WO2011158798A1 - 乾癬治療効果の経過観察及び早期の予測方法並びにそれらに使用するキット - Google Patents

乾癬治療効果の経過観察及び早期の予測方法並びにそれらに使用するキット Download PDF

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WO2011158798A1
WO2011158798A1 PCT/JP2011/063521 JP2011063521W WO2011158798A1 WO 2011158798 A1 WO2011158798 A1 WO 2011158798A1 JP 2011063521 W JP2011063521 W JP 2011063521W WO 2011158798 A1 WO2011158798 A1 WO 2011158798A1
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WO
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antibody
fatty acid
binding protein
acid binding
human
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PCT/JP2011/063521
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祐二 大和田
隆平 奥山
宏彰 細江
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国立大学法人山口大学
国立大学法人東北大学
Ｄｓファーマバイオメディカル株式会社
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a human epidermis type fatty acid binding protein (hereinafter referred to as human) in a specimen obtained from skin of a psoriatic patient (hereinafter also referred to as a rash area), skin without a rash area (hereinafter also referred to as a rash area), and the like.
  • the present invention relates to a kit for immunochemically measuring the amount (sometimes abbreviated as FABP5). More specifically, by measuring the amount of human FABP5 in a sample of psoriasis in the course of treatment for patients with psoriasis, the amount of human FABP5 in the specimen of psoriasis is measured more accurately and objectively.
  • the present invention relates to a method for determining a therapeutic effect and predicting the effect at an earlier stage and a kit used for them.
  • Psoriasis is a type of keratosis disorder and is classified as inflammatory keratosis. Psoriasis is classified into psoriasis vulgaris, pustular psoriasis (general or local), erythrodermic psoriasis, psoriatic arthritis (psoriatic arthritis), and psoriatic psoriasis. Psoriasis is a chronic skin disease in which epidermal cells overgrow and infiltrate inflammatory cells. The overgrowth of epidermal cells results in thick skin and a red rash and an erythema with white scales. Psoriasis is a chronic disease of unknown cause. At present, there is no fundamental treatment method, and symptomatic treatment for skin symptoms and accompanying symptoms is being performed.
  • Treatment is based on topical therapy, combined with phototherapy and oral therapy, taking into account the disease type, severity, and social background (such as hospital status and economic base).
  • Phototherapy is performed in combination with UV UV therapy, narrow band UVB, and other UV therapy in cases where external therapy cannot be improved or in cases where extensive skin lesions are observed.
  • antiallergic drugs In oral therapy, antiallergic drugs, cyclosporine, etretinate, methotrexate, etc. are administered.
  • PASI Psoriasis Area and Severity Index
  • this index is quantified, it is an index based on subjective factors, so the judgment criteria are clearly different between doctors and medical facilities, and an objective index is required.
  • diagnosis of the severity of psoriasis is not based on subjective or subjective indicators such as visual and tactile sense, but quantitative and objective indicators such as biochemical markers can be used to grasp accurate symptoms. And is important in selecting treatment methods.
  • KRT17 Keratin 17
  • S100A7 also known as psoriasin
  • FABP5 PI3 (Protease inhibitor 3, also known as SKALP: Skin-derived Anti-leucoprotein)
  • SKALP Skin-derived Anti-leucoprotein
  • FABP5 is called fatty acid-binding protein 5 or epidermal fatty acid-binding protein (E-FABP), and has a molecular weight of about about mainly present in epidermal cells. It is a 15 KDa protein. FABP5 binds to fatty acids (oleic acid) and hydrophobic ligands, and is involved in fatty acid uptake, transport, metabolism, and cell proliferation and differentiation.
  • E-FABP epidermal fatty acid-binding protein
  • fatty acid binding protein includes FABP1 (liver type fatty acid binding protein: L-FABP), FABP2 (small intestine type fatty acid binding protein: I-FABP), FABP3 (heart type fatty acid binding protein: H -FABP), FABP4 (fatty fatty acid binding protein: A-FABP), FABP6 (small intestine type bile acid binding protein: I-BABP), FABP7 (brain type fatty acid binding protein: B-FABP) and the like are known. All of them are expressed mainly in the organ tissue from which the name is derived, and their relation to the pathological condition and clinical significance are also different.
  • Patent Document 1 shows that administration of a therapeutic agent decreases the human FABP5 gene (mRNA) level in psoriatic lesion tissue in a dose-dependent manner of the therapeutic agent.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 show changes in human FABP5 levels in the treatment of psoriatic lesions with the administration of therapeutic agents as a result of immunohistochemistry.
  • the present invention is a method for quantitatively and objectively judging the therapeutic effect in the transition of symptoms over time during the treatment of psoriasis patients compared with conventional clinical findings, predicting the therapeutic effect earlier, and treating It is an object of the present invention to provide a method for quantitatively and objectively determining a change in symptoms after a rest and a kit used for them.
  • the present inventors have developed an immunochemical measurement method using an antibody that specifically binds to human FABP5, and highly sensitively and precisely human in a specimen obtained from skin skin, non-rash skin, etc. of psoriasis patients. It was possible to detect FABP5. Furthermore, in order to solve the above-mentioned problems, intensive studies were conducted, and a method for quantifying the transition of symptoms over time in patients with psoriasis was found, and the present invention was completed.
  • the specimens obtained from the non-rash area were also examined from the viewpoint of reducing the burden on the patient, that is, QOL, among the epidermis.
  • QOL the burden on the patient
  • the present inventors have found that the change in the measured amount of human FABP5 in the patient being treated decreases earlier than the change in clinical findings based on visual inspection and palpation and the change in the PASI score combining them. Thereby, the therapeutic effect can be evaluated at an early stage, and an appropriate treatment method can be selected.
  • the present invention 1.
  • a carrier selected from the group consisting of a solid phase, a hapten, a magnetic bead, and an insoluble carrier, to which a first antibody that specifically binds to a human epidermal fatty acid binding protein is immobilized
  • a labeled second antibody that specifically binds to a human epidermal fatty acid binding protein, or a hapten or an insoluble carrier on which the second antibody is immobilized Further comprising: An immunochemical assay kit according to claim 1; 3.
  • the method further comprises a solid phase on which a substance that specifically binds to the hapten is immobilized.
  • An immunochemical assay kit according to claim 1; 6). (1) a solid phase on which a first antibody that specifically binds to a human epidermal fatty acid binding protein is immobilized, and (2) a hapten on which a second antibody that specifically binds to a human epidermal fatty acid binding protein is immobilized, 1. It is characterized by including 2. An immunochemical assay kit according to claim 1; 7). (3) The method further comprises a labeled substance that specifically binds to the hapten. An immunochemical assay kit according to claim 1; 8).
  • the support is a solid phase, hapten or magnetic bead
  • Specimen is a biological sample collected from body fluid, rash skin or non-rash skin of a psoriasis patient, or a processed product thereof.
  • the immunochemical measurement is selected from the group consisting of a radioimmunochemical method, an enzyme immunochemical method, an immunoturbidimetric method, a colloidal gold agglutination method, a latex agglutination method, and an immunochromatography method.
  • a kit according to 20. Immunochemical measurement is an enzyme immunochemical technique. To 8. And 10. To 18. A kit according to any of the above; 21.1.
  • To 20. A method for predicting or determining a therapeutic effect by comparing the amount of human epidermal fatty acid binding protein in a specimen of a psoriasis patient before and during treatment using the kit according to any of the above; 22.1. To 20.
  • the specimen is a biological sample collected from body fluid, rash skin or non-rash skin of a psoriasis patient, or a processed product thereof. The method described in; 25.1. To 20. 26.
  • the therapeutic effect over time is determined as compared with the conventional clinical findings at the time of treatment of psoriasis patients, the effect is predicted earlier, and the change in symptoms after treatment cessation is quantitative and objective. It is possible to provide a method and a kit used for the determination, and to obtain an objective and accurate prediction or determination result. In addition, this made it possible to diagnose patients with psoriasis, to objectively evaluate the severity, and to evaluate the progression of the disease over time.
  • the effectiveness of treatment for patients can be determined more accurately and objectively compared to existing strong indicators of subjective factors, and the effect of treatment can be predicted or determined early. From the viewpoint of QOL, it is useful to use a specimen obtained by tape stripping the rashless part.
  • FIG. 3A is a diagram showing the amount of human FABP5 in each blood of patients with psoriasis, patients with atopic dermatitis, patients with skin cancer, and healthy persons. For comparison between the two groups, Mann-Whitney U-test was used, with a significance level of 5%. Healthy and psoriasis patients: p ⁇ 0.005.
  • FIG. 3A is a diagram showing the amount of human FABP5 in each blood of patients with psoriasis, patients with atopic dermatitis, patients with skin cancer, and healthy persons.
  • FIG. 3-2 is a graph showing the amount of human FABP5 in the blood of patients with psoriasis, patients with atopic dermatitis, patients with skin cancer, and healthy individuals, with mean values ⁇ SD for each group.
  • FIG. 6 is a diagram comparing the transition of measured values of human FABP5, clinical indices, and clinical findings in extracted specimens and blood specimens obtained from stratum corneum specimens in the treatment progress observation of patients with psoriasis treated with ultraviolet irradiation.
  • FIG. 6 is a diagram comparing the transition of measured values of human FABP5, clinical indices, and clinical findings in extracted specimens and blood specimens obtained from stratum corneum specimens in the treatment progress observation of patients with psoriasis treated with ultraviolet irradiation.
  • FIG. 6 is a diagram comparing the transition of measured values of human FABP5, clinical indices, and clinical findings in an extracted sample and a blood sample obtained from a stratum corneum sample in the treatment progress observation of a patient with psoriasis treated with an immunosuppressant treatment. It is the figure which compared the transition of the measured value of human FABP5, the clinical parameter
  • the kit of the present invention and the method for predicting or judging the therapeutic effect using the same include a specimen of a patient with psoriasis, specifically, a biological sample collected from a body fluid, skin of rash or non-rash skin, or a human in a processed product thereof The amount of FABP5 is measured.
  • Examples of a method for obtaining a biological sample (for example, stratum corneum, keratinocytes, epidermis cells, etc.) of a psoriasis patient from skin skin and non-rash skin include a tape stripping method.
  • a tape stripping method a tape stripping tape such as a stratum corneum checker can be used.
  • the stratum corneum checker is used for collecting a stratum corneum for evaluation of the degree of rough skin and the like, and has been conventionally used.
  • the material of the bonding surface is not limited, but it is desirable that the material has adhesiveness enough to extract the stratum corneum and does not irritate the skin.
  • a 40x60 mm or less thing is preferable. More preferably, it is selected from the range of 20 to 40 ⁇ 40 to 60 mm. More specifically, a 40 ⁇ 60 mm one is used.
  • the tape is attached to and detached from the same or different collection site of the patient, preferably the same collection site 5 times or less. More specifically, the number of times of attaching and detaching the tape may be 1, but is preferably a plurality of times, more preferably 3 times. When attaching and detaching a plurality of times, it may be performed with one tape, but it is preferable to use a different tape every time.
  • human FABP5 which is a measurement target is extracted from the stratum corneum attached to the tape.
  • the extract may contain a buffer, a surfactant, a protease inhibitor and the like.
  • the buffer solution include PBS (phosphate buffer solution-saline), Tris-HCl buffer (Tris-HCl buffer solution), MES buffer (female buffer solution), HEPES buffer (Hepes buffer solution) and the like.
  • the surfactant include Triton X-100, Tween 20, Tween 80, SDS (sodium lauryl sulfate), and the like.
  • the protease inhibitor include PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • treatment of psoriasis means treatment by medication, light (ultraviolet ray) therapy, etc.
  • patient with psoriasis undergoing treatment means a psoriasis patient being treated, and medication etc. Includes patients with psoriasis during the completed observation period.
  • “Psoriasis patient during treatment” means a psoriasis patient during the treatment, and does not include a psoriasis patient during the observation period in which medication or the like has been completed.
  • treatment cessation of “a psoriasis patient before and after treatment cessation” means a state in which the observation period is completed after receiving the treatment.
  • the therapeutic effect can be predicted or determined early, and therefore the present invention is effective in treating patients with psoriasis in the various states.
  • the body fluid include blood, urine, and the like, and any of whole blood, plasma, and serum may be used as the blood.
  • the body fluid may be used as it is, or may be used as a processed product such as a concentrated liquid.
  • the present inventors have found that in patients who have been successfully treated, the amount of human FABP5 has been reduced earlier in the non-rash area than in the rash area, and in patients whose symptoms have relapsed due to the suspension of treatment. It was discovered that the amount of human FABP5 increased earlier in the non-rash area than in the rash area. Therefore, sample collection from the non-eruptive skin is not only useful for the patient's QOL, but also more effective than using the specimen from the skin of the eruption, in that the therapeutic effect in the patient can be predicted earlier.
  • the method for detecting human FABP5 and measuring the amount thereof is not limited to a specific method, but for example, an immunochemical method can be used.
  • an immunochemical method is preferable because human FABP5 obtained from a specimen can be detected and quantified to accurately determine the symptoms of a psoriasis patient.
  • the immunochemical method is not limited to a specific method.
  • an enzyme immunochemical method, a radioimmunochemical method, a latex agglutination method, a colloidal gold agglutination method, an immunochromatography method, a radioimmunoassay method Fluorescence immunoassay, luminescence immunoassay, spin immunoassay, immunoturbidimetry, enzyme sensor electrode method, and the like can be used.
  • the enzyme immunochemical method latex agglutination method, colloidal gold agglutination method or immunochromatography method is more preferred because of its high sensitivity.
  • the enzyme immunochemical method may be a competitive method, it is a sandwich-type enzyme immunoassay method which is a kind of non-competitive method because it can measure the amount of human FABP5 with higher sensitivity and precision with simple operation. It is more preferable.
  • the first antibody in the present invention is immobilized on a carrier.
  • the carrier include “solid phase”, “hapten”, “magnetic bead”, and “insoluble carrier” as shown below.
  • immobilization means to be supported on the carrier.
  • a competitive method of an enzyme immunochemical method can be mentioned.
  • the anti-human FABP5 antibody immobilized on the carrier was allowed to compete with the enzyme-labeled human FABP5 and the unlabeled human FABP5 in the measurement target, and bound to the anti-human FABP5 antibody immobilized on the carrier.
  • This is a method for measuring the amount of human FABP5 in a measurement target by measuring the amount of enzyme of enzyme-labeled human FABP5. (Competitive enzyme immunoassay)
  • Specific examples of the carrier include a solid phase, a hapten, and a magnetic bead.
  • the immobilization of the first antibody and the carrier and the separation of the carrier and the liquid phase can be performed in the same manner as in the case of using the labeled anti-human FABP5 second antibody described later.
  • an insoluble carrier such as latex particles described later can be used as a carrier for the anti-human FABP5 antibody.
  • human FABP5 bound to a multivalent carrier is used instead of enzyme-labeled human FABP5. That is, latex particles immobilized with anti-human FABP5 antibody are allowed to compete with human FABP5 bound to the polyvalent carrier and free human FABP5 in the measurement target, and latex particles immobilized with the anti-human FABP5 antibody and the polyvalent carrier.
  • the human FABP5 in the measurement object is measured by measuring the degree of aggregation of the aggregate composed of the immune complex formed three-dimensionally by binding to the human FABP5 bound to.
  • a polyvalent carrier is a carrier for making an antigen a polyvalent antigen in order to efficiently form an immune complex, and it is necessary that the number of binding with the antigen is plural per molecule.
  • the polyvalent carrier used here may be any substance as long as it does not interfere with the reaction between the anti-human FABP5 antibody and the antigen and does not induce a non-specific reaction (self-aggregation) of latex. Specifically, bovine serum albumin (BSA), hemocyanin, thyroglobulin, and the like are used. This method can also be measured in a short time, and is compatible with an automatic analyzer capable of processing a large amount of samples in a short time.
  • BSA bovine serum albumin
  • hemocyanin hemocyanin
  • thyroglobulin and the like are used. This method can also be measured in
  • sandwich enzyme immunoassay method As a method using two types of antibodies, that is, the “first antibody” and the “second antibody” in the present invention, there is a sandwich enzyme immunoassay method. In this method, different epitopes existing in human FABP5 are used. Two types of antibodies that recognize
  • the “solid phase” in the present invention means a reaction vessel such as a microplate or a test tube.
  • a method of immobilizing the anti-human FABP5 antibody in the reaction vessel the vessel wall and the antibody molecule are slightly charged, respectively, so that they are directly immobilized by their electrostatic attraction, or chemically attached to the vessel wall.
  • a functional group such as an amino group or a carboxyl group is bound by treatment, and the same functional group that an antibody has is bound by a condensing reagent such as glutaraldehyde, carbodiimide, or succinimide.
  • human FABP5 As a sandwich-type enzyme immunoassay using a first antibody immobilized on a solid phase, human FABP5 is interposed between an anti-human FABP5 first antibody and an enzyme-labeled anti-human FABP5 second antibody previously immobilized on a reaction vessel. And a method of measuring the amount of human FABP5 by measuring the amount of enzyme of an enzyme-labeled antibody bound to human FABP5. (Sandwich enzyme immunoassay 1)
  • “Hapten” in the present invention is a carrier used in another method of sandwich enzyme immunoassay, and biotin is an example.
  • Human FABP5 is sandwiched between a biotin-labeled anti-human FABP5 first antibody and an enzyme-labeled anti-human FABP5 second antibody labeled with biotin, which is one of the haptens. Then, the antigen-antibody complex comprising this enzyme-labeled antibody-antigen-biotin-labeled antibody was transferred to a streptavidin binding well, and the antigen-antibody complex was immobilized on the well by avidin-biotin binding, and then bound to human FABP5.
  • a method for measuring the amount of human FABP5 by measuring the amount of enzyme of the enzyme-labeled antibody can be mentioned. (Sandwich-type enzyme immunoassay 2)
  • any substance may be used as long as it does not interfere with the reaction between the anti-human FABP5 primary antibody and the antigen.
  • an anti-hapten antibody prepared by a conventional method instead of avidin may be immobilized on a solid phase such as a well as a substance that specifically binds to the hapten.
  • Other combinations of haptens and hapten binding substances include hormone-hormone receptors, sugar-lectins and the like.
  • the hapten-binding substance can be immobilized on the solid phase in the same manner as the first antibody in the aforementioned sandwich enzyme immunoassay method 1.
  • an antigen-antibody reaction is carried out between human FABP5 captured with a solid-phased human FABP5 primary antibody and a biotin-labeled anti-human FABP5 secondary antibody, followed by enzyme labeling.
  • a method of measuring the amount of human FABP5 by adding streptavidin and measuring the amount of enzyme of the labeled antibody bound to human FABP5 via a biotin-labeled anti-human FABP second antibody can be mentioned.
  • the reaction is not limited to the combination of biotin as the second antibody label and streptavidin labeled with the enzyme, but the reaction between the anti-human FABP5 first antibody and the antigen. Any combination of haptens and hapten binding substances may be used as long as they are not disturbed. (Sandwich-type enzyme immunoassay 3)
  • the “magnetic bead” in the present invention is a carrier used in place of the solid phase in the above-mentioned sandwich-type enzyme immunoassay methods 1 to 3, and specifically, magnetized substances (eg, Fe 2 O 3 , Fe It means that the antigen-antibody complex can be recovered by applying a magnetic field using magnetic beads made of a polymer such as polystyrene in which 3 O 4 ) is uniformly distributed. In this case as well, when immobilizing the magnetic beads and the first antibody, it can be carried out by electrostatic immobilization or chemical bonding using a functional group, as in the aforementioned sandwich enzyme immunoassay method 1.
  • magnetized substances eg, Fe 2 O 3 , Fe
  • the magnetic beads and the first antibody via a hapten when immobilizing the magnetic beads and the first antibody via a hapten, it can be carried out in the same manner as the above-mentioned sandwich-type enzyme immunoassay method 2.
  • This method can be measured in a short time, and is also compatible with an automatic analyzer capable of processing a large amount of samples in a short time.
  • the latex agglutination method which is one of the measurement methods using the “insoluble carrier” on which the first antibody or the second antibody is immobilized in the present invention, is a method utilizing an agglutination reaction between antibody-bound latex particles and an antigen.
  • human anti-human FABP5 antibody-bound latex particles bound to each of the first antibody and the second antibody, and the degree of aggregation of latex particles generated by an immune reaction with human FABP5 are measured.
  • the amount of FABP5 is measured.
  • Latex particles and anti-human FABP5 primary antibody immobilized thereon From latex particles and anti-human FABP5 primary antibody immobilized thereon, anti-human FABP5 primary antibody-bound latex particles, and (2) Latex particles and anti-human FABP5 secondary antibody immobilized thereon Anti-human FABP5 second antibody-conjugated latex particles are used.
  • a plurality of antibody molecules are immobilized on one latex particle, and a plurality of human FABP5 molecules can be immobilized on one latex particle. That is, when human FABP5 enters a reaction solution containing both antibody-bound latex particles of (1) and (2), human FABP5 reacts with each latex particle, and the first antibody-bound latex per molecule of human FABP5.
  • the latex agglutination method is a method for examining the abundance of human FABP5 by measuring the degree of aggregation. This method can also be measured in a short time, and is compatible with an automatic analyzer capable of processing a large amount of samples in a short time.
  • the colloidal gold agglutination method is a method utilizing an agglutination reaction between antibody-sensitized gold colloidal particles and an antigen.
  • the amount of human FABP5 is measured by measuring the degree of aggregation of colloidal gold particles produced by the immune reaction between anti-human FABP5 antibody-sensitized gold colloid particles and human FABP5.
  • the measurement principle is the same as that of the latex agglutination method except that the agglomeration medium (insoluble carrier) is changed from latex particles to gold colloid particles.
  • the immunochromatography method uses a sheet-like carrier (polymer) that holds all immunochemical reaction systems. Specifically, a porous film such as a nitrocellulose film or nylon film coated with the first or second anti-human FABP5 antibody labeled with colloidal gold or latex particles and the other anti-human FABP5 antibody. Is included. Since this method does not require a special measuring device, it is an advantageous method when a quick determination is required for determination outside the hospital or emergency. In addition, this method is suitable for qualitatively detecting the presence or absence of human FABP5 of an arbitrarily set amount, that is, a cutoff value or more.
  • the kit of the present invention comprises (1) a solid phase on which a first antibody that specifically binds to human FABP is immobilized, a hapten on which the first antibody is immobilized, a magnetic bead on which the first antibody is immobilized, Of the insoluble carrier to which the first antibody is immobilized, and (2) the labeled second antibody that specifically binds to human FABP, or the insoluble carrier to which the second antibody is immobilized, only (1),
  • the kit is an immunochemical measurement kit for measuring the amount of human FABP from a specimen of a psoriasis patient, comprising (1) and (2).
  • the kit of the present invention comprises an anti-human FABP5 antibody (first antibody and second antibody) that recognizes and reacts specifically with human FABP5.
  • the anti-human FABP5 antibody include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies are more preferred because they have more specificity and can stably supply a homogeneous kit. As this antibody, since the patient is specifically human, anti-human FABP5 antibody is used.
  • a monoclonal antibody is used in the kit of the present invention, it may be confirmed in advance that the epitopes of the first antibody (biotin-labeled anti-human FABP5 antibody and the like) and the second antibody (enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody and the like) are different. preferable.
  • the antibody used in the present invention can be produced by a usual method.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by immunizing animals such as rabbits, mice, goats and horses with human FABP5.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by fusing spleen cells of animals immunized with human FABP5 and myeloma, selecting hybrids by cloning, and culturing them.
  • Human FABP5 as an antigen used for producing an anti-human FABP5 antibody can be obtained by isolation and purification from epidermal tissue or the like, but can also be obtained by cell culture or gene recombination techniques.
  • a partial peptide of human FABP5 can also be used as an antigen. When a partial peptide is used, it can be produced by chemical synthesis based on the known amino acid sequence of human FABP5.
  • the anti-human FABP5 antibody obtained as described above is, for example, an enzyme-labeled anti-human FABP5 second antibody and a hapten (for example, biotin) -labeled anti-human FABP5 antibody.
  • a hapten for example, biotin
  • One antibody is included in the kit.
  • the first antibody may be in the form of a solid-phased anti-human FABP5 antibody or an anti-human FABP5 antibody immobilized on a magnetic bead instead of the biotin-labeled anti-human FABP5 antibody.
  • the label to be combined with the anti-human FABP5 antibody to obtain the enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody is not limited to a specific one, but enzymes such as peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, etc. can be used.
  • the binding between the antibody and the label can be performed according to a conventional method using a functional group such as a carboxyl group, an amino group, a thiol group, or a hydroxyl group.
  • Immobilization of an antibody and a hapten in an antibody labeled with a hapten such as biotin is performed according to a conventional method using a hapten (biotin) molecule or a functional group such as a carboxyl group, amino group, thiol group, or hydroxyl group of the antibody. be able to.
  • the kit of the present invention preferably further contains a substance that binds to the hapten.
  • the hapten-binding substance can be provided in a state of being immobilized on a solid phase (eg, a reaction vessel such as an immunoplate) or a carrier such as magnetic beads.
  • a solid phase eg, a reaction vessel such as an immunoplate
  • a carrier such as magnetic beads.
  • the hapten is biotin, immobilize streptavidin with microplate wells or plastic magnetic beads such as polystyrene in which plastic bead magnetizable materials (eg, Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 ) are uniformly distributed.
  • a streptavidin-binding carrier can be produced by immobilization on a target (carrier).
  • An antibody-bound solid phase in which the first antibody is directly immobilized can be produced in the same manner. Immobilization to a solid phase is usually performed by dissolving streptavidin or an antibody in an appropriate buffer solution such as a citrate buffer and bringing the solid phase surface into contact with the solution for an appropriate time (1 to 2 days). be able to. Furthermore, in order to suppress non-specific adsorption and non-specific reaction, a phosphate buffer obtained by decomposing bovine serum albumin (BSA) or bovine milk protein was brought into contact with the solid phase, and the solid phase not coated with streptavidin In the case of a surface portion or an antibody-bound solid phase, it is generally performed to block the solid phase surface portion not coated with the antibody with the BSA, bovine milk protein or the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the kit of the present invention is based on the above-mentioned sandwich-type enzyme immunoassay 3, the hapten (for example, biotin) labeled anti-human FABP5 second antibody is included in the kit instead of the enzyme-labeled anti-human FABP5 second antibody.
  • the kit preferably further comprises a labeled hapten-binding substance for detecting the antigen-antibody complex of the immobilized antibody-antigen-hapten labeled antibody.
  • the hapten is biotin
  • enzyme-labeled streptavidin can be included in the kit.
  • the reaction plate can be further included in the kit of the present invention.
  • the reaction plate is a microplate that has not been solid-phased. In order to suppress non-specific adsorption and non-specific reaction as is generally done, this plate uses a phosphate buffer solution that decomposes bovine serum albumin (BSA), bovine milk protein, etc. It can be contacted with a wall and blocked with the BSA or bovine milk protein.
  • BSA bovine serum albumin
  • the enzyme immunoassay method and enzyme immunoassay reagent for detecting human FABP5 are, for example, Guthmann F et al. Expression of fatty acid-binding proteins in cells involved in lung-specific lipid metabolism. Eur J Biochem 1998, 253: 430 -436, or Denis C Y et al. Epidermal fatty acid-binding protein: a new circulating biomarker associated with cardio-metabolic risk factors and carotid atherosclerosis. Eur Heart J 2008, 29: 2156-2163.
  • a hydrogen peroxide solution as a substrate o-phenylenediamine as a chromogenic substrate, sulfuric acid as a reaction terminator, and the like can be included in the kit.
  • substrates and / or reaction-stopping substances may be included in the kit.
  • radioisotope or a fluorescent / luminescent substance commonly used in an immunoassay instead of an enzyme as a labeling substance.
  • the kit of the present invention comprises first and second antibodies immobilized on an insoluble carrier such as latex particles or colloidal gold particles.
  • an insoluble carrier such as latex particles or colloidal gold particles.
  • the kit contains a second antibody immobilized on an insoluble carrier such as latex particles or colloidal gold particles, and a solid phased first antibody.
  • Reagents used in these methods are common in this field, and can be produced by applying the anti-human FABP5 antibody obtained as described above to these reagents.
  • the anti-human FABP5 antibody obtained as described above is used in the same manner as the sandwich enzyme immunoassay, and the hapten (for example, biotin) -labeled anti-human FABP5 antibody is used.
  • the hapten for example, biotin
  • One antibody is included in the kit. Immobilization of a hapten such as biotin and an antibody can be performed according to a conventional method using a hapten (biotin) molecule or a functional group such as a carboxyl group, amino group, thiol group, or hydroxyl group possessed by the antibody.
  • kits preferably further includes a solid phase on which a hapten-binding substance (streptavidin) is immobilized for capturing an antigen-antibody complex.
  • a solid phase such as a microplate
  • magnetic beads may be used as a carrier for immobilizing an anti-human FABP5 antibody or a hapten-binding substance (streptavidin).
  • the kit of the present invention based on a competitive enzyme immunoassay contains labeled human FABP5 for reacting with an anti-human FABP5 antibody in a competitive manner with human FABP5 in the measurement target.
  • Human FABP5 can be isolated from, for example, human epidermal cells using a protein separation / purification technique known per se, or the cDNA is cloned from RNA derived from human epidermal cells using the RT-PCR method. Although it can introduce
  • the label to be bound to human FABP5 to obtain enzyme-labeled human FABP5 used in the competition method is not limited to a specific one, but enzymes such as peroxidase, ⁇ -galactosidase and alkaline phosphatase can be used.
  • the binding between human FABP5 and the labeled product can be performed according to a conventional method using functional groups such as carboxyl group, amino group, thiol group, and hydroxyl group.
  • the amount of human FABP5 in the specimen is measured by an enzyme immunochemical assay using the kit of the present invention, so that the symptoms of psoriasis patients can be objectively accurately determined.
  • This makes it possible to objectively evaluate the severity of psoriasis patients.
  • it is possible to evaluate the transition of symptoms over time. That is, changes in the severity and symptoms of psoriasis patients can be evaluated based on the amount of human FABP5 in the measurement sample. Therefore, by using the kit constructed in the present invention to track changes in the amount of human FABP5, it is possible to determine the effectiveness of treatment in patients.
  • the composition of one individual includes the following.
  • (Judgment reagent example 1) ⁇ Anti-human FABP5 antibody-immobilized microplate (blocked) ⁇ Enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody solution and its container ⁇ Human FABP5 standard reagent solution with known content (for standard curve preparation) and its container ⁇ Reaction solution (phosphate buffer-physiological saline) and its container ⁇ Microplate washing solution ( Phosphate buffer solution-saline solution and its container, coloring reagent solution (substrate solution) and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody) ⁇ Reaction stop solution and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody)
  • the above components are put together in a paper box or the like to form one kit.
  • composition of one individual determination reagent obtained by increasing the detection sensitivity of the determination reagent example 1 includes the following.
  • (Judgment reagent example 2) ⁇ Biotin-labeled anti-human FABP5 antibody solution and its container ⁇ Enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody solution and its container ⁇ Human FABP5 standard reagent solution with known content (for standard curve preparation) and its container ⁇ Reaction microplate (blocking only applied) Food) ⁇ Reaction solution (phosphate buffer-physiological saline) and its container ⁇ Streptavidin solid-phase microplate (blocking also applied) ⁇ Microplate washing solution (phosphate buffer-physiological saline) and its container ⁇ Color developing reagent solution (substrate solution) and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody) ⁇ Reaction stop solution and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody)
  • the above components are put together in
  • a single constituent of the determination reagent obtained by improving the determination reagent example 2 includes the following.
  • (Determination reagent example 3) ⁇ Anti-human FABP5 antibody-immobilized microplate (blocked) ⁇ Biotin-labeled anti-human FABP5 antibody solution and its container ⁇ Enzyme-labeled streptavidin solution and its container ⁇ Human FABP5 standard reagent solution with known content (for standard curve preparation) and its container ⁇ Reaction solution (phosphate buffer solution-physiological saline) ), Its container, microplate washing solution (phosphate buffer solution-saline), its container, coloring reagent solution (substrate solution) and its container (used to measure the amount of enzyme of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody) ⁇ Reaction stop solution and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody)
  • the above components are put together in a paper box or the like to form one kit.
  • composition of one individual of the kit of the present invention based on the competitive enzyme immunoassay includes the following.
  • (Determination reagent example 4) ⁇ Anti-human FABP5 antibody-immobilized microplate (blocked) ⁇ Enzyme-labeled human FABP5 solution and its container ⁇ Human FABP5 standard reagent solution of known content (for standard curve preparation) and its container ⁇ Reaction solution (phosphate buffer solution-saline) and its container ⁇ Microplate washing solution (phosphate) Buffer solution-saline solution) and its container, coloring reagent solution (substrate solution) and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody) ⁇ Reaction stop solution and its container (used to measure the enzyme amount of enzyme-labeled anti-human FABP5 antibody)
  • the above components are put together in a paper box or the like to form one kit.
  • the therapeutic effect in a psoriasis patient who is scheduled to receive or is receiving treatment can be predicted or determined at an early stage. Therefore, the present invention also provides a method for determining the therapeutic effect by comparing the amount of human FABP5 in a sample of a psoriasis patient before and during the treatment using the kit.
  • the amount of human FABP5 is measured at least before the treatment and during or after the treatment by the above method. It can be said that treatment is effective if the amount during or after treatment is lower than the amount of human FABP5 prior to treatment.
  • the amount is measured at least before and after the suspension by the method described above. If the measured value after the pause is higher than that before the pause, it can be determined that the affected area has deteriorated.
  • Reference example 1 Acquisition of mouse anti-human FABP5 monoclonal antibody Recombinant human FABP5 was prepared in physiological saline to an amount of 1 mg / mL, then suspended in an equal volume of adjuvant, and 2 at intervals of 2 weeks for 3 BALB / c mice. Immunized with 100 ⁇ L / mouse at a time (recombinant human FABP5 was 50 ⁇ g / mouse at a time).
  • the titer confirmation method was carried out by adding antiserum to recombinant human FABP5 immobilized on a 96-well microplate, reacting with HRP-anti-mouse IgG antibody, detecting it by a colorimetric method, and judging its absorbance level.
  • a physiological saline solution of recombinant human FABP5 was administered intraperitoneally or intravenously (50 ⁇ g / mouse). Thereafter, the immunized mouse was sacrificed, and the spleen was aseptically removed and filtered through a sterile iron mesh to prepare spleen cells. The number of cells was counted (10 8 cells / mouse), and then cell fusion was performed with mouse myeloma P3X63 that had been cultured in advance at a ratio of 5: 1 by the PEG method.
  • the fused cells (hybridoma) were seeded in a 96-well culture plate. Thereafter, the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C.
  • the culture supernatant was collected.
  • the antibody titer was confirmed by the same method as the titer confirmation of the antiserum of immunized mice. Then, the hybridoma of the antibody-producing clone was subcultured and cloned by the limiting dilution method.
  • Cloning was performed by diluting the hybridoma to 5 cells / well or 1 cell / well, and seeding it in a 96-well culture plate. This operation was performed twice, and the obtained single colony-derived cells were used as anti-human FABP5 monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the obtained monoclonal antibody-producing hybridoma was cultured in large quantities.
  • Pristane was administered intraperitoneally in advance, and 5 hybridomas were replaced with physiological saline from 5 BALB / c mice preliminarily raised for 2 weeks, and then administered at 5 ⁇ 10 6 cells / mouse. They were raised for 10-25 days and waited for ascites to accumulate. Thereafter, ascites was collected from the mouse with swollen abdomen, and the obtained ascites antibody was subjected to ammonium sulfate salting out and affinity purification using protein G (GE Healthcare) to obtain a mouse anti-human FABP5 monoclonal antibody.
  • protein G GE Healthcare
  • Reference example 2 Construction of human FABP5-specific measurement system Enzyme immunoassay by sandwich enzyme immunoassay was performed using a kit composed of the following reagents.
  • the monoclonal antibody obtained in Example 1 is used here, a polyclonal antibody can also be used.
  • the content of each following reagent is a normal thing used in the said field
  • Sandwich-type enzyme immunoassay 1 Measurement was performed according to the following procedure. First, 100 ⁇ L of each standard reagent or specimen was added to the reaction plate. Next, equal amounts of biotin-labeled anti-human FABP5 second antibody solution and enzyme-labeled anti-human FABP5 first antibody solution were mixed, added to the reaction plate, 25 ⁇ L, stirred in a mixer, and incubated at room temperature for 16 hours. Thereafter, 100 ⁇ L of this reaction solution was transferred to a streptavidin-binding well and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • Latex aggregation method Measurement was performed according to the following procedure. This method can be operated with automated analytical instruments. First, 100 ⁇ L of each standard reagent or specimen is put into a reaction container, diluted with a buffer solution, and then a solution containing anti-human FABP5 first antibody-bound latex particles and anti-human FABP5 second antibody-bound latex particles is added, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After the reaction, the change in absorbance per unit time at a wavelength of 570 to 800 nm was measured.
  • Reference example 3 3-1 Collection of the stratum corneum sample derived from the epidermis The stratum corneum was collected from the epidermis of psoriasis patients and healthy individuals using a tape stripping tape (40 ⁇ 60 mm). Sampling was performed by using three tapes, and by attaching and detaching once per sheet three times at the same location, three epidermis sampling tapes were obtained per specimen. In addition, patients with psoriasis collected the skin area of the rash and the skin area without the rash.
  • Example 1 Measurement of specimen extracted from epidermis using human FABP5 specific measurement system Skin and skin of psoriatic patient collected and extracted by the method shown in Reference Example 3, eruptive skin of the same patient, skin eruption of atopic dermatitis patient Measurements were made on the cutaneous skin and the non-rash skin of the same patient, the rash skin of the skin cancer patient, the non-rash skin of the same patient, and the stratum corneum extract sample of healthy human skin.
  • the level of human FABP5 protein in the stratum corneum of the psoriatic patient skin area was clearly higher than that of healthy subjects.
  • the level of human FABP5 protein in the horny layer of psoriatic patients was clearly higher than that in the healthy subject, and the human FABP5 protein in the horny layer was healthy person ⁇ skinless part ⁇ skiny part. Particularly in the skin eruption, even the lowest value was about 70 times as high as the highest value of the healthy subject specimen.
  • human FABP5 protein in the epidermal stratum corneum is not only in the rash area but also in the non-rash area in psoriasis patients. It was shown by qualitative measurement by immunostaining that the expression was higher than that of the healthy human epidermis. This time, the difference in expression level from this staining image, which was performed using a qualitative judgment method from a visual subjective viewpoint, can be expressed for the first time by a method based on a universal objective judgment based on a measurement value calculation by a quantitative means. did it.
  • FIG. 2 shows the relationship between the measured values of human FABP5 in the non-rash area and rash area of the same patient in psoriasis patients.
  • a content difference of 10 times or more was observed between the non-rash area and the rash area.
  • FIG. 1 it is difficult to simultaneously compare FABP5 levels in the non-eruption part and the eruption part of the sample of the epidermis of multiple psoriasis patients, and a reference example in which a plurality of individual specimen samples can be processed simultaneously. It became easy by the quantitative measurement method shown in 3.
  • Example 2 Measurement of plasma sample using human FABP5-specific measurement system Plasma samples obtained by centrifugation after blood collection were measured for psoriasis patients and healthy individuals. In addition, plasma samples from patients with atopic dermatitis and skin cancer were also measured.
  • the psoriasis patient group showed a higher trend than the healthy group (FIG. 3-1). Although the difference was not as great as that of the sample extracted from the stratum corneum and the horny stratum corneum, the average value was about 1.5 times higher than that of the healthy subject group (FIG. 3-2). The atopic dermatitis and skin cancer patient groups also showed a higher tendency than the healthy group.
  • Plasma adipocyte and epidermal fatty acid binding protein is reduced after weight loss in obesity. 6 ⁇ 0.5 ng / mL.
  • the difference from the measured values of healthy persons in this example is considered to be due to the difference in detection sensitivity depending on the type of antibody used.
  • Example 3 Comparison of changes in measured values of skin horny layer and plasma samples and clinical indicators and clinical findings in the treatment follow-up of patients with psoriasis
  • As an index of success in clinical treatment a comparison was made with respect to changes in measured values of human FABP5 in the stratum corneum extract specimen and plasma specimen, while comparing with clinical indicators and clinical findings that have been used in the past.
  • UV therapy patients In patients treated with UV therapy, the first case was treated with narrowband UVB, with a total dose of 14.57 J / cm 2 and 32 exposures.
  • the human FABP5 value in plasma decreased to the same extent as well as the existing clinical index (PASI score) and clinical findings (lesion range value, erythema score, scale score).
  • the eruption skin human FABP5 value was significantly reduced to 1/100 of the measured value before treatment (previous value: number of irradiations 0), and the eruption skin human FABP5 value was also 1/5.
  • treatment was performed with a combination therapy of narrowband UVB and PUVA.
  • the total irradiation amount of narrowband UVB was 25.33 J / cm 2
  • the number of irradiations was 31, and the total irradiation amount of PUVA was 30.05 J / cm 2 .
  • the values of the non-eruption skin and eruption skin human FABP5 were clearly decreased from the start of treatment. Furthermore, as in the first case, the eruption-free skin human FABP5 value showed a decrease preceding the clinical index (PASI score) and clinical findings (lesion range value, erythema score, scale score). The skin eruption skin human FABP5 value also showed a decrease that preceded the PASI score and clinical findings after 14 days of irradiation.
  • the E-FABP value in the non-eruptive skin or eruptive skin showed a decreasing change consistent with existing clinical indicators and clinical findings as the treatment progressed.
  • the level of the skin of the non-eruption area clearly changed earlier than the existing clinical index PASI score and clinical findings. That is, by measuring the E-FABP value in the skin without rash or rash, the treatment is more effective than the existing clinical indicators (PASI score) and clinical findings based on visual and tactile judgments with many subjective elements. It became clear that it can be grasped more objectively and earlier.
  • Example 4 Comparison of changes in measured values of blood stratum corneum sample and blood samples during follow-up of patients with psoriasis and comparison with clinical indicators and clinical findings
  • follow-up of patients with psoriasis during the period when treatment is suspended was examined.
  • a comparison was made with respect to changes in measured values of human FABP5 in a stratum corneum extract specimen and a blood specimen, while comparing with clinical indicators and clinical findings that have been used in the past.
  • the E-FABP value in the non-eruption skin or eruption skin showed an increased change consistent with existing clinical indicators and clinical findings. Furthermore, the E-FABP values in the non-eruption skin and the eruption skin showed a higher rate of increase than existing clinical indicators and clinical findings. Therefore, by measuring the E-FABP value in the non-rash skin and skin skin, treatment is suspended compared to existing clinical indicators (PASI score) and clinical findings based on visual and tactile judgments with many subjective factors It became clear that the pathological condition in the stage can be grasped objectively and with higher sensitivity. In addition, the change in human FABP5 level in the non-rash area, which was not as high as that in the rash area, was clearly more sensitive than the existing clinical indicators and clinical findings. It is considered that the judgment can be made by collecting the rashless skin with less burden on the patient, and it was shown that this determination method by collecting the rashless skin is useful also from the viewpoint of QOL.
  • the present invention determines the therapeutic effect more accurately and objectively with respect to the transition of the medical condition over time during the treatment of psoriasis disease, compared with conventional clinical findings, predicts the therapeutic effect earlier, and treatment
  • Provided are a method for quantitatively and objectively determining a change in symptoms after a pause, and a kit used for them. That is, by measuring changes in the protein level of human FABP5 in the stratum corneum of the skin, blood, etc., it shows the relationship with existing clinical indicators and clinical findings, and is clinically useful in determining the therapeutic effect in the treatment of psoriasis. It showed that there is. Furthermore, it was shown that this determination is possible even in the collection of a normal part (rashless part) with less burden on the patient.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2010-135521 filed in Japan (filing date: June 14, 2010), the contents of which are incorporated in full herein.

Abstract

　本発明は、乾癬患者の検体中の、ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質を免疫化学的に定量し、従来の臨床所見と比較して、治療効果をより正確かつ客観的に判定し、かつより早期に予測するための方法及びそれに使用するキットの提供を課題とする。　本発明は、（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、 を含み、好ましくは、 （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化したハプテンもしくは不溶性担体、 をさらに含むことを特徴とする、乾癬患者の検体からヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質を定量するため免疫化学測定のキット及びそれを用いた治療効果の判定方法を提供する。

Description

乾癬治療効果の経過観察及び早期の予測方法並びにそれらに使用するキット
　本発明は、乾癬患者の皮疹部皮膚（以下、皮疹部ともいう）、無疹部皮膚（以下、無疹部ともいう）等から得られる検体中の、ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質（以下、ヒトＦＡＢＰ５と略す場合がある）量を免疫化学的に測定するためのキットに関する。さらに具体的には、乾癬患者の治療経過において乾癬の症状の経時的な推移を乾癬患者の検体中のヒトＦＡＢＰ５量を測定することにより、従来の臨床所見と比較してより正確かつ客観的に治療効果の判定ができ、かつより早期に該効果を予測するための方法及びそれらに使用するキットに関する。
　乾癬は、角化異常症の１種で、炎症性角化症に分類される。乾癬は、尋常性乾癬、膿疱性乾癬（汎発性又は局所性）、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬（乾癬性関節炎）、滴状乾癬に分類される。乾癬は、表皮細胞が過増殖し、そこに炎症細胞が浸潤し発症する慢性の皮膚疾患である。表皮細胞が過増殖することにより、皮膚が厚くなり、紅色の発疹とその上に白色の鱗屑（りんせつ）を伴う紅斑局面とが出現する。乾癬は原因不明の慢性疾患である。現時点では、根本的な治療方法は存在せず、皮膚症状、随伴症状に対する対症療法が行われている。
　患者によっては、皮疹部に痒みを訴える例も少なくない。致命的ではないものの、積極的な治療を進めていても長期間、患者の体の見える部分に皮疹を伴う。このことから、他の疾患に比べ、日常生活の中で精神的な苦痛、悩みを抱えて過ごす患者も多い。また伝染性が無いにもかかわらず、目に見える形で皮膚に症状が現れるため、差別を受けやすく、精神的に不安を抱えている患者が多い。
　日本における乾癬の正確な罹患率は不明であるが、およそ１％と推定される。欧米では人口の２ないし３％と言われており頻度の高い皮膚疾患として知られている。欧米に多い理由としては遺伝的要因が大きいとされている。日本における罹患率は戦後増加したとされており、食生活の欧米化などがその理由とも言われている。また最近では糖尿病等のメタボリック症候群との関わりも明らかになっている。
　治療は、病型、重症度、社会的背景（通院状況、経済的基盤など）を考慮し、外用療法を基本に、光線療法、内服療法を併用して行う。
　外用療法では、活性型ビタミンＤ３製剤や副腎皮質ステロイド製剤が用いられる。
　光線療法は、外用療法にて改善が得られない症例、広範な皮膚病変が認める症例では、ＰＵＶＡ療法、ナローバンドＵＶＢなどの紫外線療法を併用して行う。
　内服療法では、抗アレルギー薬、シクロスポリン、エトレチナート、メトトレキサートなどが投与される。
　近年は、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－１２／２３ｐ４０抗体などによるサイトカインをターゲットにした治療法が開発されつつある。
　また、乾癬の病状に合わせた適切な治療、適切な投薬が切望されている。
　乾癬の重症度の診断は、現在全て視診、触診による臨床所見に依存しており、その判断には主観的な要素の与える影響が非常に大きい。具体的には、皮疹部皮膚の臨床所見（鱗屑、紅斑、浸潤等）を視覚的にスコアー化し、これらの和に病変範囲値（％）と係数をかけて求めるＰＡＳＩ（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　Ａｒｅａ　ａｎｄ　Ｓｅｖｅｒｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ）スコアーという指標が最もよく用いられている。
　この指標は数値化されているが、主観的要素に基づく指標であるので、その判断基準は医師や医療施設の各々の間で明らかな差異が認められ、客観的な指標が求められている。
　乾癬の治療においては、症状を的確にかつ客観的な指標をもって把握することが大切である。よって乾癬の重症度の診断は、視覚や触覚などの主観に左右される指標で判断するのではなく、生化学マーカーのような量的で客観的な指標で行うことは、的確な症状の把握と治療方法の選択に重要である。
　そこで、乾癬疾患の病変部の局所状態、及び全身症状の把握を、視覚的又は主観的な根拠だけで行うのでなく、客観的な指標、例えば体液、組織中の生化学マーカーの定性判定、定量によって得た根拠も併せもって診断を行うことは、的確な治療方針の策定に重要である。
　乾癬では、発症に関連する遺伝子の存在が複数知られており、例えばＫＲＴ１７（Ｋｅｒａｔｉｎ　１７）、Ｓ１００Ａ７（別名ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ＦＡＢＰ５、ＰＩ３（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　３、別名ＳＫＡＬＰ：Ｓｋｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ａｎｔｉ－ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ又はＥｌａｆｉｎ）をコードする遺伝子等である。
　このうち、ＦＡＢＰ５は、脂肪酸結合蛋白質（ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）５、又は表皮型脂肪酸結合蛋白質（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅ－ＦＡＢＰ）とよばれ、主に表皮細胞内に存在する分子量約１５ＫＤａの蛋白質である。ＦＡＢＰ５は脂肪酸（オレイン酸）や疎水性のリガンドと結合し、脂肪酸の取り込み、輸送、代謝、さらに細胞の増殖や分化などに関与する。
　脂肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ）はここに述べるＦＡＢＰ５の他に、ＦＡＢＰ１（肝臓型脂肪酸結合蛋白質：Ｌ－ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ２（小腸型脂肪酸結合蛋白質：Ｉ－ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ３（心臓型脂肪酸結合蛋白質：Ｈ－ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ４（脂肪型脂肪酸結合蛋白質：Ａ－ＦＡＢＰ）、ＦＡＢＰ６（小腸型胆汁酸結合蛋白質：Ｉ－ＢＡＢＰ）、ＦＡＢＰ７（脳型脂肪酸結合蛋白質：Ｂ－ＦＡＢＰ）等が知られている。いずれも名称の元となった臓器組織を中心に発現しており、病態との関わり、臨床的意義もそれぞれ異なるものである。
　特許文献１では、治療薬投与で乾癬病変組織におけるヒトＦＡＢＰ５遺伝子（ｍＲＮＡ）レベルが治療薬の用量依存的に減少することが示されている。非特許文献１及び非特許文献２では、治療薬投与で乾癬病変組織における治療経過に伴うヒトＦＡＢＰ５レベルの変化を免疫組織化学手法により示している。しかし、乾癬患者の無疹部皮膚でのヒトＦＡＢＰ５の発現量による重症度の検討又はその経時的な変化については開示がない。
特表２００９－５２１９３３号公報
Kuijpers ALA et al. Skin-derived antileukoproteinase(SKALP) and epidermal fatty acid-binding protein (E-FABP): two novel markers of the psoriatic phenotype that respond differentially to topical steroid. Acta Derm Venereol 1997, 77(1):14-9. Kuijpers ALA et al. The effects of oral liarozole on epidermal proliferation and differentiation in severe plaque psoriasis are comparable with those of acitretin. Br J Dermatol 1998, 139:380-389.
　本発明は乾癬患者の治療時における経時的な症状の推移において、従来の臨床所見と比較してその治療効果を量的、客観的に判定し、その治療効果をより早期に予測し、かつ治療休止後の症状の変化を量的、客観的に判定するための方法及びそれらに使用するキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、特異的にヒトＦＡＢＰ５に結合する抗体を用いた免疫化学測定法を開発し、高感度かつ精密に乾癬患者の皮疹部皮膚、無疹部皮膚等から得られる検体中のヒトＦＡＢＰ５を検出することを可能にした。さらに、上記の課題を解決するために鋭意検討を行い、乾癬患者の症状の経時的な症状の推移を定量化する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
　さらに、乾癬患者において、その表皮のうち、患者の負担の軽減、即ちＱＯＬの観点から考え、無疹部から得られた検体についても検討を行った。その結果、治療中の患者におけるヒトＦＡＢＰ５測定量の変化が、視診や触診に基づく臨床所見の変化及びこれらを組み合わせたＰＡＳＩスコアーの変化より早期に減少することを本発明者らは見出した。これによって、治療効果を早期に評価し、適切な治療方法を選択できる。
　本発明は、
１．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、
を含むことを特徴とする、乾癬患者の検体からヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質量を測定するための免疫化学測定のキット；
２．（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化したハプテンもしくは不溶性担体、
をさらに含むことを特徴とする１．に記載の免疫化学測定のキット；
３．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、及び
（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする２．に記載の免疫化学測定のキット；
４．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化したハプテン、及び
（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする２．に記載の免疫化学測定のキット；
５．（３）前記ハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含むことを特徴とする４．に記載の免疫化学測定のキット；
６．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、及び
（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第二抗体が固定化したハプテン、
を含むことを特徴とする２．に記載の免疫化学測定のキット；
７．（３）前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質をさらに含むことを特徴とする６．に記載の免疫化学測定のキット；
８．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した磁気ビーズ、及び
（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする２．に記載の免疫化学測定のキット；
９．（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した不溶性担体、及び
（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第二抗体が固定化した不溶性担体、
を含むことを特徴とする２．に記載の免疫化学測定のキット；
１０．標識された抗原をさらに含む１．に記載の免疫化学測定のキット；
１１．担体が固相、ハプテン又は磁気ビーズである１０．に記載の免疫化学測定のキット；
１２．検体が乾癬患者の、体液、皮疹部皮膚もしくは無疹部皮膚から採取した生体試料又はその処理物である１．に記載の免疫化学測定のキット；
１３．検体がテープストリッピング法で無疹部皮膚から得られたものである１２．に記載の免疫化学測定のキット；
１４．乾癬患者の皮疹部皮膚、又は無疹部皮膚から検体を採取するためのテープストリッピング用テープをさらに含む１．から１３．のいずれかに記載の免疫化学測定のキット；
１５．標識と反応する基質をさらに含む１．から８．及び１０．から１４．のいずれかに記載の免疫化学測定のキット；
１６．標識と基質との反応を停止させる物質をさらに含む１５．に記載の免疫化学測定のキット；
１７．治療を受けている乾癬患者における治療効果が早期に予測又は判定できる、又は治療休止後の症状の変化が判定できる１．から１６．のいずれかに記載の免疫化学測定のキット；
１８．抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である１．から１７．のいずれかに記載の免疫化学測定のキット；
１９．免疫化学測定が放射性免疫化学的方法、酵素免疫化学的方法、免疫比濁法、金コロイド凝集法、ラテックス凝集法、及び免疫クロマト法からなる群より選択される１．に記載のキット；
２０．免疫化学測定が酵素免疫化学的手法である１．から８．及び１０．から１８．のいずれかに記載のキット；
２１．１．から２０．のいずれかに記載のキットを用い、治療を受ける前と治療を受けている間の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較し、治療効果を予測又は判定する方法；
２２．１．から２０．のいずれかに記載のキットを用い、治療休止前と休止後の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較し、患部の状態を判定する方法；
２３．治療を受ける前と治療を受けている間の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較することによる、治療効果を予測又は判定する方法；
２４．検体が乾癬患者の、体液、皮疹部皮膚もしくは無疹部皮膚から採取した生体試料又はその処理物である２２．に記載の方法；
２５．１．から２０．のいずれかに記載のキットを用いた、乾癬患者の治療効果を予測又は判定する方法；及び
２６．ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する２種類の抗体を含むことを特徴とする、乾癬患者の検体からヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質量を測定するための免疫化学測定のキット；
等に関する。
　本発明により、乾癬患者の治療時における従来の臨床所見と比較して経時的な治療効果を判定し、その効果をより早期に予測し、かつ治療休止後の症状の変化を量的、客観的に判定するための方法及びそれらに使用するキットを提供でき、客観的で正確な予測又は判定結果を得ることができるようになった。さらにこれにより乾癬患者の診断及び重症度の客観的な評価、経時的な病状の推移の評価が可能となった。
　特に、患者に対する治療の有効性を既存の主観的要素の強い指標に比べ正確かつ客観的に判定できるようになり、また治療効果を早期に予測又は判定することが可能になった。ＱＯＬの観点からも無疹部をテープストリッピングによって得た検体を用いることは有用である。
乾癬患者、アトピー性皮膚炎患者、皮膚がん患者のそれぞれ皮疹部及び無疹部の角層から得られた抽出液中及び健常人の角層の検体から得られた抽出液中のヒトＦＡＢＰ５量を示した図である。２群間の比較はMann-Whitney U-testを用い、危険率５％を有意水準とした。健常人と乾癬無疹部：p<0.0001、健常人と乾癬皮疹部：p<0.00005、乾癬無疹部と乾癬皮疹部：p<0.0001。 乾癬患者の皮疹部及び無疹部の角層から得られた抽出液中のヒトＦＡＢＰ５量について、各患者別に皮疹部と無疹部の量の変化を比較した図である。 図３－１は、乾癬患者、アトピー性皮膚炎患者、皮膚がん患者及び健常人の各血中のヒトＦＡＢＰ５量を患者個体別に示した図である。２群間の比較はMann-Whitney U-testを用い、危険率５％を有意水準とした。健常人と乾癬患者：p<0.005。図３－２は、乾癬患者、アトピー性皮膚炎患者、皮膚がん患者及び健常人の各血中のヒトＦＡＢＰ５量を各群平均値±ＳＤで示した図である。 紫外線照射治療を施した乾癬患者の治療経過観察において、角層の検体から得られた抽出検体及び血液検体におけるヒトＦＡＢＰ５の測定値の推移と臨床指標及び臨床所見を比較した図である。 免疫抑制剤服用治療を施した乾癬患者の治療経過観察において、角層の検体から得られた抽出検体及び血液検体におけるヒトＦＡＢＰ５の測定値の推移と臨床指標及び臨床所見を比較した図である。 乾癬患者の治療休止期間における経過観察での角層の検体から得られた抽出検体及び血液検体におけるヒトＦＡＢＰ５の測定値の推移と臨床指標及び臨床所見を比較した図である。
　本発明のキット及びそれを用いた治療効果の予測又は判定方法は、乾癬患者の検体、具体的には、体液、皮疹部皮膚もしくは無疹部皮膚から採取した生体試料又はその処理物中のヒトＦＡＢＰ５量を測定することを特徴とするものである。
　乾癬患者の生体試料（例えば、角層、角質細胞、表皮細胞等）を皮疹部皮膚及び無疹部皮膚から得る方法としてはテープストリッピング法などが挙げられる。テープストリッピング法では角層チェッカー等のテープストリッピング用テープなどが使用できる。角層チェッカーは、肌荒れ等の程度の評価のために角層を採取するために用いられるもので、従来より使用されている。接着面の材質には、制限が無いが、角層を採取できる程度の粘着性があり、皮膚に対する刺激の無いものが望ましい。大きさについても特に制限は無いが、患者に対する負担の軽減のため、４０×６０ｍｍ以下のものが好ましい。より好ましくは２０～４０×４０～６０ｍｍの範囲から選ばれる。より具体的には４０×６０ｍｍのものを使用する。
　検体を得るためには患者の同一もしくは異なる採取部位、好ましくは同一採取部位にテープを５回以下着脱する。より具体的には、テープ着脱回数は１回でもよいが、好ましくは複数回であり、より好ましくは３回である。複数回着脱する場合、１枚のテープで行っても良いが、１回ごとに異なるテープを用いて行うことが好ましい。
　ヒトＦＡＢＰ５量を測定するためには、前述のようにして採取した生体試料を処理して測定に適した状態としたものを、検体として用いることが望ましい。具体的には、テープに付着した角層より測定の対象であるヒトＦＡＢＰ５を抽出する。抽出液は、緩衝液、界面活性剤、蛋白分解酵素阻害剤等を含んでいてもよい。緩衝液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝液－生理食塩水）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（トリス－塩酸緩衝液）、ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（メス緩衝液）、ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ヘペス緩衝液）等が挙げられる。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。蛋白分解酵素阻害剤としては、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）等が挙げられる。
　本発明において、乾癬の「治療」とは投薬による治療、光線（紫外線）療法等を意味し、「治療を受けている乾癬患者」とは、前記治療中の乾癬患者を意味し、投薬等が終了した観察期間中の乾癬患者も含む。「治療を受けている間の乾癬患者」とは、前記治療中の乾癬患者を意味し、投薬等が終了した観察期間中の乾癬患者は含まない。また、「治療休止前と休止後の乾癬患者」の「治療休止」とは、前記治療を受けて観察期間も終了した状態を意味する。前記種々の状態での乾癬患者の検体中のヒトＦＡＢＰ５量を測定し比較することにより、治療効果が早期に予測又は判定でき、したがって、本発明は前記種々の状態での乾癬患者の治療の有効性を示すことができる。本発明において、乾癬患者の検体は、皮疹部皮膚及び無疹部皮膚から得ることが患者への負担が少なく好ましいが、体液を用いることもできる。体液としては、血液、尿等が挙げられ、血液は、全血、血漿、血清のいずれを用いてもよい。体液は、そのまま用いてもよいし、濃縮液など処理物として用いてもよい。
　皮疹部と無疹部とでは、テープストリッピングの際の痛みがないことから無疹部皮膚から検体を採取することがより好ましい。さらに特筆すべきことに、本発明者らは、治療が奏功した患者において皮疹部よりも無疹部でより早期にヒトＦＡＢＰ５量の低下が認められ、治療の休止により症状が再燃した患者においても皮疹部より無疹部でより早期にヒトＦＡＢＰ５量の上昇が認められることを発見した。したがって無疹部皮膚からの検体採取は単に患者のＱＯＬに資するだけでなく、患者における治療効果をより早期に予測できるという点でも、皮疹部皮膚からの検体を用いるよりさらに有効である。
　ヒトＦＡＢＰ５の検出、量の測定方法は、特定の方法に限定されるものではないが、例えば、免疫化学的方法を用いることができる。特に検体から得られるヒトＦＡＢＰ５の検出及び定量を行い、正確に乾癬患者の症状を判定することができることから、免疫化学的方法が好ましい。免疫化学的方法としては、特定の方法に限定されるものではないが、例えば、酵素免疫化学的方法、放射性免疫化学的方法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、免疫クロマト法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、免疫比濁法、酵素センサー電極法などを用いることができる。これらの中では、感度が高いことから、酵素免疫化学的方法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法又は免疫クロマト法がより好ましい。酵素免疫化学的方法としては、競合法であってもよいが、簡単な操作でより高感度かつ精密にヒトＦＡＢＰ５量を測定できることから、非競合法の一種であるサンドイッチ型酵素免疫測定法であることがより好ましい。
　本発明における第一抗体は、担体に固定化されている。具体的には、担体として、下記に示すような「固相」又は、「ハプテン」、「磁気ビーズ」、「不溶性担体」が挙げられる。本明細書における「固定化」とは、上記担体に担持することを意味する。
　１種類の抗体、すなわち、本発明における「第一抗体」のみを用いる方法として、酵素免疫化学的方法の競合法が挙げられる。本方法は、担体に固定化された抗ヒトＦＡＢＰ５抗体に対し、酵素標識されたヒトＦＡＢＰ５と測定対象中の非標識ヒトＦＡＢＰ５とを競合させ、担体に固定化された抗ヒトＦＡＢＰ５抗体と結合した酵素標識ヒトＦＡＢＰ５の酵素量を測定することにより、測定対象中のヒトＦＡＢＰ５量を測定する方法である。（競合型酵素免疫測定法）
　担体としては、具体的には、固相、ハプテン又は磁気ビーズが挙げられる。それぞれの担体について、第一抗体と担体との固定化や担体と液相との分離（固液分離）は、後述の標識された抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体を用いる場合と同様に行うことができる。
　あるいは、後述のラテックス粒子等の不溶性担体を抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の担体として用いることもできる。この場合、酵素標識されたヒトＦＡＢＰ５の代わりに、多価担体に結合したヒトＦＡＢＰ５が使用される。即ち、抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を固定化したラテックス粒子に対し、多価担体に結合したヒトＦＡＢＰ５と測定対象中の遊離ヒトＦＡＢＰ５とを競合させ、抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を固定化したラテックス粒子と多価担体に結合したヒトＦＡＢＰ５との結合によって３次元的に形成される免疫複合体からなる凝集塊の凝集度合いを測定することで、測定対象中のヒトＦＡＢＰ５を測定する。（競合ラテックス法）
　多価担体とは免疫複合体を効率よく形成するため抗原を多価抗原とするための担体であり、抗原との結合数が１分子あたり複数個であることが必要である。ここで用いる多価担体は抗ヒトＦＡＢＰ５抗体と抗原との反応を妨げず、かつラテックスの非特異反応（自己凝集）を誘発しないものであれば、いかなる物質を用いてもよい。具体的には牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヘモシアニン及びサイログロブリン等が用いられる。本方法も短時間での測定が可能であり、短時間で多量の検体処理が可能な自動分析装置にも対応している。
　２種類の抗体、すなわち、本発明における「第一抗体」及び「第二抗体」を用いる方法として、サンドイッチ型酵素免疫測定法が挙げられ、本方法では、ヒトＦＡＢＰ５に存在している異なったエピトープを認識する２種類の抗体を用いる。
　本発明における「固相」とは、マイクロプレート、試験管等の反応容器等を意味する。抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を反応容器に固定化する方法としては、容器器壁と抗体分子はそれぞれわずかに帯電しているので、その静電的引力にて直接固定化させる方法、もしくは器壁に化学的処理を施しアミノ基やカルボキシル基等の官能基を結合させ、これと抗体が有する同様の官能基をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、スクシンイミド等の縮合試薬で結合させることで固定化する方法等がある。
　固相に固定化された第一抗体を用いたサンドイッチ型酵素免疫測定法として、前もって反応容器に固定化された抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体と酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体との間にヒトＦＡＢＰ５を挟みこみ、ヒトＦＡＢＰ５と結合した酵素標識抗体の酵素量を測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定する方法が挙げられる。（サンドイッチ型酵素免疫測定法１）
　本発明における「ハプテン」とは、サンドイッチ型酵素免疫測定法の他の方法で用いられる担体であり、ビオチンがその一例として挙げられる。ハプテンの１つであるビオチンで標識した、ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体と酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体との間にヒトＦＡＢＰ５を挟みこむ。そして、この酵素標識抗体－抗原－ビオチン標識抗体からなる抗原－抗体複合体をストレプトアビジン結合ウェルに移し、アビジン－ビオチン結合により抗原－抗体複合体をウェルに固定化した後、ヒトＦＡＢＰ５と結合した酵素標識抗体の酵素量を測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定する方法が挙げられる。（サンドイッチ型酵素免疫測定法２）
　ハプテンとしては、抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体と抗原との反応を妨げない限り、いかなる物質を用いても良い。ビオチン以外のハプテンを用いる場合、ハプテンに特異的に結合する物質として、アビジンの代わりに定法により作製される抗ハプテン抗体をウェル等の固相に固定化すればよい。ハプテンとハプテン結合物質の他の組み合わせとしては、ホルモン－ホルモンレセプター、糖－レクチンなどが挙げられる。ハプテン結合物質は、前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法１における第一抗体と同様の方法で、固相に固定化させることができる。
　サンドイッチ型酵素免疫測定法の他の方法としては、固相化ヒトＦＡＢＰ５第一抗体で捕捉したヒトＦＡＢＰ５とビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体との間で抗原抗体反応を行わせた後、酵素標識ストレプトアビジンを加えて、ヒトＦＡＢＰ５とビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ第二抗体を介して結合した標識抗体の酵素量を測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定する方法が挙げられる。この場合も、前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法２と同様に、第二抗体標識体のビオチンと酵素標識されたストレプトアビジンの組み合わせだけに限定されず、抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体と抗原との反応を妨げない限り、いかなるハプテン及びハプテン結合物質の組み合わせを用いても良い。（サンドイッチ型酵素免疫測定法３）
　本発明における「磁気ビーズ」とは、前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法１～３において、固相の代わりに用いられる担体であり、具体的には、磁化物質（例、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）を一様に分布させたポリスチレン等のポリマー製の磁気ビーズを用い、磁場をかけて抗原－抗体複合体を回収することができるものを意味する。この場合も、磁気ビーズと第一抗体を固定化させる場合は前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法１と同様、静電的な固定化や官能基を用いた化学的結合にて行うことができる。また、磁気ビーズと第一抗体とをハプテンを介して固定化させる場合は、前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法２と同様に行うことができる。本方法は、短時間での測定が可能であり、短時間で多量の検体処理が可能な自動分析装置にも対応している。
　本発明における第一抗体又は第二抗体が固定化した「不溶性担体」を用いる測定法の一つであるラテックス凝集法は、抗体結合ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用した方法である。この方法は、第一抗体と第二抗体のそれぞれが結合した２種の抗ヒトＦＡＢＰ５抗体結合ラテックス粒子と、ヒトＦＡＢＰ５との免疫反応で生じたラテックス粒子の凝集の程度を測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定するものである。
　即ちラテックス凝集法による本測定には、
（１）ラテックス粒子とこれに固定化した抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体とからなる、抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体結合ラテックス粒子
及び
（２）ラテックス粒子とこれに固定化した抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体とからなる、抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体結合ラテックス粒子
を用いる。これらは１個のラテックス粒子に複数個の抗体分子が固定化しており、ラテックス粒子１個に複数個のヒトＦＡＢＰ５分子が固定化することができる。即ち、（１）及び（２）の両方の抗体結合ラテックス粒子を含む反応溶液中にヒトＦＡＢＰ５が入ると、それぞれのラテックス粒子にヒトＦＡＢＰ５が反応し、ヒトＦＡＢＰ５の１分子あたり第一抗体結合ラテックス粒子と第二抗体結合ラテックス粒子が１個ずつ固定化することになる。さらにこの時抗体結合ラテックス粒子１個にはヒトＦＡＢＰ５分子が複数個固定化することになるので、その結果、（－ヒトＦＡＢＰ５－第一抗体結合ラテックス粒子－ヒトＦＡＢＰ５－第二抗体結合ラテックス粒子－ヒトＦＡＢＰ５－）ｎの免疫複合体が３次元的に形成され、短時間で凝集塊が生じる。ラテックス凝集法は、その凝集度合いを測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５の存在量を調べる方法である。本方法も短時間での測定が可能であり、短時間で多量の検体処理が可能な自動分析装置にも対応している。
　金コロイド凝集法は、抗体感作金コロイド粒子と抗原との凝集反応を利用した方法である。この方法は、抗ヒトＦＡＢＰ５抗体感作金コロイド粒子とヒトＦＡＢＰ５との免疫反応で生じた金コロイド粒子の凝集の程度を測定することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定するものである。
　測定原理は、凝集の媒体（不溶性担体）がラテックス粒子から金コロイド粒子に変わったこと以外は、ラテックス凝集法と同じである。
　免疫クロマト法は、全ての免疫化学反応系が保持されたシート状のキャリア（高分子重合体）を用いるものである。具体的には、金コロイド又はラテックス粒子などで標識された第一又は第二の抗ヒトＦＡＢＰ５抗体と、もう一方の抗ヒトＦＡＢＰ５抗体とが塗布されたニトロセルロース膜、ナイロン膜等の多孔質膜とを含むものである。この方法は、特別な測定機器が不要であることから、病院外での判定、及び救急などで迅速な判定が求められる場合に有利な方法である。また、この方法は、任意に設定した量、即ちカットオフ値以上のヒトＦＡＢＰ５の存否を定性的に検出するのに適している。
　免疫クロマト法では、検体をキャリアに滴下すると、検体中のヒトＦＡＢＰ５と金コロイド又はラテックス粒子などで標識された第一又は第二の抗ヒトＦＡＢＰ５抗体とが免疫反応して免疫複合体が生成する。この複合体がキャリア上を展開し、キャリア上の特定箇所に固定化されたもう一方の抗ヒトＦＡＢＰ５抗体に捕捉され、標識物が集積する。そしてこの集積の度合いを目視で観察することにより、ヒトＦＡＢＰ５量を測定するものである。
　本発明のキットは、（１）ヒトＦＡＢＰと特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、該第一抗体が固定化したハプテン、該第一抗体が固定化した磁気ビーズ、又は該第一抗体が固定化した不溶性担体、及び（２）ヒトＦＡＢＰと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化した不溶性担体、のうち、（１）のみ、もしくは（１）及び（２）を含むことを特徴とする乾癬患者の検体からヒトＦＡＢＰ量を測定するための免疫化学測定のキットである。
　本発明のキットは、ヒトＦＡＢＰ５を認識して特異的に反応する抗ヒトＦＡＢＰ５抗体（第一抗体及び第二抗体）を含むものである。抗ヒトＦＡＢＰ５抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。より特異性を有し、均質なキットを安定して供給できることから、モノクローナル抗体がより好ましい。この抗体としては、具体的には患者はヒトであるから、抗ヒトＦＡＢＰ５抗体が用いられる。本発明のキットにモノクローナル抗体を用いる場合、第一抗体（ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体等）と第二抗体（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体等）とのエピトープが異なることを予め確認しておくことが好ましい。
　本発明において用いられる抗体は、通常の方法により製造できる。ポリクローナル抗体は、ヒトＦＡＢＰ５でウサギ、マウス、ヤギ、ウマなどの動物を免疫することで得ることができる。また、モノクローナル抗体は、このようなヒトＦＡＢＰ５で免疫された動物の脾臓細胞とミエローマとを融合させ、クローニングを行ってハイブリドーマを選択し、これを培養することにより得ることができる。抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を製造する際に使用される抗原としてのヒトＦＡＢＰ５は、表皮組織等から単離、精製することによって得ることもできるが、細胞培養や遺伝子組み換え技術によっても得られる。また、抗原としてヒトＦＡＢＰ５の部分ペプチドを用いることもできる。部分ペプチドを用いる場合は、公知のヒトＦＡＢＰ５のアミノ酸配列に基づいて化学合成により製造することができる。
　本発明のキットがサンドイッチ型酵素免疫測定法に基づく場合、前述のようにして得られた抗ヒトＦＡＢＰ５抗体は、例えば酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体及びハプテン（例えば、ビオチン）標識抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体の形で当該キットに含まれる。第一抗体としては、ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の代わりに、固相化抗ヒトＦＡＢＰ５抗体、磁気ビーズに固定化された抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の形態とすることもできる。
　ここで、酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を得るために抗ヒトＦＡＢＰ５抗体と結合させる標識物としては、特定のものに限定されないが、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することができる。抗体と標識物との結合は、これらが有するカルボキシル基、アミノ基、チオール基、水酸基などの官能基を利用して、常法に従って行うことができる。
　ビオチン等のハプテンで標識した抗体における抗体とハプテンとの固定化は、ハプテン（ビオチン）分子又は抗体が有するカルボキシル基、アミノ基、チオール基、水酸基などの官能基を利用して、常法に従って行うことができる。
　ハプテン標識抗体を用いる場合、本発明のキットはハプテンと結合する物質をさらに含むことが好ましい。ハプテン結合物質は、固相（例、イムノプレートなどの反応容器）や磁気ビーズ等の担体に固定化された状態で提供され得る。例えば、ハプテンがビオチンの場合、ストレプトアビジンをマイクロプレートウェルやプラスチックビーズ可磁化物質（例、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）を一様に分布させたポリスチレン等のポリマー製磁気ビーズ等の固定対象（担体）に固定化させることにより、ストレプトアビジン結合担体を製造することができる。第一抗体を直接固定化させた抗体結合固相も同様に製造することができる。固相への固定化は、通常、ストレプトアビジンや抗体をクエン酸緩衝液等の適当な緩衝液に溶解し、固相表面と該溶液を適当な時間（１～２日）接触させることにより行うことができる。さらに非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白等を分解したリン酸緩衝液を固相と接触させ、ストレプトアビジンにコートされなかった固相表面部分、又は抗体結合固相の場合は、抗体にコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般的に行われる。
　本発明のキットが前述のサンドイッチ型酵素免疫測定法３に基づく場合、酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体の代わりに、ハプテン（例えば、ビオチン）標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体が当該キットに含まれる。当該キットは、固相化抗体－抗原－ハプテン標識抗体の抗原－抗体複合体を検出するための、標識されたハプテン結合物質をさらに含むことが好ましい。例えば、ハプテンがビオチンの場合、酵素標識ストレプトアビジンが当該キットに含まれ得る。
　本発明のキットにはさらに反応プレートを含めることができる。反応プレートは固相化処理されていないマイクロプレートを用いる。本プレートは、一般的に行われているように非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白等を分解したリン酸緩衝液を反応プレート器壁と接触させ、前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることができる。
　なお、ヒトＦＡＢＰ５を検出する酵素免疫測定方法及び酵素免疫測定試薬は、例えば、Guthmann F et al. Expression of fatty acid-binding proteins in cells involved in lung-specific lipid metabolism. Eur J Biochem 1998, 253:430-436、もしくはDenis C Y et al. Epidermal fatty acid-binding protein: a new circulating biomarker associated with cardio-metabolic risk factors and carotid atherosclerosis. Eur Heart J 2008, 29:2156-2163に記載されている。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質として過酸化水素水及び発色基質としてのｏ－フェニレンジアミン、反応停止物質としての硫酸などをキットに含めることができる。他の酵素を用いる場合でも、周知慣用の基質及び／又は反応停止物質等をキットに含めてよい。さらに、標識物質として酵素に代えてイムノアッセイで常用される放射性同位元素や蛍光・発光物質を用いることも可能である。
　ラテックス凝集法、金コロイド凝集法を用いてヒトＦＡＢＰ５を測定する場合、本発明のキットはラテックス粒子や金コロイド粒子といった不溶性担体に固定化した第一及び第二抗体を含む。免疫クロマト法を用いる場合には、該キットはラテックス粒子や金コロイド粒子といった不溶性担体に固定化した第二抗体と、固相化第一抗体とを含む。これらの方法に使用される試薬はこの分野において一般的であり、前述のようにして得られた抗ヒトＦＡＢＰ５抗体をこれらの試薬に適用することにより製造することができる。
　本発明のキットが競合型酵素免疫測定法に基づく場合、前述のようにして得られた抗ヒトＦＡＢＰ５抗体は、サンドイッチ型酵素免疫測定法と同様に、ハプテン（例えば、ビオチン）標識抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体の形で当該キットに含まれる。ビオチン等のハプテンと抗体との固定化は、ハプテン（ビオチン）分子又は抗体が有するカルボキシル基、アミノ基、チオール基、水酸基などの官能基を利用して、常法に従って行うことができる。ハプテン（ビオチン）標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の代わりに、固相化抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の形態とすることもできる。ハプテン（ビオチン）標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体を用いる場合、当該キットは、抗原－抗体複合体を捕捉するための、ハプテン結合物質（ストレプトアビジン）が固定化した固相をさらに含むことが好ましい。また、抗ヒトＦＡＢＰ５抗体もしくはハプテン結合物質（ストレプトアビジン）を固定化する担体として、マイクロプレートなどの固相に代えて、磁気ビーズを用いてもよい。
　競合型酵素免疫測定法に基づく本発明のキットは、測定対象中のヒトＦＡＢＰ５と競合的に抗ヒトＦＡＢＰ５抗体と反応させるための、標識されたヒトＦＡＢＰ５を含む。ヒトＦＡＢＰ５は、例えばヒト表皮細胞から自体公知の蛋白質分離・精製技術を用いて単離することもできるし、ヒト表皮細胞由来のＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲ法を用いてそのｃＤＮＡをクローニングし、適当な発現ベクターを用いて宿主細胞に導入し、組換え蛋白質として製造することもできるが、これらに限定されない。
　競合法で用いる酵素標識ヒトＦＡＢＰ５を得るためにヒトＦＡＢＰ５と結合させる標識物としては、特定のものに限定されないが、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することができる。ヒトＦＡＢＰ５と標識物との結合は、これらが有するカルボキシル基、アミノ基、チオール基、水酸基などの官能基を利用して、常法に従って行うことができる。
　そして、検体（皮疹部皮膚、無疹部皮膚並びに体液）のヒトＦＡＢＰ５の量を、本発明のキットを用いた酵素免疫化学的測定法により測定することで、乾癬患者の症状を客観的に正確に判定することができ、乾癬患者の重症度の客観的な評価が可能となる。さらに、経時的な症状の推移の評価が可能となる。すなわち、測定検体中のヒトＦＡＢＰ５量によって、乾癬患者の重症度及び症状の変化を評価することができる。よって、本発明において構築されたキットを用いて、ヒトＦＡＢＰ５量の変化を追跡することにより、患者における治療の有効性についての判定を行うことが可能となる。
　本発明のキットは、例えば、サンドイッチ型酵素免疫測定法に基づく場合、１個体の構成物には、以下のものを含む。（判定用試薬　例１）
・　抗ヒトＦＡＢＰ５抗体固相化マイクロプレート（ブロッキングも施されたもの）
・　酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体溶液とその容器
・　含量既知のヒトＦＡＢＰ５標準試薬液（標準曲線作製用）とその容器
・　反応溶液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　マイクロプレート洗浄液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　発色用試薬液（基質液）とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
・　反応停止液とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
　上記の構成物を紙箱等に纏めて１キットとする。
　また、判定用試薬　例１を高検出感度化した判定用試薬の１個体の構成物には、以下のものを含む。（判定用試薬　例２）
・　ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体溶液とその容器
・　酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体溶液とその容器
・　含量既知のヒトＦＡＢＰ５標準試薬液（標準曲線作製用）とその容器
・　反応用マイクロプレート（ブロッキングのみ施されたもの）
・　反応溶液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　ストレプトアビジン固相化マイクロプレート（ブロッキングも施されたもの）
・　マイクロプレート洗浄液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　発色用試薬液（基質液）とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
・　反応停止液とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
　上記の構成物を紙箱等に纏めて１キットとする。
　また、操作性向上等の目的で、判定用試薬　例２を改良した判定用試薬の１個体の構成物には、以下のものを含む。（判定用試薬　例３）
・　抗ヒトＦＡＢＰ５抗体固相化マイクロプレート（ブロッキングも施されたもの）
・　ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体溶液とその容器
・　酵素標識ストレプトアビジン溶液とその容器
・　含量既知のヒトＦＡＢＰ５標準試薬液（標準曲線作製用）とその容器
・　反応溶液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　マイクロプレート洗浄液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　発色用試薬液（基質液）とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
・　反応停止液とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
　上記の構成物を紙箱等に纏めて１キットとする。
　競合型酵素免疫測定法に基づく本発明のキットの１個体の構成物には、以下のものを含む。（判定用試薬　例４）
・　抗ヒトＦＡＢＰ５抗体固相化マイクロプレート（ブロッキングも施されたもの）
・　酵素標識ヒトＦＡＢＰ５溶液とその容器
・　含量既知のヒトＦＡＢＰ５標準試薬液（標準曲線作製用）とその容器
・　反応溶液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　マイクロプレート洗浄液（リン酸緩衝液－生理食塩水）とその容器
・　発色用試薬液（基質液）とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
・　反応停止液とその容器（酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５抗体の酵素量を測定するために使用）
　上記の構成物を紙箱等に纏めて１キットとする。
　本発明のキットによれば、治療を受ける予定の、又は受けている乾癬患者における治療効果が早期に予測又は判定できる。したがって、本発明は、前記キットを用い、乾癬の治療を受ける前と治療を受けている間の乾癬患者の検体中のヒトＦＡＢＰ５量を比較し、治療効果を判定する方法も提供する。
　本発明のキットを用いて治療効果を判定する場合には、前記の方法で少なくとも治療を受ける前と治療を受けている間又は治療後とにヒトＦＡＢＰ５量を測定する。治療を受けている間又は治療後の量が治療を受ける前のヒトＦＡＢＰ５量より低ければ治療は有効であるということができる。本発明のキットを用いて、治療休止後の経過観察を行う場合には、前記の方法で少なくとも休止前と休止後に量を測定する。休止前に比べて休止後の測定値が高ければ、患部が悪化していると判断することができる。
　以下に具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
参考例１
マウス抗ヒトＦＡＢＰ５モノクローナル抗体の取得
　組み換え体ヒトＦＡＢＰ５を生理食塩水にて１ｍｇ／ｍＬの量に調製し、続いて等量のアジュバントに懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に対し２週間間隔で２回、１回あたり１００μＬ／匹で免疫した（組み換え体ヒトＦＡＢＰ５は１回あたり５０μｇ／匹）。
　途中で１匹あたり３０μＬ部分採血を行い、抗血清レベルでの力価上昇度を免疫原である組み換え体ヒトＦＡＢＰ５との反応性を指標に確認した。
　力価確認方法は、９６穴マイクロプレートに固定化した組み換え体ヒトＦＡＢＰ５に抗血清を加え、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、比色法にて検出しその吸光度の高低で判断した。
　上記条件の免疫を２回行った後、抗体力価が十分上昇していることを確認した上で、組み換え体ヒトＦＡＢＰ５の生理食塩水溶液を腹腔内もしくは静脈内投与した（５０μｇ／匹）。さらにその後にこの免疫マウスを屠殺後、脾臓を無菌的に摘出し、無菌鉄メッシュでろ過後、脾細胞を調製した。細胞数を計測し（１０８　ｃｅｌｌｓ／匹）、次に予め培養していたマウスミエローマＰ３Ｘ６３と５：１の割合でＰＥＧ法により細胞融合した。
　ＰＥＧ法による細胞融合の後、融合細胞（ハイブリドーマ）を９６穴培養プレートに播種した。その後、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
　次に、培養プレート中でハイブリドーマがコロニーを形成したのを確認した上で、その培養上清を採取した。抗体力価を、免疫マウスの抗血清の力価確認と同様の方法で確認した。そして抗体産生クローンのハイブリドーマを継代培養し、限界希釈法によりクローニングを行った。
　クローニングは５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌもしくは１　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるようにハイブリドーマを希釈して９６穴培養プレートに播種した。本操作は、２回実施し、得られた単一コロニー由来の細胞を抗ヒトＦＡＢＰ５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした。
　次に得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを大量培養した。予め腹腔内にプリスタンを投与し、２週間予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に対し、ハイブリドーマを培養液から生理食塩水に置換後、５×１０６　ｃｅｌｌｓ／匹で投与した。そして１０～２５日間飼育し、腹水の貯留を待った。その後、腹部が腫脹したマウスより腹水を採取し、得られた腹水抗体を硫安塩析、プロテインＧ（ＧＥヘルスケア）によるアフィニティ精製を行うことによりマウス抗ヒトＦＡＢＰ５モノクローナル抗体を取得した。
参考例２
ヒトＦＡＢＰ５特異測定系の構築
　以下の試薬で構成したキットを用いて、サンドイッチ型酵素免疫測定法による酵素免疫測定を行った。なお、ここでは実施例１で得たモノクローナル抗体を用いているが、ポリクローナル抗体も用いることができる。尚、以下の各試薬の内容は当該分野において使用される通常のものである。
２－１　サンドイッチ型酵素免疫測定法１
　以下の手順に従って測定を行った。はじめに標準試薬又は検体をそれぞれ１００μＬずつ反応プレートに加えた。ついで、ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体液及び酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体液を等量混合し、反応プレートに２５μＬ加え、ミキサー撹拌し、室温で１６時間インキュベーションを行った。その後、この反応液を１００μＬずつストレプトアビジン結合ウェルに移し変え、室温で３０分インキュベーションを行った。そして、ＥＬＩＳＡ用ウォッシャーを用いて各ウェルから反応液を除去するとともに、各ウェルに洗浄原液を希釈して調製した洗浄液０．３ｍＬを加えて洗浄した。この洗浄を３回繰り返した後、ウェル中に残った洗浄液をペーパータオル等により除去した。ついで、基質液１００μＬを加え、室温、暗所で正確に３０分間インキュベーションを行った。その後、反応停止液１００μＬを加えて素早くミキサーにて撹拌することで、酵素反応を停止させた。各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
２－２　サンドイッチ型酵素免疫測定法２
　以下の手順に従って測定を行った。はじめに標準試薬又は検体をそれぞれ１００μＬずつ固相化抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体結合ウェルに加えてから、ミキサーにて攪拌し、室温で１時間反応させた。その後、ＥＬＩＳＡ用ウォッシャーを用いて各ウェルから反応液を除去するとともに、各ウェルに洗浄原液を希釈して調製した洗浄液０．３ｍＬを加えて洗浄した。この洗浄の操作を３回繰り返した後、ウェル中に残った洗浄液をペーパータオル等により除去した。酵素標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体１００μＬを反応ウェルに加え、室温で１時間反応させた後、上述と同様の洗浄操作を行った。ついで、基質液１００μＬを加え、室温、暗所で正確に３０分間インキュベーションを行った。その後、反応停止液１００μＬを加えて素早くミキサーにて撹拌することで、酵素反応を停止させた。各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
２－３　サンドイッチ型酵素免疫測定法３
　以下の手順に従って測定を行った。はじめに標準試薬又は検体をそれぞれ１００μＬずつ固相化抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体結合ウェルに加えてから、ミキサーにて攪拌し、室温で１時間反応させた。その後、ＥＬＩＳＡ用ウォッシャーを用いて各ウェルから反応液を除去するとともに、各ウェルに洗浄原液を希釈して調製した洗浄液０．３ｍＬを加えて洗浄した。この洗浄の操作を３回繰り返した後、ウェル中に残った洗浄液をペーパータオル等により除去した。ビオチン標識抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体１００μＬを反応ウェルに加え、室温で１時間反応させた後、上述と同様の洗浄操作を行った。ついで、酵素標識ストレプトアビジン１００μＬを反応ウェルに加え、室温で３０分反応させた後、上述と同様の洗浄操作を行った。次に基質液１００μＬを加え、室温、暗所で正確に３０分間インキュベーションを行った。その後、反応停止液１００μＬを加えて素早くミキサーにて撹拌することで、酵素反応を停止させた。各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
２－４　ラテックス凝集法
　以下の手順に従って測定を行った。本法は自動化分析機器での操作が可能である。はじめに標準試薬又は検体をそれぞれ１００μＬずつ反応容器に入れ、緩衝液で希釈後、抗ヒトＦＡＢＰ５第一抗体結合ラテックス粒子及び抗ヒトＦＡＢＰ５第二抗体結合ラテックス粒子を含む溶液を加え、３７℃で１０分程度反応後、波長５７０－８００ｎｍにおける単位時間あたりの吸光度変化を測定した。
参考例３
３－１　表皮由来の角層検体の採取
　乾癬患者及び健常人の表皮より、テープストリッピング用テープ（４０×６０ｍｍ）を用いて角層を採取した。採取は３枚のテープを用い、１枚あたり１回の着脱を同一箇所にて３回行うことにより、１検体あたり３枚の表皮採取テープを得ることとした。また、乾癬患者は皮疹部皮膚とその近傍の無疹部皮膚を採取した。
３－２　角層検体の抽出
　得られた１検体あたり３枚からなる角層採取テープ群を抽出溶媒中（４０ｍＭ　ＰＢＳ、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、ｐＨ７．０）に纏めて入れ、室温・２時間転倒撹拌した。ついでテープに対し超音波破砕による抽出を行い、さらにその後、室温・２時間転倒撹拌し測定用検体とした。
実施例１
ヒトＦＡＢＰ５特異測定系を用いた表皮抽出検体の測定
　参考例３で示された方法にて採取、抽出された乾癬患者の皮疹部皮膚及び同一患者の無疹部皮膚、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部皮膚及び同一患者の無疹部皮膚、皮膚がん患者の皮疹部皮膚及び同一患者の無疹部皮膚、並びに健常人皮膚の角層抽出検体について、測定を行った。
　その結果、乾癬患者皮疹部の角層のヒトＦＡＢＰ５蛋白質レベルは、健常人検体に比べ、明らかに高い値を示した。また乾癬患者無疹部の角層のヒトＦＡＢＰ５蛋白質レベルも、健常人検体に比べ明らかに高い値を示し、角層のヒトＦＡＢＰ５蛋白質は健常人＜無疹部＜皮疹部であった。特に皮疹部においては、最低値でも健常人検体最高値に対し約７０倍の高値を示した。
　また、皮疹部の角層においては乾癬患者の値がアトピー性皮膚炎患者及び皮膚がん患者の値に比し、明らかに高い値を示した。（図１）
　J Invest Dermatol 1992, 99(3):299-305.に記載されているように、本実施例では、表皮角層中のヒトＦＡＢＰ５蛋白質は乾癬患者においては皮疹部だけでなく無疹部においても健常人表皮部位に比べて高い発現をしていることを免疫染色による定性測定で示した。今回この染色像からの発現レベルの差について、視覚的主観的観点からの定性的判断手法をもって行っていたものを、定量手段による測定値算出による普遍的客観的判断による手法にて初めて表すことができた。
　乾癬患者において同一患者の無疹部と皮疹部におけるヒトＦＡＢＰ５測定値の関係について図２に示す。全ての患者において無疹部と皮疹部の間に１０倍以上の含有量差を認めた。免疫染色やウェスタンブロットでの手法では、無疹部と皮疹部との間の蛋白質発現レベルの差異についてこのように正確な定量性をもつ測定値として表すことは不可能である。また図１のように複数人の乾癬患者の表皮角層の抽出検体の無疹部と皮疹部におけるＦＡＢＰ５レベルを同時比較することは、困難であり、個々の検体試料を複数同時処理できる参考例３で示した定量的測定手法により、容易になった。
実施例２
ヒトＦＡＢＰ５特異測定系を用いた血漿検体の測定
　乾癬患者及び健常人について、採血後遠心分離をして得た血漿検体の測定を行った。
　併せてアトピー性皮膚炎患者、皮膚がん患者の血漿検体も測定した。
　その結果、乾癬患者群は健常人群より高値傾向を示した（図３－１）。皮疹部皮膚及び無疹部の角層の抽出検体ほどの差異ではなかったが、平均値にして健常人群の１．５倍程度の高値であった（図３－２）。アトピー性皮膚炎、皮膚がん患者群も同様に健常人群より高値傾向を示した。
　ヒトＦＡＢＰ５の血漿中での正常値については、Haider DG et al. Plasma adipocyte and epidermal fatty acid binding protein is reduced after weight loss in obesity. Diabetes, Obesity and Metabolism 2007, 9:761-763.においては２．６±０．５ｎｇ／ｍＬとされている。本実施例における健常人の測定値との差異は使用抗体の種類により検出感度が異なることが原因と考えられる。
実施例３
乾癬患者治療経過観察における皮膚角層の抽出検体測定値及び血漿検体測定値の推移と臨床指標及び臨床所見との比較検討
　乾癬患者について、紫外線療法及び免疫抑制剤服用における経過観察の検討を行った。臨床での治療奏功の指標として、従前より用いられている臨床指標及び臨床所見と比較しながら、角層抽出検体及び血漿検体中のヒトＦＡＢＰ５測定値の変化について対比検討を行った。
６－１　紫外線療法患者における治療経過観察
　紫外線療法による患者においては、１例目はナローバンドＵＶＢによる治療を行い、総照射量１４．５７Ｊ／ｃｍ２、照射回数３２回で実施した。紫外線照射２１日目において、既存の臨床指標（ＰＡＳＩスコアー）及び臨床所見（病変範囲値、紅斑スコア、鱗屑スコア）と同様に血漿中ヒトＦＡＢＰ５値は、同程度に減少した。さらに無疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値では治療前の測定値（前値：照射回数０）に対し１／１００、皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値では同じく１／５と顕著に減少した。既存の臨床指標及び臨床所見の値の減少度が２／３～１／３であるのに対し、角層中のヒトＦＡＢＰ５値は治療に対し明らかに鋭敏な反応を示した。また紫外線照射８０日目では無疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値は１／１００の減少度を維持し、皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値も１／１００まで減少し、ＰＡＳＩスコアー及び臨床所見の減少度に比べ明らかな減少度を示した。ＰＡＳＩスコアーの減少度から臨床症状が寛解したと判断された照射９２日目においても無疹部皮膚及び皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値は照射８０日目のレベルを維持していた。
　２例目においては、ナローバンドＵＶＢ、ＰＵＶＡの併用療法で治療を実施した。ナローバンドＵＶＢの総照射量は２５．３３Ｊ／ｃｍ２、照射回数は３１回、ＰＵＶＡの総照射量は３０．０５Ｊ／ｃｍ２であった。血漿中ヒトＦＡＢＰ５値、無疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値及び皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値については、照射８日目において治療前の測定値（前値：照射回数０）に対し明らかな減少を示し、以降もその傾向は照射８０日目まで維持された。本症例は臨床所見の病変範囲値の変化が治療期間を通してあまり認められなかったにも関わらず、無疹部皮膚及び皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５それぞれの値は治療開始より明らかに減少していた。さらに無疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値は１例目と同様、臨床指標（ＰＡＳＩスコアー）及び臨床所見（病変範囲値、紅斑スコア、鱗屑スコア）に先行した減少を示していた。また皮疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値も照射１４日目以降はＰＡＳＩスコアー及び臨床所見より先行した減少を示した。
　よって無疹部皮膚もしくは皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値は治療の経過と共に既存の臨床指標並びに臨床所見に一致した減少変化を示した。特に無疹部皮膚は既存の臨床指標ＰＡＳＩスコアー及び臨床所見に比べ明らかに早期にレベルが変化することが見出された。即ち無疹部皮膚もしくは皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値を測定することにより、主観的要素の多い視覚と触覚による判定に基づく既存の臨床指標（ＰＡＳＩスコアー）及び臨床所見に比べ、治療の奏功をより客観的に、かつより早期に把握できることが明らかとなった。また、無疹部皮膚のヒトＦＡＢＰ５値の変化が皮疹部よりさらに鋭敏であったことから、表皮検体採取の際、皮疹部の採取よりも患者の負担の少ない無疹部の採取によりその判断が可能と思われ、ＱＯＬの観点からも無疹部採取による本治療効果判定手法が有用であることが示された。
６－２　免疫抑制剤服用患者における治療経過観察
　免疫抑制剤（シクロスポリン：１５０ｍｇ／ｄａｙ）服用患者では服用９週目において、既存の臨床指標（ＰＡＳＩ）及び臨床所見（病変範囲値、紅斑、鱗屑スコア）と同様に無疹部皮膚ヒトＦＡＢＰ５値は治療前の測定値（前値：服用量０）に対して減少した。ＰＡＳＩスコアーの減少度から臨床症状が寛解したと判断された服用１４週目では、無疹部皮膚のみならず皮疹部ヒトＦＡＢＰ５値もＰＡＳＩスコアー及び臨床所見と同程度の減少を示した。少なくとも無疹部に関しては、ＰＡＳＩスコアー及び臨床所見に一致した変化を示したことから、無疹部皮膚もしくは皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値を測定することにより、主観的要素の多い視覚や触覚による判定に基づく既存の臨床指標（ＰＡＳＩスコアー）及び臨床所見に比べ、より客観的かつ定量的に治療の奏功が把握できることが示された。
実施例４
乾癬患者の治療休止期間における経過観察での皮膚角層の抽出検体測定値及び血液検体測定値の推移と臨床指標及び臨床所見との比較検討
　乾癬患者について、治療を休止している期間の経過観察の検討を行った。臨床での病態推移の指標として、従前より用いられている臨床指標及び臨床所見と比較しながら、角層抽出検体及び血液検体中のヒトＦＡＢＰ５測定値の変化について対比検討を行った。
　治療休止後から９週経過までの間に臨床指標並びに臨床所見はそれぞれ２倍未満程度増加した。よって皮疹部皮膚の状態は悪化していると判断された。一方、皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値は臨床指標に比べ明らかに増加し、皮疹部皮膚は約２３倍、無疹部皮膚は約４倍増加していた。よって既存の臨床指標並びに臨床所見に比べ皮膚の状態を鋭敏に反映するマーカーであることが示された。
　本検討では、無疹部皮膚もしくは皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値は既存の臨床指標並びに臨床所見に一致した増加変化を示した。さらに、無疹部皮膚及び皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値は、既存の臨床指標並びに臨床所見に比べ高い増加割合を示した。よって、無疹部皮膚及び皮疹部皮膚中のＥ－ＦＡＢＰ値を測定することにより、主観的要素の多い視覚と触覚による判定に基づく既存の臨床指標（ＰＡＳＩスコアー）及び臨床所見に比べ、治療休止期における病態について、客観的かつより感度良く把握できることが明らかとなった。また、皮疹部程でないものの、無疹部におけるヒトＦＡＢＰ５値の変化も既存の臨床指標並びに臨床所見に比べ明らかに鋭敏な変化を示していたことから、表皮検体採取の際、皮疹部皮膚の採取よりも患者の負担の少ない無疹部皮膚の採取により、その判断が可能と思われ、ＱＯＬの観点からも無疹部皮膚採取による本判定手法が有用であることが示された。
　本発明は、乾癬疾患の治療時における経時的な病状の推移について、従来の臨床所見と比較してより正確かつ客観的に治療効果の判定し、その治療効果をより早期に予測し、かつ治療休止後の症状の変化を量的、客観的に判定するための方法及びそれらに使用するキットを提供する。即ち、ヒトＦＡＢＰ５の蛋白質レベルの変化を皮膚の角層、血液等を測定することにより、既存の臨床指標並びに臨床所見との関連性を示し、乾癬治療における治療効果判定にて臨床的に有用であることを示した。さらに患者の負担の少ない正常部（無疹部）の採取においてもこの判定が可能であることを示した。
　本出願は、日本で出願された特願２０１０－１３５５２１（出願日：２０１０年６月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (19)

  1. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、
    を含むことを特徴とする、乾癬患者の検体からヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質量を測定するための免疫化学測定のキット。
  2. 　（２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化したハプテンもしくは不溶性担体、
    をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫化学測定のキット。
  3. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、及び
    （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載の免疫化学測定のキット。
  4. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化したハプテン、及び
    （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載の免疫化学測定のキット。
  5. 　（３）前記ハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相
    をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の免疫化学測定のキット。
  6. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した固相、及び
    （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第二抗体が固定化したハプテン、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載の免疫化学測定のキット。
  7. 　（３）前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質
    をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の免疫化学測定のキット。
  8. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した磁気ビーズ、及び
    （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する標識化された第二抗体、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載の免疫化学測定のキット。
  9. 　（１）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第一抗体が固定化した不溶性担体、及び
    （２）ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する第二抗体が固定化した不溶性担体、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載の免疫化学測定のキット。
  10. 　検体が乾癬患者の、体液、皮疹部皮膚もしくは無疹部皮膚から採取した生体試料又はその処理物である請求項１に記載の免疫化学測定のキット。
  11. 　乾癬患者の皮疹部皮膚、又は無疹部皮膚から検体を採取するためのテープストリッピング用テープをさらに含む請求項１から１０のいずれか１項に記載の免疫化学測定のキット。
  12. 　標識と反応する基質をさらに含む請求項１から８、１０及び１１のいずれか１項に記載の免疫化学測定のキット。
  13. 　治療を受けている乾癬患者における治療効果が早期に予測又は判定できる、又は治療休止後の症状の変化が判定できる請求項１から１２のいずれか１項に記載の免疫化学測定のキット。
  14. 　請求項１から１３のいずれか１項に記載のキットを用い、治療を受ける前と治療を受けている間の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較し、治療効果を予測又は判定する方法。
  15. 　請求項１から１３のいずれか１項に記載のキットを用い、治療休止前と休止後の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較し、患部の状態を判定する方法。
  16. 　治療を受ける前と治療を受けている間の乾癬患者の検体中のヒト表皮型脂肪酸結合蛋白量を比較することによる、治療効果を予測又は判定する方法。
  17. 　検体が乾癬患者の、体液、皮疹部皮膚又は無疹部皮膚から採取した生体試料又はその処理物である請求項１５に記載の方法。
  18. 　請求項１から１３のいずれか１項に記載のキットを用いた、乾癬患者の治療効果を予測又は判定する方法。
  19. 　ヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質と特異的に結合する２種類の抗体を含むことを特徴とする、乾癬患者の検体からヒト表皮型脂肪酸結合蛋白質量を測定するための免疫化学測定のキット。
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