CN101358976A - 检测六项肿瘤标志物的微阵列-酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

发明涉及一种六项肿瘤标志物微阵列(Array)－酶联免疫(ELISA)检测试剂盒，特别是用于检测对肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤疾病有指示作用的特征性蛋白质的六项肿瘤标志物微阵列－酶联免疫检测试剂盒。

Description

检测六项肿瘤标志物的微阵列-酶联免疫检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种六项肿瘤标志物微阵列(Array)-酶联免疫(ELISA)检测试剂盒，特别是用于检测对肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤疾病有指示作用之特征性蛋白质的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒。

技术背景：

恶性肿瘤是严重危害人类健康的多发病和常见病，可累及人体的各种脏器或组织，在我国发病率或病死率较高的恶性肿瘤疾病包括肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等。

绝大多数恶性肿瘤发病原因复杂且不明确，起病隐匿，早期诊断困难，待典型临床表现和病理学特征出现后，疾病已处于中晚期，不易治疗，5年存活率低。迫切需要提供有效的早期发现、早期诊断的方法，以便做到及时有效的治疗。

肿瘤标志物(Tumor markers，TMs)是指由于肿瘤的存在和发展，而特异性产生和/或升高的物质，可存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测。一项肿瘤标志物可能是针对某种肿瘤疾病的器官特异性标志物，也可能是对多种肿瘤疾病均有指示作用的广谱性标志物，多项血清肿瘤标志物的联合检查对肿瘤的辅助诊断、预后判断、观察疗效、监测复发具有重要的参考意义。随着检测技术的发展，方法学的改进，特别是标志物项目的增加和合理组合，结合各种标志物检测的微量变化，经综合评价，肿瘤标志物检查可以为高危人群的筛选、临床诊断、预后观察以及肿瘤复发、转移评价带来有力的证据。这些年来，随着肿瘤标志物与临床诊断的符合率的增加，不少标志物已逐渐成为肿瘤检测中可依赖的指标。

目前临床上常用的对获自患者的样品进行肿瘤标志物测定的方法很多，主要包括：放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、自动化免疫分析仪等。

放射免疫分析(RIA)是以放射性核素作为示踪物的标记免疫测定方法，具有灵敏度高、特异性强(可分辨结构类似的抗原)、样品及试剂用量少和易于自动化等优点。但由于具有放射性污染，现在已很少应用。

酶联免疫吸附法(ELISA)具有成熟度高，灵敏度高、特异性较好，操作方法简便快速、无放射性污染且检测结果排除了人为的主观判断，以及应用范围广等很多优点，但一次试验只能检测单一指标，通量低，检测成本较高，在肿瘤标志物检测的推广方面存在着极大的局限性。

自动化免疫分析仪已成为临床上广泛应用的肿瘤标志物检测方法，排除了手工操作方法重复性较差、误差比较大、操作时要特别认真的局限，是目前认可度较高的检测方法之一。但这种大型仪器检测费用较高，适合大规模检测，应用起来不够灵活且不易普及。

此外，免疫诊断蛋白芯片尽管能同时检测多项指标，但由于它是把抗体包被在用于制备蛋白质芯片的基底-玻片、微球或膜上，并且玻片和微球在使用前要经过醛基化或多聚赖氨酸等预处理，导致生产成本增加，以及后续实验的操作繁琐，重复性差，市场推广性不强。

为了克服上述检测肿瘤标志物的现有方法中的缺点，节省时间、人力和物力，本发明人开发了一种工艺简单，定位准确，反应快速，价格低廉，能进行多项蛋白检测的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒，及其制备方法。

利用六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒检测恶性肿瘤疾病，成功克服了现有检测试剂盒操作繁琐、检测指标单一、检测成本高等缺陷，具有廉价、简单、快速、准确、多重检测、血清标本用量极少、易于推广和规模化等优点。

发明内容：

本发明人所开发的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒将现代微阵列技术与传统的ELISA技术相融合，在例如96孔酶标板的基底上利用全自动点样仪有序固定多种抗体，实现了对样品中目的蛋白质的检测，可用于生物学、医学及其相关领域中目的蛋白质的鉴定和疾病标志性蛋白质的鉴别。具体的，所述试剂盒基于芯片技术的核心原理，集成酶联免疫吸附试验(ELISA)的高成熟度而成的新一代检测技术体系.在保持了ELISA方法学的成熟、方便，敏感性和特异性都较为良好的基础上，又具有芯片技术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点。

因此，本发明的一方面涉及一种六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括1)同时固定有多种抗体的基底，以及任选的，2)用于通过Array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与固定在酶标板基底上的抗体发生抗原-抗体反应的物质之反应剂和检测剂。

本领域普通技术人员知晓，所述用于固定抗体的基底可以为选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯材料的用于ELISA实验的酶标板。事实上，所述基底可以为适用于ELISA反应的任一材料，只要所选材料对于所要固定的抗体是惰性的，不影响待固定的抗体用于检测样品中相关物质的性质。

在本发明的又一方面，涉及一种用于检测对肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤疾病有指示作用的特征性蛋白质的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒，其中包括1)同时固定有针对选自如下特征性蛋白质的抗体的酶标板基底：AFP(甲胎蛋白)，CEA(癌胚抗原)，CA125(糖链抗原125)，CA19-9(糖链抗原19-9)，CA15-3(糖链抗原15-3)，PSA(前列腺特异性抗原)，以及任选的，2)用于通过Array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与固定在酶标板基底上的抗体发生反应的物质之反应剂和发光液。

在本发明的一个实施方案中，所述固定在基底，例如用于ELISA反应的酶标板上的针对所述特征性抗原之抗体的种类为2种或2种以上。

采用本发明所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒与传统的ELISA试剂盒相比，具有如下优势：后者在一次检测中所测得指标数有限，样本数量仅为一个；而前者在每个反应孔中可以一次性完成多个指标的检测，做到了多样本多指标并行检测，并且操作简单，大大提高工作效率，节约成本。

不仅如此，采用本发明所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒与现有的蛋白芯片相比，其优势在于：后者把蛋白固定在玻璃片、微球或者膜上，使得实验操作要求高，过程繁琐，人为因素产生的操作误差大，而前者的实验操作步骤与传统的ELISA几乎相同，因此更适合用于临床检测。

因此，本发明所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒是在传统的ELISA的基础上，成功地融和了ELISA技术和微阵列技术二者的优点，形成的一种操作简单，检测快速、准确，具有多重分析能力的实验技术。

具体的，本发明采用以下步骤制备所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒，以及利用所述试剂盒，针对6种不同肿瘤标志物加以检测。

六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫方法是在传统的96孔酶标板上固定特异性的抗体分子。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒在基底，例如用于ELISA反应的酶标板上固定有由如下抗原分子的特异性单克隆抗体分子组成的用于同时检测六种不同肿瘤标志物的抗体：AFP、CEA、CA125、CA19-9、CA15-3和PSA，和阳性对照羊抗鼠IgG。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体的固定采用如下方法，l)将0.1-20ng特异性抗体的磷酸盐缓冲液点样于传统的96孔可拆卸酶标板条孔内，4℃包被16-24个小时；

2)用含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脱脂奶粉，5-10％的蔗糖之0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液，37℃封闭0.5-3时；以及

3)用含有0.05-0.5％Tween20，0.1-1％NaCl的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤，晾千后，于2-8℃保存备用。

附图说明：

图1为本发明所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测反应的实验原理。

图2为本发明所述酶标板的点样示意图。

图3为本发明所述酶标板的检测结果。

具体实施方式：

下面，结合附图和实施例进一步说明本发明。

实施例1

用于多种肿瘤疾病检测的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒中固定多种抗体的酶标板的制备

为了检测样品中是否含有对肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤疾病有指示作用的特征性蛋白质，制备固定有针对选自如下特征性抗原之抗体的酶标板：AFP(甲胎蛋白)，CEA(癌胚抗原)，CA125(糖链抗原125)，CA19-9(糖链抗原19-9)，CA15-3(糖链抗原15-3)，PSA(前列腺特异性抗原)。

1.抗体的制备

所述针对特征性抗原：AFP(甲胎蛋白)，CEA(癌胚抗原)，CA125(糖链抗原125)，CA19-9(糖链抗原19-9)，CA15-3(糖链抗原15-3)，PSA(前列腺特异性抗原)的抗体商购自Fitzgerald Industries International，Inc.(产品名称和产品号分别为：AFP MAb M803209；CEA MAb M111147；PSA MAb M701042；CA125 MAb M002201；CA19-9 MAb M8073021；CA15-3 MAb M8071022)。

采用购自Greiner公司的8孔板条[产品号04300143]，使用如下包被缓冲液(磷酸二氢钠0.2965g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠4g，纯化水加至1000ml)。发光液购买自Pierce公司[产品号37075]。

2.点样：

将4-100nl的含有0.1-20ng的上述相关疾病标志物特异性抗体的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液用全自动点样仪点样于Greiner公司的8孔板条的孔内，4℃包被16-24个小时.具体的，Array-ELISA点阵示意图如图2所示，其中用于点样的阵列形式不局限于所表示的形式，可以任意组合。

3.封闭：

用50-200ul的含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脱脂奶粉，5-10％的蔗糖的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液(磷酸氢二钠5.8g，磷酸二氢钠0.593g，氯化钠8.0g，casein 2.5g，硫柳汞钠0.5g，蔗糖(HCV\TP)50.0g，蔗糖(HIV\HBV)100.0g，山羊血清100ml，明胶10ml)，37℃封闭0.5-3小时，用含有经20倍稀释的浓缩洗液(氯化钾4.0g，磷酸二氢钾4.0g，磷酸氢二钠58.0g，氯化钠160.0g，硫柳汞钠0.1g，Tween-20 50ml，加纯化水至1000ml)洗涤.晾干后，于2-8℃保存备用。

实施例2 用于肿瘤疾病检测的六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒的测定

1.加样

将用样品稀释液(磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.2965g，氯化钠10g，Casein2.5g，氨基吡啉5g，小牛血清100ml，甘油75ml，Tween-205ml，曲拉通-1005ml，ProClin300 0.15ml，纯化水加至1000ml)按照1∶21稀释好的待测样本50ul加入如上述实施例1所制备的酶标板的各个反应孔中，放入孵育振荡器，3档37℃反应60分钟。

2.洗板：

样本反应结束后，把反应板从振荡器中拿出来，放入洗板机的相应位置，调节“条数”按健至相应条数，调节“次数”按健至5次，洗板机洗板时无浸泡，无振荡，无间歇。洗板结束后，用吸水纸把板拍干。

3.加入混合酶标抗体：

向每孔加入HRP(商购自Sigma公司)标记的，混合有六种分别针对特征性抗原：AFP(甲胎蛋白)，CEA(癌胚抗原)，CA125(糖链抗原125)，CA19-9(糖链抗原19-9)，CA15-3(糖链抗原15-3)，PSA(前列腺特异性抗原)的单克隆抗体(商购自Fitzgerald Industries International，Inc.产品名称和产品号分别为：AFP MAb M0151608；CEA MAb M111146；PSAMAb M701041；CA125 MAb M002203；CA19-9 MAb M8073021；CA15-3MAb M8071021)混合溶液50ul，放入孵育振荡器，3档37℃反应60分钟.反应结束后洗板。

4.检测：

每孔加入配制好的(A∶B＝1∶1)发光液(商购自Pierce公司)30ul，室温下60秒成像。拍摄时采用低温CCD，在稳定的低温下放入相配套的扫描仪中，用焦距(mm)25；光圈1.4-16的Fujinon HF 25HA-1B镜头拍摄图片，读取数据.结果如图3所示。

实施例3

六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒与现有技术的比较采用上述实施例1-3所述的方法，对获自北京大学第一医院等临床单位的样品进行检侧。与目前常用的检测方法加以比较，结果如下。

Claims (5)

1.一种六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括1)同时固定有多种抗体的基底，以及任选的，2)用于通过Array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与固定在酶标板基底上的抗体发生抗原-抗体反应的物质之反应剂和检测剂。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述固定抗体的基底为选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯的ELISA酶标板。

3.权利要求1的试剂盒，其用于检测针对于肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤疾病之特征性蛋白质的多种抗体，其中所述多种抗体为针对选自如下的蛋白质之抗体：AFP(甲胎蛋白)，CEA(癌胚抗原)，CA125(糖链抗原125)，CA19-9(糖链抗原19-9)，CA15-3(糖链抗原15-3)，PSA(前列腺特异性抗原)。

4.一种在权利要求1所述六项肿瘤标志物微阵列-酶联免疫检测试剂盒中的基底上固定用于检测特异性蛋白质的抗体的方法，包括：

将所述特异性抗体点样于基底上，4℃包被16-24个小时；

用含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脱脂奶粉，5-10％的蔗糖之0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液，37℃封闭0.5-3小时；

用含有0.05-0.5％Tween20，0.1-l％NaCl的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤，晾干后，于2-8℃保存备用。

5.权利要求5的方法，其中所述固定抗体的基底为选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯的ELISA酶标板。

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