CN102656457A - 用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法,它们使用针对前列腺特异性抗原(PSA)的抗体来检测人尿液中的PSA。更具体地,本发明涉及用于诊断前列腺癌的试剂盒,其包括针对PSA的抗体并且使用人尿液作为样品,并且涉及用于诊断前列腺癌的方法,其包括使人尿液样品与针对PSA的抗体接触,从而检测所述样品中的PSA。
Description
技术领域
本发明涉及用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法,它们使用针对前列腺特异性抗原的抗体。
背景技术
在美国,前列腺癌是引起男性死亡的第二大癌症,并且在韩国前列腺癌患者的人数也在不断增加。在韩国,前列腺癌患者在1989年仅占男性癌症患者的1.2%,但是目前占男性癌症患者的3%。1990年韩国的前列腺癌患者死亡率仅为0.2%,但是在2000年为1.6%。不像其他癌症,前列腺癌生长非常缓慢。因此,如果可以在早期阶段诊断前列腺癌,治疗其的可能性可以增加,这表明前列腺癌的早期诊断是重要的,
前列腺特异性抗原(PSA)是一种丝氨酸蛋白酶,其具有约33kDa的分子量并且以高水平表达在前列腺上皮中。其以1-3g/L的浓度分泌到精液中。对于正常人,分泌到精液中的PSA降解精囊特异性蛋白,从而溶解凝固的精液形式(Ulf-Hakan Stenman等,Cancer Biology(癌症生物学),9:83-93,1999)。对于正常的前列腺,仅有非常少量的所生成的PSA渗漏到血液中。然而,当前列腺肥大时,显著量的PSA从前列腺中渗漏出来。在前列腺癌的情形中,有大量的PSA渗漏出来,因此增加血液PSA水平。因此,PSA不仅可以作为前列腺癌的重要指征,还可以作为前列腺异常如前列腺肥大(prostatomegaly)的重要指征。迄今为止,通过PSA检测的前列腺癌早期诊断的病例已经快速增长,并且当显著去除已经存在的癌症,包括早期前列腺癌后,血液PSA水平表现出快速降低的趋势(Korean Journal of Urology(韩国泌尿科学杂志),1999)。
对于正常人,血液PSA水平是0-4ng/ml。在血液PSA水平为1-1.5ng/ml的人中,发生前列腺癌的危险是血液PSA水平为1.0ng/ml以下的人的大约两倍高。另外,血液PSA水平为2-3ng/ml的人发生前列腺癌的危险是血液PSA水平为1.0ng/ml以下的人的大约五倍高。因为前列腺随着衰老而肥大,血液PSA水平也随着衰老增加,并且在50-60岁年龄组中为约0-3.5ng/ml,在60-70岁年龄组中为约0-4.5ng/ml,在70-80岁年龄组中为约0-6.5ng/ml。
在目前的诊断试剂盒产品情形中,将具有3ng/ml以上的血清PSA水平的患者诊断为前列腺癌。然而,这些试剂盒产品具有这样的缺点:其需要血液收集,并且诊断应该在医院进行。
因此,本发明人已经对用于诊断前列腺癌的新型试剂盒和方法进行了广泛的研究,其克服了现有产品的上述问题。结果,本发明人已经发现,与正常人尿液中的PSA量相比,前列腺癌患者尿液中的PSA量显著更小,并且基于这一发现,已经开发了用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法,其利用尿液替代血液作为样品,由此完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于诊断前列腺癌的试剂盒,其不需要从受试者采集血液。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断前列腺癌的方法,其不需要从受试者采集血液。
技术方案
为了实现上述目标,本发明提供一种用于诊断前列腺癌的试剂盒,其包括针对PSA的抗体并且使用人尿液作为样品。
本发明还提供一种用于诊断前列腺癌的方法,其包括使人尿液样品与针对PSA的抗体接触,从而检测样品中的PSA。
本发明人已经令人惊讶地发现前列腺癌患者尿液中PSA的量比正常人尿液中PSA的量显著更少。尽管还没有发现与正常人尿液中PSA的量相比前列腺癌患者尿液中PSA的量减少的特定机制,但是认为,在正常人情形中,前列腺中生成的PSA正常分泌到尿道中并且在尿液中检测到,但是在患有前列腺异常的人的情形中,所生成的PSA至尿道的分泌不充分。
因此,根据本发明所述的用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法使用尿液替代血液,不同于现有技术,并且当通过PSA特异性抗原在受试者的人尿液中检测到的PSA量少于正常人的PSA量时能够诊断前列腺癌。
因此,根据本发明所述的用于诊断前列腺癌的方法包括下述步骤:(a)确定获自受试者尿液的样品中的PSA量;(b)将步骤(a)中确定的量与参照量比较;和(c)基于步骤(b)中得到的结果,诊断所述受试者是否患有前列腺癌。
本发明的方法离体或在体外进行,并且优选在体外进行。另外,所述方法可以人工进行或通过自动化装置进行。
当用于本文时,术语“诊断”是指评估前列腺癌的发生或进展。如本领域技术人员已知的那样,对于统计学显著的受试者,评估可以准确进行,尽管其目的是对100%待诊断的受试者要准确。统计学显著性可以由本领域技术人员使用本领域广泛已知的方法容易地确定,所述方法例如,置信区间确定、p-值确定、t检验、Mann-Whitney检验等。优选的置信区间为90%以上,95%以上,97%以上,98%以上,和99%。优选的p-值是0.1,0.05,0.01,0.005或0.0001。优选地,根据本发明所述的诊断结果对于一组受试者中60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上的受试者是准确的。
当用于本文时,术语“受试者”是指动物,优选哺乳动物,更优选人。
用于本发明的样品是获自受试者的尿液样品。所述尿液样品可以在分析前进行预处理程序,如杂质去除。
在本发明中,尿液样品中PSA的量可以通过本领域已知的任何方法确定。用于确定尿液样品中PSA的量的方法包括下述步骤:(a)使所述样品中的PSA结合PSA特异性抗体,(b)任选地去除未结合的样品,和(c)确定结合的PSA特异性抗体的量。所结合的抗体本身或通过另外的操作直接或间接产生特异性信号。
当用于本文时,术语“量”可以不仅是绝对量,也可以是相对量、浓度和从其衍生的其他参数。
当用于本文时,术语“比较”意指将尿液样品中PSA的量与适当参照样品中PSA的量比较。术语“比较”意指相对应的参数的比较。例如,绝对量与适当的参照量比较,并且浓度与参照浓度比较。步骤(b)中的比较可以人工进行或使用计算机进行。对于计算机辅助的比较,确定的量值可以通过计算机程序与存储在数据库中的相对应的适当参照值比较。
术语“参照量”用于本文时是指允许评估受试者是否患有前列腺癌的量。相应地,参照获自于不患有前列腺癌的正常受试者。如果测试受试者尿液样品中PSA的量与参照样品(即,正常人的尿液样品)中PSA的量相似或比其大,则评估该受试者不患有前列腺癌。另一方面,如果测试受试者尿液样品中PSA的量小于或显著小于参照样品(即,正常人的尿液样品)中PSA的量,则评估该受试者患有前列腺癌。适当的参照量可以由参照样品确定。在下述优选实施例中,正常人尿液中PSA的量测量为大至50-80ng/ml,而前列腺癌患者中PSA的量测量仅为5ng/ml以下。另外,正常人血液中PSA的量的平均值仅为1.0615pg/ml,而前列腺癌患者中PSA的量在20pg/ml至800pg/ml范围内变化,其平均值达到332.5pg/ml。对于这样的结果,可以确定,在前列腺癌患者的情形中,血液中的PSA水平显著增加,而分泌到尿液中的PSA表现出减少而不是增加的趋势,因此,如果尿液中PSA的量显著小于正常人尿液中PSA的量,则受试者可以被评估为患有前列腺癌。
因此,在本发明的具体实施方案中,当通过PSA特异性抗体检测到的尿液样品中PSA的量为约10ng/ml以下时,受试者可以被诊断患有前列腺癌。优选地,当通过PSA特异性抗体检测到的尿液样品中PSA的量为约7ng/ml以下时,受试者可以被诊断患有前列腺癌。
在本发明的另一个实施方案中,在选择前列腺癌患者作为参照的情形中,如果获自受试者的尿液样品中PSA的量等于或小于获自所述前列腺癌患者的尿液样品中PSA的量,则所述受试者可以被诊断患有前列腺癌。
用于本发明的PSA特异性抗体没有特别限制,并且可以是商购的抗-PSA抗体或按照已知方法生产的抗体。优选地,用于本发明的抗体可以是选自由下列各项组成的组的一种或多种抗体:HB-10494,HB-9119,HB-11426,HB-8051,HB-8525,HB-8527(American Type Culture Collection(美国典型培养物中心),VA,USA)和抗-PSAAb(目录号:MO-C40081C:C-PSA1,Abazyme,Needham,MA,USA)。另外,抗体可以进行修饰,以增加与PSA结合的亲和性,并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体、或其可以与PSA结合的片段。
在本发明中,尿液样品中的PSA通过与PSA特异性抗体的抗原-抗体反应形成免疫复合物。所形成的免疫复合物可以通过免疫测定法检测。可以用来检测和/或定量抗原的数种方法对本领域技术人员来说是已知的(参见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室),纽约1988,556-612)。免疫测定法的具体实例包括,但不限于,免疫色谱、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫组织化学、免疫细胞化学等。免疫测定法中所用的试剂组合物包括适当的载体、能够产生可检测信号的检测标记、溶解试剂、和清除剂。如果检测标记是酶,则试剂组合物可以进一步包括底物和反应终止剂。适当的载体包括可溶性载体,例如,本领域已知的生理学可用的缓冲剂(例如,PBS),或不溶性载体,例如,聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、聚合物如由包被有金属的胶乳制成的磁性微粒、纸、玻璃、金属、琼脂糖以及它们的组合。
在本发明中,能够产生可检测信号的检测标记可以与针对PSA的抗体缀合。所述检测标记的实例包括各种酶、辅基(prosthetic groups)、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。检测标记可以直接与针对PSA的抗体偶联或缀合或者利用本领域已知的技术通过中间体(诸如例如,本领域已知的接头)、可以结合PSA蛋白的其他多克隆抗体、或可以结合PSA抗体的二级抗体间接与针对PSA的抗体偶联或缀合。适当的酶的实例包括辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、马来酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、或转化酶或者;适当的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素/生物素;适当的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、或藻胆蛋白;发光物质的实例包括鲁米诺、异鲁米诺(isolucinol)和光泽精;生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母荧光素;适当的放射性物质的实例包括125I,131I,111In,99Tc 14C,和3H。适当的显色物质的实例包括金、碳和胶乳。
本发明用于诊断前列腺癌的试剂盒可以包括上述用于诊断受试者中的前列腺癌的部件。具体地,本发明用于诊断前列腺癌的试剂盒可以包括容纳针对PSA的抗体、适当的载体、能够产生可检测信号的检测标记、溶解试剂、清除剂等的容器。当标记是酶时,试剂盒可以包括能够测量酶活性的底物和反应终止剂,并且检测标记可以直接或通过接头与针对PSA的抗体偶联或缀合或者可以与识别PSA抗体的二级抗体偶联或缀合。优选地,所述试剂盒进一步包括使用说明书。具体地,所述试剂盒包括指示使用者怎样结合通过本发明的方法提供的诊断结果分析检测结果的使用说明书。使用说明书包括能够基于确定的PSA量确定前列腺癌的存在或不存在的信息。使用者手册可以采取纸或电子文件(例如,CD ROM)的形式。
另外,本发明用于诊断前列腺癌的试剂盒可以利用目前商购的基于免疫色谱测定法设计的诊断前列腺癌的试剂盒的原理。免疫色谱测定法是免疫化学和色谱的组合,并且应用抗体针对抗原的免疫反应性、胶体金的着色特征和运动性、和多孔膜的毛细现象导致的分子运动。在免疫色谱测定法中,现有的多步骤免疫测定法所需要的样品稀释、清洗和通过酶复合物和底物之间的反应进行着色过程可以整合在一个系统中,从而使检测可以快速且便利地以一个步骤进行。另外,检测结果可以不用任何特定设备判定,因此,提供了容易、经济可行和检测结果快速判读的优点。
在本发明的优选实施方案中,人尿液样品中的PSA可以这样定量:通过将人尿液样品添加到包被有针对PSA的抗体的微量滴定平板上,使该样品与所述抗体反应,使所述样品与酶-二级抗体缀合物反应,用对该酶的特异性底物处理该样品来测量该样品的吸光度,并且将该吸光度与标准曲线比较。生物素可以与酶-二级抗体缀合物中的二级抗体缀合。酶可以是辣根过氧化物酶,但是不限于此。ELISA测定法中所用的任何酶和底物可以用在本发明中。
ELISA测定法是利用抗原-抗体反应来检测样品中抗原存在并且定量所述抗原的测定法。一个ELISA试剂盒中所需要的抗体数目是2种或3种。利用针对PSA的抗体的ELISA试剂盒包括2种抗体,并且其构建和原理如下述。
含有PSA的人尿液样品中的PSA可以这样定量:通过用针对PSA的抗体(一级抗体)包被96孔板,将所述样品加入到所述孔板中,使所述样品与所述抗体反应,使酶标记的多克隆抗体(二级抗体)与所述样品反应,用能够与所述酶标记反应的底物处理所述样品,检测酶-底物反应,并且将该反应与标准曲线比较。在本发明的具体实施方案中,生物素和链霉抗生物素蛋白-缀合的辣根过氧化物酶可以用作所述酶和底物。
有利效果
根据本发明所述的用于诊断前列腺癌的试剂盒和方法使用人尿液作为样品,其中所述人尿液样品比常规方法中所用的血液容易采集。另外,如果受试者尿液中PSA的量比正常人尿液中PSA的量少,则该受试者可以被诊断患有前列腺癌。因此,当使用本发明的诊断试剂盒和方法时,甚至在家不必去医院就可以容易地进行前列腺癌的诊断。
附图说明
图1显示使用针对PSA的抗体定量人尿液中的PSA的结果。
图2显示使用针对PSA的抗体定量人血液中的PSA的结果。
具体实施方式
以下,本发明将参考实施例进行更详细地描述。然而,应该理解,这些实施例仅是出于举例说明的目的,并不意欲限制本发明的范围。
实施例
实施例1:使用针对PSA的抗体定量人尿液中的PSA
尿液收集自20名正常人和10名前列腺癌患者中的每一名,并且离心去除沉淀。尿液样品中的PSA使用ELISA(Abazyme目录号EL10005)以下述方式定量。
1)将ELISA试剂盒中的平板用抗-人PSA单克隆抗体(目录号:MO-C40081C:C-PSA1,Abazyme,Needham,MA,USA)包被,并且向每个孔中加入50μl每种样品。
2)将每个孔中的样品搅拌至扩散,然后在37℃保存30分钟。
3)将每个孔用蒸馏水洗涤5次。
4)将每个孔中的样品用100μl辣根过氧化物酶-缀合的二级抗体(Abazyme,Needham,MA,USA)处理,并且在37℃温育30分钟。
5)将每个孔用蒸馏水洗涤5次。
6)将每个孔中的样品用100μl底物溶液处理,然后在37℃温育15分钟。
7)当样品中的抗原-抗体反应发生时,向每个孔中加入反应终止剂以终止反应。
8)使用ELISA读数仪读取450nm波长下每种样品中显色的程度。
测量结果显示20名正常人中PSA的量的平均值为50-80ng/ml,10名前列腺癌患者中PSA的量为5ng/ml以下(图1)。
实施例2:使用针对PSA的抗体定量人血液中的PSA
3ml血液收集自20名正常人和10名前列腺癌患者中的每一名,并且以10000rpm离心5分钟来沉淀血红细胞凝块,并且分离上清血清。各种血清中的PSA使用ELISA(Abazyme目录号EL10005)以与实施例1相同的方式定量。测量结果显示20名正常人中PSA的量的平均值仅为1.0615pg/ml,而10名前列腺癌患者中PSA的量在20pg/ml至800pg/ml范围内变化,并且其平均值达到332.5pg/ml(图2)。
对于实施例1和2的结果,可以看出,在前列腺癌患者的情形中,血液中PSA的量显著增加,而分泌到尿液中的PSA表现出减少而不是增加的趋势。因此,如果受试者尿液中PSA的量显著小于正常人尿液中PSA的量,则该受试者可以被诊断患有前列腺癌。
Claims (9)
1.一种用于诊断前列腺癌的方法,其包括下述步骤:
(a)确定获自受试者尿液的样品中前列腺特异性抗原(PSA)的量;
(b)将步骤(a)中确定的量与参照量比较;和
(c)基于步骤(b)中得到的结果,诊断所述受试者是否患有前列腺癌。
2.权利要求1的方法,其中所述方法在体外进行。
3.权利要求1或2的方法,其中所述步骤(a)中PSA的量使用PSA-特异性抗体来确定。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述步骤(b)中的参照量是对收集自正常人的尿液样品确定的PSA的量。
5.权利要求4的方法,其中如果所述步骤(a)中PSA的量小于所述步骤(b)中的参照量,则所述受试者被诊断患有前列腺癌。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中如果述步骤(a)中PSA的量为约10ng/ml以下,则所述受试者被诊断患有前列腺癌。
7.一种用于权利要求1-6中任一项的方法的前列腺癌-诊断试剂盒,其中所述试剂盒包括PSA-特异性抗体并且使用尿液作为样品。
8.权利要求7的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括使用说明书,所述使用说明书包括基于确定的所述尿液样品中PSA的量能够确定前列腺癌的存在或不存在的信息。
9.权利要求7的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括使用说明书,所述使用说明书指示当确定的所述尿液样品中PSA的量为约10ng/ml以下时,诊断前列腺癌。
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