CN104730247A - 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，包括：1)包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体；2)AMH和INHB的混合校准品；3)镧系元素1标记的AMH检测抗体；4)镧系元素2标记的INHB检测抗体；5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。本发明还提供了适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒的使用方法。本发明采用双标记时间分辨荧光免疫分析技术，解决了以往的AMH和INHB需分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒仅能检测AMH或INHB的缺点，减少了检测步骤，缩短了加样时间和减少了血样本的用量。

Description

一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种双标记快速时间分辨荧光免疫法试剂盒，尤其涉及一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒及其使用方法。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)，生育问题困扰着约10％的夫妻，影响全球多达8000万人，而且这一数字还在不断上升。正常女性生殖系统的受孕能力称为生育潜能。卵巢储备功能(ovarian reserve，OR)体现的是女性的生育能力，OR降低是指卵巢中的存留卵子量降到阈值以致影响了生育潜能，导致生育力低下。由于OR与生育和不孕症诊治关系密切，而日益受人关注。对尚未完成生育大事，未来即将准备受孕之女性，OR评估非常重要，因为OR多寡提供了选择治疗方向之参考，愈来愈多年轻女性正面临卵巢早衰之威胁，所以用科学方式评估OR的重要性越来越高。

近年来，随着不孕症发病率的逐年升高，辅助生殖技术(Assisted ReproductiveTechnology,ART)实现了很多不孕患者的生育愿望，更为广泛的应用到不孕症的治疗中。在ART中，体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)最具有代表性。如何获得足够数量的优质卵子是决定IVF-ET成功率的重要因素。在IVF-ET治疗过程中，控制性超排卵(controlled ovarianhyperstimulation,COH)并获得多个成熟的卵子是治疗成功的关键，而COH的效果又取决于卵巢的反应性。卵巢的反应性主要由卵母细胞的数量和质量，即OR来决定。在COH的过程中，OR和卵巢对外源性促性腺激素(gonadotropin，Gn)的反应性是影响COH的重要因素。OR是指卵巢皮质内的被己经募集的卵泡，逐步发育为可受精卵母细胞的潜能，它受卵泡数量和质量的影响，当卵泡的数量或质量下降时，卵巢对Gn刺激的反应性降低，导致获卵数的减少甚至无卵可取，从而使妊娠率降低，影响妊娠结局。相对于卵巢的低反应，当卵巢对Gn过于敏感时，引起卵巢过度反应，在促排卵过程会有过多的卵泡同时发育成熟，使机体内的雌激素水平过高，卵巢过度增大，容易引发促排卵过程中较为常见的并发症，卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)。过度反应会刺激更多的卵泡生长，可能会取得更多的卵子供体外受精使用，但这并不意味着会相应的得到高质量的胚胎及理想的妊娠结局。约有15％～20％的促排卵周期因为轻度到中度的OHSS而被取消，而严重的OHSS会因血管通透性的增加，使患者出现胸水、腹水、无尿等症状，发生休克，甚至危及生命。因此，在促排卵之前，需要对患者的OR和反应性进行评估和预测，选择合适的促排卵方案，个体化用药，预防并发症的出现，减少患者的身心及经济负担，提高抱婴率。如何在COH治疗中正确评价卵巢的储备能力及其对COH的反应性，寻找评估OR的理想指标，预防卵巢低反应和卵巢过度刺激的发生，一直是生殖领域的研究热点之一。

目前，临床上用来评估卵巢储备功能的指标包括年龄，基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteotropic hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)、窦卵泡计数(antral follicle count，AFC)、血清抗苗勒管激素(Anti-MUllerian Hormone，AMH)、抑制素B(Inhibin B，INHB)等。AMH和INHB都是由卵泡周围的颗粒细胞产生。血清AMH水平与AFC、基础E2有较强的相关性。随着年龄的增加，卵巢储备功能降低，血清AMH水平出现降低，并且AMH被认为是能最早揭示这一生理现象的指标。而血清AMH在整个月经周期保持相对的稳定性，可在月经周期的任何一天进行检测，传统预测卵巢功能与库存量之方式采经期1至3天抽血检测FSH，但FSH经常会有误差，如卵巢手术过可能FSH正常但事实上已濒临衰竭，又如子宫内膜异位症妇女，卵巢功能实际上已经衰退，但FSH却还在正常范围。因此，AMH的测定不受月经周期的限制，与FSH和E2相比，AMH是评估OR的优异指标。大量文献表明，血清AMH与获卵数的相关性比年龄、基础FSH、LH更强，能够更好的预测卵巢的储备和反应性。同时，对于INHB的研究指出，当OR降低时，INHB水平下降，但是比基础FSH水平的升高，E2的下降出现的更早。血清INHB是由颗粒细胞产生，推测能比基础FSH更直接，更敏感的体现卵巢储备功能及反应性。血清AMH、INHB因其特有的优势，近年被更多人的用来评估OR和研究其是否与妊娠结局有关。血清AMH、INHB血液检测试剂盒可产生标准化的结果，而使用超声波评估OR时，评估结果通常依赖于操作者或诊所。

目前没有任何一项研究使用单一的标志物预测OR可以获得满意的灵敏度和特异度，提高预测标志物的检测阈值虽然可以增加特异度，但是灵敏度会随之下降，反之亦然，所以将标志物联合检测可以提高对OR的预测。有研究表明血清AMH和INHB水平呈正相关，在临床工作中联合应用检测AMH和INHB水平，可以提高对OR的预测。OR减退是一个渐进性的过程，早期发现及诊断OR减退，及时进行干预，可以改善女性的生殖潜能，提高受孕能力及妊娠结局。血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有价值的预测指标。

目前用于检测AMH和INHB常分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒仅能检测AMH或INHB，此种方式存在以下缺点：1.检测步骤繁多，特别是手工法容易导致实验出现错误；2.加样时间长，检测时间长，费时费力；3.样本需要量大，导致采血量增加；4)目前AMH和INHB采用的酶联免疫法检测时间较长(1～3h)。

目前常用免疫方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、电化学发光免疫分析法(electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)等。RIA由于放射性污染，对环境和操作者影响较大，批内批间变异较大，难于自动化；ELISA采用大分子酶标记，且酶容易失活，这种依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多(即使是优秀的“管式ELISA”，其试管形状的变化也会影响试验的结果)，其灵敏度、线性和稳定性未能高于RIA；CLIA的化学发光通常是瞬间完成，发光峰值很快衰减，温度和pH值对发光有很大影响，该类因素影响了该类方法的应用；ECLI仍为非开放系统，试剂依赖进口，试剂昂贵，维修及检测成本高，这也限制了其推广应用。由于时间分辨荧光免疫法(time-resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)独特的技术原理，有区别于传统的免疫标记技术的特点和优势，已被人们广泛接受，与现在广泛使用的RIA、ELISA、CLIA和ECLI相比，TRFIA克服了RIA放射性污染的不足、酶标记物的不稳定性和定量范围窄的缺陷、化学发光仅能一次发光、一般荧光标记受环境干扰的难点和ECLI的非直接标记等缺点，铕(Eu)标记TRFIA的灵敏度可达10^-19mol/L，应用范围广，致使其试剂盒的生产和检测仪器的更新换代进展甚速，目前已实现了分析技术的自动化，TRFIA已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中一个试剂盒仅能单独检测AMH或INHB、灵敏度较低、检测步骤繁琐、加样时间较长以及血样本用量较多的问题。

因此，本发明提供了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，包括：1)包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体；2)AMH和INHB的混合校准品；3)镧系元素1标记的AMH检测抗体；4)镧系元素2标记的INHB检测抗体；5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。

在上述技术方案中，由于血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有价值的预测指标，两者联合检测可以提高对OR的预测。AMH和INHB双标记快速时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒的研制，与传统方案及单标记方法检测AMH和INHB相比，可更快的获得更可靠的检测结果。

在上述技术方案中，AMH包被抗体和AMH检测抗体可结合AMH分子上不同的抗原结合位点，AMH包被抗体包被在固相载体上，而AMH检测抗体被用于与镧系元素1结合，以制得镧系元素1标记的AMH检测抗体标记物。同理，INHB包被抗体和INHB检测抗体可结合INHB分子上不同的抗原结合位点，INHB包被抗体包被在固相载体上，而INHB检测抗体被用于与镧系元素2结合，以制得镧系元素2标记的INHB检测抗体标记物。因此，向试剂盒中的固相载体加入待测样品、镧系元素1标记的AMH检测抗体标记物和镧系元素2标记的INHB检测抗体标记物以后，待测样品中的AMH通过其两个结合位点分别与AMH包被抗体和镧系元素1标记的AMH检测抗体结合，结合到固相载体上的镧系元素1标记的AMH检测抗体标记物与AMH的含量成正比，同时待测样品中的INHB通过其两个结合位点分别与INHB包被抗体和镧系元素2标记的INHB检测抗体结合，结合到固相载体上的镧系元素2标记的INHB检测抗体标记物与INHB的含量成正比。这样，通过时间分辨荧光测定仪测定固相载体上结合的标记物的荧光强度，并结合根据AMH和INHB的混合校准品制得的标准曲线，即可得出待测样品中的AMH含量和INHB含量。

在上述技术方案中，镧系元素1与镧系元素2是两种不同的镧系元素，它们可以从能够应用在时间分辨荧光免疫技术中的镧系元素中选择，如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、锝(Te)。这些稀土金属的荧光寿命较长，可达1-2ms，而且它们的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，能够满足时间分辨荧光分析法测量要求。

在上述技术方案中，免疫反应促进液可增加抗原抗体反应表位的专一亲和力，促进抗原抗体特异性结合，产生比传统方法高几倍或十几倍的信号强度，从而解决免疫检测实验中经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题，可更快地获得理想的数据而省去那些反复查找失败原因并尝试改进的麻烦。

作为对上述技术方案的进一步改进，以往免疫检测方法多采用多克隆抗体，应用多克隆抗体有较高的敏感性但特异性差，后来采用单克隆抗体代替多克隆抗体，提高了方法学的特异性，但又存在敏感性较低的缺点，因此弥补这一缺陷，所述AMH包被抗体为AMH多克隆抗体，所述AMH检测抗体为AMH单克隆抗体。抑制素是一种由女性卵巢颗粒细胞及男性睾丸支持细胞分泌的异二聚体蛋白质激素。完整的抑制素分子是一个分子量约为32KD的分子，由两个不同的亚单位(α亚单位和β亚单位)经二硫键连接而成。卵泡液和血清中也可以发现a亚单位。此外，游离的α亚单位与β亚单位没有生物活性。因此所述INHB包被抗体为INHBβ亚单位单克隆抗体，所述INHB检测抗体为INHα亚单位单克隆抗体。

作为对上述技术方案的进一步改进，Eu³⁺和Sm³⁺的激发波长均为340nm，最大发射波长分别为615nm和643nm，虽然相差不大，但由于是窄峰发射，能够充分分辨，并且均能利用β-NTA螯合剂进行解离和增强荧光强度。因此，可以利用它们之间的这些荧光特性，测量时选择不同的滤光片，能够精确地测量出混合物中不同镧系元素的含量。所述镧系元素1为铕(Eu)，所述镧系元素2为钐(Sm)。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体为包被有AMH多克隆抗体和INHBβ亚单位单克隆抗体的固相载体；所述镧系元素1标记的AMH检测抗体为Eu³⁺标记的AMH单克隆抗体，所述镧系元素2标记的INHB检测抗体为Sm³⁺标记的INHα亚单位单克隆抗体。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述免疫反应促进液含有BSA、染料或色素、Procline300、EDTA、Tris-HCl缓冲液和免疫检测活性剂；其中的免疫检测活性剂为吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG)2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 10000、PEG 12000、PEG 20000中的至少一种。适量的EDTA能消除Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子对TRFIA荧光检测的影响，并且也可以用于消除血样本中补体对检测结果的影响。Procline300防腐剂具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性，它是一种理想的可替代硫柳汞、叠氮钠和庆大霉素等生物防腐剂。Tween20是一种非离子型去污剂，不破坏蛋白的结构，适量的Tween20可以降低免疫反应的阴性本底；在生物学实验中又可作封闭剂，适量的Tween20可以封闭未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。Tween-20可以降低抗体的非特异性结合。近年来研究表明，PEG作为反应增强介质，是一种无电荷的线形分子结构的多糖，其作用是能消除蛋白质(抗原、抗体)分子周围的电子云和水化层，因而能够促进抗原、抗体分子结合形成大分子复合物，可以提高抗原抗体反应的敏感性，快速达到反应平衡。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述免疫反应促进液含100ml/L BSA、0.05g/L曙红、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppm Procline300以及含4％PEG6000的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液；分装成40ml/瓶。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体的制备方法为：将AMH包被抗体和INHB包被抗体用包被缓冲液稀释至0.1～10μg/mL，在固相载体上进行包被，洗涤固相载体，然后再用封闭缓冲液进行封闭，将固相载体干燥后，真空包装，2～8℃保存备用。其中，所述包被缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液，20mmol/L、pH 4.5的磷酸盐缓冲液，50mmol/L、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液或50mmol/L、pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液。所述封闭缓冲液为含有10g/L的牛血清白蛋白的10mmol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述浓缩洗液为含有4mL/L Tween20、30ppm亮蓝、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述增强液为含0.5mL/L曲拉通-100、0.8mL/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述AMH和INHB的混合校准品的制备方法为：将纯化的AMH标准品原料和INHB标准品原料用含有10g/L BSA的50mmol/L、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液稀释成A-F 6个混合校准品，A-F 6个混合校准品中含有浓度分别为0、1、5、20、40、100ng/mL的AMH和0、1、10、50、250、1000pg/mL的INHB。

本发明还提供了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)将试剂及所需数量的固相载体从试剂盒中取出并平衡至室温；稀释浓缩洗液以配制工作洗涤液，并于使用前30min内，将镧系元素1标记的AMH检测抗体、镧系元素2标记的INHB检测抗体与免疫反应促进液按一定的体积比混匀，制得标记物工作液；

2)吸取AMH和INHB混合校准品以及待测样本依次加入包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体中，同时加入适量的标记物工作液，将固相载体在室温下，振荡孵育15min，孵育结束后，用工作洗涤液洗涤数次；向每个反应位中加入适量的增强液，将固相载体于室温下缓慢振荡5min；

3)分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测AMH和INHB混合校准品对应的最终反应物的荧光值，并根据检测的荧光值分别绘制AMH和INHB的标准曲线；

分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测待测样本对应的最终反应物的荧光值，并根据相应的标准曲线，计算待测样本中的AMH和INHB浓度。

本发明还提供了另一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)将试剂及所需数量的固相载体从试剂盒中取出并平衡至室温；稀释浓缩洗液以配制工作洗涤液，并于使用前30min内，将镧系元素1标记的AMH检测抗体、镧系元素2标记的INHB检测抗体与免疫反应促进液按一定的体积比混匀，制得标记物工作液；

2)吸取AMH和INHB混合校准品以及待测样本依次加入包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体中，同时加入适量的免疫反应促进液，将固相载体在室温下，振荡孵育15min，第一步孵育结束后，用工作洗涤液洗涤数次；

3)向每个反应位中加入适量的标记物工作液，在室温下，振荡孵育15min，第二步孵育结束后，洗涤数次，然后向每个反应位中加入适量的增强液，将固相载体于室温下缓慢振荡5min；

4)分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测AMH和INHB混合校准品对应的最终反应物的荧光值，并根据检测的荧光值分别绘制AMH和INHB的标准曲线；

分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测待测样本对应的最终反应物的荧光值，并根据相应的标准曲线，计算待测样本中的AMH和INHB浓度。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本发明采用双标记时间分辨荧光免疫分析技术，解决了以往的AMH和INHB需分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒仅能检测AMH或INHB的缺点，减少了检测步骤，缩短了加样时间和减少了血样本的用量。

2)本研究应用了免疫反应促进液，增加了抗原抗体反应表位的专一亲和力，促进抗原抗体特异性结合，产生比传统方法高几倍或十几倍的信号强度，从而解决免疫检测实验中经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题，更快地获得理想的数据而省去那些反复查找失败原因并尝试改进的麻烦。本发明中免疫反应促进液应用的优点：(1)可以显著改善信噪比，提高低丰度AMH和INHB的检测成功率，得到更好的结果；(2)较传统的方法，最高可以节省高达90％的标记抗体用量，大大降低了试剂成本；(3)对减少HOOK效应的发生起着直接作用，检测AMH或INHB高值、低值的P/N值均高于常规法，并且可将HOOK效应发生的临界浓度减小。

3)适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒的使用，与传统方案及单标记方法检测AMH和INHB相比，可更快的获得更可靠的检测结果。血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有价值的预测指标，两者联合检测可以提高对OR的预测。

附图说明

图1为实施例1中的本发明试剂盒INHB的剂量-反应曲线。

图2为实施例1中的本发明试剂盒AMH的剂量-反应曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括：1)包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体；2)AMH和INHB的混合校准品；3)镧系元素1标记的AMH检测抗体；4)镧系元素2标记的INHB检测抗体；5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。

根据本发明，制备该试剂盒包括以下步骤：1)制备包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体、AMH和INHB的混合校准品、镧系元素1标记的AMH检测抗体、镧系元素2标记的INHB检测抗体、免疫反应促进液、浓缩洗液及增强液；2)分装；3)贴标签；以及4)组装为成品。

根据本发明提供的试剂盒，采用了双抗体夹心双标记快速时间分辨荧光免疫法，实验方法简单快速，可自动化操作，检测系统为开放式操作系统，本发明的试剂盒的使用可以采用以下两种优选方案：

1、双抗体夹心一步法：1)在包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体中的相应位置加入AMH和INHB的混合校准品或待测样本；2)加入适量的已用免疫反应促进液稀释好的镧系元素1标记的AMH检测抗体和镧系元素2标记的INHB检测抗体；3)孵育；4)洗板；5)加入适量的增强液；6)振荡；以及7)检测，分析结果。

2、双抗体夹心二步法：1)在包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体中的相应位置加入AMH和INHB的混合校准品或待测样本；2)加入适量的免疫反应促进液；3)孵育；4)洗板；5)加入适量的已用免疫反应促进液稀释好的镧系元素1标记的AMH检测抗体和镧系元素2标记的INHB检测抗体；6)孵育；7)洗板；8)加入适量的增强液；9)振荡；以及10)检测，分析结果。

本发明采用双标记时间分辨荧光免疫分析技术，解决了以往的AMH和INHB需分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒仅能检测AMH或INHB的缺点，减少了检测步骤，缩短了加样时间和减少了血样本的用量。本研究应用了免疫反应促进液，增加了抗原抗体反应表位的专一亲和力，促进抗原抗体特异性结合，产生比传统方法高几倍或十几倍的信号强度，从而解决免疫检测实验中经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题，更快地获得理想的数据而省去那些反复查找失败原因并尝试改进的麻烦。本发明中免疫反应促进液应用的优点：(1)可以显著改善信噪比，提高低丰度AMH和INHB的检测成功率，得到更好的结果；(2)较传统的方法，最高可以节省高达90％的标记抗体用量，大大降低了试剂成本；(3)对减少HOOK效应的发生起着直接作用，检测AMH或INHB高值、低值的P/N值均高于常规法，并且可将HOOK效应发生的临界浓度减小。AMH和INHB双标记快速时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒的研制，与传统方案及单标记方法检测AMH和INHB相比，可更快的获得更可靠的检测结果。血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有价值的预测指标，两者联合检测可以提高对OR的预测。

作为对上述技术方案的进一步改进，本发明的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法定量测定AMH和INHB的试剂盒包括：1)同时包被有AMH多克隆抗体(AMH Pcab)和INHBβ亚单位单克隆抗体(INHBβMcab)的固相载体；2)AMH和INHB的混合校准品；3)Eu³⁺标记的INHα亚单位单克隆抗体(Eu³⁺-INHαMcab)；4)Sm³⁺标记的AMH单克隆抗体(Sm³⁺-AMH Mcab)；5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。

以上改进方案中的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备包被有AMH Pcab和INHBβMcab的固相载体；2)制备AMH和INHB的混合校准品；3)制备Eu³⁺-INHαMcab；4)制备Sm³⁺-AMH Mcab；5)制备免疫反应促进液、浓缩洗液以及增强液；6)分装AMH和INHB的混合校准品、Eu³⁺-INHαMcab、Sm³⁺-AMH Mcab、免疫反应促进液、浓缩洗液以及增强液；7)贴标签；8)组装为成品。

其中，步骤1)中制备包被有AMH Pcab和INHBβMcab的固相载体采用以下步骤：

将AMH Pcab和INHBβMcab用包被缓冲液(可以使用50mmol/L、pH 9.6的碳酸缓冲液，20mmol/L、pH 4.5的磷酸盐缓冲液，50mmol/L、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液或50mmol/L、pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液等)稀释至最适浓度，在固相载体上进行包被，将固相载体洗涤1次，然后再用含有10g/L的牛血清白蛋白(BSA)的10mmol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液进行封闭，将固相甩干，晾干，真空包装，2～8℃保存备用。

其中，步骤2)所述制备AMH和INHB的混合校准品采用以下步骤：

将纯化的AMH标准品原料和INHB标准品原料用含有10g/L BSA的50mmol/L、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液稀释成A～F 6个混合校准品，A～F 6个混合校准品中和的浓度分别为0，1，5，20，40，100ng/mL的AMH和0，1，10，50，250，1000pg/mL的INHB。

其中，步骤3)所述制备镧系元素标记物采用以下步骤：

(1)Eu³⁺-INHαMcab的制备将1.0mg的INHαMcab加入Millipore公司的截留分子量为50000的超滤离心管中，8000r/min离心5～6min，再用标记缓冲液(50mmol/L，pH 9.6的碳酸缓冲液)重复洗涤6次，将处理得到的200μL INHαMcab加入到1.0mg的预先用标记缓冲液溶解的Eu³标记试剂充分混匀，2～8℃振荡孵育(24±2)h。反应液经分别用50mmol/L pH 7.80Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)层析，分别A₂₈₀监测收集第一洗脱峰即为Eu³⁺-INHαMcab母液。

(2)Sm³⁺-AMH Mcab的制备将1.0mg的AMH Mcab加入Millipore公司的截留分子量为50000的超滤离心管中，8000r/min离心5～6min，再用标记缓冲液重复洗涤6次，将处理得到的200μl AMH Mcab加入到1.0mg的预先用标记缓冲液溶解的Sm³⁺标记试剂充分混匀，2～8℃振荡孵育(72±2)h。反应液经分别用50mmol/L pH 7.80Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)层析，分别A₂₈₀监测收集第一洗脱峰即为Sm³⁺-AMH Mcab母液。

以上改进方案中的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)试剂准备

抗原和抗体固相载体：将试剂及所需数量的固相载体平衡至室温(20～25℃)，余下的固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存；

洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml纯化水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用。纯化水敬请用户自备；

标记物工作液：使用前30min内配制，将Eu³⁺-INHαMcab和Sm³⁺-AMHMcab分别与免疫反应促进液按体积比1:1:20加进洁净的同一个一次性容器中并混匀；当次实验用完；

2)试验操作

(1)双抗体夹心一步法：

①吸取25μl的AMH和INHB混合校准品、待测样本依次加入固相载体中，同时加入75μl标记物工作液；

②固相载体在室温下，振荡孵育15min；

③孵育结束后，用洗涤工作液洗涤6次；

④向每个反应位中加入增强液100μl；

⑤固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析；铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。

(2)双抗体夹心二步法：

①吸取25μl的AMH和INHB混合校准品、待测样本依次加入固相载体中，同时加入75μl免疫反应促进液；

②固相载体在室温下，用振荡孵育15min；

③第一步孵育结束后，洗涤4次；

④向每个反应位中加入100μl已配好的标记物工作液；

⑤在室温下，振荡孵育15min；

⑥第二步孵育结束后，洗涤6次；

⑦向每个反应位中加入增强液100μl；

⑧固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析；铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。

根据本发明提供的试剂盒，其使用原理是：采用了双抗体夹心双标记时间分辨荧光免疫法，具体详述如下：

1、双抗体夹心一步法：以AMH多克隆抗体(AMH Pcab)和INHBβ亚单位单克隆抗体(INHBβMcab)包被固相载体，Eu³⁺标记INHα亚单位单克隆抗体(Eu³⁺-INHαMcab)和Sm³⁺标记AMH单克隆抗体(Sm³⁺-AMH Mcab)作为示踪物。在固相相应位置中加入AMH和INHB的混合校准品或待测样本，同时加入适量的已用免疫反应促进液稀释好的Eu³⁺-INHαMcab和Sm³⁺-AMH Mcab，孵育，混合校准品或待测样本中的AMH或INHB分别与固相上的AMH Pcab和INHBβMcab以及示踪物结合，形成固相AMH Pcab-AMH-Sm³⁺-AMH Mcab和固相INHBβMcab-INHBβ-Eu³⁺-INHαMcab复合物，洗涤去除未结合物质。加入增强液，振荡，利用时间分辨荧光免疫法的原理检测荧光值，铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序，荧光值强度与校准品或样本中的AMH或INHB的含量成正比。

2、双抗体夹心二步法：以AMH多克隆抗体(AMH Pcab)和INHBβ亚单位单克隆抗体(INHBβMcab)包被固相，Eu³⁺标记INHα亚单位单克隆抗体(Eu³⁺-INHαMcab)和Sm³⁺标记AMH单克隆抗体(Sm³⁺-AMH Mcab)作为示踪物。在固相相应位置中加入校准品或样本，同时加入适量的免疫反应促进液，孵育，校准品或样本中的AMH或INHB分别与固相上的AMH Pcab和INHBβMcab结合，形成固相AMH Pcab-AMH和固相INHBβMcab-INHBβ，洗涤去除未结合的物质。加入适量的已用免疫反应促进液稀释好的Eu³⁺-INHαMcab和Sm³⁺-AMH Mcab，孵育，AMH Pcab-AMH和固相INHBβMcab-INHBβ复合物分别与示踪物结合，形成固相AMH Pcab-AMH-Sm³⁺-AMH Mcab和固相INHBβMcab-INHBβ-Eu³⁺-INHαMcab复合物，洗涤去除未结合的物质。加入增强液，振荡，利用时间分辨荧光免疫法的原理检测荧光值，铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序，荧光值强度与校准品或样本中的AMH或INHB的含量成正比。

下面通过具体实施例方式结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例中的AMH Pcab和AMH Mcab购于上海武昊经贸有限公司，INHBβMcab和INHαMcab购于上海浩宏生物科技有限公司；AMH抗原购于上海瑞齐生物科技有限公司，INHB抗原购于美国Sigma公司。固相为96孔微孔空白板(8×12孔)购于深圳市金灿华实业有限公司；铕(Eu³⁺)与钐(Sm³⁺)标记试剂盒购于芬兰Wallac公司；琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B购于瑞典Pharmacia公司；增强液、浓缩洗液、FWZ-Ⅰ型微量振荡仪、DEM-Ⅲ型全自动酶标洗板均由广州市丰华生物工程有限公司提供。Victor_TM ²D1420型TRFIA仪购于美国Perkin Elmer公司。其他试剂为国产分析纯。

实施例1

适于利用双标记快速时间分辨荧光免疫法检测AMH和INHB的试剂盒及其制备 方法和使用方法

一种适于利用双标记快速时间分辨荧光免疫法检测AMH和INHB的试剂盒，包括：

1)抗体固相载体：包被有AMH Pcab和INHBβMcab的固相载体；

2)AMH和INHB混合校准品：校准品B、C、D、E、F含有AMH标准品原料和INHB标准品原料；

3)镧系元素标记物：标记物1含有Eu³⁺-INHαMcab、标记物2含有Sm³⁺-AMH Mcab；

4)免疫反应促进液：含有100ml/L BSA、0.05g/L曙红、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30mg/L Procline300以及含4％PEG 6000的pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液。

5)浓缩洗液：含有Tween20及亮蓝、Procline300、Tris-HCl缓冲液；

6)增强液：含曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水。

本发明的适于利用双标记快速时间分辨荧光免疫法检测AMH和INHB的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备抗体固相载体：将AMH Pcab和INHBβMcab均用同一包被缓冲液(可以使用50mmol/L，pH 9.6的碳酸缓冲液、20mmol/L，pH 4.5的磷酸盐缓冲液、50mmol/L，pH 7.8的Tris-HCl缓冲液或50mmol/L，pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液等)稀释至0.1μg/mL～10μg/mL，在固相上进行包被，将固相洗涤1次，然后再用含有10g/L的牛血清白蛋白(BSA)的10mmol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液进行封闭，将固相甩干，晾干，真空包装，2～8℃保存备用。

2)制备AMH和INHB混合校准品：将纯化的AMH标准品原料和INHB标准品原料用含有10g/L BSA的50mmol/L，pH 7.8的Tris-HCl缓冲液稀释成A-F 6个混合校准品，A-F 6个混合校准品中和的浓度分别为0，1，5，20，40，100ng/mL的AMH和0，1，10，50，250，1000pg/mL的INHB。分装成0.5ml/瓶。

3)制备镧系元素标记物：将Eu³⁺-INHαMcab母液、Sm³⁺-AMH Mcab母液分别用含有2g/L BSA的50mmol/L，pH7.8的Tris-HCl缓冲液稀释成最适工作浓度的1/20倍，分别分装成0.5ml/瓶；

4)制备免疫反应促进液：为含100ml/L BSA、0.05g/L曙红、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30mg/L Procline300以及含4％PEG 6000的pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液；分装成40ml/瓶。

5)制备浓缩洗液：为含有4ml/L Tween20、30mg/L亮蓝、30mg/L Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，分装成40ml/瓶；

6)制备增强液：含0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。分装成40ml/瓶。

7)贴标签。

8)成品组装。

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出3份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成AMH和INHB双标记快速时间分辨荧光免疫法试剂盒。组装完成后还需抽检合格后才能出厂。

适于利用双标记快速时间分辨荧光免疫法检测AMH和INHB的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)试剂准备

①抗原和抗体固相载体：将试剂及所需数量的固相载体平衡至室温(20～25℃)。余下的固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。

②洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml纯化水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用。纯化水敬请用户自备。

③标记物工作液：使用前30min内配制，将Eu³⁺-INHαMcab和Sm³⁺-AMHMcab分别与免疫反应促进液按体积比1:1:20加进洁净的同一个一次性容器中并混匀；当次实验用完。

2)试验操作

(1)双抗体夹心一步法：

①吸取25μl的AMH和INHB混合校准品、待测样本依次加入固相载体中。同时加入75μl标记物工作液。

②固相载体在室温下，振荡孵育15min。

③孵育结束后，用洗涤工作液洗涤6次。

④向每个反应位中加入增强液100μl。

⑤固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析。铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。具体检测步骤如下：

将AMH和INHB混合校准品的6个不同浓度的校准位点的最终反应物分别放入TRFIA仪的铕标记窗口中，检测各个校准位点的最终反应物在波长为340nm的激发光的作用下，发射出的波长为615nm的荧光的荧光强度，并根据已知的校准品各个位点的AMH的浓度，绘制标准曲线(如图1所示)；

然后，将AMH和INHB混合校准品的6个不同浓度的校准位点的最终反应物分别放入TRFIA仪的钐标记窗口中，检测各个校准位点的最终反应物在波长为340nm的激发光的作用下，发射出的波长为643nm的荧光的荧光强度，并根据已知的校准品各个位点的INHB的浓度，绘制标准曲线(如图2所示)；

将待测样本的最终反应物分别在TRFIA仪的铕标记窗口和钐标记窗口检测荧光强度，并根据标准曲线，得出待测样本的AMH浓度和INHB浓度。

(2)双抗体夹心二步法：

①吸取25μl的AMH和INHB混合校准品、待测样本依次加入固相载体中。同时加入75μl免疫反应促进液。

②固相载体在室温下，用振荡孵育15min。

③第一步孵育结束后，洗涤4次。

④向每个反应位中加入100μl已配好的标记物工作液。

⑤在室温下，振荡孵育15min。

⑥第二步孵育结束后，洗涤6次。

⑦向每个反应位中加入增强液100μl。

⑧固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析。铕标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。

实施例2

本发明的双标记快速时间分辨荧光免疫法与传统时间分辨荧光免疫法检测时间 比较

本发明的双标记快速时间分辨荧光免疫法与传统时间分辨荧光免疫法检测时间比较如下表所示。

从上表可知，双标记快速时间分辨荧光免疫法在同一固相载体反应位内可以同时检测出AMH和INHB，双标记快速时间分辨荧光免疫法只需传统时间分辨荧光免疫方法检测时间的1/4以内，比单标记快速方法也省近1半的时间，比现有的酶联免疫方法所需时间(1～2h)还短。

实施例3

本发明的试剂盒的分析性能评价指标

以上实施例1制备的AMH和INHB双标记快速时间分辨荧光免疫法试剂盒的性能评价指标如下：

①最低检出量：AMH的最低检出量不高于0.1ng/mL，功能灵敏度为1ng/mL；INHB的最低检出量不高于0.5pg/mL，功能灵敏度为1pg/mL。

②线性：AMH在1～100ng/mL间；INHB在1～1000pg/mL间，实测值与理论值的线性相关系数r大于0.98。

③准确度：AMH在1～100ng/mL间；INHB在1～1000pg/mL间，检测企业参考品，实测值与理论值相对偏倚均在±20.0％内。

④HOOK效应：一步法检测AMH在200ng/mL内，INHB在2000pg/mL内未见明显HOOK效应；二步法检测高达1000ng/mL的AMH，10000pg/mL的INHB的荧光值仍分别高于100ng/mL AMH，1000pg/mL INHB的荧光值。

⑤稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37℃放置6天(有效期为12个月)；成品剩余效期内，则按37℃放置6天有效期为12个月推算37℃放置的时间进行检测，结果符合各项目规定的要求。

实施例4

本发明的双标记快速时间分辨荧光免疫法与传统时间分辨荧光免疫法的HOOK 临界浓度比较

本发明的双标记快速时间分辨荧光免疫法与传统时间分辨荧光免疫法的

HOOK临界浓度比较如下表所示。

实施例5

本发明的试剂盒的干扰试验评价

以上实施例1制备的AMH和INHB双标记快速时间分辨荧光免疫法试剂盒的分析特异性评价如下：

一步法和二步法检测血样本中胆红素818μmol/L、血红蛋白180g/L、甘油三酯21.54mmol/L对本试剂盒的检测结果无干扰作用，检测LH、FSH、HCG均无明显交叉反应。二步法不受血样本中柠檬酸钠(1.088mol/L)、乙二胺四乙酸二钾(0.2744mol/L)、草酸钾(0.5428mol/L)、氟化钠(0.4878mol/L)、肝素钠(150U/L)等抗凝剂的干扰。一步法检测血样本中不能含有柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钾、草酸钾、氟化钠等抗凝剂。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为术语本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测血清AMH、INHB的试剂盒，其特征在于：包括：1)包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体；2)AMH和INHB的混合校准品；3)镧系元素1标记的AMH检测抗体；4)镧系元素2标记的INHB检测抗体；5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。

2.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述AMH包被抗体为AMH多克隆抗体，所述INHB包被抗体为INHBβ亚单位单克隆抗体，所述AMH检测抗体为AMH单克隆抗体，所述INHB检测抗体为INHα亚单位单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述镧系元素1为铕，所述镧系元素2为钐。

4.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体为包被有AMH多克隆抗体和INHBβ亚单位单克隆抗体的固相载体；所述镧系元素1标记的AMH检测抗体为Eu³⁺标记的AMH单克隆抗体，所述镧系元素2标记的INHB检测抗体为Sm³⁺标记的INHα亚单位单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体的制备方法为：将AMH包被抗体和INHB包被抗体用包被缓冲液稀释至0.1～10μg/mL，在固相载体上进行包被，洗涤固相载体，然后再用封闭缓冲液进行封闭，将固相载体干燥后，真空包装，2～8℃保存备用。

6.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗液为含有4mL/L Tween20、30mg/L亮蓝、30mg/L Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述增强液为含有0.5mL/L曲拉通-100、0.8mL/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。

8.如权利要求1所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：所述AMH和INHB的混合校准品的制备方法为：将纯化的AMH标准品原料和INHB标准品原料用含有10g/L BSA的50mmol/L、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液稀释成A～F 6个混合校准品，A～F 6个混合校准品中包含浓度分别为0、1、5、20、40、100ng/mL的AMH和0、1、10、50、250、1000pg/mL的INHB。

9.如权利要求1～8中任一所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将试剂及所需数量的固相载体从试剂盒中取出并平衡至室温；稀释浓缩洗液以配制工作洗涤液，并于使用前30min内，将镧系元素1标记的AMH检测抗体、镧系元素2标记的INHB检测抗体与免疫反应促进液按一定的体积比混匀，制得标记物工作液；

2)吸取AMH和INHB混合校准品以及待测样本依次加入包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体中，同时加入适量的标记物工作液，将固相载体在室温下，振荡孵育15min，孵育结束后，用工作洗涤液洗涤数次；然后向每个反应位中加入适量的增强液，将固相载体于室温下缓慢振荡5min；

3)分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测AMH和INHB混合校准品对应的最终反应物的荧光值，并根据检测的荧光值分别绘制AMH和INHB的标准曲线；

分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测待测样本对应的最终反应物的荧光值，并根据相应的标准曲线，计算待测样本中的AMH和INHB浓度。

10.如权利要求1～8中任一所述的适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，其特征在于：包括以下步骤：

1)将试剂及所需数量的固相载体从试剂盒中取出并平衡至室温；稀释浓缩洗液以配制工作洗涤液，并于使用前30min内，将镧系元素1标记的AMH检测抗体、镧系元素2标记的INHB检测抗体与免疫反应促进液按一定的体积比混匀，制得标记物工作液；

2)吸取AMH和INHB混合校准品以及待测样本依次加入固相载体中，同时加入适量的免疫反应促进液，将固相载体在室温下，振荡孵育15min，第一步孵育结束后，用工作洗涤液洗涤数次；

3)向每个反应位中加入适量的标记物工作液，在室温下，振荡孵育15min，第二步孵育结束后，洗涤数次，然后向每个反应位中加入适量的增强液，将固相载体于室温下缓慢振荡5min；

4)分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测AMH和INHB混合校准品对应的最终反应物的荧光值，并根据检测的荧光值分别绘制AMH和INHB的标准曲线；

分别利用镧系元素1和镧系元素2对应的荧光窗口检测程序检测待测样本对应的最终反应物的荧光值，并根据相应的标准曲线，计算待测样本中的AMH和INHB浓度。