CN111707835B - 用于检测IgG4的组合物、试剂盒、应用及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测样本中IgG4的组合物、试剂盒、应用及检测方法,涉及体外检测的技术领域,本发明提供的用于检测IgG4抗原的组合物包括被IgG4抗体包被的纳米磁微粒、偶联有酶的IgG4抗体、样品稀释液a、样品稀释液b及酶促发光底物,该组合物通过纳米磁微粒化学发光法能够有效实现对IgG4抗原的检测,降低了双抗体与抗原结合的空间位阻,能够以双抗体夹抗原夹心法实现对IgG4抗原的检测,有效提高了检测的特异性、灵敏度、精密度及试剂化学发光的线性宽发光范围。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域,尤其是涉及一种用于检测IgG4的组合物、试剂盒、应用及检测方法。
背景技术
正常人体内的免疫球蛋白G(IgG)包括四个亚型,分别为IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4,其占比分别约为:60~70%、15~20%、5~10%及1~7%,IgG4相关性疾病是一种与IgG4淋巴细胞密切相关的慢性、系统性疾病。IgG4为人体内含量最低的免疫球蛋白G亚型,故检测试剂需要灵敏度较高,并且需要避免与其他类型的免疫球蛋白及IgG1-3发生交叉反应,故又需特异性良好。
目前人免疫球蛋白G4的检测方法主要有胶乳增强比浊和酶联免疫两种方法学,胶乳增强比浊的检测原理为在高分子微球表面交联能特异性结合IgG4蛋白的抗体,当携带有抗体的微球与IgG4蛋白结合后,微球发生聚集,改变了溶液的散光或透光性能,通过检测溶液的发光值反应检测样本的IgG4蛋白浓度。酶联免疫法的检测原理为在固相酶标板上包被能与IgG4蛋白特异结合的抗体用于捕获样本中的IgG4蛋白,当IgG4蛋白被固相载体上的抗体捕获后结合有酶的二抗能与捕获的IgG4蛋白再次结合,加入底物后二抗上的酶能使底物发生颜色变化,通过检测底物的颜色变化来反应样本的IgG4蛋白浓度。这两种方法学都存在特异性差,灵敏度低,线性范围窄的缺点。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于检测IgG4的组合物,以至少解决现有技术中存在的人免疫球蛋白G4的检测方法特异性差,灵敏度低,线性范围窄问题之一。
本发明的第二个目的在于提供包含上述用于检测IgG4的组合物的试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供上述组合物或试剂盒在检测IgG4中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种非诊断目的用于检测IgG4的检测方法。
本发明提供了一种用于检测IgG4的组合物,所述组合物包括纳米磁微粒溶液、酶结合液、样本稀释液a、样本稀释液b和发光底物;
所述纳米磁微粒溶液包括第一抗体包被的纳米磁微粒,所述第一抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的IgG4抗体;
所述酶结合液包括偶联有酶的第二抗体,所述第二抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的抗体;
所述样本稀释液a包括用于将所述样本中IgG4水解以产生与所述第一抗体和所述第二抗体特异性结合的Fc片段的蛋白水解酶;
所述样本稀释液b包括用于将所述蛋白水解酶浓度稀释至不影响所述Fc片段与所述第一抗体和所述第二抗体结合的缓冲液;
所述发光底物包括酶促发光底物。
进一步的,所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,其中满足:M≤0.5%N。
进一步的,所述蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶,优选的,所述蛋白水解酶浓度为1-4U/mL。
进一步的,所述磁珠包括甲苯磺酰基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、链霉亲和素磁珠,优选为甲苯磺酰基磁珠;
优选地,所述纳米磁微粒的所述第一抗体包被量为10ug抗体/mg磁珠、纳米磁微粒溶液浓度为0.1-0.6mg/ml。
与所述第二抗体偶联的酶包括碱性磷酸酶、吖啶酯衍生物和辣根过氧化物酶,优选为碱性磷酸酶;
优选地,所述酶结合液中所述第二抗体的浓度为0.1-1μg/ml。
进一步的,所述蛋白水解酶为木瓜蛋白酶;
进一步的,所述酶促发光底物包括碱性磷酸酶酶促发光底物、吖啶酯衍生物激发液、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物,所述碱性磷酸酶酶促发光底物,优选包括AMPPD。
本发明还提供了一种用于检测IgG4的试剂盒,所述试剂盒包括上述的用于检测IgG4的组合物。
进一步的,所述试剂盒还包括样本稀释液a、样本稀释液b、校准品和质控品中的一种或多种。
进一步的,所述样本稀释液a包括缓冲液及蛋白水解酶,蛋白水解酶包括胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶,优选为木瓜蛋白酶,更优选的木瓜蛋白酶使用浓度为1-4U/ml;更优选地,所述木瓜蛋白酶的使用浓度为1U/mL。
优选地,所述样本稀释液a还包括磷酸盐缓冲液,更优选包括0.005-0.02M的磷酸盐缓冲液;
优选地,所述样本稀释液的pH为7.2-7.5;
优选地,所述缓冲液中还包括牛血清白蛋白和/或防腐剂;
优选地,所述牛血清白蛋白的含量为0.1%-2%,优选为1%;
优选地,所述防腐剂的含量为0.05%-0.2%,优选为0.1%;
优选地,所述防腐剂包括Procline-300、Procline-950、叠氮钠、硫柳汞和苯酚,优选为Procline-300。
所述样本稀释液b包括缓冲液。
优选包括磷酸盐缓冲液,更优选包括0.005-0.02M的磷酸盐缓冲液;
优选地,所述样本稀释液的pH为7.2-7.5;
优选地,所述缓冲液中还包括牛血清白蛋白和/或防腐剂;
优选地,所述牛血清白蛋白的含量为0.1%-2%;
优选地,所述防腐剂的含量为0.05%-0.2%;
优选地,所述防腐剂包括Procline-300。
另外,本发明还提供了上述的用于检测IgG4的组合物或用于检测IgG4的试剂盒在检测IgG4中的应用;
优选地,所述检测的样本包括血清、血浆或全血。
另外,本发明还提供了一种非诊断目的用于检测IgG4的检测方法,步骤如下:
加样:将样本放入样本稀释液a中;
稀释:将一定量的经加样步骤产生的含有样本的样本稀释液a通过含有可将蛋白水解酶浓度稀释至不影响所述Fc片段与第一抗体和第二抗体结合的缓冲液的样本稀释液b稀释;
其中所述第一抗体为对样本中IgG4具有特异性的IgG4抗体;所述第二抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的抗体;
孵育:先将所述样本与所述第一抗体包被的纳米磁微粒溶液孵育;
清洗:清洗纳米磁微粒;
再孵育:再将包括偶联有酶的所述第二抗体的酶结合液加入清洗后的纳米磁微粒溶液中孵育;
再清洗:清洗纳米磁微粒;
发光:最后向清洗后的纳米磁微粒溶液中加入酶促发光底物,测定发光值,发光值可定量分析IgG4含量。
优选地,S2中在稀释步骤完成时,所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,其中满足:M≤0.5%N。
抗体通常是由两条重链和两条轻链通过二硫键连接,形成一个Y形结构,两条重链在中间位置形成绞链区,绞链区以上的两个片段,是Fab片段,Fab片段包括一个可变区,和一个恒定区。绞链区以下的片段,称为可结晶片段即Fc片段,本发明中的检测物质IgG4抗原实际为一种抗体,本发明中磁珠上标记的特异性抗体及酶结合物中的特异性抗体的结合位点都为IgG4抗原的Fc片段,木瓜蛋白酶主要作用于绞链区近端,酶解产物为Fab片段和Fc片段,木瓜蛋白酶在Fc片段上作用于末端14号氨基酸残基和105号氨基酸残基之间;酶解后,用对IgG4抗原Fc片段的检测代替了对整个IgG4抗原的检测有效避免了完整IgG4蛋白Fab片段存在带来的空间位阻和多检测特异性的干扰。
本发明提供的用于检测IgG4的组合物包括样本稀释液a、样本稀释液b、被对样本中IgG4抗原具有特异性的IgG4抗体包被的纳米磁微粒、偶联有酶的对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体及酶促发光底物,该组合物通过纳米磁微粒化学发光法能够有效实现对IgG4的检测。其中,样本稀释液a中的蛋白水解酶对目标蛋白IgG4抗原进行水解,产生IgG4抗原Fc片段,降低了双抗体与抗原结合的空间位阻,通过样品稀释液b将样品中蛋白水解酶的浓度降低至不影响抗体与抗原结合的浓度,并且悬浮的磁微粒混悬液能使样本充分反应,有效提高了检测的灵敏度、精密度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例提供的S0、S1拟合校准曲线图;
图2为本发明实验例提供的稀释线性拟合方程图;
图3为IgG4蛋白结构图及木瓜蛋白酶水解位点示意图。
具体实施方式
人免疫球蛋白G4属于抗体类蛋白,因抗原与抗体是一种相对概念,且本发明中所采用“抗体-抗原-抗体”双抗体夹抗原夹心结构的检测原理,故本发明中所述的IgG4抗原应理解为人免疫球蛋白G4,即IgG4蛋白,也可理解为由IgG4抗原水解生成的可与双抗体结合形成“抗体-抗原-抗体”双抗体夹抗原夹心结构的Fc片段;本发明中所述抗体为与所述IgG4抗原或由IgG4抗原水解生成的Fc片段可特异性结合的物质。
除非本文另有定义,连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰,然而,在任何潜在不明确性的情况下,本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中,除非另有说明,“或”的使用意味着“和/或”。此外,术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地,连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明,本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行,所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面,提供了一种用于检测IgG4的组合物,所述组合物包括纳米磁微粒溶液、酶结合液、样本稀释液a、样本稀释液b和发光底物;
纳米磁微粒溶液包括第一抗体包被的纳米磁微粒,第一抗体为对样本中IgG4具有特异性的IgG4抗体;
酶结合液包括偶联有酶的第二抗体,所述第二抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的抗体;
样本稀释液a包括缓冲液及用于将样本中IgG4抗体水解以产生与第一抗体和第二抗体特异性结合的Fc片段的蛋白水解酶;
样本稀释液b包括用于将蛋白水解酶浓度稀释至不影响Fc片段与第一抗体和第二抗体结合的缓冲液;
所述发光底物包括酶促发光底物。
在使用本发明提供的组合物检测IgG4时,待测样本先用样本稀释液a稀释并孵育,若样本中含有目标蛋白IgG4抗原,则蛋白水解酶则将IgG4水解成若干片段(Fab、F(ab’)2、Fc),再将样品中的蛋白水解酶稀释至不影响样品中酶切获得的Fc片段与IgG4抗体结合的浓度,酶切获得的Fc片段与对样本中IgG4抗原具有特异性的IgG4抗体包被的纳米磁微粒作用发生结合反应,再加入酶结合液后,其中偶联有酶的对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体也会与Fc片段发生结合反应,从而形成“抗体-抗原-抗体夹心”。此时,再加入酶促发光底物,则可观测到光信号变化,说明待测样本中含有目的蛋白IgG4;若加入酶促发光底物后无光信号变化,则说明待测样本中不含有目的蛋白IgG4抗原。
由此可知,通过纳米磁微粒溶液、酶结合液、样本稀释液a、样本稀释液b和发光底物的配合使用,能够以双抗体夹抗原夹心法实现对IgG4抗原的检测,相比胶乳比浊的单抗体捕获模式和酶联免疫的双抗体夹心模式,胶乳比浊的单抗体捕获模式和酶联免疫的双抗体夹心模式的检测物均为IgG4完整蛋白,IgG4的Y型空间结构会影响抗体与IgG4结合的反应效率,同时由于IgG4抗体结合位点众多,抗体结合位点无法精准控制,会导致特异性及精密度较差,本发明在检测前通过样本稀释液中的蛋白水解酶将目标物IgG4抗原水解成若干片段(Fab、F(ab’)2、Fc),只对其中Fc片段精准结合,且本发明中Fc片段与双抗体结合时的空间位阻大大降低,大大提高了检测的灵敏度、特异性、精密度及检测范围。
需要说明的是,为了便于生产和应用,本发明中的对样本中IgG4抗原具有特异性的IgG4抗体可以优选IgG4单克隆抗体。
在本发明中,设所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,将所述蛋白水解酶浓度稀释至不影响所述Fc片段与所述第一抗体和所述第二抗体结合的浓度需满足:M≤0.5%N。
其中,第一抗体和第二抗体类型可以相同,也可以不同,可以但不限于为鼠抗人IgG4单克隆抗体、兔抗人IgG4单克隆抗体、羊抗人IgG4多克隆抗体等各种宿主来源的IgG4特异性抗体。本方案中第一抗体与第二抗体均使用鼠抗人IgG4单克隆类抗体,但第一抗体与第二抗体的具体结构不同。
所述纳米磁微粒包括甲苯磺酰基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、链霉亲和素磁珠,在一些优选的实施方式中,纳米磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。
优选地,所述纳米磁微粒溶液抗体包被量为10ug(抗体)/mg(磁珠)、纳米磁微粒溶液浓度为0.1-0.6mg/ml,例如可以为,但不限于0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml或0.6mg/ml。通过优化纳米磁微粒的浓度,能够保证其上的IgG4抗体与样本的反应更加充分,保证检测的灵敏度和精密度,同时避免试剂的浪费。
在一些优选的实施方式中,所述酶包括碱性磷酸酶、吖啶酯衍生物和辣根过氧化物酶,优选为碱性磷酸酶。
优选地,所述酶结合液中对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度为0.1-1μg/ml,例如可以为,但不限于0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml或1μg/ml。对酶结合液中对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度进行调整和限定,能够在保证反应完全的基础上进一步节约成本。
在一些优选的实施方式中,所述样本稀释液a包括缓冲液及蛋白水解酶,蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶,因木瓜蛋白酶的酶活性在中性环境中较好,胃蛋白酶的酶活性在酸性环境中较好(如图3所示),而组合物中体系pH为7.2-7.5,为保证蛋白水解酶对IgG4蛋白的水解效率,本发明优选木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶的使用浓度为1-4U/ml,木瓜蛋白酶浓度更优选为1U/ml。
所述样品稀释液b包括缓冲液。
优选包括磷酸盐缓冲液,更优选地,磷酸盐缓冲液的浓度为0.005-0.02M,例如可以为,但不限于0.005M、0.01M、0.015M或0.02M,进一步优选缓冲液的pH为7.2-7.5,例如可以为,但不限于7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地,所述缓冲液中还包括牛血清白蛋白和/或防腐剂;例如可以包括牛血清白蛋白、或者包括防腐剂、或者同时包括牛血清白蛋白和防腐剂。
优选地,所述牛血清白蛋白的含量为0.1%-2%,例如可以为,但不限于0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%;所述防腐剂的含量为0.05%-0.2%,例如可以为,但不限于0.05%、0.08%、0.1%、0.12%、0.15%、0.18%或0.2%。
优选地,所述防腐剂包括Procline-300。
样本稀释液a用于稀释待测样本、酶切检测物,通过对样本稀释液a的组分和含量进行进一步的调整和优化,使得本实施方式提供的样本稀释液a在有效稀释样本的基础上,避免对结合反应或检测产生干扰,保证检测的准确性。样本稀释液a优选包含有1U/ml木瓜蛋白酶、1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液。
样本稀释液b用于将对本稀释液a中的蛋白水解酶稀释至0.009U/ml,通过对样本稀释液b的组分和含量进行进一步的调整和优化,使得本实施方式提供的样本稀释液b在有效稀释样本的基础上,避免蛋白水解酶对抗体-抗原-抗体结合反应或检测产生干扰,保证检测的准确性。样本稀释液b优选包括1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300的0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液。
在一些优选的实施方式中,所述酶促发光底物包括碱性磷酸酶酶促发光底物,优选包括AMPPD。
AMPPD为1,2-二氧环乙烷衍生物,是一种超灵敏的碱性磷酸酶底物,具有反应速度快的优点,在很短的时间内即可显示出正确、可靠的结果,增加检测反应的灵敏性,提高检测效率。
基于本发明提供的用于检测IgG4的组合物,本发明的第三个方面还提供了一种用于检测IgG4的试剂盒,包括本发明提供的用于检测IgG4的组合物。因此,本发明提供的用于检测IgG4的试剂盒具有本发明提供的用于检测IgG4的组合物的全部有益效果,在此不再赘述。
在一些优选的实施方式中,所述试剂盒还包括校准品和质控品中的一种或多种。例如可以含有校准品、或者含有质控品、或者同时含有校准品和质控品。
样本稀释液a用于稀释待测样本、酶切检测物,典型的样本稀释液a包括缓冲液及蛋白水解酶,优选的蛋白水解酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,优选的为木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶使用浓度为1-4U/ml,更优选为1U/ml。
校准品用于校准检测仪器,能够进一步避免不必要的误差,保证检测结果的准确性。在一些优选的实施方式中,所述校准品包括使用校准品缓冲液稀释IgG4蛋白得到的不同浓度的IgG4蛋白的稀释液。
所述不同浓度包括S0:0mg/ml、S1:0.2-0.75mg/ml、S2:0.75-1.5mg/ml、S3:1.5-2.5mg/ml、S4:2.5-7.5mg/ml、S5:7.5-15mg/ml和S6:15-30mg/ml中的至少两种。例如可以包括S0和S1、或者S0和S3、或者S0和S4、或者包括S0、S2、S5、或者包括S0、S1、S6、或者同时包括S0、S1、S2、S3、S4、S5和S6。优选同时包括S0、S1、S2、S3、S4、S5和S6。当校准点的数量越多时,校准后的准确性越高。
其中,S1例如可以为,但不限于0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml或0.7mg/ml;S2例如可以为,但不限于0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.5mg/ml;S3例如可以为,但不限于1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.3mg/ml或2.5mg/ml;S4例如可以为,但不限于3mg/ml、4.5mg/ml、5.5mg/ml、6.5mg/ml、7.0mg/ml或7.5mg/ml;S5例如可以为,但不限于8.75mg/ml、9.8mg/ml、10.9mg/ml、13mg/ml、14.1mg/ml或15.00mg/ml;S6例如可以为,但不限于16.55mg/ml、18.5mg/ml、22.3mg/ml、25.9mg/ml、28.1mg/ml或30.00mg/ml。优选地,所述不同浓度包括S0:0mg/ml、S1:0.5mg/ml、S2:1mg/ml、S3:2mg/ml、S4:5mg/ml、S5:10mg/ml和S6:20mg/ml。
优选地,所述校准品缓冲液包括磷酸盐缓冲液,优选地,磷酸盐缓冲液的浓度为0.005-0.02M,例如可以为,但不限于0.005M、0.01M、0.015M或0.02M,进一步优选缓冲液的pH为7.2-7.5,例如可以为,但不限于7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地,所述校准品缓冲液还包括牛血清白蛋白、防腐剂和表面活性剂中的一种或多种;例如单独包括牛血清白蛋白、或者单独包括防腐剂、或者单独包括表面活性剂、或者包括牛血清白蛋白和表面活性剂、或者包括防腐剂和表面活性剂、或者同时包括牛血清白蛋白、防腐剂和表面活性剂。
优选地,所述牛血清白蛋白的含量为0.1%-2%,例如可以为,但不限于0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%;所述防腐剂的含量为0.05%-0.2%,例如可以为,但不限于0.05%、0.08%、0.1%、0.12%、0.15%、0.18%或0.2%;所述表面活性剂的含量为0.1%-2%,例如可以为,但不限于0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%。
优选防腐剂包括Procline-300;表面活性剂包括Triton X-100。
通过对校准品缓冲液的组分和含量进行进一步的调整和优化,使得本实施方式提供的校准品缓冲液制备得到的校准品能够保证检测的准确性。优选包含有1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300、1%Triton X-100的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液作为校准品缓冲液。
通过设置质控品,能够进一步保障检测结果的准确性和有效性。在一些优选的实施方式中,所述质控品包括使用质控品缓冲液稀释IgG4蛋白得到的不同浓度的IgG4蛋白的稀释液;
优选地,所述质控品包括两个质控点:C1:0.5-1mg/ml和C2:3-5mg/ml;
优选地,所述质控品缓冲液包括磷酸盐缓冲液,优选磷酸盐缓冲液的浓度为0.005-0.02M,例如可以为,但不限于0.005M、0.01M、0.015M或0.02M,进一步优选缓冲液的pH为7.2-7.5,例如可以为,但不限于7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地,所述质控品缓冲液还包括牛血清白蛋白、防腐剂和表面活性剂中的一种或多种;例如单独包括牛血清白蛋白、或者单独包括防腐剂、或者单独包括表面活性剂、或者包括牛血清白蛋白和表面活性剂、或者包括防腐剂和表面活性剂、或者同时包括牛血清白蛋白、防腐剂和表面活性剂。
优选地,所述牛血清白蛋白的含量为0.1%-2%,例如可以为,但不限于0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%;所述防腐剂的含量为0.05%-0.2%,例如可以为,但不限于0.05%、0.08%、0.1%、0.12%、0.15%、0.18%或0.2%;所述表面活性剂的含量为0.1%-2%,例如可以为,但不限于0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%。
优选防腐剂包括Procline-300;表面活性剂包括Triton X-100。
通过对质控品缓冲液的组分和含量进行进一步的调整和优化,使得本实施方式提供的质控品缓冲液制备得到的质控品能够保证检测的准确性。优选包含有1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300、1%Triton X-100的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液作为质控品缓冲液。
根据本发明的第三个方面,还提供了用于检测IgG4的组合物或用于检测IgG4的试剂盒在检测IgG4中的应用。
基于本发明提供的组合物和试剂盒的有益效果,应用该组合物或试剂盒,能够实现快速、准确、灵敏地对IgG4进行检测。
优选地,所述检测的样本包括血清、血浆或全血。
根据本发明的第四个方面,基于本发明提供的用于检测IgG4的组合物,本发明还提供了一种非诊断目的用于检测IgG4的检测方法。因此,本发明提供的用于检测IgG4的检测方法具有本发明提供的用于检测IgG4的组合物的全部有益效果,在此不再赘述。
一种用于非诊断目的检测IgG4的检测方法,步骤如下:
加样:将样本放入样本稀释液a中;
稀释:将一定量的经加样步骤产生的含有样本的样本稀释液a通过含有可将蛋白水解酶浓度稀释至不影响所述Fc片段与第一抗体和第二抗体结合的缓冲液的样本稀释液b稀释;
其中所述第一抗体为对样本中IgG4具有特异性的IgG4抗体;所述第二抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的抗体;
孵育:先将所述样本与所述第一抗体包被的纳米磁微粒溶液孵育;
清洗:清洗纳米磁微粒;
再孵育:再将包括偶联有酶的所述第二抗体的酶结合液加入清洗后的纳米磁微粒溶液中孵育;
再清洗:清洗纳米磁微粒;
发光:最后向清洗后的纳米磁微粒溶液中加入酶促发光底物,测定发光值,发光值可定量分析IgG4含量。
优选地,在稀释步骤完成时,所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,其中满足:M≤0.5%N。
在一些具体的实施方式中,当使用本发明提供的试剂盒配套全自动化学发光仪对待测样本进行检测时,所以测试流程均为自动化操作,自动化操作具体如下:
加样:仪器吸取20μl样本、180μl样本稀释液a,混匀稀释成10×样本稀释中间液,37℃孵育10min。
稀释:仪器吸取20μl 10×样本稀释中间液、180μl样本稀释液b混匀稀释成100×样本稀释中间液。仪器吸取20μl 100×样本稀释中间液、380μl样本稀释液b混匀稀释成2000×样本稀释液。
孵育:仪器吸取20μl 2000×样本稀释液加入250μl纳米磁微粒溶液中,震荡混匀,37℃孵育10min。
清洗:仪器施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,加入500μl清洗液,震荡重悬,再次施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,重复此操作三次。
再孵育:吸取250μl酶结合液加入磁珠,震荡混匀,37℃孵育10min。
再清洗:仪器施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,加入500μl仪器配套清洗液,震荡重悬,再次施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,重复此操作三次。
发光:加入200μl发光底物,充分混匀,测定发光值(RLU)。
样本中的IgG4抗原被样本稀释液中的蛋白水解酶水解成Fc片段和Fab或者F(ab’)2片段,通过稀释将木瓜蛋白酶浓度稀释至0.0009U/ml,水解形成的Fc片段被包被在磁珠上的IgG4特异抗体捕获,剩余的Fab或者F(ab’)2被清洗分离,偶联有碱性磷酸酶的鼠抗人IgG4单克隆抗体与结合在磁珠上的Fc片段再次结合,形成双抗体夹抗原夹心的复合物,在自Fc片段与磁珠上的对样本中IgG4抗原具有特异性的IgG4特异抗体和偶联有碱性磷酸酶的对样本中IgG4抗原具有特异性的鼠抗人IgG4单克隆抗体形成双抗体夹抗原夹心的复合物期间,因木瓜蛋白酶浓度仅为0.005U/ml以下,因此不会影响Fc片段与磁珠上的IgG4特异抗体和偶联有碱性磷酸酶的鼠抗人IgG4单克隆抗体的结合。加入底物时,复合物上的AP酶催化底物形成光信号,光信号越强则IgG4浓度越高。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,包括:对样本中IgG4抗原具有特异性的鼠抗人IgG4单克隆抗体,IgG4抗体包被的甲苯磺酰基磁珠溶液,抗体包被量为10ug(抗体)/mg(磁珠),甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.3mg/ml;偶联有碱性磷酸酶的对样本中IgG4抗原具有特异性的鼠抗人IgG4单克隆抗体的溶液,抗体的浓度为0.5μg/ml;含有1U/ml木瓜蛋白酶、1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的样本稀释液a;含有1%牛血清白蛋白、0.1%Procline-300的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的样本稀释液b和AMPPD,样本中IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。
仪器吸取20μl样本、180μl样本稀释液a,混匀稀释成10×样本稀释中间液,37℃孵育10min。
仪器吸取20μl 10×样本稀释中间液、180μl样本稀释液b混匀稀释成100×样本稀释中间液。
仪器吸取20μl 100×样本稀释中间液、380μl样本稀释液b混匀稀释成2000×样本稀释液。
仪器吸取20μl 2000×样本稀释液加入250μl纳米磁微粒溶液中,震荡混匀,37℃孵育10min。
仪器施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,加入500μl清洗液,震荡重悬,再次施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,重复此操作三次。
吸取250μl酶结合液加入磁珠,震荡混匀,37℃孵育10min。
仪器施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,加入500μl仪器配套清洗液,震荡重悬,再次施加磁力,使磁微粒沉降聚集,去除上清,重复此操作三次。
加入200μl发光底物,充分混匀,测定发光值(RLU)。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml时,测发光值分别为12252、174474、324726、643996、1341950、2062724、4008765。
实施例2
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.05mg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml时,测发光值分别为1048、8873、22208、46183、99466、156353、187676。
实施例3
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.1mg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为6096、85746、164416、318366、678933、1012706、2108798。
实施例4
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.6mg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为24448、347072、645236、1277384、2705824、4041004、7841099。
实施例5
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.8mg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为24448、347072、645236、1277384、2705824、4041004、7841099。
实施例6
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度为0.05μg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为1226、17497、33404、65023、135674、202148、404456。
实施例7
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度为0.1μg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为6130、87489、167024、325115、678372、1010740、2230098。
实施例8
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度为1μg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为24504、348948、649452、1287992、2683900、4125448、8256782。
实施例9
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,对样本中IgG4抗原具有特异性的抗体的浓度为2μg/ml。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为49008、697896、1298904、2575984、5367800、11150896、11144567。
实施例10
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,无蛋白水解酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为11998、12878、25980、56745、111342、132245、127896。
实施例11
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,蛋白水解酶为1U/ml的胃蛋白酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为15314、209004、350548、680976、1394495、1707907、2520343。
实施例12
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,蛋白水解酶为0.25U/ml的木瓜蛋白酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为12994、12855、24956、58777、120001、153345、160098。
实施例13
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,蛋白水解酶为0.5U/ml的木瓜蛋白酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为12505、169683、365138、680976、1402799、2068002、2533245。
实施例14
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,蛋白水解酶为2U/ml的木瓜蛋白酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为16960、206447、349431、680976、1418878、2111227、4011860。
实施例15
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,蛋白水解酶为4U/ml的木瓜蛋白酶。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为18696、180627、345186、680976、1418878、2068161、4033020。
实施例16
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,稀释倍数为50×,即样本中的蛋白水解酶浓度稀释至所述样本稀释液a中蛋白水解酶浓度的2%。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为12008、12885、24888、58786、120112、150097、160321。
实施例17
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,稀释倍数为100×,即样本中的蛋白水解酶浓度稀释至所述样本稀释液a中蛋白水解酶浓度的1%。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为13111、170683、365432、683336、1454321、2090002、2234441。
实施例18
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,稀释倍数为200×,即样本中的蛋白水解酶浓度稀释至所述样本稀释液a中蛋白水解酶浓度的0.5%。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为19544、185693、345864、680976、1397661、2106245、4009446。
实施例19
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,稀释倍数为400×,即样本中的蛋白水解酶浓度稀释至所述样本稀释液a中蛋白水解酶浓度的0.25%。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为16771、212446、355234、683211、1457009、2111227、4011345。
实施例20
本实施例提供了一种用于检测IgG4的组合物,与实施例1的不同之处在于,使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,稀释倍数为800×,即样本中的蛋白水解酶浓度稀释至所述样本稀释液a中蛋白水解酶浓度的0.125%。
当IgG4浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml(单位)时,测发光值分别为17547、214814、368389、680976、1406433、2101126、4015170。
数据分析
1、单克隆抗体包被的甲苯磺酰基磁珠浓度选择
甲苯磺酰基磁珠浓度为0.05mg/ml时,校准品反应性弱,线性不够宽,当甲苯磺酰基磁珠浓度为0.8mg/ml时,S4-S5到达反应平台区,信号趋势变缓,高值线性不好,当甲苯磺酰基磁珠浓度为0.1-0.6mg/ml时,线性较好。
表1单克隆抗体包被的甲苯磺酰基磁珠浓度选择
2、酶结合液浓度选择
当IgG4-AP浓度为0.05ug/ml时,校准品反应性弱,线性不够宽,当IgG4-AP浓度为2ug/ml时,S4-S5到达反应平台区,信号趋势变缓,高值线性不好,当甲苯磺酰基磁珠浓度为0.1-1ug/ml时,线性较好。
表2酶结合液浓度选择
3、最低检测限
检测样本稀释液,浓度0mg/ml,重复检测20次计算发光值(RLU)的平均值(M)和标准差(SD),并计算出M+2SD值,根据S0、S1的发光值进行两点回归得出一次方程,将M+2SD值代入方程Y=0.0000168101*X-0.1022444560,求出的浓度值即为最低检测限。
表3校准品S0、S1测值
表4样本稀释液测值
参见表3,测出S0、S1发光值平均值,根据发光值拟合校准曲线(图1)和回算方程,参见表4测试样本稀释液b0次,求出平均值及X+2SD,代入回算方程Y=0.0000168101*X-0.1022444560,可得灵敏度=0.003mg/ml。
4、精密度
测试高(浓度12.00mg/ml)、中(浓度4.20mg/ml)、低样本(浓度1.47mg/ml)各10次,每次重复测2次,计算平均值,将测得的发光值代入校准曲线回算浓度,计算发光值和回算浓度的变异系数,变异系数均<3%,见表5。
表5
5、IgG蛋白亚型干扰
向样本稀释液,浓度0mg/ml,中分别加入5mg/ml的天然提取人IgG1、IgG2、IgG3,用试剂检测发光值并计算浓度。见表6,试剂与IgG1、IgG2、IgG3无交叉反应,检测结果为阴性。
表6
IgG1 | IgG2 | IgG3 | |
发光值 | 7010 | 6890 | 7254 |
回算浓度(mg/ml) | 0.04 | 0.03 | 0.04 |
6、线性范围
取一支IgG4浓度为20mg/ml左右的样本,依次对半稀释至理论浓度接近检测下限,使用本检测系统检测稀释样本,将回算浓度与理论浓度做线性回归,当斜率位于0.85-1.15之间,R2>0.99时,即符合线性要求,请说明线性范围。如图2所示:斜率=0.9952,R2=0.9995。本实验过程中,当样品浓度为20mg/ml时,测得的发光值已接近所用仪器发光值的最大值,因此选取样品浓度20mg/ml为检测线性范围上限。
表7
7.蛋白水解酶种类筛选
使用无任何蛋白水解酶的样本稀释液和添加了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的样本处理样本后进行检测,无蛋白水解酶时,浓度低于0.5mg/ml时无检测信号,浓度高于5mg/ml时,信号已处于平台期,此时由于过高浓度的IgG4抗原,相对较大的空间结构在磁珠表面形成了空间位阻,阻止了磁珠表面剩余抗体的进一步反应。当样本稀释液中添加了木瓜蛋白酶或胃蛋白酶时,IgG4抗原被水解成分子量和空间更小的Fc和其他片段,当样本浓度低时,更小的片段是抗体结合位点更好的暴露,有利于低浓度的信号检出,高浓度时,更小的分子量和空间结构能有效避免空间位阻效应,使磁珠能捕获更多的Fc片段。
因木瓜蛋白酶的酶活性在中性环境中较好,胃蛋白酶的酶活性在酸性环境中较好,而组合物中体系pH为7.2-7.5,为保证蛋白水解酶对IgG4蛋白的水解效率,由实验数据可得,当样品浓度为10-20mg/ml时,使用胃蛋白酶为蛋白水解酶时测得的数据有误,本发明优选木瓜蛋白酶。
表8
校准品 | 浓度 | 无蛋白水解酶 | 木瓜蛋白酶1U/ml | 胃蛋白酶1U/ml |
S0 | 0 | 11998 | 12252 | 15314 |
S1 | 0.5 | 12878 | 172345 | 209004 |
S2 | 1 | 25980 | 331234 | 350548 |
S3 | 2 | 56745 | 680976 | 680976 |
S4 | 5 | 111342 | 1387789 | 1394495 |
S5 | 10 | 132245 | 2067678 | 1707907 |
S6 | 20 | 127896 | 4005567 | 2520343 |
8.木瓜蛋白酶浓度筛选
使用不同浓度的木瓜蛋白酶水解样本,当使用浓度为0.25U/ml时,浓度过低无法有效水解样本中的IgG4蛋白,所以低值无法检出,高值梯度较差,当使用浓度为0.5U/ml时,木瓜蛋白酶能有效水解低值样本中的IgG4蛋白,但高浓度的样本无法在短时间内全部水解,所以低值可以检出,但高值梯度较差,当使用浓度为1U/ml时,木瓜蛋白酶能有效水解低值与高值样本中的IgG4蛋白,所以低值可以检出,但高值梯度较好,当使用浓度为2U/ml、4U/ml时,效果与1U/ml时一致,但高浓度的木瓜蛋白酶对下一步的稀释有影响,故选择能有效水解样本中IgG4的最低木瓜蛋白酶浓度即可。
表9
9.蛋白水解酶稀释倍数筛选
使用样本稀释液b对水解处理后的样本稀释液a中间液进行稀释,当稀释倍数小于200×,即稀释后样本稀释液中木瓜蛋白酶浓度大于样本稀释液a浓度的0.5%时,残留的木瓜蛋白酶会对磁珠及酶结合物上的抗体水解,影响低值及高值样本的检测,当大于200×稀释时,即稀释后样本稀释液中木瓜蛋白酶浓度小于样本稀释液a浓度的0.5%时,残留的木瓜蛋白酶几乎可以忽略不计对检测体系没影响。
表10
通过与药监局可查的胶乳增强比浊和酶联免疫两种检测试剂的备案参数对比,本发明提出的检测试剂对IgG4抗原的检测结果在检测范围、最低检测限、精密度、特异性参数上均较胶乳增强比浊和酶联免疫两种检测试剂有较大提升。
表11
胶乳比浊 | 酶联免疫 | 化学发光(本发明) | |
检测范围 | 0.052-3.3mg/ml | 0.05-5mg/ml | 0.02-20mg/ml |
最低检测限 | 0.052mg/ml | 0.05mg/ml | 0.003mg/ml |
精密度 | <5% | <10% | <3% |
特异性(IgG1IgG2IgG3)干扰 | 有 | 有 | 无 |
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种用于检测样本中IgG4的组合物,其特征在于,所述组合物包括:对样本中IgG4抗原具有特异性的鼠抗人IgG4单克隆抗体,鼠抗人IgG4单克隆抗体包被的甲苯磺酰基磁珠溶液,抗体包被量为10ug抗体/mg磁珠,甲苯磺酰基磁珠的浓度为0.1-0.6 mg/ml;偶联有碱性磷酸酶的对样本中IgG4抗原具有特异性的鼠抗人IgG4单克隆抗体的溶液,抗体的浓度为0.1-1μg/ml;含有1U/ml木瓜蛋白酶、1% 牛血清白蛋白、0.1% Procline-300的0.01 MpH7.4磷酸盐缓冲液的样本稀释液a;含有1% 牛血清白蛋白、0.1% Procline-300的0.01 MpH7.4磷酸盐缓冲液的样本稀释液b和AMPPD;
所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,其中满足:M≤0.5%N。
2.一种用于检测IgG4的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测IgG4的组合物。
3.一种非诊断目的用于检测IgG4的检测方法,其特征在于:
所述检测方法使用权利要求1所述的组合物或权利要求2所述试剂盒,所述检测方法包括,
加样:将样本放入样本稀释液a中;
稀释:将一定量的经加样步骤产生的含有样本的样本稀释液a通过含有可将蛋白水解酶浓度稀释至不影响Fc片段与第一抗体和第二抗体结合的缓冲液的样本稀释液b稀释;
其中所述第一抗体为对样本中IgG4具有特异性的IgG4抗体;所述第二抗体为对所述样本中IgG4具有特异性的抗体;
孵育:将所述样本与所述第一抗体包被的纳米磁微粒溶液孵育;
清洗:清洗纳米磁微粒;
再孵育:再将包括偶联有酶的所述第二抗体的酶结合液加入清洗后的纳米磁微粒溶液中孵育;
再清洗:清洗纳米磁微粒;
发光:最后向清洗后的纳米磁微粒溶液中加入酶促发光底物,测定发光值,发光值可定量分析IgG4含量;
在稀释步骤完成时,所述样本稀释液b完全稀释所述样本稀释液a后的蛋白水解酶浓度为M,所述样本稀释液a中蛋白水解酶稀释前的浓度为N,其中满足:M≤0.5%N。
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