合型(comlexedPSA，C-PSA)占大部分，即与内源性蛋白酶抑制物前列腺癌α1-抗糜蛋白酶(αl-antichymotrysin，ACT)结合成PSA-ACT复合物，以及与另一种蛋白抑制物α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin，α2M)结合成PSA-α2M。在精液中，PSA还与C蛋白抑制物构成复合物。由于PSA-α2M不具有免疫活性，不能被现有的PSA检测法检测到。所以目前可定量检测到的PSA有3种：T-PSA(总PSA)，F-PSA,PSA-ACT。
测量血清中总PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌，它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物。研究显示,总PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。美国FDA已批准将总PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。使用总PSA作为诊断前列腺癌的诊断标准是：总PSA：0～4ng/ml正常；4～10ng/mL，21～25％的患癌几率；>10ng/ml癌症。在4.0～10ng/ml的灰色区域，单独检测总PSA无法区分癌症和良性增生。游离PSA可提供更好的生化指标，用于区分总PSA4～10ng/ml的前列腺癌和良性增生。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。
在本发明中，包被酶标板的游离PSA单克隆抗体和HRP标记的游离PSA单克隆抗体为配对抗体，并且可通过商业渠道获得。
在本发明的一个实施方案中，所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。
所述辅助试剂包括对照缓冲液、底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，各试剂具体为：
对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
反应终止液为3mol/L硫酸；
清洗缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
本发明所述游离PSA的酶联免疫试剂盒的最低检测限可以达到0.1ng/mLPSA，并且稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4℃下可保存3年。
具体实施方式
下面将结合举例来说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
试剂盒组成：游离PSA单克隆抗体包被酶标板(96孔)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液1瓶，6ml/瓶；对照缓冲液1瓶；游离PSA标准品1瓶，底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
游离PSA单克隆抗体包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。具体过程为：以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度15mg/ml。单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析9小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗游离PSA单克隆抗体。再用含0.2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
反应终止液为3mol/L硫酸；
清洗缓冲液(1X)组成为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
实施例2试剂盒灵敏度考察
分别配制PSA标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，具体检测方法如下：
a)抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入50μlPSA标准品溶液和对照缓冲液，37℃水浴保温50分钟。清洗缓冲液洗板操作5次。
b)将HRP标记的PSA单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温50分钟。重复洗板操作5次。
c)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温20分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
d)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
e)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；
计算PSA标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的PSA标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
0.1ng/mlPSA标准品及对照缓冲液OD450吸光度值
0.1ng/ml PSA标准品 空白对照缓冲液 OD比值
OD450吸光度值 0.012 0.003 4.0
根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y＝0.106x+0.0086；R2＝0.98。上表数据表明本发明试剂盒在0.1ng/ml浓度下，灵敏度良好，并且线性极佳。
实施例3试剂盒稳定性考察
将实施例1制备的试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对数据进行回归分析，计算R2值。
本实施例中对比例设定如下：
对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液中不添加PEG200。
对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液中PEG200替换为胎牛血清(FBS)，浓度同PEG200。
对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。
具体结果如下：
另外，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。
实施例4
应用本发明技术制备游离PSA酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测
精密度：随机抽取50盒不同批次试剂盒，用同一份肝癌阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于2％。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (3)

1.一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成；
所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05MpH值为9.5碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05MpH值为9.5磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板；
所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5；
所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5；
对照缓冲液为15mmol/LpH7.4的PBS缓冲液；
底物溶液为pH7.4磷酸-柠檬酸缓冲液配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，反应终止液为3mol/L硫酸；清洗缓冲液为15mmol/LpH7.4的PBS配制的0.05％吐温20溶液。
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