CN111007265A - 一种先兆子痫风险预测标志物PIGF的Simoa试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫检测技术、先兆子痫风险预测领域，特别是指一种标志物PIGF的Simoa试剂盒及其应用。所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、PIGF标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。本发明提供的基于Simoa平台和双抗夹心法检测人血液中PIGF蛋白含量的Simoa试剂盒，不仅可以定性还可以定量的检测人血液中PIGF含量；具有高灵敏度、高通量、较少样本量、自动化、花费时间短、操作简便、检测范围宽等特点。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术、先兆子痫前期风险预测领域，特别是指一种先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒及其应用。
背景技术
胎盘生长因子（PIGF）是VEGF（血管内皮生长因子）子家族的成员。PIGF是血管生成和胚胎发生过程中的关键分子。妊娠期间PIGF的主要来源是胎盘滋养细胞。子痫前期是一种妊娠疾病，其特征是高血压的发作和大量的尿蛋白。这种状况往往出现在怀孕20周后。在严重时，可能会出现红细胞破裂、血小板计数低、肝功能受损、肾功能不全、肿胀以及肺部积液引起的呼吸急促或视力障碍。子痫前期增加母亲和婴儿预后不良的风险。如果不及时治疗，可能会导致癫痫发作，这被称为子痫。
先兆子痫的危险因素包括肥胖、原发性高血压、年龄大和糖尿病。在妇女的第一次怀孕以及携带双胞胎的情况下，这种情况也更加频繁。潜在的机制涉及胎盘中血管的异常形成以及其他因素，大多数病例在分娩前被诊断出来。子痫很少在分娩后开始，既需要高血压又需要尿液中的蛋白质来进行诊断，但某些定义还包括患有高血压和任何相关器官功能障碍的定义。子痫前期通常在产前检查中进行筛查。
先兆子痫标志物的发现和定量检测对先兆子痫风险预测的早期干预和预后评估起到了越来越重要的作用。血液PIGF（亚皮克级）已经被广泛用于先兆子痫的诊断和预后评估。研究表明，带有先兆子痫病人的血液PIGF浓度明显高于健康人。病人接受治疗后，随着病情好转，PIGF浓度会不同程度的降低。基于此，PIGF在血清中的浓度可以作为临床医生在先兆子痫中的诊断指标。
目前临床上使用的PIGF检测方法主要是比色免疫分析法、化学发光免疫分析法、放射免疫分析法和电化学发光免疫分析法。其中，比色免疫分析法是最常见的一种方法。但是该方法灵敏度较低，耗时长，样本量需求大，不利于对病情的持续观察。其它三种方法可以快速、灵敏地检测出结果，但是这些方法重复性差，变异系数大。放射免疫分析法对操作人员还可能存在潜在的健康风险。Simoa是基于泊松分布原理和单分子技术发展起来的数字化超灵敏检测蛋白标志物的技术平台。该平台采用经典ELISA双抗夹心的方法，可以将带有单个待测蛋白的免疫磁珠载入到约46飞升的微孔中进行荧光成像。通过对发光的微孔进行计数，该平台可以对蛋白进行定性定量检测。
Simoa是基于泊松分布原理和单分子技术发展起来的数字化超灵敏检测蛋白标志物的技术平台。该平台采用经典ELISA双抗夹心的方法，可以将带有单个待测蛋白的免疫磁珠载入到约46飞升的微孔中进行荧光成像。通过对发光的微孔进行计数，该平台可以对蛋白进行超灵敏定量检测。
因此，基于Simoa技术开发一种高灵敏度、自动化程度高、快速、准确性好且适合推广的PIGF检测方法，对快速检测先兆子痫标志物PIGF具有重大的意义。
发明内容
本发明提出一种先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒及其应用，以便解决现有技术中操作复杂、样本量需求大及灵敏度不足等技术问题。本专利的操作简单便捷、高通量、灵敏度高、样本量少适合用于大规模的筛查。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、PIGF标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。
所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：
（1）将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；
（2）将2.7μm磁珠用EDC进行活化；
（3）于4℃条件下，将步骤（1）处理的捕获抗体与步骤（2）活化的磁珠混合孵育2-3h；
（4）经步骤（3）孵育的产物用PBST溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。
所述步骤（1）中捕获抗体为鼠抗人PIGF单克隆抗体；超滤管使用的缓冲液是为50mmol/L吗啉乙磺酸缓冲液，pH=6.2。
所述步骤（3）中捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL；活化的磁珠的反应浓度为1.2×109/mL。
所述步骤（4）中PBST溶液为10mmol/LPBS+1%Tween20，pH=7.4；封闭液为10mmol/LPBS+1%BSA、pH=7.4；磁珠稀释液为50mmol/LTris-HCl+10mmol/LEDTA+0.1%Tween20+1%BSA，pH=7.4。
所述生物素化的检测抗体的制备方法为：将检测抗体用PBS溶液通过超滤管进行换液处理，于室温下加入NHS-Biotin或其衍生物，反应30min，得生物素化后的检测抗体，用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体，其中检测抗体为兔抗人PIGF多克隆抗体。
所述检测抗体与NHS-Biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40；PBS溶液为10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4。
所述SBG溶液从原始浓度通过酶稀释液稀释到浓度为150pmol/L，其中酶稀释液为10mmol/LPBS+0.5%胎牛血清+1mmol/LMgCl2，pH=7.4；所述PIGF标准品通过样本稀释液被配制成1mL，其余标准品可以根据需要自行稀释配制；其中样本稀释液为10mmol/LPBS+5mmol/LEDTA+0.1%Tween20+2%BSA；荧光底物为试卤灵-β-半乳糖苷，荧光底物溶液的浓度为100μmol/L；
所述先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒在制备先兆子痫风险预测诊断试剂中的应用。
所述先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒在检测人血液中PIGF含量中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的基于Simoa平台和双抗夹心法检测人血液中PIGF蛋白含量的Simoa试剂盒，为以一种单克隆抗体为捕获抗体，以多克隆抗体为检测抗体的一种人PIGF双抗体夹心数字化ELISA检测试剂盒，不仅可以定性还可以定量的检测人血液中PIGF含量；具有高灵敏度、高通量、较低样本量可为2μL、自动化、花费时间短、操作简便、检测范围宽等特点，由附图1可知本申请的最低检测限可达0.7pg/mL。本发明可以作为无创伤性的诊断和监测先兆子痫风险预测（尤其是肺癌和胰腺癌）病程发展的试剂盒的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试剂盒的反应机理。
图2为本发明PIGFSimoa试剂盒标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明提供的用于检测人血液中PIGF含量的Simoa试剂盒，包含捕获抗体包被的2.7μm磁珠、PIGF标准品、生物素化的检测抗体、链霉亲合素-β-半乳糖苷酶（SBG）溶液、荧光底物溶液和样本稀释液，以及试验方法电子文件。
在本发明中，磁珠、捕获抗体、标准品、检测抗体、生物素化试剂、SBG和荧光底物的原始材料通过购买获得；其中捕获抗体为单克隆抗体，具体为，鼠抗人PIGF单克隆抗体；检测抗体为多克隆抗体，具体为兔抗人PIGF多克隆抗体。
在本发明的捕获抗体包被磁珠方案中，制备过程为：首先，储存的抗体通过超滤管进行换液处理，所使用的缓冲液是MES，所述MES为50mmol/L吗啉乙磺酸缓冲液，pH=6.2。
然后，磁珠用EDC进行活化，4°C环境下，捕获抗体和活化的磁珠孵育2h。接着，用PBST洗两次，再用封闭液37°C封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，储存在磁珠稀释液中，即获得捕获抗体包被的磁珠。其中捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL；活化的磁珠的反应浓度为1.2×109/mL。
所述PBST配方：10mmol/LPBS+1%Tween20，pH=7.4；封闭液配方：10mmol/LPBS+1%BSA，pH=7.4。磁珠稀释液配方：50mmol/LTris-HCl+10mmol/LEDTA+0.1%Tween20+1%BSA，pH=7.4。
在本发明的生物素化检测抗体方案中，制备过程为：首先，原始储存的检测抗体用PBS通过超滤管进行换液处理。然后，室温下加入NHS-Biotin或其衍生物，反应30min。最后，生物素化后的检测抗体用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体。PBS配方：10mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS），pH=7.4。其中检测抗体与NHS-Biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40。
酶和底物溶液的配制：SBG从原始浓度通过酶稀释液稀释到150pmol/L，底物用上述PBS稀释到100μmol/L；其中酶稀释液为：10mmol/LPBS+0.5%胎牛血清+1mmol/LMgCl2，pH=7.4。
上述最终浓度均是工作浓度，用于最终的成像。
所述底物为：试卤灵-β-半乳糖苷(RGP)
标准品溶液的配制：100ng/mLPIGF标准品通过样本稀释液被配制成1mL。其余标准品可以根据需要自行配制，其中样本稀释液为：10mmol/LPBS+5mmol/LEDTA+0.1%Tween20+2%BSA。
PIGFSimoa试剂盒的使用方法：
首先，将试验方法电子文档导入Quanterix生产的HD-1/HD-XSimoa分析仪上，该试验方法电子文档包含了试验运行的方式。该试验方法电子文档上的方法，可以根据需求进行更改，以适合试剂盒的试剂用途。
此试验方法电子文档包括：磁珠、样本及检测抗体的反应时间（35min），磁珠用量（25μL），检测抗体的用量（20μL），标准品和样品的用量（100μL），SBG的用量（100μL）及反应时间（5min）。本发明默认反应时间设置为（35min-5min），默认方法是Simoa2.0两步法。标准品浓度可以被自定义设置，默认设置为（1000，333，111，37.0，12.3，4.12，1.37，0pg/mL）。
然后，浓度为2×107/mL的磁珠，浓度为1μg/mL的检测抗体，浓度为150pmol/L的SBG，浓度为100μmol/L的荧光底物RGP和加有标准品和样本的96孔板装载到分析仪指定位置，同时扫描标签和设置位置参数。
最后，运行试验。待试验结束，导出试验结果，仪器自动拟合曲线和计算样本结果，见图1。
拟合方程为：四参数Logistic曲线拟合方程：
。
其中A=0.01254、B=0.9863、C=1.115×107、D=48959.6。当本试剂盒的空白背景和2.5倍标准偏差（Blank+2.5SD）等于Y（x）时，可计算出x即本试剂盒检测PIGF的灵敏度（LOD）可达到0.7pg/mL，远远满足临床检测需求。
本申请的Simoa试剂盒在检测人血液中PIGF含量中的应用也属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、PIGF标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。
2.根据权利要求1所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：
（1）将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；
（2）将2.7μm磁珠用EDC进行活化；
（3）于4℃条件下，将步骤（1）处理的捕获抗体与步骤（2）活化的磁珠混合孵育2-3h；
（4）经步骤（3）孵育的产物用PBST溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。
3.根据权利要求2所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（1）中捕获抗体为鼠抗人PIGF单克隆抗体；超滤管使用的缓冲液是为50mmol/L吗啉乙磺酸缓冲液，pH=6.2。
4.根据权利要求2所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（3）中捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL；活化的磁珠的反应浓度为1.2×109/mL。
5.根据权利要求2所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（4）中PBST溶液为10mmol/LPBS+1%Tween20，pH=7.4；封闭液为10mmol/LPBS+1%BSA，pH=7.4；磁珠稀释液为50mmol/LTris-HCl+10mmol/LEDTA+0.1%Tween20+1%BSA，pH=7.4。
6.根据权利要求1所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于，所述生物素化的检测抗体的制备方法为：将检测抗体用PBS溶液通过超滤管进行换液处理，于室温下加入NHS-Biotin或其衍生物，反应30min，得生物素化后的检测抗体，用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体，其中检测抗体为兔抗人PIGF多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述检测抗体与NHS-Biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40；PBS溶液为10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4。
8.根据权利要求1所述的先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒，其特征在于：所述SBG溶液从原始浓度通过酶稀释液稀释到浓度为150pmol/L，其中酶稀释液为10mmol/LPBS+0.5%胎牛血清+1mmol/LMgCl2，pH=7.4；所述PIGF标准品通过样本稀释液被配制成1mL，其余标准品可以根据需要自行稀释配制；其中样本稀释液为10mmol/LPBS+5mmol/LEDTA+0.1%Tween20+2%BSA；荧光底物为试卤灵-β-半乳糖苷，荧光底物溶液的浓度为100μmol/L。
9.权利要求1-8任一项所述先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒在制备先兆子痫风险预测诊断试剂中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述先兆子痫标志物PIGF的Simoa试剂盒在检测人血液中PIGF含量中的应用。
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| CN202010047705.4A CN111007265A (zh) | 2020-01-16 | 2020-01-16 | 一种先兆子痫风险预测标志物PIGF的Simoa试剂盒及其应用 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111579788A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 郑州大学 | 一种高灵敏肿瘤标志物EPHA2的Simoa试剂盒及其应用 |
| CN111812329A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-23 | 山东圣剑医学研究有限公司 | 一种定量检测多种肿瘤标志物的抗体芯片试剂盒 |
| WO2021233186A1 (zh) * | 2020-05-17 | 2021-11-25 | 格物致和生物科技(北京)有限公司 | 基于虚拟分割技术的生物靶标数字化定量检测方法和系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN206540921U (zh) * | 2017-01-22 | 2017-10-03 | 广州福慧医学科技有限公司 | 一种具有磁力搅拌的先兆子痫检测试剂盒 |
| CN107884570A (zh) * | 2016-09-29 | 2018-04-06 | 韦彦余 | 一种孕妇先兆子痫检测试剂盒 |
| US20190346452A1 (en) * | 2016-05-17 | 2019-11-14 | Ldx Prognostics Limited Co. | Methods and compositions for providing preeclampsia assessment |
-
2020
- 2020-01-16 CN CN202010047705.4A patent/CN111007265A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190346452A1 (en) * | 2016-05-17 | 2019-11-14 | Ldx Prognostics Limited Co. | Methods and compositions for providing preeclampsia assessment |
| CN107884570A (zh) * | 2016-09-29 | 2018-04-06 | 韦彦余 | 一种孕妇先兆子痫检测试剂盒 |
| CN206540921U (zh) * | 2017-01-22 | 2017-10-03 | 广州福慧医学科技有限公司 | 一种具有磁力搅拌的先兆子痫检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SANJIB KUMAR GHOSH等: "Serum PLGF as a potential biomarker for predicting the onset of preeclampsia", 《ARCH GYNECOL OBSTET》 * |
| 乔准: "单分子阵列技术在肺癌标志物HOXC10和CPS1超灵敏检测中的应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021233186A1 (zh) * | 2020-05-17 | 2021-11-25 | 格物致和生物科技(北京)有限公司 | 基于虚拟分割技术的生物靶标数字化定量检测方法和系统 |
| CN111579788A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 郑州大学 | 一种高灵敏肿瘤标志物EPHA2的Simoa试剂盒及其应用 |
| CN111812329A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-23 | 山东圣剑医学研究有限公司 | 一种定量检测多种肿瘤标志物的抗体芯片试剂盒 |
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