CN1880958A - 酶促化学发光免疫检测系统 - Google Patents
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Abstract
酶促化学发光免疫检测系统,属于医学诊断技术领域。由电脑、打印机、洗板机、37度恒温箱、小型震荡器、系列体外诊断试剂、高效稳定酶促化学发光底物系统、基于标准96孔不透明微孔板的化学发光仪组成。其中的系列体外诊断检测试剂包括甲功系列、肿瘤系列、性激素系列、传染病系列、心肌标志物系列、糖尿病系列、优生优育系列等四十余种。为临床免疫诊断提供了一整套解决方案,患者仅需提供5ml的外周静脉血,经离心处理分离出血清,即可完成上述的四十余种项目的定性定量检测。数据处理程序化,不同项目的检测结果可组合打印于同一张化验单上。灵敏度高,结果准确,配套合理,自动化程度高,成本低,可最大限度地降低医患双方的经济负担。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断检测技术领域,特别涉及一种酶促化学发光免疫检测系统。
背景技术
本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析,利用发光的化学反应分析超微量物质,特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前,这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合,用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)基本相似,但与放射免疫试剂(RIA)比较,化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害,大大缩短了反应时间,同时兼具高灵敏度的优势。化学发光的灵敏度与可测范围远远高于酶免产品,同时兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度,又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点,易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂,试剂保质期长,应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作,成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种可进行多指标检测的酶促化学发光免疫检测系统。
为达上述目的,本实发明采用如下技术方案:酶促化学发光免疫检测系统,主要由系列体外诊断试剂、高效稳定酶促化学发光底物系统、基于标准96孔不透明微孔板的化学发光仪和与之相配套中文软件操作系统组成。
还包括电脑、打印机、37℃恒温温箱、小型震荡器。
系列体外诊断检测试剂包括以下7类:
(1)肿瘤标志物系列:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、β2微球蛋白(β2-MG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原19-9(CA19-9)、CA50;
(2)甲状腺功能系列:甲状腺素(T4)、游离甲状腺素(f-T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、游离三碘甲腺原氨酸(f-T3)、促甲状腺素(TSH)、抗-TG、抗-TPO;
(3)生殖内分泌激素系列:垂体泌乳素(PRL)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2);
(4)传染病系列:甲肝(HAV)、乙肝五项(HBsAg,抗-HBs,HBeAg,抗-HBe,抗-HBc)、丙肝(HCV)、丁肝(HDV)、庚肝(HGV)、HIV(1+2)、TORCH;
(5)心肌标志物系列:cTnI,cTnT,Mb,CK-MB,TNP;
(6)糖尿病系列:胰岛素、血清C肽;
(7)其他检测系列:皮质醇、总IgE;
高效稳定酶促化学发光底物系统由A,B两种成份组成,A液含高效化学发光剂、复合增强剂、氨基酸;B液中含有氨基酸氧化酶及稳定剂。
本发明涉及化学发光检测的方案设计、系列体外诊断试剂的开发、配套设备仪器设施的优选、包含具有国内领先水平的高效稳定酶促化学发光底物系统,优选了国外配套的化学发光全自动、半自动检测仪,并自行设计开发了全中文化学发光管理软件,可实现程序测量、快速测量、单板多项、两点定标、自动打印化验单、工作量统计等功能。从而形成了仪器、试剂、软件的全面配套,为临床检验界提供了一套完善的解决方案。本发明还具有检测试剂齐全,配套合理,操作方便,检测灵敏度高,结果准确,检测范围宽等特点,特别是试剂及发光底物的自主研制与开发,与进口试剂相比,性能优越,具有使用方便,成本低廉等优势。
本发明为临床检验界提供了一套完善的解决方案,特别适合于医院检验部门对患者的血清进行人体免疫分析,为临床大夫提供诊断信息。
本发明中,所有体外诊断试剂样品板采用塑料不透光白色96孔板结构,标记物为HRP标记的抗原或抗体,温育反应采用37度恒温箱。使用时,取患者血清适量加入包被孔中,同时加入酶标记物,放小型震荡器上震荡1分钟,放恒温箱内温育,这时反应微孔中发生抗原抗体反应,形成免疫复合物,用洗板机洗板,多余的酶标记物及未反应物被除去,然后加入提前等量混合好的化学发光底物,震荡1分钟,放入化学发光仪,读取每孔的相对发光值,然后与标准曲线对照,化学发光仪自动换算成相应的被测物的具体含量,然后通过打印机将结果打印。
本发明实施的最为关键的是化学发光底物,它直接影响检测信号的大小,检测灵敏度及测量范围。本方案所采用的是自主开发的化学发光底物。它由高效发光剂、复合增强剂、氧化剂及适宜的缓冲盐体系构成,分为A、B两组。该底物系统特别适用于过氧化物酶(辣根过氧化物酶HRP)或HRP标记的抗原抗体配合物的痕量检测。该底物系统在碱性条件下被HRP催化,发生氧化还原反应,产生光子,通过化学发光仪将发光信号放大,通过光信号的强弱来进行HRP配合物定量检测。该底物系统具有发光信号强,持续时间长,试剂在常温保存长达12个月等特点,在临床免疫诊断具有重要应用价值。
本发明还涉及化学发光仪器的全中文操作软件,功能全面的测量程序编辑,标准品、质控品、阴阳性对照、样品等可根据试验需要进行自由布局。全面的定量分析方法:可进行点到点、线性回归、三次样条、四参数、logit-log等曲线拟合,坐标轴可进行线性、对数、自然对数自由选择。还具有单板多项功能,最多支持多达12项同时检测。定性分析功能,支持多达4组临界值设定,5组定性分组。
具有丰富多样的数据输出形式:中文化验单打印,各种测量项目任意选择,矩阵打印,整板测量结果一目了然,形式多样的统计功能,多种统计数据自由输出。创新数据导出功能,将数据导出为文本文件,测量结果直接导入EXCEL中进行自定义处理。功能强大的数据库管理:数据库自动备份,确保数据能安全保存,测量各序导入功能,将程序导入软件,减少编程麻烦。经过临床的使用和不断改进,它更适合于中国的实际情况,从而大大减轻了测试人员的劳动强度。
酶促化学发光免疫检测系统检测甲胎蛋白(AFP):
AFP是原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志,也是目前最好的可实际用于早期诊断的指标,可在症状出现前6-12个月作出诊断。转移性肝癌及肝外肿瘤,AFP也会有一定程度的增高。血清AFP水平和肿瘤大小及肿瘤组织分化程度相关,可用于肝癌诊断、鉴别及疗效评价。在排除活动性肝病、生殖腺胚胎瘤和妊娠情况下,血清定量测定AFP>400ng/ml持续4周,或是>200ng/ml持续8周,可诊断原发性肝癌。其他非肿瘤性疾病,如:先天性胆道闭锁症,毛细血管扩张障碍,急慢性肝炎,肝硬化等均可不同程度的增高。但是,胆管细胞癌、高分化和低分化肝细胞癌,或已坏死液化者,AFP检测均可呈阴性。建议与血清铁蛋白(SF)联合检测,可提高肝癌的检出率,对于AFP阴性的患者尤有意义。
实验原理:
甲胎蛋白(AFP)化学发光定量检测试剂盒,应用双抗体夹心法,即在化学发光微孔板上包被甲胎蛋白单克隆抗体,在微孔板各孔中分别加入标准品、血清样品后,再加入另一株甲胎蛋白单抗的酶结合物,则标准品、血清样品中所含的甲胎蛋白将会与之形成抗体-抗原-抗体-酶复合物。洗去未结合的酶结合物后,加入化学发光底物,其发光强度与甲胎蛋白含量成正比。
实验步骤
1、取出一定量的包被孔,编号。每孔分别加入20μl标准品、血清样品。
2、每孔分别加入酶结合物100μl。微量振荡器上振荡30秒使其混合均匀。
3、置37℃温育60分钟。
4、甩去孔内混合物,洗板机洗板5次,或用蒸馏水注满各孔,甩去,重复5次,最后在吸水纸上拍干。
5、每孔加入混合后的底物100μl,室温(18-25℃)反应5分钟。
6、化学发光检测仪检测发光强度。
结果计算
通过化学发光软件中的程序设置:选择适当的拟和方式,利用本次实验的标准曲线求出待测标本的浓度值。本试剂盒可以采用以标准品发光强度值为纵坐标(Y轴),以标准品浓度为横坐标(X轴),即点到点方式拟和;也可以以标准品ALU值的对数值为纵坐标(Y轴),以标准品浓度的对数值为横坐标(X轴),即双对数方式拟和。通过程序测量即可将患者的检量发光值自动换算出检测物的含量。
酶促化学发光免疫检测系统检测三碘甲状腺原氨酸(T3):
3,5,3’三碘甲状腺原氨酸(T3)与T4相同,由甲状腺合成及分泌入血。血清中T3的量只约是T4的1/60,但其生物活性比T4大5倍。故血清中三碘甲状腺原氨酸(T3)的浓度是评价甲状腺功能的重要参数,尤其用在确诊甲状腺功能亢进和检查甲状腺毒症时。一般主要用于:
1、诊断甲状腺功能亢进:甲亢时血清中T3和T4浓度一般平行升高,但T3升高的幅度更明显。有些甲亢,T4升高不明显或未见升高,但T3明显升高,即为T3型甲亢。另外,甲亢时T3升高可能先于T4升高,因此,T3的检测对诊断及早期诊断甲亢很有意义。
2、评价治疗甲亢的疗效:甲亢在治疗过程中T4及T3先于临床症状的改善而下降,T4下降的速度快于T3,而且幅度较大,有时T4已降至正常范围,而T3仍高于正常。往往症状完全消失时,T3大多降至正常。因此要协同观察T3和T4作为治疗效果及临床变更药物的指标。
3、低T3综合症:许多疾病如肝硬化、肾病综合征、糖尿病酮症、恶性肿瘤、传染病、手术创伤后及心肌梗死等均可导致T3下降,下降的程度反应病情恶化的程度。
实验原理
本试剂盒应用竞争型化学发光免疫测定技术检测血清中T3含量。试剂盒中将抗T3抗体包被在微孔板上,制成固相抗体,酶结合物为辣根过氧化物酶标记的T3,往包被抗体的微孔中同时加入T3标准或待测血清以及酶标T3,二者共同与抗体竞争,反应后冲洗微孔板去掉未结合物,再加发光底物测定每孔发光值,其发光强度与T3含量成反比。
操作步骤:
实验前准备
1、将所有试剂恢复至室温(约半小时),整个操作环境应该控制在20到25度。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度。
3、液体标准品可以直接使用;固体标准品要按要求充分溶解后使用。
4、准备T3酶结合物试剂,将0.1ml的T3酶结合物浓缩液加入到1ml的T3酶稀释液中(1∶10稀释),并混合均匀。酶量取决于您的检测量,及用及配。
5、将发光底物A、B液等比例混合至本次试验所需体积(每孔需100μl,可按照每条包被板需混合后的发光底物1ml混合,依此类推)。
实验方法:
1、将所需用量的微孔条放置在支架上;
2、在反应微孔中依次加入50μl标准品或待测标本(请准确加样);
3、每孔加入100μl酶结合物,轻轻震荡微孔支架,充分混匀;
4、贴封膜后,在24±2℃条件下,温育60分钟;
5、将各孔液体弃尽,用蒸馏水洗板五次(或用洗板机洗涤),每次冲洗后将水分弃尽,最后一次冲洗后将微孔板中残余水分拍干,注意切勿擦拭反应微孔内壁。
6、每孔加混合后的底物100μl,室温反应5分钟。
7、化学发光检测仪检测发光强度值。
结果计算
选择适当的拟和方式,利用本次实验的标准曲线求出待测标本的浓度值。本试剂盒推荐采用点到点拟和方式,即以标准品浓度值为横坐标(X轴),以标准品发光强度值为纵坐标(Y轴),建立标准曲线,进行计算。
酶促化学发光免疫检测系统检测雌二醇(E2):
雌二醇(Estradiol)为C18类固醇激素,分子量为272.4。它是雌性激素中活性最强的一种,主要产自卵巢和胎盘,少量产自肾上腺皮质和男性睾丸。
分泌进入血液的E2中98%与性激素结合(SHBG)结合循环,少量的与其他血清蛋白如白蛋白结合,仅有很少部分以游离激素状态循环。雌激素的活性通过雌二醇-受体复合物在靶位上激发适当的反应。这些靶位包括卵泡、子宫、胸腺、阴道、下丘脑、垂体,对肝脏和皮肤也有较小的作用。
月经周期正常的未孕女性,E2的分泌遵循一种循环的两阶段模式,在排卵前达到最高浓度,排卵后E2水平快速下降,直至黄体细胞活跃产生第二次平缓的上升,并在黄体期形成平台。在孕期母亲血清E2水平明显升高,远高于上述的排卵前峰值水平,而且高水平的E2浓度持续整个孕期。
血清E2测定对评价各种月经异常是非常有用的指标:如女孩青春期提前或延迟、原发性或继发性闭经、卵巢早衰等。据报道,男性患有女性化综合征、乳房女性化以及睾丸癌的病人也会有E2升高。在不育症患者中,血清E2的监测对于监控诱导排卵及随后的治疗,例如用柠檬酸克罗米芬、LH释放激素(LHRH)或外源性的促性腺激素的治疗是非常有用的。在体外受精(IVF)中,对卵巢进行过激刺激时,通常每天对绒毛膜促性腺激素的使用和卵母细胞的收集进行最佳的调整,也需要检测血清E2浓度。
本试剂盒用于测定人血清或血浆中的总E2浓度。
实验原理
本化学发光定量检测试剂盒,采用竞争抑制法测定血清中E2的含量。E2标准品或病人血清、兔抗E2抗体及E2-HRP结合物均加入抗兔IgG包被的微孔中一起温育,血清样品中的E2和E2-HRP与恒定量的兔抗E2抗体竞争结合,形成的复合物与固相上的抗兔IgG结合,最终结合在固相上的E2-HRP的量与血清中E2浓度成反比。加入化学发光底物,测定每孔发光值,发光强度与标本中E2的含量成反比。以系列标准品发光值为纵坐标(Y轴),以标准品浓度为横坐标(X轴)作图,即得到标准曲线。血清样品中雌二醇浓度可相应从该标准曲线上查得。
操作步骤:
实验前准备
1、确保操作环境在室温(18-25℃),取出试剂盒及待测样品。将所有试剂及样品恢复至室温(约需30分钟)。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度。
3、液体标准品可以直接使用;固体标准品按要求充分溶解后使用。
4、将发光底物A、B液等比例混合至本次试验所需体积(每孔需50μl,可按照每条包被板(8孔)需混合后的发光底物0.5ml混合,依此类推)。
实验步骤
1、取出一定量的包被孔编号。每孔分别加入25μl标准品或血清样品。
2、每孔分别加入酶结合物100μl。
3、每孔分别加入E2抗体溶液50μl,充分混匀30秒.
4、置室温(18-25℃)下温育90分钟。
5、洗板:甩尽板孔内液体,用蒸馏水或去离子水注满各孔,甩去,重复5次,最后在吸水纸上拍干。
6、每孔加入混合后的底物50μl,室温(18~25℃)反应10分钟。
7、化学发光检测仪检测发光强度。
结果计算
选择适当的拟和方式,利用本次实验的标准曲线求出待测标本的浓度值。本试剂盒推荐采用点对点拟和方式,即以标准品浓度值为横坐标(X轴),以标准品发光强度值为纵坐标(Y轴),建立标准曲线(线性-线性),进行计算。
具体实施方式
实施例、酶促化学发光免疫检测系统,由电脑、打印机、37℃恒温温箱、小型震荡器、系列体外诊断试剂、高效稳定酶促化学发光底物系统、基于标准96孔不透明微孔板的化学发光仪和与之相配套中文软件操作系统组成。
系列体外诊断检测试剂包括以下7类:
(1)肿瘤标志物系列:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、β2微球蛋白(β2-MG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原19-9(CA19-9)、CA50;
(2)甲状腺功能系列:甲状腺素(T4)、游离甲状腺素(f-T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、游离三碘甲腺原氨酸(f-T3)、促甲状腺素(TSH)、抗-TG、抗-TPO;
(3)生殖内分泌激素系列:垂体泌乳素(PRL)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2);
(4)传染病系列:甲肝(HAV)、乙肝五项(HBsAg,抗-HBs,HBeAg,抗-HBe,抗-HBc)、丙肝(HCV)、丁肝(HDV)、庚肝(HGV)、HIV(1+2)、TORCH;
(5)心肌标志物系列:cTnI,cTnT,Mb,CK-MB,TNP;
(6)糖尿病系列:胰岛素、血清C肽;
(7)其他检测系列:皮质醇、总IgE;
高效稳定酶促化学发光底物系统由A,B两种成份组成,A液含高效化学发光剂、复合增强剂、氨基酸;B液中含有氨基酸氧化酶及稳定剂。
Claims (4)
1、酶促化学发光免疫检测系统,其特征在于,主要由系列体外诊断试剂、高效稳定酶促化学发光底物系统、基于标准96孔不透明微孔板的化学发光仪和与之相配套中文软件操作系统组成。
2、如权利要求1所述的检测系统,其特征在于,还包括电脑、打印机、37℃恒温温箱、小型震荡器。
3、如权利要求1所述的系统,其特征在于,系列体外诊断检测试剂包括以下7类:
(1)肿瘤标志物系列:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、β2微球蛋白(β2-MG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原19-9(CA19-9)、CA50;
(2)甲状腺功能系列:甲状腺素(T4)、游离甲状腺素(f-T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、游离三碘甲腺原氨酸(f-T3)、促甲状腺素(TSH)、抗-TG、抗-TPO;
(3)生殖内分泌激素系列:垂体泌乳素(PRL)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2);
(4)传染病系列:甲肝(HAV)、乙肝五项(HBsAg,抗-HBs,HBeAg,抗-HBe,抗-HBc)、丙肝(HCV)、丁肝(HDV)、庚肝(HGV)、HIV(1+2)、TORCH;
(5)心肌标志物系列:cTnI,cTnT,Mb,CK-MB,TNP;
(6)糖尿病系列:胰岛素、血清C肽;
(7)其他检测系列:皮质醇、总IgE。
4、如权利要求1所述的系统,其特征在于,高效稳定酶促化学发光底物系统由A,B两种成份组成,A液含高效化学发光剂、复合增强剂、氨基酸;B液中含有氨基酸氧化酶及稳定剂。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061220 |