JPH1026621A - イムノアッセイ法 - Google Patents

イムノアッセイ法

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JPH1026621A
JPH1026621A JP8183279A JP18327996A JPH1026621A JP H1026621 A JPH1026621 A JP H1026621A JP 8183279 A JP8183279 A JP 8183279A JP 18327996 A JP18327996 A JP 18327996A JP H1026621 A JPH1026621 A JP H1026621A
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immobilized
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JP8183279A
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Kazunori Saito
和典 齋藤
Mitsuhisa Manabe
満久 真鍋
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Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
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Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 測定対象抗原の一部を認識する抗体を不
溶性担体粒子に担持させてなる固定化抗体と被検試料中
の抗原とを反応させ、次いで当該固定化抗体とは抗原に
対する認識部位を異にする遊離抗体を反応させることに
より、又は測定対象抗原の一部を認識する遊離抗体と被
検試料中の抗原とを反応させ、次いで当該遊離抗体とは
認識部位を異にする抗体を不溶性担体粒子に担持させて
なる固定化抗体を反応させることにより生ずる凝集の変
化の程度を光学的に測定するイムノアッセイ法。 【効果】 本発明のイムノアッセイ法は、特異性が高
く、しかも簡便かつ低コストであり、また使用する抗体
は、いずれか一方が測定対象抗原に対する高い特異性を
有していれば良く、他方は厳密な特異性を必要とせず、
若干の交差反応性を有していても差し支えないという利
点を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、被検試料中の抗原
の測定法に関し、更に詳細には、不溶性担体を用いた二
段階反応による凝集生成を利用した、特異性が高く、し
かも簡便かつ低コストのイムノアッセイ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、抗原抗体反応に基づくイムノアッ
セイ法には、凝集反応を利用するものや、検出用の酵素
で標識した抗体を利用するものなどが知られている。こ
れらのイムノアッセイ法においては、特異的な抗原抗体
反応により生ずる免疫複合体の量を目視あるいは光学的
な変化として測定している。特に、不溶性担体に抗体を
担持させた不溶化粒子（以下、「固定化抗体」という）
とそれに対する抗原との抗原抗体反応に基づく凝集反応
あるいは凝集阻止反応を利用した被検試料中の抗原の測
定法（以下、「凝集法」という）は、測定の自動化が可
能なことから、自動分析装置に適用されて広く普及して
いる。
【０００３】従来行われている凝集法の多くは、不溶性
担体としてラテックス粒子を使用し、抗体として、(1)
ポリクローナル抗体、(2)１種類のモノクローナル抗
体、又は(3)２種類のモノクローナル抗体を使用した固
定化抗体を、被検試料中の目的抗原と反応させて免疫凝
集体を形成させ、その凝集の程度を目視あるいは光学的
に測定するものが知られている。また、(4)被検試料中
の目的抗原を不溶性担体に吸着もしくは結合させた後、
該抗原に対する抗体を反応させて不溶性担体を選択的に
凝集させる方法（特開平7-35752号公報）も知られてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来の方法には以下のような欠点がある。すなわち、(1)
の方法は、現在最も汎用されている方法ではあるが、測
定系の特異性が使用するポリクローナル抗体の特異性に
より左右されるため、抗体作製に用いる抗原が含有する
極くわずかな夾雑成分による夾雑抗体や、目的抗原と構
造が類似する他の成分と交差反応するなどの問題があ
る。(2)の方法は、１種のモノクローナル抗体しか使用
しないため、抗原に抗原抗体反応に関与する部分（以
下、「認識部位」という）が複数存在する特殊な抗原に
しか利用できない。(3)の方法は、２種のモノクローナ
ル抗体の使用により、認識部位の数を抗体の数に相当す
る数にまで増やすことで免疫凝集体を形成させるもので
あるが、同じ抗原に対するモノクローナル抗体ならばど
の２種の組合せでも使用できるわけではなく、目的に応
じて特殊な２つの組合せを選択しなければならないとい
う問題がある。更に(4)の方法には、不溶性担体が自動
分析装置の反応容器に非特異的に吸着して、反応容器を
汚染するという問題がある。
【０００５】また、固定化抗体と遊離抗体を使用する方
法（特公平3-31227号公報）もあるが、この方法は固定
化抗体と測定対象が反応して光学的に測定可能な免疫凝
集を形成する反応系において、測定対象に対する双方の
抗体（遊離抗体と固定化抗体）を競合させることにより
免疫凝集の発生を抑制して測定範囲の拡大を行うもの
で、免疫凝集を発生、増大させるために２つの異なる形
態の抗体を使用する本発明とはその原理、目的共に全く
異なるものである。
【０００６】本発明は以上のような問題点に鑑みてなさ
れたものであり、その目的は、測定対象に対する固定化
抗体の凝集を利用した特異性の高いイムノアッセイ法を
提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を重ねた結果、測定対象抗原の異な
る部位を認識する２種の抗体を用い、一方を固定化、他
方を遊離の状態のままとし、順次反応させることによ
り、特異性が高く、しかも簡便かつ低コストなイムノア
ッセイが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち本発明は、測定対象抗原の一部を
認識する抗体を不溶性担体粒子に担持させてなる固定化
抗体と被検試料中の抗原とを反応させ、次いで当該固定
化抗体とは抗原に対する認識部位を異にする遊離抗体を
反応させることにより生ずる凝集の変化の程度を光学的
に測定することを特徴とするイムノアッセイ法に係る第
１の発明、並びに、測定対象抗原の一部を認識する遊離
抗体と被検試料中の抗原とを反応させ、次いで当該遊離
抗体とは認識部位を異にする抗体を不溶性担体粒子に担
持させてなる固定化抗体を反応させることにより生ずる
凝集の変化の程度を光学的に測定することを特徴とする
イムノアッセイ法に係る第２の発明を提供するものであ
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において用いられる不溶性
担体粒子としては、従来不溶性担体を用いて抗原又は抗
体を測定する場合に使用される公知の物質はいずれも制
限なく使用することができ、例えば有機高分子物質、無
機物質、細胞膜、血球、微生物等が挙げられる。有機高
分子物質としては、例えばアクリル酸重合体、スチレン
重合体、メタクリル酸重合体等の微粉末を均一に懸濁さ
せたラテックス粒子が好ましい。無機物質としては、シ
リカ、アルミナ等の微粒子が挙げられる。また不溶性担
体粒子の粒径も特に限定されるものではなく、一般的に
は平均粒子径0.05〜１μｍ、特に0.05〜0.5μｍのもの
が好ましい。更に、かかる不溶性担体に抗体を固定化す
る方法も特に限定されず、物理吸着、共有結合、免疫的
結合、磁気的結合等による方法が挙げられる。
【００１０】固定化抗体を懸濁する液としては、特に限
定されないが、一般には、リン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液が使用さ
れる。反応におけるpHは５〜10、特に６〜９が好まし
い。最終的に調製される試薬中における固定化抗体の濃
度は特に限定されないが、懸濁液中0.1〜10mg/mlが好ま
しい。
【００１１】本発明において使用される抗体の形態は、
固定化抗体と遊離抗体の２形態であるが、これら抗体は
測定対象とする抗原上の認識部位を異にするものであれ
ば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいず
れでもよい。なお、本発明で使用する抗体は、固定化抗
体及び遊離抗体のいずれか一方が、測定対象に対する高
い特異性を有していれば、他方の抗体は厳密な特異性を
必要とせず、若干の交差反応性を有しているものでもよ
い。また、抗体は前記条件を満たせば、単独で用いて
も、また複数種混合して用いてもよい。
【００１２】本発明における測定対象抗原としては特に
限定されないが、ホルモン（インシュリン、HCG-β、成
長ホルモン、TSH、LH、FSH、プロラクチン、サイロキシ
ン、トリヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴン、
ソマトスタチン等）、酵素（エラスターゼ、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノ
ラーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、血清タンパク
質（IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、RF、SAA、SLO、マクロ
グロブリン、TBG、糖タンパク質、糖脂質、アポAI、AI
I、B、CI、CII、CIII、D、E、Fタンパク質等）、凝固・
線溶因子（TAT、PIC、ATIII、APL等）、HbA1C、腫瘍関
連抗原（CEA、α-フェトプロテイン、フェリチン、PO
A、CA19-9、CA125等）、DNA結合性タンパク質因子、サ
イトカイン（インターフェロン、インターロイキン１、
インターロイキン２等）、種々の細菌、ウイルス、原虫
（真菌、連鎖球菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、
エイズウイルス、トキソプラズマ原虫、マラリア原虫、
赤痢アメーバー等）などが挙げられる。
【００１３】本発明のイムノアッセイ法による被検試料
中の抗原の測定は、例えば次のようにして行われる。す
なわち、抗原と固定化抗体とを反応させ、次いで遊離抗
体を反応させる二段階免疫反応により、又は抗原と遊離
抗体とを反応させ、次いで固定化抗体を反応させる二段
階免疫反応により、凝集を形成させる。そして、その凝
集量に依存した透過光の減少を、分光光度計又は自動分
析機により測定し、予め作成した検量線との照合等によ
り、試料中の抗原の量を測定することができる。
【００１４】本発明における反応の原理は、固定化抗体
又は遊離抗体と目的抗原を反応させて当該抗体で該抗原
を捕捉した後、捕捉された該抗原と結合できる遊離抗体
又は固定化抗体を介して検出可能な凝集体を形成させる
という二段階の反応であり、目的抗原を介して一段階で
固定化抗体同士を凝集させ、光学的に検出可能な凝集体
を形成させる従来の凝集イムノアッセイ法とはその反応
のメカニズムが異なる。また、ポリエチレングリコール
6000等の免疫反応促進成分の存在下で抗原抗体反応を行
い、免疫凝集の程度を光学的に測定する免疫比濁法と
は、免疫反応促進成分を必要としない点、固定化抗体を
使用する点で大きく異なる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】実施例１ アポ蛋白Ｂの測定： (1)抗アポ蛋白Ｂ抗体固定化粒子懸濁液の調製 抗アポ蛋白Ｂモノクローナル抗体を1.4mg/mlの濃度で0.
05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和した液５mlに、平均
粒径0.2μｍのポリスチレン系ラテックス（積水化学工
業社製）２％懸濁液５mlを加え、摂氏４度にて２時間攪
拌した。次に２％牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシ
ン緩衝液（pH8.4）を加え、摂氏４度で一晩攪拌し、抗
アポ蛋白Ｂ抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
【００１７】(2)抗アポ蛋白Ｂ遊離抗体液の調製 抗アポ蛋白Ｂポリクローナル抗体を0.2mg/mlの濃度で0.
05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和し、抗アポ蛋白Ｂ遊
離抗体液を調製した。
【００１８】(3)アポ蛋白Ｂの測定 抗アポ蛋白Ｂ抗体固定化粒子懸濁液200μｌに、アポ蛋
白Ｂを含有する試料液５μｌを加えて摂氏37度で５分間
加温後、抗アポ蛋白Ｂ遊離抗体液200μｌを加えて攪拌
後１分から５分までの波長600nmにおける吸光度変化量
を測定した。得られた吸光度とアポ蛋白Ｂ濃度の関係を
図１に示した。
【００１９】比較例1-1 抗アポ蛋白Ｂ抗体固定化粒子懸濁液に代えて0.05Mグリ
シン緩衝液200μｌを使用する以外は実施例１(3)と同様
に操作してアポ蛋白Ｂの測定を実施した。得られた吸光
度変化量を図１に示した。
【００２０】比較例1-2 抗アポ蛋白Ｂ遊離抗体液に代えて0.05Mグリシン緩衝液2
00μｌを使用する以外は実施例１(3)と同様に操作して
アポ蛋白Ｂの測定を実施した。得られた吸光度変化量を
図１に示した。
【００２１】図１より、実施例１ではアポ蛋白Ｂ濃度に
依存した吸光度変化を示すのに対して、比較例1-1及び1
-2共に、吸光度の変化は認められない。
【００２２】実施例２ 血清アミロイドＡ蛋白（SAA）
の測定： (1)抗アミロイドＡ蛋白抗体固定化粒子懸濁液の調製 抗アミロイドＡ蛋白ポリクローナル抗体を2.8mg/mlの濃
度で0.05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和した液５ml
に、平均粒径0.2μｍのポリスチレン系ラテックス（積
水化学工業社製）２％懸濁液５mlを加え、摂氏４度にて
２時間攪拌した。次に２％牛血清アルブミンを含む0.05
Mグリシン緩衝液（pH8.4）を加え、摂氏４度で一晩攪拌
し、抗アミロイドＡ蛋白抗体固定化粒子懸濁液を調製し
た。
【００２３】(2)抗血清アミロイドＡ蛋白遊離抗体液の
調製 血清アミロイドＡ蛋白のＣ末側の部分をウサギに免疫し
て作製した抗血清アミロイドＡ蛋白Ｃ末側特異ポリクロ
ーナル抗体を0.5mg/mlの濃度で0.05Mグリシン緩衝液（p
H8.4）に混和し、抗血清アミロイドＡ蛋白遊離抗体液を
調製した。
【００２４】(3)血清アミロイドＡ蛋白の測定 抗アミロイドＡ蛋白抗体固定化粒子懸濁液240μｌに、
血清アミロイドＡ蛋白を含有する試料液４μｌを加えて
摂氏37度で５分間加温後、抗血清アミロイドＡ蛋白遊離
抗体液80μｌを加えて攪拌後１分から５分までの波長60
0nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度
と血清アミロイドＡ蛋白濃度の関係を図２に示した。
【００２５】比較例2-1 抗アミロイドＡ蛋白抗体固定化粒子懸濁液に代えて0.05
Mグリシン緩衝液240μｌを使用する以外は実施例２(3)
と同様に操作して血清アミロイドＡ蛋白の測定を実施し
た。得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００２６】比較例2-2 抗血清アミロイドＡ蛋白遊離抗体液に代えて0.05Mグリ
シン緩衝液80μｌを使用する以外は実施例２(3)と同様
に操作して血清アミロイドＡ蛋白の測定を実施した。得
られた吸光度変化量を図２に示した。
【００２７】図２より、実施例２では血清アミロイドＡ
蛋白濃度に依存した吸光度変化を示すのに対して、比較
例2-1及び2-2共に、吸光度の変化は認められない。
【００２８】実施例３ トロンビン-アンチトロンビンI
II複合体（TAT）の測定： (1)抗トロンビン抗体固定化粒子懸濁液の調製 抗トロンビンモノクローナル抗体を1.4mg/mlの濃度で0.
05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和した液５mlに、平均
粒径0.2μｍのポリスチレン系ラテックス（積水化学工
業社製）２％懸濁液５mlを加え、摂氏４度にて２時間攪
拌した。次に２％牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシ
ン緩衝液（pH8.4）を加え、摂氏４度で一晩攪拌し、抗
トロンビン抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
【００２９】(2)抗アンチトロンビンIII遊離抗体液の調
製 アンチトロンビンIIIモノクローナル抗体を２mg/mlの濃
度で0.05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和し、抗アンチ
トロンビンIII遊離抗体液を調製した。
【００３０】(3)トロンビン-アンチトロンビンIII複合
体の測定 抗トロンビン抗体固定化粒子懸濁液200μｌに、トロン
ビン-アンチトロンビンIII複合体を含有する試料液20μ
ｌを加えて摂氏37度で５分間加温後、抗アンチトロンビ
ンIII遊離抗体液100μｌを加えて攪拌後１分から５分ま
での波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得ら
れた吸光度とトロンビン-アンチトロンビンIII複合体濃
度の関係を図３に示した。
【００３１】比較例3-1 抗トロンビン抗体固定化粒子懸濁液に代えて0.05Mグリ
シン緩衝液200μｌを使用する以外は実施例３(3)と同様
に操作してトロンビン-アンチトロンビンIII複合体の測
定を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示した。
【００３２】比較例3-2 抗アンチトロンビンIII遊離抗体液に代えて0.05Mグリシ
ン緩衝液100μｌを使用する以外は実施例３(3)と同様に
操作してトロンビン-アンチトロンビンIII複合体の測定
を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示した。
【００３３】図３より、実施例３ではトロンビン-アン
チトロンビンIII複合体濃度に依存した吸光度変化を示
すのに対して、比較例3-1及び3-2共に、吸光度の変化は
認められない。
【００３４】実施例４ トロンビン-アンチトロンビンI
II複合体（TAT）の測定： (1)抗トロンビン抗体固定化粒子懸濁液の調製 抗トロンビンモノクローナル抗体を1.4mg/mlの濃度で0.
05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和した液５mlに、平均
粒径0.2μｍのポリスチレン系ラテックス（積水化学工
業社製）２％懸濁液５mlを加え、摂氏４度にて２時間攪
拌した。次に２％牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシ
ン緩衝液（pH8.4）を加え、摂氏４度で一晩攪拌し、抗
トロンビン抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
【００３５】(2)抗アンチトロンビンIII遊離抗体液の調
製 アンチトロンビンIIIモノクローナル抗体を２mg/mlの濃
度で0.05Mグリシン緩衝液（pH8.4）に混和し、抗アンチ
トロンビンIII遊離抗体液を調製した。
【００３６】(3)トロンビン-アンチトロンビンIII複合
体の測定 抗アンチトロンビンIII遊離抗体液200μｌに、トロンビ
ン-アンチトロンビンIII複合体を含有する試料液20μｌ
を加えて摂氏37度で５分間加温後、抗トロンビン抗体固
定化粒子懸濁液100μｌを加えて攪拌後１分から５分ま
での波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得ら
れた吸光度とトロンビン-アンチトロンビンIII複合体濃
度の関係を図４に示した。
【００３７】比較例4-1 抗アンチトロンビンIII遊離抗体液に代えて0.05Mグリシ
ン緩衝液200μｌを使用する以外は実施例４(3)と同様に
操作してトロンビン-アンチトロンビンIII複合体の測定
を実施した。得られた吸光度変化量を図４に示した。
【００３８】比較例4-2 抗トロンビン抗体固定化粒子懸濁液に代えて0.05Mグリ
シン緩衝液100μｌを使用する以外は実施例４(3)と同様
に操作してトロンビン-アンチトロンビンIII複合体の測
定を実施した。得られた吸光度変化量を図４に示した。
【００３９】図４より、実施例４ではトロンビン-アン
チトロンビンIII複合体濃度に依存した吸光度変化を示
すのに対して、比較例4-1及び4-2共に、吸光度の変化は
認められない。
【００４０】
【発明の効果】本発明のイムノアッセイ法は、特異性が
高く、しかも簡便かつ低コストであり、また使用する抗
体は、いずれか一方が測定対象抗原に対する高い特異性
を有していれば良く、他方は厳密な特異性を必要とせ
ず、若干の交差反応性を有していても差し支えないとい
う利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法によりアポ蛋白Ｂを測定し
た場合の吸光度とアポ蛋白Ｂ濃度の関係を示す図である
【図２】図２は、本発明方法により血清アミロイドＡ蛋
白（SAA）を測定した場合の吸光度とSAA濃度の関係を示
す図である
【図３】図３は、本発明方法によりトロンビン-アンチ
トロンビンIII複合体（TAT）を測定した場合の吸光度と
TAT濃度の関係を示す図である
【図４】図４は、本発明方法によりトロンビン-アンチ
トロンビンIII複合体（TAT）を測定した場合の吸光度と
TAT濃度の関係を示す図である

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 測定対象抗原の一部を認識する抗体を不
    溶性担体粒子に担持させてなる固定化抗体と被検試料中
    の抗原とを反応させ、次いで当該固定化抗体とは抗原に
    対する認識部位を異にする遊離抗体を反応させることに
    より生ずる凝集の変化の程度を光学的に測定することを
    特徴とするイムノアッセイ法。
  2. 【請求項２】 測定対象抗原の一部を認識する遊離抗体
    と被検試料中の抗原とを反応させ、次いで当該遊離抗体
    とは認識部位を異にする抗体を不溶性担体粒子に担持さ
    せてなる固定化抗体を反応させることにより生ずる凝集
    の変化の程度を光学的に測定することを特徴とするイム
    ノアッセイ法。
JP8183279A 1996-07-12 1996-07-12 イムノアッセイ法 Pending JPH1026621A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8183279A JPH1026621A (ja) 1996-07-12 1996-07-12 イムノアッセイ法
US08/893,759 US6835543B2 (en) 1996-07-12 1997-07-11 Step agglutination immunoassay
EP97111863A EP0818680B1 (en) 1996-07-12 1997-07-11 Agglutination immunoassay
DE69731999T DE69731999T2 (de) 1996-07-12 1997-07-11 Agglutinations-Immunotest

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8183279A JPH1026621A (ja) 1996-07-12 1996-07-12 イムノアッセイ法

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