CN112014575A - 一种cyfra21-1测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CYFRA21‑1测定试剂盒及其制备方法，将氯甲基磁珠包被CYFRA21‑1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠稀释液稀释后获得试剂M；将CYFRA21‑1检测抗体使用还原剂溶液处理，获得活化后的抗体；碱性磷酸酶用酶活化剂活化，获得活化后的碱性磷酸酶；将所述活化后的抗体与所述活化后的碱性磷酸酶反应，获得酶标抗体复合物；将所述酶标抗体复合物使用酶标稀释液稀释后获得试剂R。本发明通过用氯甲基磁珠一步法包被捕获抗体，用还原剂处理断开检测抗体重链间二硫键后用碱性磷酸酶标记的方法来提高化学发光法检测CYFRA21‑1的线性范围和准确性。

Description

一种CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
细胞角蛋白19片段(Cytokeratin-19-fragment CYFRA21-1)是病理条件下肺泡上皮细胞凋亡时，其细胞中含有的角蛋白的碎片降解后变成可溶性物质而进入血液，使血中含量增高。病理条件其可溶性片段(CYFRA21-1)释放入血并可与两株单克隆抗体KS19.1和BM19.21特异性结合，是检测非小细胞肺癌的首选肿瘤标志物。
CYFRA21-1主要用于监测非小细胞性肺癌(NSCLC)的病程，肺癌的临床诊断主要根据临床症状、影像学或内镜检查和外科手术，肺部不能明确诊断的病灶，如果伴有CYFRA21-1检测结果的增高(>30ngl ml),预示患原发性支气管肺癌的可能性相当高；血清高水平的CYFRA21-1提示肿瘤晚期和预后较差；血清CYFRA21-1水平正常或轻微上升，不能排除肿瘤存在的可能；患者治疗中，血清CYFRA21-1水平快速下降到正常范围内提示治疗有，血清CYFRA21-1水平持续性保持、轻微改变或缓慢下降提示肿瘤可能切除不完全，在疾病进展过程中CYFRA21-1水平的升高往往早于临床症状及影像学检查，对非小细胞肺癌(NSCLC)的早期诊断、疗效监测和预后判断均有重要意义。
目前检测CYFRA21-1的方法主要是酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析法，CN106483298A公开了一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒，该试剂盒的灵敏度为0.03ng/ml；线性系数：r≥0.9990，线性范围：0.10-16ng/ml；其线性范围较窄，无法满足临床需求。
因此，如何开发一种能够提高化学发光法检测CYFRA21-1的线性范围的CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法，通过用氯甲基磁珠一步法包被捕获抗体，用还原剂断开检测抗体重链间二硫键后用碱性磷酸酶标记的方法来提高化学发光法检测CYFRA21-1的线性范围。
为了实现上述目的，本发明提供了一种磁珠抗体复合物的制备方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述氯甲基磁珠质量和所述CYFRA21-1捕获抗体质量的比值为1:(0.02-0.1)。
进一步地，所述还原剂选自DTT、TCEP、MEA。
更进一步地，所述还原剂配方为：10～100mM PBS，10～100mM DTT；所述CYFRA21-1检测抗体质量与所述还原剂溶液质体积的比值为(0.5～1)mg：1mL。
进一步地，，所述酶活化剂的配方为：10～100mM Tris，0.2～0.6％NaCl，2～10mMEDTA，10～50mM SMCC交联剂。
进一步地，所述碱性磷酸酶质量与所述酶活化剂体积的比值为(0.5～1)mg：0.5mL；所述活化后的碱性磷酸酶与所述抗CYFRA21-1检测抗体的质量比为(0.5-0.8):1；
进一步地，所述酶标稀释液的配方为：20～100mM的Tris，0.5～0.9％NaCl，1～5mMMgCl2，0.1～0.5mM ZnCl2，0.05～0.15％PC-300，1～5％甘油，0.1～1％BSA，5～10％胎牛血清，pH为6～7。
进一步地，所述磁珠稀释液的配方为：20～100mM PBS，0.1～0.3％Tween20，0.1～1％BSA，0.05～0.3％PC-300，pH为7.0～8.0。
进一步地，所述氯甲基磁珠质量和所述CYFRA21-1捕获抗体质量的比值为1:(0.02-0.1)。
进一步地，所述将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，具体包括：
将氯甲基磁珠、CYFRA21-1捕获抗体和偶联缓冲液直接进行偶联反应，偶联后进行封闭，加入保存液后获得磁珠包被抗体复合物。
进一步地，所述偶联缓冲液的配方为50～100mM硼酸溶液，pH8.0～8.5。
进一步地，所述封闭缓冲液的配方为50～100mM PBS，0.5～1.5％BSA，pH7.0～7.5。
本发明还提供了方法制备得到的CYFRA21-1测定试剂盒。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法，采用氯甲基磁珠直接一步法包被捕获抗体，相比羧基磁珠包被方式的不用添加活化剂活化磁珠，偶联效率高，批间差小；将用于碱性磷酸酶标记的抗体先用还原剂将检测抗体重链间的二硫键打开，可以提高偶联效率，这种磁珠包被和酶标记的方式，提高了低端灵敏度和高端线性，改善了化学发光法检测CYFRA21-1的“S型”线性问题，提高了CYFRA21-1检测的线性范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1、对比例1和对比例2的测定试剂盒的线性范围；
图2为本发明实施例1提供的CYFRA21-1测定试剂盒与罗氏样本相关性。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，包括：
步骤S1、将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠稀释液稀释后获得磁珠试剂M；
步骤S2、CYFRA21-1检测抗体使用还原剂溶液处理，获得活化后抗体；碱性磷酸酶用酶活化剂活化，获得活化后的碱性磷酸酶；将所述活化后的抗体与所述活化后的碱性磷酸酶反应，获得酶标抗体复合物；将所述酶标抗体复合物使用酶标稀释液稀释后获得试剂R。
本发明采用氯甲基磁珠直接一步法包被捕获抗体，相比羧基磁珠包被方式的不用添加活化剂活化磁珠，偶联效率高，批间差小；将用于碱性磷酸酶标记的检测抗体先用还原剂将抗体重链间的二硫键打开，可以提高偶联效率，这种磁珠包被和酶标记的方式，提高了低端灵敏度和高端线性，改善了化学发光法检测CYFRA21-1的“S型”线性问题，提高了CYFRA21-1检测的线性范围。
所述步骤S1中，将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠稀释液稀释后获得磁珠试剂M，具体包括：
将氯甲基磁珠、CYFRA21-1捕获抗体和偶联缓冲液直接进行偶联反应，偶联后进行封闭，加入保存液后获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠抗体稀释液稀释后获得磁珠试剂M。
所述偶联缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。本实施例中，所述偶联缓冲液的配方为50～100mM硼酸溶液，pH8.0～8.5。
所述封闭缓冲液的配方为50～100mM PBS，0.5～1.5％BSA，pH7.0～7.5。
所述磁珠稀释液的配方为：20～100mM PBS，0.1～0.3％Tween20，0.1～1％BSA，0.05～0.3％PC-300，pH为7.0～8.0。
所述氯甲基磁珠质量和所述CYFRA21-1捕获抗体质量的比值为1：(0.02～0.1)。
所述步骤S2中，所述还原剂为DTT。所述还原剂溶液的配方为：10～100mM PBS，10～100mM DTT；所述DTT还原剂的浓度为(10～100)mM，优选为50mM，所述DTT还原剂的浓度过高会导致抗体失活，过低会导致活化效果不够。
所述酶活化剂的配方为：10～100mM Tris，0.2～0.6％NaCl，2～10mM EDTA，10～50mM SMCC交联剂；
所述碱性磷酸酶质量与所述酶活化剂体积的比值为(0.5～1)mg：0.5mL。该范围内有利于最大程度的活化。
所述活化后的碱性磷酸酶与所述CYFRA21-1检测抗体的质量比为(0.5-0.8):1。当质量比增大，碱性磷酸酶用量过多时，造成系统背景值升高，且高值样本光子值超出仪器测值上限，影响高值样本测试精密度；当质量比减小，抗体过多时，未标记的游离抗体与碱性磷酸酶-CYFRA21-1检测抗体复合物竞争抗原位点，降低了低端样本灵敏度。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述方法制备得到的CYFRA21-1测定试剂盒。
所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，包括R试剂和M试剂；
所述R试剂：CYFRA21-1检测抗体使用还原剂溶液处理，获得活化后抗体；碱性磷酸酶用酶活化剂活化，获得活化后的碱性磷酸酶；将所述活化后的抗体与所述活化后的碱性磷酸酶反应，获得酶标抗体复合物；将所述酶标抗体复合物使用酶标稀释液稀释后获得试剂R。
所述酶标稀释液的配方为：20～100mM的Tris，0.5～0.9％NaCl，1～5mM MgCl2，0.1～0.5mM ZnCl2，0.05～0.15％PC-300，1～5％甘油，0.1～1％BSA，5～10％胎牛血清，pH为6～7。
所述M试剂为以磁珠稀释液将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体稀释成工作液备用。所述磁珠稀释液的配方为：20～100mM PBS，0.1～0.3％Tween20，0.1～1％BSA，0.05～0.3％PC-300，pH为7.0～8.0。
所述CYFRA21-1测定试剂盒的检测原理如下：
本发明采用化学发光免疫分析双抗体夹心法，定量检测CYFRA21-1试剂盒，主要原理为：磁微粒包被鼠抗人单克隆抗体(捕获抗体)，结合人血清或血浆中的CYFRA21-1，再与碱性磷酸酶标记鼠抗人CYFRA21-1单克隆抗体(检测抗体)形成双抗夹心法，碱性磷酸酶在底物存在情况下，催化底物发光，通过化学发光检测系统进行定量检测。
化学发光免疫法分析法常见的磁珠包被方式为羧基磁珠包被，但用在化学发光法检测CYFRA21-1项目上不理想，CYFRA21-1的线性呈“S型”，低端灵敏度差，高端线性较差，线性范围较窄；本发明用氯甲基磁珠直接一步法包被捕获抗体，相比羧基磁珠包被方式的不用添加活化剂活化磁珠，偶联效率高，批间差小；将用于碱性磷酸酶标记的检测抗体先用还原剂将抗体重链间的二硫键打开，可以提高偶联效率，这种磁珠包被和酶标记的方式，提高了低端灵敏度和高端线性，改善了化学发光法检测CYFRA21-1的“S型”线性问题，提高了CYFRA21-1检测的线性范围。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法进行详细说明。
涉及到的实验材料包括：
羧基磁珠：购于日本JSR株式会社。
氯甲基磁珠：购于厦门普瑞迈格生物技术有限公司
碱性磷酸酶：购于罗氏诊断生物技术公司，
抗体：鼠抗人CYFRA21-1单克隆抗体，纯度＞95％。
实施例1
本实施例的CYFRA21-1测定试剂盒包括R试剂、M试剂和校准品：
1、M试剂：将磁珠包被后的抗体用M稀释液(100mM PB，0.1％Tween20，0.5％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)按照1:20的比例进行稀释，得到M试剂。所述磁珠包被后的抗体为氯甲基磁珠包被CYFRA21-1抗体，具体为：
(1)取10mg/mL氯甲基磁珠0.2mL于离心管中，去除上清液，用0.5mL的磁珠清洗液(100mM MES，0.05％Tween20，pH6.0)进行磁性分离洗涤3次，去除上清液。
(2)加入100μg的捕获抗体和0.5mL的偶联缓冲液(100mM硼酸溶液，pH8.0-8.5)，25℃偶联2-3h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态，偶联完成，去除上清液。
(3)加入0.5mL封闭缓冲液(100mM PBS，1％BSA，pH7.2)，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化基团，保持磁珠悬浮状态，封闭完成，去除上清液，用洗涤液(100mM PBS缓冲液，pH7.2)清洗3次。
(4)加入1mL保存液(100mM Tris，0.1％PC-300，pH8.0)保存，得到磁珠包被后的试剂M，保存在2-8℃条件下。
2、R试剂：将酶标记抗体用R稀释液(100mM的Tris，0.9％NaCl，4mM MgCl2，0.4mMZnCl2，0.1％PC-300，5％甘油，1％BSA，5％胎牛血清，pH为6.5)按照1:500的比例进行稀释，得到R试剂。所述酶标抗体的制备方法为：
取0.5mg的检测抗体，加入50mM的DTT还原剂，室温下反应30min，将抗体重链间的二硫键断开形成游离巯基。
另取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂(100mM Tris，0.3％NaCl，5mMEDTA，25mM SMCC交联剂)，室温下反应15min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶。
将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标抗体复合物。
按照1:1的体积加入甘油保存，得到酶标抗体，保存在-20℃条件下。
3、校准品的制备
将CYFRA21-1抗原用校准品稀释液(50mM Tris，0.9％NaCl，0.2％Tween20，0.2％酪蛋白，1％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)配制成0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL的浓度。
对比例1
该对比例为羧基磁珠包被抗体，其他均同实施例1。
(1)取10mg/mL羧基磁珠0.2mL于离心管中，去除上清液，用0.5mL的磁珠清洗液(100mM MES，0.05％Tween20，pH6.0)进行磁性分离洗涤3次，去除上清液。
加入0.5mL的磁珠清洗液作为分散剂，加入0.1mL的10mg/mL EDC溶液和0.1mL的10mg/mL NHS溶液(活化剂，现配现用)与装有磁珠的离心管中，旋涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化20-30min，期间保持磁珠悬浮状态，磁珠表面的羧基活化完成，去除上清液。
加入100μg的捕获抗体和0.5mL的偶联缓冲液(100mM硼酸溶液，pH8.0-8.5)，25℃偶联2-3h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态，偶联完成，去除上清液。
加入0.5mL封闭缓冲液(100mM PBS，1％BSA，pH7.2)，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，保持磁珠悬浮状态，封闭完成，去除上清液，用洗涤液(100mM PBS缓冲液，pH7.2)清洗3次。
加入1mL保存液(100mM Tris，0.1％PC-300，pH8.0)保存，得到磁珠包被后的抗体M，保存在2-8℃条件下。
对比例2
该对比例中用于碱性磷酸酶标记的抗体不使用还原剂还原；其余同实施例1，具体地：
取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂(100mM Tris，0.3％NaCl，5mM EDTA，25mM SMCC交联剂、DMF)，室温下反应15min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶。
将0.5mg的检测抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标抗体复合物。
按照1:1的体积加入甘油保存，得到酶标抗体，保存在-20℃条件下。
试验例1
实验仪器选择：全自动化学发光免疫分析仪，用实施例1和对比例1-2配制成M试剂和R试剂后选择CYFRA21-1校准品进行定标后，检测灵敏度和线性。
1、灵敏度：将实施例1、对比例1-2测试低值稀释样本。
表1实施例1和对比例1-2灵敏度
Figure BDA0002664776420000071
从表1的数据可知，实施例1的灵敏度相比对比例1-2的灵敏度好。
进一步地，采用实施例1的试剂盒测试11次后，评价实施例1试剂盒的灵敏度，如表2所示。
表2实施例1灵敏度数据
Figure BDA0002664776420000072
Figure BDA0002664776420000081
由表2可知：实施例1的测定试剂盒的灵敏度可达0.02ng/mL。
2、线性范围：将对比例1-2和实施例1测试高值样本梯度稀释的样本，计算线性相关系数，结果如表3和图1所示。
表3-对比例1-2和实施例1线性范围
Figure BDA0002664776420000082
由表2数据可知，实施例1的灵敏度比对比例1-2高，对比例1的线性相关系数R2为0.9059，对比例2的线性相关系数R2为0.9136，实施例1线性相关系数R2为0.9998，实施例1的线性范围更宽。
由图1可知，对比例1-2的低端灵敏度差，高端线性较差，整体线性呈“S型”，线性范围窄，实施例1线性相比对比例1的“S型”有所改善，且灵敏度和高端线性优于对比例1-2，线性范围宽。
3、样本相关性：将实施例1测试不同浓度且覆盖线性范围的样本，与罗氏电化学发光进行比较，相关性R2＞0.95；结果如图2所示。
由图2结果可知：实施例1与罗氏样本相关性R2为0.9963，相关性较好。
综上所述，本发明通过用氯甲基磁珠一步法包被捕获抗体，用还原剂断开检测抗体重链间二硫键后用碱性磷酸酶标记的方法可以成功提高化学发光法检测CYFRA21-1的线性范围。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠稀释液稀释后获得磁珠试剂M；
将CYFRA21-1检测抗体使用还原剂溶液处理，获得活化后的抗体；将碱性磷酸酶用酶活化剂活化，获得活化后的碱性磷酸酶；将所述活化后的抗体与所述活化后的碱性磷酸酶反应，获得酶标抗体复合物；将所述酶标抗体复合物使用酶标稀释液稀释后获得试剂R。
2.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述还原剂配方为：10～100mM PBS，10～100mM DTT；所述CYFRA21-1检测抗体质量与所述还原剂溶液质体积的比值为(0.5～1)mg：1mL。
3.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶活化剂的配方为：10～100mM Tris，0.2～0.6％NaCl，2～10mM EDTA，10～50mM SMCC交联剂；所述碱性磷酸酶质量与所述酶活化剂体积的比值为(0.5～1)mg：0.5mL。
4.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化后的碱性磷酸酶与所述抗CYFRA21-1检测抗体的质量比为(0.5-0.8):1；所述酶标稀释液的配方为：20～100mM的Tris，0.5～0.9％NaCl，1～5mM MgCl2，0.1～0.5mM ZnCl2，0.05～0.15％PC-300，1～5％甘油，0.1～1％BSA，5～10％胎牛血清，pH为6～7。
5.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述磁珠稀释液的配方为：20～100mM PBS，0.1～0.3％Tween20，0.1～1％BSA，0.05～0.3％PC-300，pH为7.0～8.0。
6.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述氯甲基磁珠质量和所述CYFRA21-1捕获抗体质量的比值为1:(0.02-0.1)。
7.根据权利要求1所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述将氯甲基磁珠包被CYFRA21-1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，具体包括：
将氯甲基磁珠、CYFRA21-1捕获抗体和偶联缓冲液直接进行偶联反应，偶联后进行封闭，加入保存液后获得磁珠包被抗体复合物。
8.根据权利要求7所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭缓冲液的配方为50～100mM PBS，0.5～1.5％BSA，pH7.0～7.5。
10.一种采用权利要求1-9任一所述的方法制备得到的CYFRA21-1测定试剂盒。
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