CN110494561A - 抗ApoA1抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于，取得无论高密度脂蛋白的修饰状态如何、另外无论是否摄取了标记胆甾醇均能够与高密度脂蛋白结合的抗体。一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其可以与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的氨基酸序列所构成的肽或第201～267位的氨基酸序列所构成的肽结合、且可以与下述(1)～(3)的高密度脂蛋白结合；(1)经氧化修饰的高密度脂蛋白、(2)未经氧化修饰的高密度脂蛋白、和(3)摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白。
Description
技术领域
本说明书公开与载脂蛋白A-1(本说明书中称为“ApoA1”)结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。另外，本说明书公开使用上述单克隆抗体或其抗原结合片段的高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的测定方法以及高密度脂蛋白的定量方法。进一步地，本说明书公开包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段的高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒、和高密度脂蛋白的定量用试剂盒。
背景技术
近年来，脂蛋白的功能作为评价疾病的存在、疾病风险的指标而受到关注。例如，已知高密度脂蛋白(HDL)是脂蛋白的一种，利用HDL从末梢组织排出胆甾醇的功能对于心血管疾病的风险而言为负向预后因子。
为了正确地进行这样的临床评价，定量地、精度良好地评价脂蛋白的功能是重要的。期望的是，优选在从生物体内捕捉脂蛋白后通过B/F分离来除去夹杂物，以高S/N来评价功能。另一方面，已知脂蛋白在生物体内接受氧化修饰反应，氧化程度会根据个体差异、实时状况而改变。为了正确地进行脂蛋白的功能评价，期望不论脂蛋白的氧化状态如何均捕捉脂蛋白、在此基础上对功能进行分析。
非专利文献1公开了一种抗ApoA1抗体，其不论HDL的氧化状态如何均同样地与HDL结合。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利申请公开第2016/0109469号说明书
非专利文献
非专利文献1:DiDonato JA et al.,Circulation.2013Oct 8；128(15):p1644-1655
发明内容
发明要解决的课题
在测定高密度脂蛋白的功能的基础上，常常需要使用标记胆甾醇并捕捉摄取了标记胆甾醇的脂蛋白(例如专利文献1)。
本发明的一课题在于，提供不论有无氧化均能与高密度脂蛋白结合、并且不仅与未摄取标记胆甾醇的高密度脂蛋白结合、而且与摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白也能结合的抗体和其抗原结合片段。
用于解决课题的手段
本发明人们反复进行了深入研究，结果确认：取得不论高密度脂蛋白有无氧化修饰均能够与高密度脂蛋白、和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白结合的单克隆抗体，通过使用该抗体可以进行高密度脂蛋白的功能评价。
本说明书中，作为课题解决手段的第1方式，公开了具有下述特征的单克隆抗体或其抗原结合片段：与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的氨基酸序列所构成的肽或第201～267位的氨基酸序列所构成的肽结合、且能与下述(1)～(3)的高密度脂蛋白结合，
(1)经氧化修饰的高密度脂蛋白、
(2)未经氧化修饰的高密度脂蛋白、和
(3)摄取了下述式(I)所示的标记胆甾醇的高密度脂蛋白：[化1]
根据本方式的单克隆抗体或其抗原结合片段，不论高密度脂蛋白的氧化修饰状态、有无摄取标记胆甾醇均可以与脂蛋白结合，因此能够捕捉该高密度脂蛋白和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白。
本说明书中，作为课题解决手段的第2方式，公开了产生上述单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤。
本说明书中，作为课题解决手段的第3方式，公开了测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法，其包含：将上述单克隆抗体或其抗原结合片段、包含标记物质的标记胆甾醇和高密度脂蛋白混合，从而形成包含上述摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白和上述单克隆抗体或其抗原结合片段的复合体的工序；和，检测起因于上述复合体中的标记物质的信号的工序。根据本方式，对于高密度脂蛋白，不论其氧化修饰状态，均可以测定标记胆甾醇摄取能力。
本说明书中，作为课题解决手段的第4方式，公开一种高密度脂蛋白的定量方法，其包含：将高密度脂蛋白、捕捉抗体和检测抗体混合而形成复合体的工序；和，对上述复合体进行定量的工序。上述捕捉抗体和上述检测抗体分别为选自由与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、以及与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段组成的组中的一种。根据本方式，可以再现性良好地测定高密度脂蛋白。
本说明书中，作为课题解决手段的第5方式，公开一种高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定方法。本方式包含：将由被检体取得的第1试样中的高密度脂蛋白和标记胆甾醇混合，形成摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白的工序；将第1捕捉抗体和上述摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白混合，从而形成上述摄取了标记胆甾醇的上述高密度脂蛋白和上述捕捉抗体的第1复合体的工序；和，取得起因于上述第1复合体中的标记物质的第1测定值的工序；以及，将由与上述被检体相同的被检体取得的第2试样中的高密度脂蛋白、第2捕捉抗体和检测抗体混合，形成第2复合体的工序；取得上述第2复合体的第2测定值的工序；和基于上述第1测定值和上述第2测定值算出高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的工序。本方式中，上述第1捕捉抗体为权利要求1～7中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，上述第2捕捉抗体和上述检测抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、或与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。根据本方式，可以再现性良好地测定标记胆甾醇摄取能力。
本发明的方法所涉及的方式是离体进行的。
发明的效果
根据本说明书所公开的单克隆抗体和抗原结合片段，不论高密度脂蛋白的氧化修饰状态，均可以检测高密度脂蛋白、和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白。
附图说明
图1的A示出各克隆相对于未处理重组ApoA1或氧化重组ApoA1的反应性。图1的B示出各克隆相对于未处理HDL或氧化HDL的反应性。横轴表示克隆名。
图2示出与图1不同的克隆相对于未处理HDL或氧化HDL的反应性。横轴表示克隆名。
图3的A示出1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、和P1A7抗体对标记胆甾醇-HDL的捕捉能力。图3的B示出1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、和P1A7抗体对HDL的捕捉能力。图3中，HighTG mix.表示高甘油三酯混合血清，Normal mix.表示正常混合血清。
图4的A示出在未氧化处理(-)的HDL和氧化处理(+)的HDL之间比较1C5抗体对标记胆甾醇-HDL的捕捉能力的结果。图4的B示出在未氧化处理(-)的HDL和氧化处理(+)的HDL之间比较1C5抗体的HDL的捕捉能力的结果。图4中，(-)表示阴性对照。oxidation(-)表示未氧化处理，oxidation(+)表示受到氧化处理。
图5示出8E10抗体、P1-A5抗体、P1-A7抗体、和1C5抗体对序列号1所示的氨基酸序列中所含的部分序列的结合性。
图6示出8E10抗体和抗His标签抗体对序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的范围内所含的各种部分序列的结合性。
图7是示出高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒的一例的概略图。
图8是示出高密度脂蛋白的定量用试剂盒的一例的概略图。
具体实施方式
[单克隆抗体或其抗原结合片段]
第1方式涉及与ApoA1结合的单克隆抗体或其结合片段。
ApoA1是指载脂蛋白A-1，优选为人来源的ApoA1。进一步优选为序列号1所示的蛋白质。在生物体内，由ApoA1基因转录和翻译序列号1的ApoA1，然后将N末端侧切断。HDL以序列号2所示的成熟型ApoA1形式存在。本方式中，在言及ApoA1的氨基酸序列上的特定区域时，基于序列号1中记载的氨基酸序列。另外，本方式中，ApoA1包含与序列号1所示的氨基酸序列具有70％以上、优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上的同源性的蛋白质。关于这些的同源性，可以使用National Center forBiotechnology Information(NCBI)中揭示的blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins&PROGRAM＝blastp&BLAST_PROGRAMS＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&DBSEARCH＝true&QUERY＝&SUBJECTS＝)等求出。
单克隆抗体与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的范围或第201～267位的范围结合。优选单克隆抗体与序列号1所示的氨基酸序列的第91～110位的范围结合。另外，本方式的单克隆抗体优选不与序列号1所示的氨基酸序列的第101～160位的范围结合。进一步地，本方式的单克隆抗体优选也不与序列号1所示的氨基酸序列的第2～60位和第151～210位的范围结合。
进一步地，单克隆抗体可以与下述蛋白结合：
(1)经氧化修饰的高密度脂蛋白、
(2)经氧化修饰的高密度脂蛋白、和
(3)摄取了下述式(I)所示的标记胆甾醇的高密度脂蛋白：[化2]
其中，高密度脂蛋白也被称为HDL。高密度脂蛋白是具有1.063g/mL以上的密度的脂蛋白。
高密度脂蛋白的氧化修饰是指至少该高密度脂蛋白中所含的ApoA1蛋白质或脂质的氧化，除此以外没有特别限制。作为ApoA1的氧化修饰，可列举例如：丙二醛修饰；成熟型ApoA1的第192位的酪氨酸残基的氯化、第18位的酪氨酸残基的硝基化(J BiolChem.2012Feb 24；287(9):6375-86.)、第72位的色氨酸残基的羟基化(Nat Med.2014Feb；20(2):193-203.)。作为脂质的氧化修饰，可列举氧化磷脂酰胆碱修饰(J.Biol.Chem.2,69,15274-15279,1994)等。作为离体进行氧化修饰的方法，可列举例如如非专利文献1中记载那样使用过氧化氢等将高密度脂蛋白氧化的方法。
关于与高密度脂蛋白结合，只要上述单克隆抗体或其抗原结合片段通过抗原抗体反应与高密度脂蛋白中所含的ApoA1的至少一部分结合则没有限制。结合优选是指可以捕捉高密度脂蛋白。更优选地，结合是指在不含牛血清白蛋白的PBS或不含牛血清白蛋白的StartingBlock(PBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher SCIENTIFIC/制品编号37538)中发生的结合。结合是指：在将上述单克隆抗体或其抗原结合片段作为捕捉抗体而通过ELISA法检测高密度脂蛋白或具有序列号1所示的上述氨基酸序列的肽时，包含高密度脂蛋白或具有上述氨基酸序列的肽的孔的信号比包含PBS等阴性对照的孔的信号高。不结合是指：在将上述单克隆抗体或其抗原结合片段作为捕捉抗体而通过ELISA法检测高密度脂蛋白或具有序列号1所示的上述氨基酸序列的肽时，包含高密度脂蛋白或具有上述氨基酸序列的肽的孔的信号与包含PBS等阴性对照的孔的信号为同等或比其低。该结合可以不仅对非变性的高密度脂蛋白发生、而且对变性后的高密度脂蛋白也发生。优选上述单克隆抗体或其抗原结合片段与在非变性条件下的试样中以非变性的状态存在的高密度脂蛋白结合。非变性状态的高密度脂蛋白是指例如维持蛋白质和脂质的复合体的高密度脂蛋白。变性是指例如未维持蛋白质和脂质的复合体。另外，就变性而言，可以包含蛋白质的二级结构以上的高级结构的全部或一部分被可逆或不可逆地破坏的状态。具体而言，变性包含例如：高密度脂蛋白的带电状态全部或部分改变的状态、和/或高密度脂蛋白中所含的蛋白质的二硫键全部或部分被切断的状态。
上述试样只要包含从哺乳动物等被检体取得的检体来源的高密度脂蛋白、优选人的高密度脂蛋白则没有特别限定。作为检体，可列举例如血液、血清和血浆之类的血液试样。试样可以是例如检体本身，也可以是将检体用生理盐水、PBS等稀释而得的，或者可以是由检体中通过专利文献1所记载的聚乙二醇法回收的高密度脂蛋白的悬浮液等。上述试样优选包含与胆甾醇形成酯的脂肪酸。
另外，作为第1方式的单克隆抗体，可列举由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代(包含传代物)产生的单克隆抗体。保藏编号NITE BP-02442和保藏编号NITE BP-02443所规定的杂交瘤分别以标识表示“8E10”和“P1A5”于2017年3月8日在位于日本千叶县木更津上总镰足2-5-8 122号室的独立行政法人制品评价技术基盘机构的微生物保藏中心进行了国际保藏。在本说明书中，有时将由这些杂交瘤产生的抗体分别称为8E10抗体和P1A5抗体。该单克隆抗体可以与上述特征(1)～(3)的全部的高密度脂蛋白结合。
另外，第1方式的单克隆抗体以具备上述特征为限度，包含含有与由上述杂交瘤或其后代分别产生的单克隆抗体的全部或一部分相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
另外，上述单克隆抗体中包含：它们的重链互补性决定区(HCDR)和轻链互补性决定区(LCDR)的氨基酸序列与由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的各单克隆抗体的HCDR和LCDR的氨基序列一致的单克隆抗体。具体而言，包含具有与保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的各单克隆抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列一致的氨基酸序列所构成的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的单克隆抗体。
通常，抗原结合片段是指保持着抗原结合能力和/或抗原识别能力的、抗体的一部分。本方式中，抗原结合片段为上述单克隆抗体的一部分，与该单克隆抗体同样地保持与其抗原即ApoA1的结合能力和/或抗原识别能力，具备下述特征。
与(a)序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的氨基酸序列、优选为第91～110位的氨基酸序列所构成的肽或(b)序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位的氨基酸序列所构成的肽结合。
优选与(c)序列号1所示的氨基酸序列的第91～110位的氨基酸序列所构成的肽结合。
更优选不与(d)序列号1所示的氨基酸序列的第101～160位的范围结合。
进一步优选不与(e)序列号1所示的氨基酸序列的第2～60位和第151～210位的氨基酸序列所构成的肽结合。
进一步地，上述抗原结合片段除了上述(a)至(e)的特征以外，还可以与下述蛋白结合：
(1)经氧化修饰的高密度脂蛋白、
(2)经氧化修饰的高密度脂蛋白、和
(3)摄取了式(I)所示的标记胆甾醇的高密度脂蛋白。
[化3]
作为本方式的对象的抗原结合片段只要具有所述特征则没有限制，可以是例如包含上述的单克隆抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、diabody、dsFv、CDR的肽等。这些抗原结合片段的制备方法是公知的，例如，可以通过美国专利申请公开第2016/0159895号说明书中记载的方法来制备。
[杂交瘤]
第2方式涉及保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443所规定的杂交瘤或其后代。该后代包含所保藏的杂交瘤本身、所保藏的杂交瘤的培养物、从所保藏的杂交瘤中分出的部分、这些的进一步传代培养的细胞等。如上所述，该杂交瘤于2017年3月8日在国际保藏机构进行了国际保藏。将杂交瘤的制作方法的例子示于后述的实施例1。
[测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法1]
第3方式涉及测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法(以下有时简称为测定方法)。
＜复合体的形成＞
第3方式中，将上述[单克隆抗体或其抗原结合片段]一栏所述的单克隆或抗原结合片段和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白混合，从而形成上述摄取了标记胆甾醇的上述高密度脂蛋白和上述单克隆抗体或其抗原结合片段的复合体(也称为第1复合体)。与上述摄取了标记胆甾醇的上述高密度脂蛋白形成复合体的上述单克隆抗体或其抗原结合片段之一可以优选为用于将上述摄取了标记胆甾醇的上述高密度脂蛋白捕捉到后述的固相等的捕捉抗体(也称为第1捕捉抗体)。
上述高密度脂蛋白优选为试样中所含的高密度脂蛋白。关于试样，可以将上述[单克隆抗体或其抗原结合片段]一栏中的说明援引于此。
将单克隆抗体或抗原结合片段和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白混合的条件只要可以使单克隆抗体或抗原结合片段与上述摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白结合则没有限制。
在与摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白进行混合时，捕捉抗体可以是结合于磁珠、塑料珠、板等固相的状态。单克隆抗体或抗原结合片段的固相化可以按照公知的方法进行。
将捕捉抗体固定于固相时，将捕捉抗体固定于固相的方式没有特别限定。例如，可以使捕捉抗体和固相直接结合，也可以使捕捉抗体和固相之间夹有其它物质、从而间接结合。作为直接结合，可列举例如物理性吸附等。作为间接结合，可列举例如介由与亲和素类组合的结合。这种情况下，通过将捕捉抗体预先用生物素修饰、在固相上预先结合亲和素类，从而可以介由生物素和亲和素类的结合而将捕捉抗体和固相间接地结合。本实施方式中，捕捉抗体和固相的键合优选为介由生物素和亲和素类的间接结合。
固相的材料没有特别限定，例如可以从有机高分子化合物、无机化合物、生物高分子等中选择。作为有机高分子化合物，可列举胶乳、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可列举磁性体(氧化铁、氧化铬和铁氧体等)、二氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物高分子，可列举不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。可以将这些中的两种以上组合使用。固相的形状没有特别限定，可列举例如粒子、膜、微孔板、微型管、试管等。它们中，优选粒子，特别优选磁性粒子。
标记胆甾醇是在胆甾醇分子的一部分上结合有成为标记的分子(标记物质)的物质。其中，标记胆甾醇中的胆甾醇部分可以具有天然存在的胆甾醇结构，或者，也可以具有从天然存在的胆甾醇的C17位上所键合的烷基链中除去了1个以上的亚甲基和/或甲基而成的胆甾醇(也称为降胆甾醇)的结构。
由于脂蛋白将胆甾醇酯化并摄取，因此更优选使用被脂蛋白酯化的标记胆甾醇。需要说明的是，本实施方式的方法中，在与高密度脂蛋白混合时，标记胆甾醇可以在高密度脂蛋白中所含的卵磷脂-胆甾醇脂酰转移酶(LCAT)活性作用下与试样中所含的脂肪酸进行酯化。脂蛋白所实现的标记胆甾醇的酯化的确认方法本身在该技术领域中是公知的，可以由本领域技术人员常规地进行。
标记物质只要产生可检测的信号则没有特别限定。例如，可以是其本身产生信号的物质(以下也称为“信号产生物质”)，也可以是催化其它物质的反应而产生信号的物质。作为信号产生物质，可列举例如荧光物质、发光物质、显色物质、放射性同位素等。
标记物质对抗体的标记可以通过免疫测定技术领域中公知的标记方法进行。另外，可以使用市售的标记试剂盒等进行标记。
荧光物质优选包含具有极性结构的荧光团。在该技术领域中，荧光标记胆甾醇和包含具有极性结构的荧光团的标记胆甾醇本身是公知的。
作为这类包含具有极性结构的荧光团的荧光标记胆甾醇，可列举例如包含具有下述式(II)：
[化4]
所示的氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY(注册商标))骨架结构或下述式(III)：
[化5]
所示的苯并噁二唑骨架结构的荧光团的荧光标记胆甾醇等。
作为标记胆甾醇，优选为下述式(I)所示的化合物：
[化6]
((23-(二吡咯亚甲基二氟化硼)-24-降胆甾醇、商品名TopFluor Cholesterol、CAS No：878557-19-8，可以由Avanti Polar Lipids公司获得)或
下述式(IV)所示的化合物：
[化7]
(25-[N-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)甲基]氨基]-27-降胆甾醇、商品名25-NBD Cholesterol、CAS No：105539-27-3，可以由Avanti Polar Lipids公司获得)，更优选为上述式(I)所示的化合物。
除了上述以外，作为荧光物质，还可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、AlexaFluor(注册商标)等荧光色素、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)等荧光蛋白等。
作为放射性同位素，可以使用125I、14C、32P等。
作为催化其它物质的反应并产生可检测的信号的物质，可列举例如酶。作为酶，可列举碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。
标记胆甾醇可以具有标签作为标记物质。标记有标签的胆甾醇也被称为添加了标签的胆甾醇。使用添加了标签的胆甾醇的情况下，在后述的信号检测工序中，可使用与标签特异性结合的物质(以下记作“捕捉体”)来检测信号。标签可以是天然来源的物质和合成的物质中的任一者，可列举例如化合物、肽、蛋白质、核酸和它们的组合等。就化合物而言，只要是存在或可以得到能与其特异性结合的物质则可以为该技术中公知的标记化合物，可列举例如色素化合物等。
在该技术中，已知胆甾醇通过被酯化而脂溶性增大，促进脂蛋白的摄取。添加到胆甾醇上的标签可以是脂溶性或疏水性的物质。
作为标签和能与该标签特异性结合的物质的组合，可列举例如：抗原与识别该抗原的抗体、半抗原与抗半抗原抗体、肽或蛋白质与识别它们的适体、配体与其受体、寡核苷酸与具有其的互补链的寡核苷酸、生物素与亲和素(或链霉亲和素)、组氨酸标签(包含6～10个组氨酸残基的肽)与镍、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与谷胱甘肽等。作为标签的抗原可以是该技术中公知的肽标签和蛋白标签，可列举例如FLAG(注册商标)、血凝素(HA)、Myc蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)等。作为标签的半抗原可列举例如2,4-二硝基苯酚等。
作为捕捉体使用的抗体可以是以标记物质或其一部分为抗原免疫人以外的动物而得到的多克隆抗体、单克隆抗体、和它们的片段(例如Fab、F(ab)2等)。另外，免疫球蛋白的类和亚类没有特别限制。
作为标签的例子，可列举具有上述的式(II)所示的结构或下述的式(V)所示的结构的标签。
[化8]
式(II)所示的结构是氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY(注册商标))骨架，式(V)所示的结构表示生物素的一部分。对于添加了包含式(II)或(V)所示的结构的标签的胆甾醇而言，针对这些标签的捕捉体通常可以获得，因此是优选的。
另外，添加了具有2,4-二硝基苯基(DNP)的标签的胆甾醇由于抗DNP抗体有市售而优选。
作为添加了标签的胆甾醇，可列举例如下述的式(VI)所示的添加了标签的胆甾醇。
[化9]
(式中，R1是可具有甲基的碳数1～6的亚烷基，
X和Y相同或不同，由-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或-S-R2-表示，其中，R2分别独立地表示连接键、可具有取代基的碳数1～10的亚烷基、可具有取代基的碳数6～12的亚芳基或杂亚芳基或可具有取代基的碳数3～8的亚环烷基或亚杂环烷基，
L由-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-表示，其中，R3是氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，
TAG是标签，
a和c相同或不同，为0～6的整数，
b是0或1，
d和e相同或不同，为0～12的整数，
f是0～24的整数。)
式(VI)中，a、b和c中的任一者为0时，该式所示的添加了标签的胆甾醇不具有接头，标签和胆甾醇部分直接键合。式(VI)中，a、b和c中的任一者不为0时，该式所示的添加了标签的胆甾醇在标签和胆甾醇部分之间具有接头(-[X]a-[L]b-[Y]c-)。可认为，接头使露出到脂蛋白的外表面的标签和捕捉体变得更容易结合。以下对式(VI)的各取代基进行说明。
R1可以以碳数1～6的亚烷基为主链、在任一位置具有甲基。R1相当于键合于天然存在的胆甾醇的C17位的烷基链。在本实施方式中，R1在碳数是1～5时，优选为天然存在的胆甾醇的C20的位置具有甲基。R1在碳数是6时，优选为与天然存在的胆甾醇的C20位～C27位的烷基链相同的结构。
[X]a相当于R1与L、[Y]c或标签的连接部分。[Y]c相当于R1、[X]a或L与标签的连接部分。X和Y可根据使胆甾醇部分与接头结合的反应和接头与标签结合的反应的种类来决定。
关于R2，连接键是指在其间没有其它原子而直接键合。在R2是碳数1～10的亚烷基时，作为这类亚烷基，可列举例如亚甲基亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚戊基(ペンチレン)、亚新戊基(ネオペンチレン)、亚己基、亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、亚壬基和亚癸基等基团。它们中，优选碳数1～4的亚烷基。R2为具有取代基的亚烷基时，上述的碳数中不含取代基的碳数。
R2是亚芳基或杂亚芳基时，这类基团只要是可以包含选自N、S、O和P中的1个以上的杂原子的碳数6～12的芳香环即可。可列举例如亚苯基、亚萘基、亚联苯基、呋喃亚基、吡咯亚基、噻吩亚基、三唑亚基、噁二唑亚基、吡啶亚基、嘧啶亚基等基团。R2是具有取代基的亚芳基或杂亚芳基时，上述的碳数中不含取代基的碳数。
R2是亚环烷基或亚杂环烷基时，这类基团只要是可以包含选自N、S、O和P中的1个以上的杂原子的碳数3～8的非芳香环即可。可列举例如亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、吡咯烷亚基、哌啶亚基、吗啉亚基等基团。R2是具有取代基的亚环烷基或亚杂环烷基时，上述的碳数中不含取代基的碳数。
作为R2中的取代基，可列举例如羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、和硫醚等基团。R2可具有多个取代基。其中，卤素表示氟、氯、溴、或碘。烷氧基表示-O-烷基，该烷基是碳数1～5、优选为碳数1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。
优选a和c均为1，X和Y相同或不同，为-(C＝O)-NH-、或-NH-(C＝O)-。
L相当于间隔基，具有对接头赋予规定的长度的聚合物结构。该聚合物结构部分优选具有不妨碍脂蛋白对胆甾醇的摄取且使接头部分不易被脂蛋白摄取的性质。作为这类聚合物，可列举聚乙二醇(PEG)等亲水性聚合物。在优选的实施方式中，L是由-(CH2)d-[O-(CH2)e]f-、或-[(CH2)e-O]f-(CH2)d-表示的结构。其中，d和e相同或不同，为0～12的整数、优选为2～6的整数、更优选均为2。f是0～24的整数、优选为2～11的整数、更优选为4～11的整数。
作为不具有接头的添加了标签的胆甾醇，可列举例如上述式(I)所示的荧光标记胆甾醇(23-(二吡咯亚甲基二氟化硼)-24-降胆甾醇)。该添加了标签的胆甾醇中，标签(具有BODIPY骨架结构的荧光部分)与胆甾醇的C23位直接结合。作为上述的具有BODIPY骨架结构的荧光部分的特异性结合捕捉体，有抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies公司)在销售。
作为标签介由接头而结合的添加了标签的胆甾醇，可列举下述的式(VII)所示的添加了生物素的胆甾醇，[化10]
(式中，n是0～24的整数、优选为2～11的整数、更优选为4～11的整数。)。该添加了标签的胆甾醇中，标签(式(V)所示的生物素部分)介由接头(聚乙二醇)而与胆甾醇部分结合。作为生物素部分的特异性结合捕捉体，适宜为亲和素或链霉亲和素。另外，结合有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等标记物质的亲和素或链霉亲和素也有销售。
另外，可列举下述的式(VIII)所示的添加DNP的胆甾醇。
[化11]
该添加了标签的胆甾醇中，DNP介由接头(-(C＝O)-NH-CH2-CH2-NH-)而与胆甾醇部分结合。
作为DNP特异性结合捕捉体，适宜为抗DNP抗体。另外，结合有HRP、ALP等标记物质的抗DNP抗体也有销售。
胆甾醇部分和标签的结合方式没有特别限定，可以是胆甾醇部分与标签结合，也可以是胆甾醇部分和标签介由接头而结合。结合手段没有特别限定，例如利用官能团的交联由于简便而优选。官能团没有特别限定，氨基、羧基和巯基由于有市售的交联接头可用而优选。
胆甾醇中键合于C17位的烷基链上没有官能团，因此在添加标签时，优选使用在该烷基链上具有官能团的胆甾醇衍生物。作为这类胆甾醇衍生物，可列举例如胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆甾烯-3β-醇等。标签的官能团根据标签的种类而不同。例如，在使用肽或蛋白质作为标签时，可以利用氨基、羧基和巯基(SH基)，在利用生物素作为标签时，可以利用侧链的羧基。接头优选为在两端具有官能团的聚合物。需要说明的是，在添加生物素作为标签时，可以使用市售的生物素标记试剂。该试剂包含在末端具有氨基等官能团的结合有各种长度的间隔臂(PEG等)的生物素。
在复合体形成后、优选为复合体形成后且标记物质检测前，可以进行用于除去未形成复合体的未反应的游离成分的Bound/Free(B/F)分离。未反应的游离成分是指未构成复合体的成分。例如，可列举试样中的高密度脂蛋白以外的成分等。B/F分离的手段没有特别限定，如果固相是粒子，则可以通过离心分离仅回收捕捉了复合体的固相而进行B/F分离。如果固相是微孔板、微型管等容器，则可以将包含未反应的游离成分的液体除去，从而进行B/F分离。另外，在固相是磁性粒子时，在用磁体对磁性粒子进行磁拘束的状态下通过喷嘴抽吸除去包含未反应的游离成分的液体，从而可以进行B/F分离。上述方法从自动化的角度是优选的。在除去未反应的游离成分后，可以将捕捉了复合体的固相用磷酸缓冲盐水(PBS)等合适的水性溶剂洗涤。
在本实施方式的测定方法中，通过使上述标签特异性结合的捕捉体和标记物质与如上形成的复合体结合，而对该复合体进行标记。
标签特异性结合的捕捉体可根据上述的添加了标签的胆甾醇的标签的种类适当决定。例如，可以参照上述的标签和可以与该标签特异性结合的物质的组合从抗体、配体受体、寡核苷酸、生物素、亲和素(或链霉亲和素)、组氨酸标签或镍、GST或谷胱甘肽等中选择。它们中，作为捕捉体，优选与标签特异性结合的抗体。这种抗体可以是市售的抗体，也可以是通过该技术中公知的方法制作的抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。抗体的来源和同种型没有特别限定。另外，也可以使用抗体的片段和其衍生物，可列举例如Fab片段、F(ab')2片段等。
标记物质可以使用信号产生物质、催化其它物质的反应而产生可检测的信号的物质等。作为信号产生物质，可例示荧光物质、放射性同位素等。作为催化其它物质的反应而产生可检测的信号的物质，可例示酶。作为酶，可列举过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可列举异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、Alexa Fluor(注册商标)等荧光色素、GFP等荧光蛋白等。作为放射性同位素，可列举125I、14C、32P等。它们中，作为标记物质，优选酶。
在优选的实施方式中，使标记物质介由与标签特异性结合的捕捉体间接地与复合体结合，从而对该复合体进行标记。可列举例如使与标记物质结合后的捕捉体与复合体结合、或使标记物质与和复合体结合后的捕捉体结合。可以使用预先结合有标记物质的捕捉体，也可以使用能与捕捉体特异性结合的标记物质。
预先结合有标记物质的捕捉体例如可以通过用上述的标记物质标记标签特异性结合的捕捉体而得到。需要说明的是，物质的标记方法本身在该技术中是公知的。在捕捉体是抗体的情况下，可以使用市售的标记试剂盒等进行标记。作为可以与捕捉体特异性结合的标记物质，可列举例如特异性识别捕捉体的标记抗体(二抗)等。
该标记工序中的温度条件和时间条件没有特别限定，例如可以将复合体、标签特异性结合的捕捉体和标记物质的混合物在4～60℃、优选为25～42℃孵育1秒～24小时、优选为1～2小时。孵育期间，混合物可以静置，也可以进行搅拌或振荡。
本实施方式中，可以在复合体、捕捉体和标记物质混合后且信号检测前进行用于除去未反应的游离成分的B/F分离。作为未反应的游离成分，可列举例如未与标签结合的游离的捕捉体、未与捕捉体结合的游离的标记物质等。
＜信号检测＞
检测信号的方法本身在免疫测定技术领域中是公知的。本实施方式中，适当选择与来自标记物质的信号的种类对应的测定方法即可。
例如，在标记物质是酶的情况下，可以使用光度计、分光光度计等公知的装置测定使底物对该酶反应而产生的光、颜色等信号而进行。
酶的底物可以根据该酶的种类从公知的底物中适当选择。例如，使用ALP作为酶时，作为底物，可列举CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)等化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠、对硝基苯磷酸酯等显色底物。特别优选为CDP-Star(注册商标)。上述底物的发光优选通过光度计来检测。
在标记物质是放射性同位素时，作为信号的放射线可以使用闪烁计数器等公知的装置来测定。另外，在标记物质是荧光物质时，可以使用荧光酶标仪等公知的装置来测定作为信号的荧光。需要说明的是，激发波长和荧光波长可以根据使用的荧光物质的种类适当决定。ELISA法中，可以使用全自动免疫测定装置HISCL(希森美康株式会社)来进行复合体的形成和其检测。
其中，“检测信号”包括：定性检测信号的有无、对信号强度进行定量和对信号的强度进行半定量性检测。半定量性的检测是指将信号的强度按照“未产生信号”、“弱”、“中”、“强”等的方式分阶段示出。
试样的稀释中使用的水性溶剂、用于进行B/F分离的洗涤用的水性溶剂优选包含添加剂(例如LIPIDURE(注册商标)-BL802等)，该添加剂是为了防止标记胆甾醇附着于管等而添加的。
检测到的信号表示脂蛋白所摄取的胆甾醇的量，为脂蛋白的胆甾醇摄取能力的指标。该指标既可以用荧光强度、发光强度等光学信息表示，也可以以所摄取的胆甾醇的量(分子数等)表示。上述检测到的信号可以作为起因于第1复合体中的结合于胆甾醇的标记物质的测定值(也称为第1测定值)使用。
高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的测定例如可以基于美国专利申请公开第2016/0109469号或美国专利申请公开第2017/0315112号中记载的方法进行。美国专利申请公开第2016/0109469号或美国专利申请公开第2017/0315112号通过参照而引入本说明书。
[高密度脂蛋白的定量方法]
第4方式涉及对高密度脂蛋白进行定量的方法(以下，有时简称为定量方法)。
上述[单克隆抗体或其抗原结合片段]一栏所述的单克隆抗体或抗原结合片段不仅与摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白结合、而且与未摄取标记胆甾醇的高密度脂蛋白也能结合。
与高密度脂蛋白形成复合体的上述单克隆抗体或其抗原结合片段之一可以优选为用于将高密度脂蛋白捕捉到固相等的捕捉抗体(也称为第2捕捉抗体)。另外，与高密度脂蛋白形成复合体的上述单克隆抗体或其抗原结合片段之一可以是用于检测高密度脂蛋白的检测抗体。
通过使用单克隆抗体或抗原结合片段作为捕捉抗体和/或检测抗体，可以对高密度脂蛋白进行定量。高密度脂蛋白的定量可以通过公知的免疫学测定法进行。例如，可以使用[单克隆抗体或其抗原结合片段]一栏所述的单克隆或抗原结合片段作为捕捉抗体和检测抗体，通过夹心ELISA法进行测定。
捕捉抗体的表位和检测抗体的表位可以相同。另外，高密度脂蛋白通常具有多个ApoA1分子，因此捕捉抗体的表位和检测抗体的表位可以至少部分重复，也可以不同。
优选地，用于定量高密度脂蛋白而使用的捕捉抗体和检测抗体分别为选自由下述物质组成的组中的一种：与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、以及与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
更优选地，捕捉抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，检测抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。或者，捕捉抗体和上述检测抗体均为与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
作为与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体，可优选列举由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代(包含传代物)产生的单克隆抗体(例如8E10抗体)。作为与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体，可优选列举由保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代(包含传代物)产生的单克隆抗体(例如P1A5抗体)。
在该栏中，援引上述[单克隆抗体或其抗原结合片段]一栏所述的关于单克隆或抗原结合片段的说明。
高密度脂蛋白的定量包含：将高密度脂蛋白、捕捉抗体和检测抗体混合而形成复合体(也称为第2复合体)的工序；和对上述复合体进行定量的工序。
起因于标记物质的信号数据可以作为高密度脂蛋白的测定值(也称为第2测定值)使用。或者，也可以由起因于标记物质的信号数据生成高密度脂蛋白的测定值。例如，在定量检测信号强度的情况下，可以使用信号强度本身或由该信号强度算出的值作为上述测定值。作为由信号强度算出的值，可列举例如由各检体的信号强度的值减去阴性对照试样的信号强度的值而得的值、将各检体的信号强度除以阳性对照试样的信号强度的值而得的值、和它们的组合等。作为阴性对照试样，可列举不含高密度脂蛋白的试样等。作为阳性对照试样，可列举包含已知量的高密度脂蛋白的试样(也称为校准试样)等。
另外，高密度脂蛋白的测定值可以如下算出：由校准试样的信号强度的值和校准试样的高密度脂蛋白的量制作标准曲线，在该标准曲线中带入来自各检体的摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白的信号强度的值，从而算出。另外，也可以不制作标准曲线，而是由校准试样的信号强度的值求出回归式，在该回归式中带入来自各检体的靶物质的信号强度的值，从而算出高密度脂蛋白的测定值。
高密度脂蛋白的测定值为例如反映每一定量的试样的高密度脂蛋白的量或浓度的值。
捕捉抗体和检测抗体可以使用上述[单克隆抗体或其结合片段]中说明的单克隆抗体或其结合片段、以及它们的片段(例如Fab、F(ab)2等)中的任一者。另外，免疫球蛋白的类和亚类没有特别限制。
在进行上述免疫学测定时，用于进行试样的稀释、B/F分离的洗涤用的水性溶剂优选包含添加剂(例如LIPIDURE(注册商标)-BL802等)，该添加剂是为了防止标记胆甾醇附着于管等而添加的。
[测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法2]
第5方式涉及用于测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的第2方法。本方式中，基于通过上述[测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法1]中所述的方法取得的、起因于胆甾醇上所结合的标记物质的第1测定值和通过上述[高密度脂蛋白的定量方法]中所述的方法取得的高密度脂蛋白的第2测定值评价高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力。
本方式的方法中，为了测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力而使用第1试样，为了进行高密度脂蛋白的定量而使用第2试样。第1试样和第2试样是从同一被检体收集的试样。第1试样和第2试样可以是在不同的时刻收集的，但优选实质相同的时刻。其中，在实质相同的时刻收集包括：在同一时刻收集第1试样和第2试样、在同一天收集、以及在数天内收集。优选在同一时刻收集第1试样和第2试样。具体而言，可将从同一被检体收集的试样分成2份而作为第1试样和第2试样。
包含测定工序A，所述测定工序A包含：将从被检体取得的第1试样中的高密度脂蛋白和标记胆甾醇混合而形成摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白的工序；将第1捕捉抗体和摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白混合而形成摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白和捕捉抗体的第1复合体的工序；和取得起因于第1复合体的胆甾醇上所结合的标记物质的第1测定值的工序。
另外，本方式的高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的测定方法包含测定工序B，所述测定工序B包含：将从与上述被检体相同的被检体取得的第2试样中的高密度脂蛋白、第2捕捉抗体和检测抗体混合而形成第2复合体的工序；和取得起因于第2复合体的第2测定值的工序。
进一步地，本方式中的高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的测定方法包含下述工序：基于通过测定工序A取得的第1测定值和通过测定工序B取得的第2复合体的第2测定值，算出高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力。具体而言，可以由通过测定工序A取得的第1测定值和通过测定工序B取得的第2复合体的第2测定值算出比活性。其中，高密度脂蛋白的“比活性”是下述(i)和(ii)所示的任一值：(i)第1测定值除以第2测定值而得的值、(ii)上述(i)中得到的值的倒数。
本方式的测定方法可以包含输出所算出的值的工序。“输出”没有特别限定，包括例如：由算出测定结果的CPU输出到存储器、监视器；在监视器等中显示测定结果、将测定结果发送到其它终端、以及将测定结果打印到纸上等。
高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的测定方法按照上述[测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法1]中说明的方法。高密度脂蛋白的量或浓度的求法按照上述[高密度脂蛋白的定量方法]中说明的方法。
[高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定试剂盒1]
第6方式涉及高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定用试剂盒。
该试剂盒包含上述[单克隆抗体或其结合片段]一栏所述的单克隆或抗原结合片段和标记胆甾醇。在使用添加了标签的胆甾醇作为标记胆甾醇时，还可包含结合有标记物质的捕捉体。
将试剂盒的1例示于图7。试剂盒10a包含上述[单克隆抗体或其结合片段]中所述的单克隆抗体或抗原结合片段、和标记胆甾醇。作为标记胆甾醇，可列举例如上述[测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法1]的项目中记载的标记胆甾醇。这些例如可以以溶液或粉末的状态、收容于容器等的状态构成试剂盒。另外，试剂盒10a中可以包含生理盐水、缓冲液(例如PBS等)的溶剂。另外，溶剂可以保护添加剂(例如LIPIDURE(注册商标)-BL802等)，该添加剂是为了防止标记胆甾醇附着于管等而添加的。图7中，示出包含收容单克隆抗体或抗原结合片段的容器11a、收容标记胆甾醇的容器12a、和收容溶剂的容器13a作为试剂盒的构成成分的试剂盒10a。进一步地，试剂盒10a可以包含收纳这些容器的箱15a。进一步地，试剂盒10a中可以包含操作说明书或记载有可以预览操作说明书的URL的纸张14a。上述单克隆抗体或抗原结合片段可以是固相化于磁珠或塑料珠的状态。另外，作为图7中记载的容器收容方式的替代方式，上述单克隆抗体或抗原结合片段例如还可以以固相化于96孔微孔板上的状态组装到试剂盒中。单克隆抗体或结合片段的固相化可以按照公知的方法进行。另外，也可以不使单克隆抗体或结合片段直接固定于磁珠等，例如可以介由生物素和亲和素(或链霉亲和素)的结合而与磁珠等结合。
[高密度脂蛋白的定量用试剂盒]
第7方式涉及一种高密度脂蛋白的定量用试剂盒，其包含上述[单克隆抗体或其结合片段]一栏所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
将试剂盒的1例示于图8。试剂盒10b包含上述[单克隆抗体或其结合片段]中所述的单克隆抗体或抗原结合片段。例如，单克隆抗体或抗原结合片段可以以溶液或粉末的状态、收容于容器等的状态构成试剂盒。另外，试剂盒10b可以包含生理盐水、缓冲液(例如PBS等)的溶剂。另外，溶剂可以包含添加剂(例如LIPIDURE(注册商标)-BL802等)，该添加剂是为了防止标记胆甾醇附着于管等添加的。图7中，示出了包含收容有单克隆抗体或抗原结合片段的容器11b、和收容溶剂的容器13b作为试剂盒的构成成分的试剂盒10b。另外，试剂盒10b可以包含容器12b，其收容有能够与结合在胆甾醇上的标记物质结合的检测抗体等。进一步地，试剂盒10b可以包含收纳这些容器的箱15b。进一步地，试剂盒10b可以包含操作说明书或记载有可以预览操作说明书的URL的纸张14b。上述单克隆抗体或抗原结合片段可以是固相化于磁珠或塑料珠的状态。另外，作为图8中记载的容器收容方式的替代方式，上述单克隆或抗原结合片段例如可以以固相化于96孔微孔板上的状态组装到试剂盒中。单克隆抗体或结合片段的固相化可以按照公知的方法进行。另外，也可以不使单克隆抗体或结合片段直接固定于磁珠等，例如可以介由生物素和亲和素(或链霉亲和素)的结合而与磁珠等结合。
[高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定试剂盒2]
该试剂盒是用于测定高密度脂蛋白的比活性的试剂盒。该试剂盒包含前文所述的[高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定试剂盒1]的构成和[高密度脂蛋白的定量用试剂盒]的构成。
另外，作为第6方式、和第7方式的其它方式，涉及上述[单克隆抗体或其结合片段]一栏所述的单克隆抗体或抗原结合片段的、用于制造高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒或高密度脂蛋白的定量用试剂盒的用途。即，第1方式的单克隆抗体或抗原结合片段可以用于制造上述的高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒或高密度脂蛋白的定量用试剂盒。该高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒或高密度脂蛋白的定量用试剂盒如上所述。
实施例
以下示出实施例来具体说明本发明的内容，但并非限定于实施例来解释本发明。
实施例1：单克隆抗体的制作
1.杂交瘤的取得
通过小鼠肠骨淋巴结法(日本专利第4098796号)制作产生单克隆抗体的杂交瘤。具体而言，抗原的接种如下进行：将使1mg/mL的全长型人ApoA1重组蛋白(SIGMA-ALDRICH公司、制品编号SRP4693-100UG；大肠杆菌来源；氨基酸序列如序列号1所示。)和弗氏完全佐剂以体积比1:2混合而成的乳液(抗原浓度：0.33mg/mL)，以0.1mL/只对小鼠(C57Bl6)的尾根部注射1次。另外，在首次接种抗原的16天后，将上述乳液再次以0.06mL/只对同一小鼠的尾根部注射1次，从而进行追加免疫。再在第2次抗原接种的4天后，从肠骨淋巴结分离淋巴细胞，与骨髓瘤进行细胞融合，得到杂交瘤。
2.一次筛选
杂交瘤所产生的单克隆抗体的一次筛选如下进行：使用杂交瘤的培养上清作为样品，通过固定有制作杂交瘤时所使用的人ApoA1蛋白质和含有由正常人血清利用聚乙二醇沉淀而提取的HDL的级分这2种阳性抗原的抗原固相ELISA法进行。作为固定的阴性对照，使用牛血清白蛋白(BSA)。进行一次筛选，选择包含对上述2种阳性抗原这两者显示反应、与阴性对照的反应少的培养上清的孔。抗原固相ELISA法按照以下方法来进行。聚乙二醇沉淀通过专利文献1、或国际公开第2016/194825号中记载的方法进行。
＜方法＞
i.将用PBS稀释成1μg/mL的阳性抗原或阴性对照以50μl添加到96孔板的各孔中，在37℃下孵育1小时，使阳性抗原和阴性对照固定在孔内，制作抗原固相板。
ii.将各孔用PBS 200μl洗涤2次，最后将PBS尽量除去。
iii.向各孔中各添加200μl添加有2％BSA的PBS，在25℃下封闭1小时。
iv.将包含单克隆抗体的杂交瘤的培养上清用StartingBlock(PBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher SCIENTIFIC/制品编号37538)稀释10倍，向抗原固相板的各孔中各添加50μl，在4℃下孵育一晚。
v.将各孔用PBS 200μl洗涤3次，最后，将PBS尽量除去。
vi.将用StartingBlock(PBS)封闭缓冲液稀释10,000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Dako/制品编号P0260)向抗原固相板的各孔中各添加50μl，在25℃下孵育30分钟。
vii.将各孔用PBS 200μl洗涤5次，最后，将PBS尽量除去。
viii.向各孔中各添加100μl化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)，将板在25℃下以600rpm振荡2分钟而使其发光。
ix.用酶标仪(Infinite(注册商标)F200 Pro、TECAN公司制)测定各孔的发光强度。
3.二次筛选
使用所选择的杂交瘤的培养上清，通过抗原固相ELISA法进行二次筛选。二次筛选中，作为阳性抗原，使用上述2.一次筛选中使用的2种阳性抗原(未处理的重组ApoA1或未处理的HDL；以下分别称为“未处理重组ApoA1”、“未处理HDL”)、以及对这些阳性抗原进行氧化处理而得的氧化阳性抗原(氧化处理的重组ApoA1或氧化处理的HDL；以下分别称为“氧化重组ApoA1”或“氧化HDL”)这4种作为阳性抗原。另外，阴性对照设为BSA。选择包含对上述4种阳性抗原显示反应性、有无氧化处理时的反应性差异少、对阴性对照的反应少的培养上清的孔。抗原固相ELISA法和抗原的氧化处理通过以下的方法来进行。
＜方法＞
i.将用PBS稀释成1μg/mL的阳性抗原或阴性对照以50μl添加到96孔板的各孔中，在37℃下孵育1小时，将阳性抗原和阴性对照固相化在孔内，制作抗原固相板。
ii.将各孔用PBS 200μl洗涤2次，最后，将PBS尽量除去。
iii.为了制作氧化处理的2种阳性抗原，向固定有各阳性抗原的孔中添加氧化处理溶液(包含1M过氧化氢、200μM亚硝酸钠、100μM二亚乙基三胺五乙酸的PBS)。向固定有不进行氧化处理的2种阳性抗原的孔中添加PBS。将所有的板在37℃下孵育1小时。
iv.将各孔用PBS 200μl洗涤2次，最后，将PBS尽量除去。
v.按照一次筛选的iii～ix测定各孔的发光强度。
＜二次筛选结果＞
通过上述3.二次筛选对所得到的各克隆产生的抗体与未处理重组ApoA1、未处理HDL、氧化重组ApoA1或氧化HDL的反应性进行了确认。
将结果示于图1的A、图1的B和图2。图1的A、图1的B和图2的横轴为杂交瘤的克隆名，纵轴是发光强度。(需要说明的是，各杂交瘤的上清中所含的抗体浓度根据各克隆而不同。)
如图1的A和图1的B所示，8E10克隆产生的抗体对任一阳性抗原均显示高反应性。如图2所示，包含P1A5和P1A7的几种抗体对未处理HDL和氧化HDL均显示高反应性(需要说明的是，省略了图2所示的各克隆与重组ApoA1和氧化重组ApoA1的反应性的确认。图2所示的各克隆是以ApoA1为抗原而建立的克隆，因为认为如果确认与HDL结合，当然也是与ApoA1结合)。对这3种抗体如下实施克隆，进一步研究反应性。
4.克隆
将上述3.二次筛选所选择的孔的细胞通过有限稀释法播种。对其培养上清，按照上述3.二次筛选的方法再次进行筛选，取得3种作为目标的单一克隆的杂交瘤(克隆名：8E10、P1A5、和P1A7)。需要说明的是，这些杂交瘤中，8E10和P1A5分别以标识表示“8E10”和“P1A5”于2017年3月8日在位于日本千叶县木更津上总镰足2-5-8 122号室的独立行政法人制品评价技术基盘机构的微生物保藏中心进行了国际保藏(标识表示“8E10”：保藏编号NITE BP-02442、标识表示“P1A5”：保藏编号NITE BP-02443)。
实施例2：各抗体的捕捉能力
然后，通过荧光强度对相对于实施例1中克隆的杂交瘤所产生的单克隆抗体的摄取了BODIPY标记胆甾醇的HDL(标记胆甾醇-HDL)捕捉性进行了评价。所评价的单克隆抗体为分别来自克隆名8E10、P1A5、和P1A7的抗体(以下分别称为8E10抗体、P1A5抗体、和P1A7抗体)的3种和市售的抗ApoA1抗体(Anti-Apolipoprotein AI/HDL2/HDL3,Mouse-Mono(1C5)、SANBIO BV公司、制品编号MON5030；以下记作1C5抗体)。
供于测试的HDL是通过上述的聚乙二醇沉淀而由人血清中初步纯化的。作为人血清，使用2种高甘油三酯的血清(A15、A24)和高甘油三酯的血清(A16、A18、A19)的混合血清(高甘油三酯混合血清：High TG mix)、以及3种正常血清(N52、N60、N103)和正常血清(N73、N83、N93)的混合血清(正常混合血清：Normal mix)。作为阴性对照，使用包含LIPIDURE(注册商标)-BL802(日油株式会社)的PBS。
以下，在摄取标记胆甾醇的实验中所用的缓冲液中添加LIPIDURE(注册商标)-BL802。另外，在微孔板等的封闭中使用封闭试剂N101(日油株式会社)。
1.单克隆抗体的标记胆甾醇-HDL的捕捉能力的评价
向96孔板(荧光测定用黑色板H、住友电木株式会社制)的各孔中，分别添加调整为10μg/mL的抗体浓度的实施例1中得到的3种单克隆抗体(8E10抗体、P1A5抗体、P1A7抗体)或1C5抗体，制作抗体固相板。使标记胆甾醇对于HDL的摄取按照专利文献1或国际公开第2016/194825号小册子中记载的方法进行。具体而言，将HDL与BODIPY标记胆甾醇(BODIPY商品名TopFluor Cholesterol、CAS No:878557-19-8、Avanti Polar Lipids公司)混合，在37℃下振荡2小时，同时进行孵育，制作包含标记胆甾醇-HDL的反应液。向固定有各单克隆抗体的96孔板分别添加上述反应液，在25℃下振荡1小时，同时进行孵育。孵育结束后，除去反应液，洗涤板。用添加有0.01％CHAPS的PBS进行板的洗涤。添加10mM甲基-β-环糊精/PBS溶液，在25℃下振荡混合1小时。接着，对于该板，用荧光酶标仪(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN社制)以485/535nm的激发波长/荧光波长测定BODIPY的荧光强度，对于固定化在板上的单克隆抗体评价标记胆甾醇-HDL的捕捉量。
2.单克隆抗体的HDL的捕捉能力的评价
使用上述1.中测定荧光强度后的板，通过ELISA法测定被单克隆抗体捕捉的标记胆甾醇-HDL量。具体而言，在上述1中测定荧光强度后，洗涤以除去10mM甲基-β-环糊精。用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)将山羊抗ApoAI抗血清(N测试ApoAIR2试剂：日东纺)稀释1,000倍，添加到各孔中。在25℃下振荡1小时同时进行孵育，然后用PBS洗涤3次。将HRP标记兔抗山羊IgG抗体稀释1,000倍，添加到各孔中。在25℃下振荡1小时同时进行孵育，然后除去反应液，用PBS洗涤5次。向各孔中添加化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)各100μl，将板在25℃下以600rpm振荡2分钟而使其发光。用酶标仪(Infinite(注册商标)F200 Pro、TECAN公司制)测定各孔的发光强度。
3.基于HDL有无氧化处理来评价1C5抗体的捕捉能力
使用未处理的HDL和进行了实施例1的二次筛选一栏中记载的氧化处理的HDL，通过ELISA法研究1C5抗体的捕捉能力。
4.结果
将结果示于图3和图4。图3的A示出1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、和P1A7抗体对标记胆甾醇-HDL的捕捉能力。另外，图3的B示出这些抗体对HDL的捕捉能力。另外，图4的A示出在氧化处理HDL和未氧化处理的HDL之间比较1C5抗体对标记胆甾醇-HDL的捕捉能力的结果。图4的B示出在氧化处理HDL和未氧化处理的HDL之间比较1C5抗体的HDL的捕捉能力的结果。
如图3的A和图3的B所示，在通过标记胆甾醇-HDL的荧光强度来评价时，市售抗体1C5抗体在A15、和高甘油三酯混合血清(High TG mix)以外的血清的情况下仅得到与阴性对照(缓冲液)同程度的荧光强度。另外，在通常ELISA法评价1C5抗体的捕捉能力时，也通过血清确认捕捉不充分。但是，如图4的A和图4的B所示，通过对HDL进行氧化处理，1C5抗体的标记胆甾醇-HDL和HDL的捕捉能力得到改善。
由该结果可知，市售的1C5抗体与受到氧化修饰的HDL的结合性高，与未氧化处理的HDL的结合性低。
如图3的A所示，此次制作的8E10抗体和P1A5抗体对于使用1C5抗体时得不到荧光信号的血清而言，也可以得到荧光信号。另外，如图3的B所示，8E10抗体和P1A5抗体在利用ELISA的情况下对于所使用的全部血清均检测到标记胆甾醇-HDL，可认为检测灵敏度比1C5抗体高。
另一方面，P1A7抗体对于全部血清均能够捕捉标记胆甾醇-HDL，能够与8E10抗体同程度地捕捉标记胆甾醇-HDL(图3的B)，但是，来自P1A7抗体所捕捉的标记胆甾醇-HDL的荧光信号比用8E10抗体捕捉时弱。本实施例中，抗体所捕捉的HDL中包括摄取了BODIPY标记胆甾醇的标记胆甾醇-HDL和未摄取BODIPY标记胆甾醇的HDL这两者。因此，在ELISA法的情况下，在捕捉到上述2种HDL中的任一者时均会检测到发光信号。P1A7抗体由于选择性捕捉未摄取BODIPY标记胆甾醇的HDL，因此认为得不到BODIPY的荧光信号。
根据以上的结果认为，8E10抗体和P1A5抗体不仅对未摄取标记胆甾醇的HDL，对于标记胆甾醇-HDL也显示高结合性。
实施例3：单克隆抗体所识别的结合部位的确定
按照以下的方法确定8E10抗体、P1-A5抗体、P1-A7抗体、和1C5抗体的结合部位。
制作在序列号1所示的全长型人ApoA1重组蛋白(大肠杆菌来源)的氨基酸序列所含的各种的部分序列上添加有His标签序列的肽，以该肽为抗原，通过以下所示的抗原固相ELISA法观察抗体和抗原是否结合。作为具有部分序列的肽，使用序列号1所示的氨基酸序列的第2～60位、第51～110位、第101～160位、第151～210位、和第201～267位的氨基酸序列所构成的肽，共计5种。
＜方法＞
i.向96孔板的各孔中分别添加调整为1ng/mL的上述肽。
ii.洗涤各孔后，用添加有2％BSA的PBS进行封闭。
iii.将用添加有2％BSA的PBS稀释10倍的8E10、P1A5、和P1A7的杂交瘤培养上清以及用添加有2％BSA的PBS制备成1μg/mL的1C5抗体分别向各孔中添加50μl。在25℃下孵育1小时后，洗涤各孔。将10,000倍稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体稀释1,000倍，添加到各孔中，在25℃孵育1小时。洗涤各孔后，与实施例2同样地添加发光底物，用酶标仪测定发光强度。
如图5所示，8E10抗体与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位所构成的肽结合，不与其它氨基酸序列(第2～60位、第101～160位、第151～210位、第201～267位)所构成的肽结合。P1A5抗体与上述氨基酸序列的第201～267位所构成的肽结合，不与其它氨基酸序列(第2～60位、第51～110位、第101～160位、第151～210位)所构成的肽结合。P1A7抗体和1C5抗体仅与上述8E10抗体和P1A5抗体不结合的上述氨基酸序列的第101～160位所构成的肽结合。
进一步地，为了更详细地研究8E10抗体的结合部位，制作在包含于序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的范围内的部分序列上添加有His标签序列的肽，以该肽为抗原，通过抗原固相ELISA法观察抗体和抗原是否结合。作为这些具有部分序列的肽，选择序列号1所示的氨基酸序列的第51～70位、第64～83位、第77～96位、和第91～110位所构成的肽，共计5种。抗原固相ELISA法除了仅使用8E10抗体这一点以外，按照上述实施例3的＜方法＞i～iii实施。另外，在8E10抗体的基础上，还使用抗His标签抗体同样地评价是否与上述肽结合。
如图6所示，8E10抗体与序列号1所示的氨基酸序列的第91～110位所构成的肽显示出强结合性。另外，抗His标签抗体与上述氨基酸序列的第91～110位所构成的肽强烈结合，并且与上述氨基酸序列的第77～96位所构成的肽也结合。由此认为，8E10抗体的结合部位包含于序列号1所示的氨基酸序列的第91～110位的范围。另外，由图6可知，8E10抗体的结合部位不包含在序列号1所示的氨基酸序列的第51～70位的范围、第64～83位的范围、和第77～96位的范围。
实施例4.用于定量高密度脂蛋白量的抗体组合的研究
为了找到对于用ELISA法定量高密度脂蛋白(HDL)量而言最佳的捕捉抗体和检测抗体的组合，使用本公司的全自动免疫测定装置HISCL，使用P1A5抗体、8E10抗体、和多克隆抗体(实施例2中使用的山羊抗ApoAI抗血清)作为捕捉抗体和检测抗体来构建ELISA测定系统，并对结果的精度进行比较。
＜ELISA测定系统的构建＞
i.对于各抗体，按照公知的方法对作为捕捉抗体使用的抗体进行生物素标记。按照公知的方法对作为检测抗体使用的抗体标记碱性磷酸酶(ALP)。
ii.除去HISCL磁珠的缓冲液，用与所除去的缓冲液等量的含有0.1％pluronicF68的PBS洗涤3次。
iii.使利用含有0.1％pluronic F68的PBS洗涤3次后的HISCL磁珠和生物素标记捕捉抗体反应，对于各抗体制备捕捉抗体固相HISCL磁珠。捕捉抗体固相HISCL磁珠在用含有0.1％pluronic F68的PBS洗涤3次后，悬浮于该缓冲液中(作为HISCL的R2试剂使用)。
iv.从检体中，按照专利文献1中记载的聚乙二醇法分别得到HDL级分(以下称为“样品”)。
v.作为HISCL的R1试剂，准备包含1mM环糊精、0.1％pluronic F68、×200脂质体、1/1000LIPIDURE(注册商标)-BL802+2％甘油的PBS。
vi.准备在HISCL的R3缓冲液中添加有各检测用抗体和碱性磷酸酶标记检测抗体的R3试剂。
vii.在HISCL中设置各试剂和样品，按照以下的规程，在将15个样品各分注1次(检体编号No.1～15)后分别进行HDL的定量：
[将R1试剂90μl和样品10μl混合]→[42℃,742sec]→[添加R2试剂30μl]→[42℃,742sec]→[B/F分离]→[42℃,568sec]→[B/F分离]→[R4试剂50μl、[添加R5试剂100μl]→[42℃,305sec]→发光强度检测。
将捕捉抗体和检测抗体的组合示于表1。
[表1]
＜结果＞
将定量结果、平均值(Average)、标准偏差(SD)、分散(CV％)示于表1。
在使用P1A5抗体或8E10抗体作为捕捉抗体、使用多克隆抗体作为检测抗体的体系中，CV分别为62％、99％，可知测定间的偏差大、测定结果不稳定。与此相对地，使用P1A5抗体作为捕捉抗体、使用8E10抗体作为检测抗体时的CV是17％，可知测定间的偏差小。使用8E10抗体作为捕捉抗体、使用8E10抗体或P1A5抗体作为检测抗体时的CV分别为11％、13％，可知测定间的偏差小。
根据以上结果认为，在进行HDL的定量时，优选使用8E10抗体和/或P1A5抗体作为捕捉抗体和检测抗体。
符号说明
10a 高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒
11a 收容有单克隆或抗原结合片段的容器
12a 收容有标记胆甾醇的容器
13a 收容有溶剂的容器
14a 操作说明书或记载有可以预览操作说明书的URL的纸张
15a 收纳上述容器的箱
10b 高密度脂蛋白的定量用试剂盒
11b 收容有单克隆或抗原结合片段的容器
12b 收容用于检测结合在胆甾醇上的标记物质的捕捉抗体的容器
13b 收容有溶剂的容器
14b 操作说明书或记载有可以预览操作说明书的URL的纸张
15b 收纳上述容器的箱
序列表
<110> 希森美康株式会社
<120> 抗ApoA1抗体
<130> P18-038WO
<150> JP 2017-066691
<151> 2017-03-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
20 25 30
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp
35 40 45
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
50 55 60
Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65 70 75 80
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
85 90 95
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
100 105 110
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
115 120 125
Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
130 135 140
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
145 150 155 160
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala
165 170 175
Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
195 200 205
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
210 215 220
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
225 230 235 240
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
245 250 255
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
260 265
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr
1 5 10 15
Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln
20 25 30
Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
35 40 45
Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu
50 55 60
Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu
65 70 75 80
Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys
85 90 95
Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met
100 105 110
Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu
115 120 125
Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu
130 135 140
Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg
145 150 155 160
Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala
165 170 175
Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr
180 185 190
His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys
195 200 205
Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser
210 215 220
Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu
225 230 235 240
Asn Thr Gln
Claims (24)
1.一种具有下述特征的单克隆抗体或其抗原结合片段：
与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位的氨基酸序列所构成的肽或第201～267位的氨基酸序列所构成的肽结合、且
能与下述(1)～(3)的高密度脂蛋白结合，
(1)经氧化修饰的高密度脂蛋白、
(2)未经氧化修饰的高密度脂蛋白、和
(3)摄取了下述式(I)所示的标记胆甾醇的高密度脂蛋白：
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，与序列号1所示的氨基酸序列的第91～110位的氨基酸序列所构成的肽结合，不与序列号1所示的氨基酸序列的第101～160位的范围结合。
3.根据权利要求1或2中所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与存在于非变性条件的试样中的非变性高密度脂蛋白结合。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体包含与由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的单克隆抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别相同的氨基酸序列所构成的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，HCDR表示重链互补性决定区，LCDR表示轻链互补性决定区。
5.根据权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包含与由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别相同的氨基酸序列所构成的重链可变区和轻链可变区。
6.根据权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包含与由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
7.由保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代产生的单克隆抗体或其抗原结合片段。
8.保藏编号NITE BP-02442或保藏编号NITE BP-02443的杂交瘤或其后代。
9.一种测定高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的方法，其包含：
将权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含标记物质的标记胆甾醇和高密度脂蛋白混合，从而形成包含摄取了所述标记胆甾醇的所述高密度脂蛋白和所述单克隆抗体或其抗原结合片段的复合体的工序；和，
检测起因于所述复合体中的标记物质的信号的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述标记胆甾醇是下述式(I)所示的标记胆甾醇，
11.一种高密度脂蛋白的功能评价用试剂盒，其包含权利要求1～7中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、和标记胆甾醇。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，还包含能够与标记胆甾醇结合的抗体。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中，所述标记胆甾醇是下述式(I)所示的标记胆甾醇，
14.一种高密度脂蛋白的定量方法，其包含：
将高密度脂蛋白、捕捉抗体和检测抗体混合而形成复合体的工序；和
对所述复合体进行定量的工序，
所述捕捉抗体和所述检测抗体分别为选自由与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、以及与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段组成的组中的一种。
15.根据权利要求14所述的定量方法，其中，
所述捕捉抗体为与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，
所述检测抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求14所述的定量方法，其中，所述捕捉抗体和所述检测抗体是与相同的表位结合的抗体。
17.根据权利要求14所述的定量方法，其中，所述捕捉抗体和所述检测抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
18.根据权利要求14～17中的任一项所述的定量方法，其中，所述捕捉抗体和所述检测抗体与经氧化修饰的高密度脂蛋白和未经氧化修饰的高密度脂蛋白中的任一者均结合。
19.根据权利要求14～18中的任一项所述的定量方法，其中，所述捕捉抗体和所述检测抗体与摄取了下述式(I)所示的标记胆甾醇的高密度脂蛋白结合，
20.根据权利要求14～19中的任一项所述的定量方法，其中，
所述检测抗体包含标记物质，
在所述定量工序中，检测所述复合体中所含的所述标记物质来源的信号。
21.根据权利要求14～19中的任一项所述的定量方法，其中，
所述捕捉抗体固定化于固相。
22.一种高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定方法，其包含：
将由被检体取得的第1试样中的高密度脂蛋白和标记胆甾醇混合，形成摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白的工序；
将第1捕捉抗体和所述摄取了标记胆甾醇的高密度脂蛋白混合，从而形成摄取了所述标记胆甾醇的所述高密度脂蛋白和所述捕捉抗体的第1复合体的工序；和
取得起因于所述第1复合体中的标记物质的第1测定值的工序；以及，
将由与所述被检体相同的被检体取得的第2试样中的高密度脂蛋白、第2捕捉抗体和检测抗体混合，形成第2复合体的工序；
取得起因于所述第2复合体的第2测定值的工序；和
基于所述第1测定值和所述第2测定值算出高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力的工序，
所述第1捕捉抗体为权利要求1～7中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，
所述第2捕捉抗体和所述检测抗体是与序列号1所示的氨基酸序列的第51～110位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、或与序列号1所示的氨基酸序列的第201～267位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.根据权利要求22所述的高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定方法，其中，还包含在所述算出工序后将算出结果输出的工序。
24.根据权利要求23所述的高密度脂蛋白的胆甾醇摄取能力测定方法，其中，在所述算出工序中，算出(i)第1测定值除以第2测定值而得的值、和/或(ii)所述(i)中得到的值的倒数。
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