CN116298246A - 定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括M试剂、R1试剂和R2试剂；其中，M试剂包含包被有羊抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的磁颗粒；R1试剂包含FITC标记的两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗；R2试剂包含生物素标记的抗神经丝轻链蛋白羊多抗；R1试剂中，所述两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗靶向神经丝轻链蛋白不同位点。本发明还公开了一种定量检测神经丝轻链蛋白的方法。使用本发明所述的试剂盒及方法检测神经丝轻链蛋白的含量操作简便、价格低廉、测试时间短、检测范围和灵敏度基本能满足临床需求。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒及其应用。
背景技术
神经丝轻链(Neurofilament light chain，NFL或NEFL)蛋白是神经元神经丝(NF)蛋白的重要组成。作为神经元轴突主要的细胞骨架蛋白，在神经元轴突部位高表达，发挥着维持轴突形态稳定、保证神经元信号传导的功能。正常生理条件下轴突释放少量的NFL，但在病理条件下NFL释放量显著增加。组织液中的NFL可以通过脑脊液扩散至血液，血液中的NFL浓度较脑脊液中的低。脑脊液和血液NFL浓度和神经病变程度密切相关，因此NFL在临床上被用作神经元损伤相关疾病的生物标志物。
NFL是轴突损伤的非特异性标志物。神经元损伤类疾病如阿兹海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓小脑共济失调(SCA)3型等情况下，血液中NFL水平都会上升。此外，NFL的水平也会随着年龄增长而上升。
目前，市面上的NFL检测技术主要有单分子免疫诊断法和酶联免疫法(Elisa)。单分子免疫诊断法操作繁琐，价格昂贵，测试时间较长。Elisa法也有操作繁琐，测试时间长的缺点，同时它的分析性能差，检测范围偏窄，灵敏度低，不能完全满足临床需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中检测NFL蛋白操作繁琐、灵敏度低的缺陷，提供一种定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒及其应用。本发明的目的在于提供一种采用化学发光方法制备的检测NFL蛋白的试剂盒，使用本发明所示的试剂盒，操作简便、价格低廉、测试时间短、检测范围和灵敏度基本能满足临床需求的定量检测血清、血浆中NFL蛋白的含量。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供一种定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括M试剂、R1试剂和R2试剂；
其中，M试剂包含包被有羊抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的磁颗粒；R1试剂包含FITC标记的两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗；R2试剂包含生物素标记的抗神经丝蛋白轻链羊多抗；
R1试剂中，所述两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗靶向神经丝轻链蛋白不同位点。
NFL蛋白共有544个位点，本发明中，两株抗NFL蛋白鼠单抗分别针对该蛋白的前端(20-40)和末端(420-440)两个位点，以提升捕获效果。
本发明一些具体实施方案中，所述羊抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体、FITC标记的两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗和抗神经丝轻链蛋白羊多抗均购于thermofisher，货号为MAB22164和MAB22161。
本发明一些实施方案中，所述M试剂中磁颗粒的工作浓度为0.5-0.9mg/mL。
本发明一些具体实施方案中，磁颗粒的工作浓度为0.5mg/mL。
本发明一些实施方案中，所述R1试剂中两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗的工作浓度为0.1～2mg/L。
本发明一些具体实施方案中，所述R1试剂中两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗的工作浓度为0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8或2mg/L。
本发明一些实施方案中，两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗与FITC的标记摩尔比例是1∶(10～20)。
本发明一些具体实施方案中，两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗与FITC的标记摩尔比例是1∶10、1∶12、1∶15、1∶18或1∶20。
本发明一些实施方案中，所述R2的试剂中抗神经丝轻链蛋白羊多抗的工作浓度为0.2～2mg/L。
本发明一些具体实施方案中，R2试剂中抗神经丝轻链蛋白羊多抗的工作浓度为1mg/L。
本发明一些实施方案中，抗神经丝轻链蛋白羊多抗与生物素标记摩尔比例是1∶(5～20)。
本发明一些具体实施方案中，抗神经丝轻链蛋白羊多抗与生物素标记摩尔比例是1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18或1∶20。
本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括R3试剂；所述R3试剂包含化学发光物标记的链霉亲和素。
本发明一些较佳实施方案中，R3试剂中，所述链霉亲和素与标记的化学发光标记物标记摩尔比例是1∶(5～20)。
本发明一些具体实施方案中，R3试剂中，所述链霉亲和素与标记的化学发光标记物标记摩尔比例是1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18或1∶20。
本发明一些实施方案中，所述R3试剂中化学发光物标记的链霉亲和素的工作浓度为0.2～2mg/L；较佳地为1mg/L。
本发明一些较佳实施方案中，所述R3试剂中化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌。
本发明一些具体实施方案中，所述发光标记物为碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(SA-ALP)。
本发明一些具体实施方案中，所述SA-ALP的工作浓度为1mg/L。
本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括样本稀释液。
本发明一些较佳实施方案中，所述样本稀释液为包含牛血清白蛋白、EDTA的缓冲液。
本发明一些更佳实施方案中，所述样品稀释液包含0.5M PBS缓冲液、1％的EDTA和1％～5％牛血清白蛋白。
本发明一些实施方案中，所述M试剂、R1试剂、R2试剂、R3试剂中均含有试剂缓冲液。
本发明中，所述试剂缓冲液为包含0.02-0.5M PBS，pH＝5.8～8.0、蛋白和防腐剂的混合溶液。
本发明中，所述蛋白优选地为牛血清白蛋白、牛血清、酪蛋白中的一种或两种的组合。
本发明中，所述防腐剂优选地为PC300、Bro、MIT、NaN3中的两种或两种以上的组合。
本发明一些具体实施方案中，所述蛋白为牛血清白蛋白。
本发明一些具体实施方案中，所述防腐剂为PC300。
本发明的第二方面提供了一种定量检测神经丝轻链蛋白的方法，所述方法包括使用如本发明第一方面所述的试剂盒对样本进行检测。
本发明一些实施方案中，所述样本为血清样本或血浆样本。
本发明一些实施方案中，所述方法包括在样本中添加M试剂与R1试剂混匀温育后加入R2和R3试剂。
本发明一些实施方案中，所述方法包括：将M试剂与R1试剂以3∶5的体积比加入样本混合后温育，包被板后加入体积比为1∶2的R2试剂和R3试剂，混合后温育；加入发光底物液后检测发光值。
本发明一些较佳实施方案中，所述温育的温度为35～37℃，所述温育的时间分别为：M试剂与R1试剂温育12～15min；加入R2试剂和R3试剂后温育15～17min。
本发明一些具体实施方案中，所述温育的温度为37℃，所述温育的时间分别为：M试剂与R1试剂温育15min；加入R2试剂和R3试剂后温育17min。
本发明一些实施方案中，所述温育后还包括清洗液洗涤的步骤，所述洗涤的次数为3～5次。
本发明的第三方面提供一种如本发明第一方面所述的试剂盒在定量检测NFL含量中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的试剂盒利用化学发光免疫平台检测NFL蛋白，操作简单方便，检测灵敏度高，特异性强，检测范围宽(例如0.5～10ng/mL)，免去了临床上超限稀释的麻烦；利用两种单克隆捕获抗体加多克隆检测抗体构成免疫配对，解决了NFL蛋白检测存在的灵敏度不足和特异性差的问题；同时本发明配制的特殊的样品稀释液，降低了假阳和漏检的概率，提高了NFL检测的准确性，基本可以满足临床检测需求。此外，本发明的试剂盒通过定量检测血清、血浆中NFL蛋白，可辅助用于阿兹海默症、肌萎缩侧索硬化、缺血性脑卒中的早期诊断、疗效评价及预后跟踪等，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明试剂盒和Quanterix公司Simoa试剂盒相关性分析示意图。
图2为本发明试剂盒的精密性评价结果示意图。
图3为本发明试剂盒线性范围结果示意图。
图4为本发明试剂盒空白限结果示意图。
图5为本发明试剂盒回收率结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本试剂盒所用的磁微粒、FITC、抗FITC抗体、重组的NFL校准原料，两种神经丝轻链蛋白鼠单抗(货号为MAB22164和MAB22161)，抗神经丝轻链蛋白羊多抗，SA-ALP均购于thermofisher。
实施例1：缓冲液配制
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4·12H2O，溶于1000mL水
0.2M NaH2PO4：称取31.202g NaH2PO4·2H2O，溶于1000mL水
PB(pH＝7.4)的配制：
先配0.2M PB(pH＝7.4，100mL)：取19mL 0.2mol/L的NaH2PO4，81mL0.2mol/L的Na2HPO4。
1000mL 0.1M pH＝7.4PBS的配制：
取500mL 0.2MPB，加水稀释至1000mL，加入NaCl至0.9％(g/100mL)，2-8℃保存待用。
在0.1M pH＝7.4PBS缓冲液中添加1％BSA、0.1％的PC300作为试剂稀释缓冲液备用。
实施例2：NFL蛋白定量检测试剂盒的制备
1、100mL封闭液配制：取100mL Tris-HCl缓冲液，加入2％的牛血清白蛋白(BSA)，混合均匀，2-8℃保存待用。
2、M试剂的制备：将羧基磁微粒原液充分混匀、用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5次，加入活化剂10mg/mL的EDC(EDC来自Thermo fisher)40μL和10mg/mL的NHS(NHS来自Merck)40μL，混匀震荡2h，再次用PBS洗涤5次，按照0.1μg/T的浓度加入羊抗FITC抗体及100μL PBS，混匀震荡2h，采用Tris-HCl终止反应，最后用封闭液封闭定容，2-8℃保存待用。
3、R1试剂的制备：将纯化的两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗用0.1M pH为7.4的PBS缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中称取适量FITC，加入DMSO(FITC-1mg/1mLDMSO)使工作浓度为50μg FITC/1mg抗体/1mg DMSO。按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中将FITC标记物用PBS加至2.5mL，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h。使用超滤方式纯化所得反应物。最后用PBS定容，得到的试剂2-8℃保存待用，两种单抗的混合比例为1∶1。
4、R2试剂的制备：将纯化的抗神经丝轻链蛋白羊多抗用0.1MpH为7.4的PBS缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中称取适量EZ-LinkTMNHS-SS-Biotin，加入0.1MpH7.0PBS缓冲液使工作浓度为50μg Biotin/1mg抗体/1mL PBS。磁力搅拌器室温下避光搅拌2h。使用超滤方式纯化所得反应物。最后用PBS定容，得到的试剂2-8℃保存待用。
5、R3试剂的制备：PBS缓冲液中加入纯化的SA-ALP，2-8℃保存待用。
6、样品稀释液的制备：向0.2M PBS缓冲液中加入2％牛血清白蛋白(BSA)，1％的EDTA，混合均匀后分装，2-8℃保存待用。其中EDTA包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾。
7、校准品的制备：向0.5M PBS缓冲液中添加1％的BSA保护蛋白，混合均匀后得到校准品稀释液，然后用该校准品稀释液将NFL抗原稀释成8个浓度点(理论浓度分别是0pg/mL、0.5pg/mL、2pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、1ng/mL、10ng/mL)，分装成1mL/瓶，制备完成的校准品，2-8℃保存待用。
实施例3：NFL蛋白定量检测试剂盒的检测步骤
1)在反应容器(以下简称“孔”)中依次加入校准品(用于定标)和样本，加样量均为100μL/孔。
2)每孔分别加入M试剂30μL，R1试剂50μL和样品稀释液50μL；
其中，M试剂中羧基磁微粒的浓度为0.5mg/mL，R1试剂中两种单抗的工作浓度均为2mg/L。
3)混匀后37℃温育15分钟。
4)清洗液洗涤3次。
5)每孔分别加入R2试剂50μL和R3试剂100μL；
其中，R2试剂中，抗体的工作浓度为1mg/L；R3试剂中，SA-ALP的工作浓度为1mg/L。
6)混匀后37℃温育17分钟。
7)清洗液洗涤5次。
8)每孔加入发光底物液(AMP)200μL。
9)混匀后1～5分钟检测发光值。
10)结果计算。
选择适当的曲线拟合方式进行结果计算。本试剂盒推荐采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线，根据待测样本的发光值计算相应的浓度值。全自动化学发光分析仪TK2000自动操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的发光值自动计算样本测试结果。
实施例4：NFL蛋白定量检测试剂盒的临床性能评价
采用本发明试剂盒与Quanterix公司生产的Simoa NFL蛋白测定试剂盒(单分子免疫诊断)平行考核梯度样本500例，含阴性样本150份，样本均来自上海同济医院，浓度范围为1pg/mL-11ng/mL，对检测结果进行临床相关性分析和符合率分析。符合率结果如表1所示，相关性如图1所示。
表1
从表1结果可以看出，本发明试剂盒与Quanterix公司Simoa试剂盒的阳性符合率可达100％，阴性符合率达99.33％，总符合率为99.80％，一致性较好。
从图1可以看出，本发明试剂盒和Quanterix公司Simoa试剂盒有较好的相关性，R2＝0.9999，且量值偏差较小。
实施例5：本发明试剂盒的精密性评价
取两批本发明的试剂盒进行精密度实验，分别检测高(H＝100000pg/mL)、中(M＝100pg/mL)、低(L＝2pg/mL)值样本各测20次，计算测定浓度的变异，测定结果如图2所示，结果表明变异系数均小于6％。
实施例6：本发明试剂盒的线性范围考核
取1例高值样本H(＞10ng/ml)，1例低值样本L(＜1pg/ml)，分别按照如下比例混合成7个浓度样本(6H、5H+1L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、1H+5L、6L)，每个浓度样本检测3次，计算均值。将理论值与实测均值使用EXCEL软件进行一次方程y＝ax+b回归分析，统计方程因子斜率a和相关性R2，要求a＝1±0.1，R2＞0.99。结果如图3所示，可以看出本发明试剂盒线性范围可达1～10000pg/mL。
实施例7：灵敏度
用零浓度校准品(校准品稀释液0.5M PBS)作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测定结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD。根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即为空白限。由实验结果可知，该试剂盒的空白限为0.03pg/mL，结果如图4所示。
实施例8：准确度
对阳性血样浓度为Sample1(2±0.2)pg/mL和Sample2(500±50)pg/mL的样本，使用混合阴性血基质液对这两个样本进行10倍稀释，计算其回收率。由实验结果可知，该试剂盒的回收率为100％±5％，结果如图5所示。
Claims (10)
1.一种定量检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括M试剂、R1试剂和R2试剂；
其中，M试剂包含包被有羊抗异硫氰酸荧光素抗体的磁颗粒；R1试剂包含异硫氰酸荧光素标记的两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗；R2试剂包含生物素标记的抗神经丝轻链蛋白羊多抗；
R1试剂中，所述两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗靶向神经丝轻链蛋白不同位点。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述M试剂中磁颗粒的工作浓度为0.5-0.9mg/mL；优选为0.5mg/mL。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗的工作浓度为0.1～2mg/L，优选为2mg/L；和/或，两种抗神经丝轻链蛋白鼠单抗与异硫氰酸荧光素的标记摩尔比例为1∶(10～20)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2的试剂中抗神经丝轻链蛋白羊多抗的工作浓度为0.2～2mg/L，优选为1mg/L；抗神经丝轻链蛋白羊多抗与生物素标记摩尔比例是1∶(5～20)。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括R3试剂；所述R3试剂包含化学发光物标记的链霉亲和素；
较佳地，所述R3试剂中链霉亲和素与标记的化学发光标记物的摩尔比例为1∶(5～20)；化学发光物标记的链霉亲和素的工作浓度为0.2～2mg/L；
更佳地，所述R3试剂中化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌，例如为碱性磷酸酯酶标记的链霉亲和素；和/或，所述化学发光物标记的链霉亲和素的工作浓度为1～2mg/L。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液；
较佳地，所述样本稀释液包含牛血清白蛋白、EDTA的缓冲液；
更佳地，所述样品稀释液包含0.5M PBS缓冲液、1％的EDTA和1％～5％牛血清白蛋白。
7.如权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述M试剂、R1试剂、R2试剂、R3试剂中均含有试剂缓冲液；
较佳地，所述试剂缓冲液为包含0.02-0.5M PBS，pH＝5.8～8.0、蛋白和防腐剂的混合溶液；
更佳地，所述蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、酪蛋白中的一种或两种的组合，例如为牛血清白蛋白；和/或，所述防腐剂为PC300、Bro、MIT、NaN3中的两种或两种以上的组合，例如为PC300。
8.一种定量检测神经丝轻链蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1～7任一项所述的试剂盒对样本进行检测；
较佳地，所述样本为血清样本或血浆样本；和/或，所述方法包括在样本中添加M试剂与R1试剂混匀温育后，加入R2和R3试剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将M试剂与R1试剂以3：5的体积比加入样本混合后温育，包被板后加入体积比为1∶2的R2试剂和R3试剂，混合后温育；加入发光底物液后检测发光值；
较佳地，所述温育的温度为35～37℃，所述温育的时间分别为：M试剂与R1试剂温育12～15min；加入R2试剂和R3试剂后温育15～17min；和/或，所述温育后还包括清洗液洗涤的步骤，所述洗涤的次数为3～5次。
10.一种如权利要求1～7任一项所述的试剂盒在定量检测神经丝轻链蛋白中的应用。
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| CN117624356A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 南京诺唯赞医疗科技有限公司 | NfL特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用 |
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2023
- 2023-03-10 CN CN202310251333.0A patent/CN116298246A/zh active Pending
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