JPWO2007114337A1 - 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の実施例は、認識するエピトープが異なる二種類の抗CDTマウスモノクローナル抗体を別々のラテックスにそれぞれ感作し、カラム等の検体の前処理が不要な汎用自動分析装置に適用可能な三試薬系のCDT測定試薬を構築して免疫測定を実施したものである。
CDT高値ヒト血清10mLに鉄飽和溶液(0.5M NaHCO3 250μLと10mM FeCl3 180μL)を加え、4℃で一時間インキュベート後、脱脂溶液(100g/l デキストラン硫酸 100μLと1M CaCl2 500μL)を加えた溶液の上清を回収した。さらにブルーセファロースカラム(Blue Sepharose 6 Fast Flow:商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いてアルブミンを除去し、次いで、Protein Gカラム(Hi Trap Protein G HP:商品名:GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いてグロブリンを除去することにより、トランスフェリン以外のタンパク質を除去した後、陰イオン交換カラム(MonoQ HR 5/5:商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いて未変性のジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含むCDT分画を調製した。
前記実施例1で得られたジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含む分画をCDT抗原として用いた。該抗原を濃度0.5mg/mLの抗原溶液に調製した。該抗原溶液500μLにアジュバンド500μL(TiterMax Gold:商品名、 TiterMax Co.製)を混和して乳化させ、5週齢のBALB/cマウスの皮下に免疫した。追加免疫として同様に調製したものを2週おきに3回繰り返した。その間免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から14日後に100μLの抗原溶液を腹腔内に投与し、3日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞(P3x63Ag8.653)とポリエチレングリコール4000(商品名、メルク社製)の存在下で2分間反応させることにより融合させた。融合後、HAT選択培地に懸濁して96ウェルの培養プレートに分注し、37℃のCO2 インキュベーターで培養し、ハイブリドーマを調製した。
前記実施例2で得られたハイブリドーマについて、本発明の抗体産生ハイブリドーマの選抜はサンドイッチELISAにより行った。96ウェルのマイクロプレートにPBSで10μg/mLに調製した抗マウス抗体を1ウェル当たりそれぞれ50μL加え、4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄し、0.5%BSA−PBSでブロッキングを行いスクリーニング用のプレートとした。ハイブリドーマの増殖の認められたウェルの培養上清50μLをウェルに加え、室温で1時間反応させた。引き続き洗浄液(0.05%Tween−PBS)で洗浄後、前記実施例1に記載したCDT分画を室温で1時間反応させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体50μLを加え、室温で1時間反応させた。なお、該アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体は、抗トランスフェリンポリクローナル抗体(株式会社シバヤギ製)にアルカリフォスファターゼ(ロシュ社製)を過ヨウ素酸法で結合させることにより調製したものを使用した。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をKind−King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度を測定し、該CDT分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマNCDT077及びNCDT503を選抜した。
前記実施例3で選抜した各ハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、樹立株を得た。得られたハイブリドーマNCDT077は特許生物寄託センター(IPOD)に寄託し(受託日:平成18年3月14日、受託番号:FERM P−20843)、ハイブリドーマNCDT503は特許生物寄託センター(IPOD)に寄託した(受託日:平成18年3月14日、受託番号:FERM P−20844)。
前記実施例4で得られた各樹立株について、CDT分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、モノクローナル抗体の大量産生のためマウス腹腔内にて増殖させた。こうして得られたマウス腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインGカラム(GE社製)を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。
前記実施例3で得られたハイブリドーマNCDT077の産生するモノクローナル抗CDT抗体のサブクラスはIsostrip(登録商標、ロシュ社製)を使用して、IgG2a(κ)と決定した。同様にしてハイブリドーマNCDT503の産生するモノクローナル抗CDT抗体のサブクラスは、IgG1(κ)と決定した。
前記実施例5で調製したモノクローナル抗体(ハイブリドーマNCDT077産生抗体及びハイブリドーマNCDT503産生抗体)についてサンドイッチELISAを用いて、前記実施例1で調製したトランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を行った。96ウェルのマイクロプレートにPBSで10μg/mLに調製した抗体を1ウェル当たりそれぞれ50μL加え、4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄し、0.5%BSA−PBSでブロッキングを行った。その後、前記実施例1で調製したトランスフェリンアイソフォーム50μLをウェルに加え、室温で1時間反応させた。引き続き洗浄液(0.05%Tween−PBS)で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体(前記実施例3で調製したものと同じ)50μLを加え、室温で1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をKind−King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さを比較することで抗体の特異性を確認した。その結果を下記の表1に示す。
前記実施例5で調製したモノクローナル抗体(ハイブリドーマNCDT077産生抗体及びハイブリドーマNCDT503産生抗体)を用い、サンドイッチELISA法で、健常者とアルコール中毒患者の血清合計32検体を測定した。対照試験としてバイオラッド社製の試薬を用いて測定した。該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の%CDTを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後のCDTの量を測定し、検体中のCDT濃度と%CDT(総トランスフェリンに対するCDTの割合)を算出した。
前記実施例5で調製した各モノクローナル抗体(ハイブリドーマNCDT077産生抗体及びハイブリドーマNCDT503産生抗体)の反応性を次のようにして調べた。下記のP1−P6に示す6種類のアミノ酸配列のペプチドをELISAプレートに結合させた後、10μg/mLに調製した抗体を1ウェル当たりそれぞれ50μL加え、室温で1時間反応させた。引き続き洗浄液(0.05%Tween−PBS)で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG抗体(Goat F(ab') Anti-Mouse Ig' s, Alkaline Phosphatase Conjugate AMI4405: 商品名、BIOSOURCE 社製)50μLを加え、室温で1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をKind−King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度を測定した。
P1 VLAENYNKSDNCE (配列番号1)
P2 QHLFGSNVTDCSG (配列番号2)
P3 VVARSMGGKEDLIWELL (配列番号3)
P4 IAKIMNGEADAMSL (配列番号4)
P5 YEKYLGEEYVKAV (配列番号5)
P6 SKLSMGSGLNLSEPN (配列番号6)
前記実施例5で調製したモノクローナル抗体(ハイブリドーマNCDT077産生抗体及びハイブリドーマNCDT503産生抗体)の抗原認識部位の違いを調べるために、各抗体を組み合わせたサンドイッチELISAにより確認した。最初に96ウェルのマイクロプレートにPBSで10μg/mLに調製した一方の抗体を1ウェル当たりそれぞれ50μL加え,4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄し、0.5%BSA−PBSでブロッキングを行った。その後、50倍に希釈したアルコール中毒者の血清50μLをウェルに加え,室温で1時間反応させた。引き続き洗浄液(0.05%Tween−PBS)で洗浄後、他方の抗体をビオチン標識したものを50μL加え、室温で1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン50μLを加え、室温で30分反応させ、洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をKind−King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで490nmのODを測定した。その結果を表4に示す。
粒径が0.13μmの10%ラテックス溶液100μLを1.5mL遠心チューブに分注し、感作緩衝液825μLを加えて希釈した後、10mg/mLに調整した抗CDTマウスモノクローナル抗体1(ハイブリドーマNCDT503産生抗体)を75μL添加して直ちに撹拌混合し、冷所で2時間転倒混和して感作を行った。感作の後ブロッキング緩衝液を100μL添加して2分間のソニケーションを行ってラテックスを分散させ、37℃で1時間反応させてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、遠心して上清の未反応成分を除去し、沈渣に保存緩衝液1mLを加えてソニケーションを行ってラテックスを分散させ、700nmの吸光度が0.8Absとなるように希釈してラテックス試薬1を調製した。同様の操作で抗CDTマウスモノクローナル抗体2(ハイブリドーマNCDT077産生抗体)を感作させたラテックス試薬2を調製した。
10mM TES pH7.5
150mM 塩化ナトリウム
0.095質量% アジ化ナトリウム
10mM TES pH7.5
10% ウシ血清アルブミン
0.095質量% アジ化ナトリウム
10mM Tris pH8.0
20質量% グリセロール
0.1質量% ウシ血清アルブミン
0.095質量% アジ化ナトリウム
[実施例12]:ラテックス試薬の反応性
測定には、第1試薬、第2試薬、第3試薬からなる試薬系による測定が可能な日立7170型自動分析装置を使用し、第1試薬として下記組成の緩衝液を用い、第2試薬、第3試薬として前記実施例11で調製したラテックス試薬1、2を下記のイ)ロ)ハ)の3種類の条件で使用して測定を行った。
10mM TES pH7.5
150mM 塩化ナトリウム
0.095% アジ化ナトリウム
ヒト血清からイオン交換カラムにより精製したCDT分画を生理食塩水で希釈した0、3、6、12および18mg/dLの溶液。
<測定条件>
イ)2種のラテックス試薬を混合して用いた場合
検体量 5μL
第1試薬 100μL
第2試薬 0μL
第3試薬 100μL ラテックス試薬1および2を等量混合したもの
測定波長 主波長570nm、副波長800nm
測光ポイント 19−34
検体量 5μL
第1試薬 100μL
第2試薬 50μL ラテックス試薬1
第3試薬 50μL ラテックス試薬2
測定波長 主波長570nm、副波長800nm
測光ポイント 19−34
検体量 5μL
第1試薬 100μL
第2試薬 50μL ラテックス試薬2
第3試薬 50μL ラテックス試薬1
測定波長 主波長570nm、副波長800nm
測光ポイント 19−34
前記実施例11と同様の感作方法で抗CDTマウスモノクローナル抗体2(ハイブリドーマNCDT077産生抗体)を粒径0.09μm、0.13μm、0.15μm、0.20μm、0.34μm、0.46μmのラテックスに感作することにより粒径の異なるラテックス試薬を調製した。試薬の希釈倍率は前記実施例11における粒径0.13μmの場合と同じ希釈倍率を他の粒径にも適用した。測定試料は生理食塩水で希釈した0、5、10、15、20、25、30、35、40mg/dLのCDT溶液とし、調製した粒径の異なるラテックス試薬を前記実施例12のロ)の条件で測定した。測定結果をCDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図5に示す。図5によれば0.09μmから0.46μmの間の粒径はCDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、該粒径範囲で使用可能であることが判る。
前記実施例11で調製したラテックス試薬2の濃度を変化させ、反応液中のラテックス濃度を0.01%、0.02%、0.04%、0.07%、0.13%、0.17%、0.25%、0.5%とした場合の吸光度を前記実施例12のロ)の条件および前記実施例13の評価試料で測定した。測定結果をCDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図6に示す。図6は反応液中のラテックス濃度を変えた場合の感度を示すグラフである。図6によれば、吸反応液中のラテックス濃度が0.01%では測定に十分な感度が得られず、0.5%では吸光度が減少したが、0.02%から0.25%の間ではCDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であることが判る。0.5%の吸光度の低下の理由は強い凝集のため主波長は0濃度で頭打ちし、副波長が濃度に応じて上昇するためと考えられる。
前記実施例11と同様の感作方法で抗CDTマウスモノクローナル抗体2(ハイブリドーマNCDT077産生抗体)の感作時濃度を変化させ、溶液中の抗体濃度として0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mLとした場合の吸光度を前記実施例12のロ)の条件および前記実施例13の評価試料で測定した。測定結果をCDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図7に示す。図7によれば、反応液中の抗体濃度が0.02mg/mLでは測定に十分な感度が得られなかったが、0.03mg/mLから0.09mg/mLの間ではCDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であることが判る。
前記実施例12で調製した第1試薬のほかにpHの異なる緩衝液を調製し、前記実施例12のロ)の条件および前記実施例13の評価試料で反応液中のpHと吸光度を測定した。測定結果をCDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図8に示す。図8によれば、pH6.5以下ではブランク反応の異常が見られ、pH9.6では測定に十分な感度が得られなかったが、pH6.8からpH8.5の範囲ではCDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、該pH範囲で使用可能であることが判る。
前記実施例12のロ)の条件で、20回連続測定した生理食塩水の吸光度を、5mg/dLのCDT溶液からCDT濃度に換算し、0濃度の平均値+3SDにより最小検出限界を算出した結果を表5に、4濃度の試料を10回測定した場合の同時再現性を表6に、精製CDT分画による120mg/dLまでの抗原過剰の測定結果をCDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図9にそれぞれ示す。この方法により算出された最小検出限界は、想定される健常人検体に含まれるCDT濃度よりも十分に小さい数値であり、同時再現性、測定範囲等も測定試薬として十分な性能を有しているといえる。
上記ハイブリドーマNCDT503は、該国際寄託当局に平成18年3月14日にFERM P−20844として原寄託され、該原寄託から平成19年4月16日にFERM BP−10816としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された。
上記ハイブリドーマNCDT077は、該国際寄託当局に平成18年3月14日にFERM P−20843として原寄託され、該原寄託から平成19年4月16日にFERM BP−10815としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された。
前記実施例3で選抜した各ハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、樹立株を得た。得られたハイブリドーマNCDT077は特許生物寄託センター(IPOD)に寄託し(受託日:平成18年3月14日、受託番号:FERM P−20843(FERM BP−10815))、ハイブリドーマNCDT503は特許生物寄託センター(IPOD)に寄託した(受託日:平成18年3月14日、受託番号:FERM P−20844(FERM BP−10816))。
Claims (17)
- 認識するエピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体が該抗体の種類毎に分けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を含む免疫凝集反応試薬キットであって、
該二種類の感作された担体粒子は、目的の抗原を含む検体に対して同時に反応させた場合には凝集反応が弱く、特定の種類のモノクローナル抗体が感作された担体粒子の反応順序を特定した場合、凝集反応が増大する性質を有し、
該二種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されていることを特徴とする免疫凝集反応試薬キット。 - 前記モノクローナル抗体が感作された担体粒子がラテックス粒子である請求項1記載の免疫凝集反応試薬キット。
- 前記担体粒子の粒径が0.05μm以上1μm未満である請求項1記載の免疫凝集反応試薬キット。
- 前記モノクローナル抗体が認識する抗原は、CDTである請求項1記載の免疫凝集反応試薬キット。
- ハイブリドーマNCDT503(FERM P−20844)の産生する抗CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を最初に反応させる試薬とし、ハイブリドーマNCDT077(FERM P−20843)の産生する抗CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を次に反応させる試薬として組み合わせたことを特徴とする請求項1記載の免疫凝集反応試薬キット。
- 前記担体粒子は、ラテックス粒子である請求項1に記載の免疫凝集反応試薬キット。
- 請求項1乃至5の何れか1項に記載の免疫凝集反応試薬キットを用意し、
抗原を含むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反応液に他方の種類の試薬を反応させることにより凝集を生じさせ、凝集の変化量を測定することを特徴とする抗原の測定方法。 - 自動分析装置又は用手法により行う請求項7記載の抗原の測定方法。
- 前記反応液の担体粒子濃度が0.02質量%以上0.25質量%以下である請求項7記載の抗原の測定方法
- 前記反応液のモノクローナル抗体濃度が0.03mg/mL以上0.09mg/mL以下である請求項7記載の抗原の測定方法。
- 前記反応液のpHが6.8以上8.5以下である請求項7記載の抗原の測定方法。
- 前記抗原がCDTである請求項7記載の抗原の測定方法。
- CDTを含むと疑われる検体に対して、ハイブリドーマNCDT503(FERM P−20844)の産生する抗CDTマウスモノクローナル抗体1を感作した担体粒子を含む試薬を反応させた後、その反応液にハイブリドーマNCDT077(FERM P−20843)の産生する抗CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を反応させることにより凝集を生じさせ、凝集の変化量を測定することを特徴とする抗原の測定方法。
- 前記凝集の変化量は、吸光度の変化量である請求項7又は13記載の抗原の測定方法。
- 請求項13に記載の抗原の測定方法に用いられるハイブリドーマNCDT077(FERM P−20843)の産生する抗CDTマウスモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体が次のP1−P6のペプチド領域に対して反応性を有しないか又は実質的に反応性を有しない請求項15記載の抗CDTマウスモノクローナル抗体。
P1: VLAENYNKSDNCE
P2: QHLFGSNVTDCSG
P3: VVARSMGGKEDLIWELL
P4: IAKIMNGEADAMSL
P5: YEKYLGEEYVKAV
P6: SKLSMGSGLNLSEPN - ハイブリドーマNCDT077(FERM P−20843)。
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