CN111999510A

CN111999510A - 一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒及其制备和使用方法

Info

Publication number: CN111999510A
Application number: CN202010843215.5A
Authority: CN
Inventors: 谭海娟; 徐运; 朱雨; 胡苗苗; 吴泽东; 张金东
Original assignee: Anhui Iprocom Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Iprocom Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2020-11-27

Abstract

一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒，涉及医学及生物化学技术领域，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，试剂R1包括：Tris‑HCl缓冲液、TWEEN20、PEG‑8000、NaCl、二价金属盐、Proclin300，溶剂为纯化水；试剂R2包括：MES缓冲液、EDC、乳胶微球、AMH单克隆抗体1、AMH单克隆抗体2、BSA、Proclin300，溶剂为纯化水。本发明还公开了一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒的制备方法和使用方法。本发明相比现有技术的优点在于：本发明的试剂盒采用大粒径微球对两株不同位点的单抗分别偶联，提高了低值灵敏度，检测精密度好；本发明可检测血清和不同抗凝剂血浆，不同样本类型相关性好，检测准确度高。

Description

一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及医学及生物化学技术领域，尤其涉及一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术

抗缪勒氏管激素(Anti-Muellerian hormone，AMH)，又称缪勒氏管抑制物(Muellerian-inhibiting substance，MIS)、缪勒氏管抑制因子(Muellerian-inhibitingfactor，MIF)，是由两个72kDa的单体通过二硫键连接构成的二聚体糖蛋白。MIS/AMH属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，该家族包括TGF-β、抑制素和激活素糖蛋白等。

抗缪勒氏管激素(AMH)由睾丸支持细胞(男性)、卵泡颗粒细胞(女性)产生，其主要作用是抑制缪勒氏管的生长，使其退化。在男性中，AMH负责缪勒管的衰退和男性生殖道的正常发育，AMH在睾丸支持细胞中持续生成，并伴随终生，进入青春期后缓慢减少。血清AMH浓度可以反应男性性别分化异常、生殖器官分化异常，以及预测男性青春期。在女性中，它是早期卵泡的直接产物，最初表达于初级卵泡的颗粒细胞层，在直径约0.1～0.2mm的窦前卵泡及直径约2mm左右小窦状卵泡中表达最强，而在大于4mm窦状卵泡中表达逐渐减弱至完全消失，对于卵泡发育起重要作用，因此胎儿时期的女宝宝从9个月便开始制造AMH，卵巢内的窦卵泡及小窦卵泡数量越多，AMH的浓度便越高；反之，当卵泡随着年龄及各种因素逐渐消耗，AMH浓度也会随之降低，越接近更年期，AMH便渐趋于0。因为血清AMH水平不受垂体促性腺激素的影响，在整个月经周期中数值波动不大，相对于目前常用的预测卵巢储备及卵巢反应性(年龄及窦卵泡计数(AFC)，卵泡刺激素(FSH)和雌二醇(E2)等)传统方法而言，血清AMH可更早期、更准确地预测妇女卵巢储备的变化，在监测卵巢储备力、诊断卵巢相关疾病、评估癌症治疗对患者卵巢储备的影响、预测体外受精IVF成功率及预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)并发症等方面也具有十分明显的优势。AMH是目前预测卵巢反应、评估卵巢贮备功能的最理想生物标志物。

AMH临床意义

1.评估卵巢储备功能

卵巢的储备功能取决于卵巢内库存卵泡的数量和质量，随着年龄增长，卵巢内存留的卵泡数目减少以及卵子质量下降可导致生育能力下降，即卵巢储备功能降低。女性的抗缪勒氏管激素(AMH)由卵泡发育早期阶段的卵泡颗粒细胞产生。AMH浓度在成年初期达峰值水平，之后随着年龄的增加逐渐降低，至原始卵泡耗竭时即绝经前5年内降至无法检测的低水平。从而可以通过AMH来预测女性生殖寿命的剩余长度。

2.预测卵巢反应性

卵巢超刺激是体外受精IVF的一个组成部分，而且不考虑患者的个体特征，均采用统一的标准化方式。大多数应用的超刺激方案非常复杂，耗时且昂贵。研究发现卵巢对刺激的反应存在显着的个体差异，从一直反应低下或几乎没有任何反应(导致治疗取消或IVF结果不良)到过度的反应(与卵巢过度刺激综合征(OHSS)潜在危险相关)。在卵巢超刺激方案中(当大多数窦状卵泡发育为大优势卵泡)，血清AMH水平显著下降。因此AMH是卵巢超刺激过程中预测卵巢反应的指标。

3.辅助诊断多囊卵巢综合征(PCOS)

PCOS是育龄妇女常见的内分泌紊乱，其发病机制还不明确，通常表现为月经稀发或闭经、稀发排卵或无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗和高胰岛素血症等，B超下可见卵巢体积增大、卵巢的多囊性改变，每个卵巢的一个切面可见十几个甚至几十个小卵泡。PCOS患者卵巢中有大量生长期卵泡，血清AMH显著增高。临床研究发现，PCOS患者血清AMH水平高于正常水平2-3倍，因此血清AMH可以用来诊断PCOS并评估其疗效。

4.鉴别男性性别分化异常

在男性中，抗缪勒氏管激素负责缪勒管的衰退和男性生殖道的正常发育，AMH在睾丸支持细胞中持续生成，并伴随终生，进入青春期后缓慢减少。血清AMH浓度可以反应男性性别分化异常、生殖器官分化异常。血清AMH水平可协助诊断患儿是否存在性腺发育异常、性早熟、隐睾等发育障碍疾病。如果血清AMH水平很低或检测不出，则高度提示无睾丸组织，可用于诊断真假两性畸形。

5.诊断卵巢颗粒细胞瘤(GCT)

AMH由颗粒细胞产生，其表达水平由卵巢初级卵泡和窦前卵泡的颗粒细胞决定，颗粒细胞瘤患者血清AMH水平升高，且在肿瘤切除后恢复正常，AMH的再次升高与肿瘤的复发存在相关性，因此血清AMH可作为卵巢颗粒细胞瘤的一个标志物，并且对卵巢颗粒细胞瘤的复发有一定的预测价值。

目前市面上在售的AMH检测试剂主要有酶联免疫法、化学发光法和免疫层析法等。其中酶联免疫法操作复杂，检测时间长，且极易受到其他因素影响；化学发光法则需要大型仪器的支持，且仪器昂贵成本要求过高；免疫层析法虽操作简便快速，但由于方法学缺陷，灵敏度不高且精密度较差。在检测样本类型方面，层析法可检测血清、血浆和全血，但存在不同抗凝剂与血清的检测结果偏差较大的问题；酶联免疫法和电化学发光法多数仅能检测血清和肝素抗凝血浆，不能检测EDTA抗凝血浆。专利CN109613276A公开了一种高灵敏度、宽检测范围的人抗缪勒管激素测定试剂盒。专利CN111273042A公开了一种一种抗缪勒氏管激素检测试剂盒。文献《荧光微球免疫层析技术定量检测抗缪勒氏管激素方法的确定》([J].生物化工,2019,5(01):15-19)，利用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式，依据双抗体夹心原理，制备抗缪勒氏管激素免疫层析试纸条；并从灵敏度，特异性，精密度，稳定性等方面进行全面的方法学评价。专利CN107340398A公开了一种基于稀土纳米上转发光法的抗缪勒氏管激素(AMH)的定量检测试剂及其方法，采用上转发光法的UCP颗粒作为生物标记物，特异性的标记有抗AMH抗体。专利CN109975536A公开了一种抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，首次利用胶乳增强免疫透射比浊法来测定抗缪勒激素，可在全自动生化分析仪上使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种精密度好、灵敏度高、检测样本类型多样且准确度高，且适用于全自动生化分析仪的测定抗缪勒氏管激素的试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的，一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：

试剂R1：

试剂R2：

优选地，所述二价金属盐包括CaCl₂、MgCl₂、FeCl₂、XnCl₂或CuCl₂。

优选地，所述二价金属盐优选为MgCl₂。

优选地，所述乳胶微球为羧基化乳胶微球。

优选地，所述乳胶微球的粒径为180-400nm。

一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)配制试剂R1

a.按照试剂R1的组分含量，将Tris-HCl溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成缓冲液；

b.按照试剂R1的组分含量，将Tween20溶于制得的缓冲液中，搅拌均匀后，再将PEG8000、NaCl、二价金属离子和Proclin300溶于其中，即制得试剂R1液；

(2)配制试剂R2

a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成缓冲液；

b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于步骤a制得的缓冲液中，搅拌均匀；

c.再将乳胶微球溶于步骤b制得的缓冲液中，搅拌均匀后，室温混匀20min；

d.按照试剂R2的组分含量，分别将AMH单克隆抗体1和AMH单克隆抗体2溶于步骤c制得的溶液中，搅拌均匀后，37℃混匀1-3h。

e.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于步骤d制得的溶液中，搅拌均匀后，室温混匀1-2h，即制得试剂R2液。

一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；

(2)加入试剂R2，混合均匀；

(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；

(4)300s后，采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2；

(5)根据吸光度变化值计算出样本中的AMH的浓度。

进一步地，所述步骤(1)和步骤(2)中，试剂R1和试剂R2按照体积比3:1混合。

进一步地，所述步骤(3)和步骤(4)中，在主波长600nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。

进一步地，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即ΔA＝A2-A1。

反应原理：在缓冲体系中，抗人AMH抗体与乳胶微球以共价结合的方式存在，当样本中含有AMH时，就会被抗人AMH抗体快速的结合，此时乳胶微球因为结合变会聚集形成浊度，在特定的波长下样本中AMH的含量与其形成的浊度成正比，由此计算出样本中AMH的含量：

式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；

ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；

CS：校准液中HA的浓度。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)本发明的试剂盒采用大粒径微球对两株不同位点的单抗分别偶联，提高了低值灵敏度，检测精密度好；

(2)本发明大大的压缩了反应时间，原有的技术反应时间为最快为30min，现在缩短为10min，原有技术无法用在全自动生化分析仪上，现有技术可应用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，大批量开展；

(3)本发明在试剂R1中添加的高浓度氯化钠，可明显降低样本中存在一些非特异性吸附干扰，明显改善临床相关性。

(4)本发明可检测血清和不同抗凝剂血浆，如：肝素钠，EDTA和枸橼酸钠，不同样本类型相关性好，检测准确度高；在试剂R1中添加的二价金属离子，可与EDTA抗凝血浆中的EDTA反应，螯合掉EDTA，从而降低其对试剂的干扰，提高EDTA抗凝血浆与血清检测值的相关性，且不影响其他抗凝剂血浆的检测结果。

附图说明

图1是本发明实施例的本试剂盒检测的校准曲线图；

图2是本发明实施例的不同粒径微球的偶联的灵敏度对比图；

图3是本发明实施例的试剂R1中不添加氯化钠的临床相关性结果图；

图4是本发明实施例的试剂R1中添加0.5％氯化钠的临床相关性结果图；

图5是本发明实施例的试剂R1中添加0.9％氯化钠的临床相关性结果图；

图6是本发明实施例的试剂R1中添加1.8％氯化钠的临床相关性结果图；

图7是本发明实施例的试剂R1中添加2.9％氯化钠的临床相关性结果图；

图8是本发明实施例的试剂R1中添加5.0％氯化钠的临床相关性结果图；

图9是本发明实施例的线性范围结果图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种测定抗缪勒氏管激素的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：

试剂R1：

试剂R2：

优选地，所述乳胶微球为羧基化乳胶微球。

优选地，所述乳胶微球的粒径为273nm。

实施例2

试剂R1：

试剂R2：

优选地，所述乳胶微球为羧基化乳胶微球。

优选地，所述乳胶微球的粒径为273nm。

实施例3

试剂R1：

试剂R2：

优选地，所述乳胶微球为羧基化乳胶微球。

优选地，所述乳胶微球的粒径为273nm。

实施例4

制备上述测定抗缪勒氏管激素的试剂盒的方法，包括以下步骤：

(1)配制试剂R1

(2)配制试剂R2

d.按照试剂R2的组分含量，分别将AMH单克隆抗体1和AMH单克隆抗体2溶于步骤c制得的溶液中，搅拌均匀后，37℃混匀3h。

e.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于步骤d制得的溶液中，搅拌均匀后，室温混匀2h，即制得试剂R2液。

实施例5

本实施例的一种使用上述实施例1-3中测定抗缪勒氏管激素的试剂盒的方法：

检测仪器：贝克曼AU680全自动生化分析仪。

待测样本：空腹采集，新鲜不溶血血清，无脂浊，2-8℃可稳定七天。

具体步骤：

(1)设置测定管组和空白管组，其中，测定管组：将25uL待测样品与180uL试剂R1混合，37℃孵育5min；空白管组：将25uL蒸馏水与180uL试剂R1混合，37℃孵育5min；校准曲线如图1所示；

(2)各组中分别加入60uL试剂R2，混合均匀；

(3)采用全自动生化分析仪在主波长600nm处测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；

(4)300s后，采用全自动生化分析仪在主波长600nm处再测定一次混合液的吸光度A2；

(5)根据吸光度变化值ΔA＝A2-A1，再结合计算公式计算出样本中的抗缪勒氏管激素的浓度。

计算结果：

按照如下计算公式计算：

式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；

ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；

CS：校准液中HA的浓度。

精密度：批内CV≤5％；批间相对极差≤10％。

准确度：相对偏差控制在±15％内。

线性范围：在0.10-16.00ng/mL

范围内，相关系数r≥0.990。

本实施例采用两点终点法，反应方向向上，从开始到结束仅需10min，操作方便、耗时短、精度高。

实施例6

本实施例用以评价上述实施例中抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒：

(1)灵敏度验证

利用实施例2配方配制试剂，并做一组与实施例2配方的区别为试剂R2中采用不同粒径微球的偶联的灵敏度的对照实验，实施例2中的乳胶微球的粒径为273nm，对比例的乳胶微球的粒径为123nm，检测乳胶微球偶联灵敏度，结果如图2所示，可以看出大粒径乳胶微球的偶联灵敏度更好。

(2)精密度和准确度验证

采用本试剂盒对同一样品中连续抽取10次进行测定，并对低值、中值和高值分别进行检测，计算测定值的均数

标准差SD和变异系数CV，其中，

结果分析：变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好；对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的；如表1所示，本发明试剂盒的低值检测标准差SD＝0.0171，中值检测标准差＝0.0750，高值检测标准差＝0.0640；低值检测CV＝3.33％，中值检测CV＝1.07％，高值检测CV＝0.53％，CV值均小于5％，表明本发明方法具有优良的精密度。

表1为本发明试剂盒精密度验证的结果。

(3)临床相关性验证

利用实施例2配方配制试剂，通过改变试剂R1中NaCl的浓度，检测氯化钠对临床相关性的影响，结果如下表2和图3-8所示，随着氯化钠浓度增加，相关性明显变好，添加至一定浓度后，改善程度不大；其中第⑤组(2.9％氯化钠)与Roche检测值的相关性最佳，R²＝0.9877。

表2为氯化钠浓度对临床相关性的影响结果。

组别

①

②

③

④

⑤

⑥

氯化钠浓度

0.0％

0.5％

0.9％

1.8％

2.9％

5.0％

(3)线性范围验证

收集接近线性范围上限和下限的样品(H和L)，按照L、4L+1H，3L+2H，2L+2H，1L+4H，H的方式配制不同浓度水平的样品，测定后计算实测值与理论值的线性回归方程，以及相关系数等参数。结果见图9，线性回归方程为y＝1.0089x+0.0403，R²＝0.9998，说明线性关系良好，线性范围可达0.1～16ng/mL。

表2为本发明试剂盒线性范围验证结果

(4)不同样本类型相关性

试剂R1中二价金属离子和二价金属离子浓度的筛选：以实施例2配方配制试剂，通过改变试剂R1中二价金属离子的类型，试剂R1中分别添加50mM的Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Xn²⁺、Cu²⁺，并分别检测血清和不同抗凝剂血浆如：肝素钠，EDTA和枸橼酸钠的相关性，结果如表3、4所示。

表3为本发明不同样本类型的相关性验证结果

结果表明，在试剂R1中添加的二价金属离子，可与EDTA抗凝血浆中的EDTA反应，螯合掉EDTA，从而降低其对试剂的干扰，提高EDTA抗凝血浆与血清检测值的相关性，且不影响其他抗凝剂血浆的检测结果。

表4为不添加二价金属盐的试剂盒的相关性验证结果

从上述试验的二价金属离子Ca²⁺,Mg²⁺，Fe²⁺,Xn²⁺,Cu²⁺等中筛选出MgCl₂能改善对EDTA抗凝血浆检测值的偏差，进一步对MgCl₂添加浓度进行筛选，数据如表5所示。

表5为不同MgCl₂浓度的试剂盒的检测准确度验证结果

由上述实验数据可知，随着MgCl₂添加浓度增加，EDTA抗凝血浆的偏倚由负偏移变为正偏移，添加浓度为40mM时，偏移可控制在±10％以内，并且对血清和其他抗凝血浆的检测结果无明显影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。