JP2019190883A - 新規肺がんマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、該文献の遺伝子発現解析では、肺がんではCHL1が増加する場合と減少する場合の両方が示されており、CHL1と肺がんとの関係が明らかではない。また遺伝子レベルの解析からでは、肺がん組織においてCHL1タンパク質が発現しているかは不明であり、肺がん組織から血清中へのCHL1タンパク質の漏出についても、不明であった。
naplastic lymphoma kinase)−TG(transgenic)マウスを使用して解析した結果、CHL1がエキソソームだけでなく、その切断型(truncated form)として血清中に存在し、野生型マウス血清より多くのCHL1が検出されることを見出した。
[1]被検対象由来の生体試料におけるCHL1タンパク質の量を測定する工程を含む、肺がん診断のためのデータ取得方法。
[2]CHL1タンパク質の量が健常者におけるレベルより高い場合に肺がんに罹患している可能性が高いという基準により、肺がんを診断するためのものである、[1]に記載の方法。
[3]前記肺がんが、非小細胞肺がんである、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記肺がんが、EML4−ALK変異肺がんである、[1]〜[3]の何れかに記載の方法。
[5]前記生体試料が、血清、血漿、またはそれらの細胞外小胞画分である、[1]〜[4]の何れかに記載の方法。
[6]前記測定する工程が、免疫測定法による、[1]〜[5]の何れかに記載の方法。[7]前記測定する工程が、ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)法による、[6]に記載の方法。
[8]前記被検対象が、マウスまたはヒトである、[1]〜[7]の何れかに記載の方法。
[9]CHL1タンパク質の量を測定する試薬を含む、肺がん診断用キット。
[10]CHL1タンパク質の量を測定する試薬が、少なくとも抗CHL1抗体を含む、[9]に記載のキット。
膜貫通型の細胞接着分子(CAM)であり、神経細胞での機能が示唆されている。
免疫測定法は、酵素免疫定量法に従い定量検出する方法や、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等で測定する方法等が好ましい。酵素免疫定量法は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。また、イムノソルベントを用いる、ELISA法を選択することが、特に好ましい。
サンドイッチ法において、免疫複合体を形成させる順序は特に限定されない。固定化抗体に対して、CHL1を含む生体試料、二次抗体の順で添加して結合させてもよいし、まずCHL1を含む生体試料と二次抗体とを混合して複合体を形成させたものを固定化抗体に対して添加して結合させてもよい。
また、各抗体は一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、CHL1に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。
これらのうち、感度及び操作の簡便さの観点から酵素が好ましく、西洋わさび過酸化酵素(HRP)、アルカリフォスファターゼ(AP)、グルコースオキシダーゼ(GOD)等がより好ましい。標識物質としてHRPを用いる場合はTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)等を、APを用いる場合はAMPPD(3−(2’−スピロア
ダマンタン)−4−メトキシ−4−(3’’−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン・2ナトリウム塩)、9−(4−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン)−10−メチルアクリダン二ナトリウム塩等を基質として使用することができる。また、標識物質としては、他にFITC(fluorescein isothiocy
anate)、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線(標準曲線)を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のCHL1濃度を算出することができる。
固定化抗体の固相への固定化後は非特異吸着を防ぐため、スキムミルク、アルブミン、カゼイン等で適宜ブロッキングしてもよい。
本発明において、抗原−抗体反応を行う時間、本発明の方法を行う温度、試料や試薬の希釈液及び洗浄液の組成やpH等は特に限定されず、一般的に行われるELISA法に適用する条件でよい。
標準物質を含んでもよい。
さらに、標識化二次抗体、標識が酵素である場合その基質、BSA等のブロッキング剤
等の試薬を含めることもできる。
さらに、手順や診断基準を記載した添付文書を含んでもよい。
さらに、血清25μLあたり、6.3μLのExoQuick exosome precipitation solution(システムバイオサイエンス社、カリフォルニア州)と混和し、4℃で15分間インキュベートした。1500gで15分間の遠心分離を行い、細胞外小胞を含む沈殿物と血清上清とを分離した。細胞外小胞を含む沈殿物をPBS(Phosphate buffered saline)50μLで再懸濁した。
実施例1によって得られた血清細胞外小胞画分及び該画分を除いた血清上清を用いてウエスタンブロットを行った(図1)。血清及び細胞外小胞画分をそれぞれ2μLずつ6%SDS−PAGEゲルに注入して電気泳動した。レーン1〜7がWTマウスであり、レーン8〜14はTGマウスの試料である。その後、Immobilon(商標登録)PVDF膜(Merck Millipore、ドイツ)に転写した。タンパク質を転写したPVDF膜を5%スキムミルクにてブロッキングした後、このPVDF膜は、HRP結合抗マウスCHL1抗体(AF2147;R&Dシステムズ、ミネソタ州;1μg/mL)によって室温で1時間反応させた。その後、そのPVDF膜をImmobilon Western Chemiluminescent HRP基質(Merck Millipore、ドイツ)によって基質反応を行った。そのPVDF膜を露光し、ChemiDoc MP image analyzer(BIO−RAD、カリフォルニア州)によって分析した。
ウエスタンブロット法の結果、血清細胞外小胞画分及び該画分を除いた血清上清においてCHL1が検出でき、その発現量はEML4−ALK−TGマウスで増加している傾向が見られた。
実施例1にて得られたマウス血清をPBSで50倍に希釈し、96ウェルELISAプレート(CORNING、ニューヨーク州;No.3369)に注入し、37℃で1時間インキュベートした。0.05%Tween含有PBS溶液で洗浄した後、各ウェルを5%スキムミルクによって37℃で1時間ブロッキングした。HRP結合抗マウスCHL1抗体を5%スキムミルク溶液で3000倍に希釈し、各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、HRP基質溶液(SureBlue Reserve;SeraCare、マサチューセッツ州)は室温で10〜20分間反応させた。1N HCl溶液を各ウェルに添加したのち、吸光度を測定した(450nm)。ELISAプレート間の測定誤差を補正するために、相対値が「相対指数」の結果に基づき求めた。
野生型マウスの相対指数の平均値は0.01865(標準偏差0.01051)であり、EML4−ALK−TGマウスの相対指数の平均値は0.06325(標準偏差0.05861)であった(図2)。p値は小さいので(1.801x10−9)、野生型マウスとEML4−ALK−TGマウスの間で血清マウスCHL1のレベルに有意差があることが分かった。
スピアマンの順位相関係数によって解析した結果、図3に示すように、血清マウスCHL1レベルと腫瘍重量の間で著しく相関していることが分かった。スピアマンの順位相関係数は0.692であった(p=7.97x10−6)。
健常人および肺がん患者の血液試料を遠心分離することにより、血清を回収した。
さらに、血清10μLあたり、2.5μLのExoQuick exosome precipitation solutionと混和し、4℃で30分間インキュベートした。1500gで10分間の遠心分離により、細胞外小胞を含む沈殿物と血清上清とを分離することができた。細胞外小胞を含む沈殿物をPBS10μLで再懸濁した。
実施例5によって得られた血清細胞外小胞画分及び該画分を除いた血清上清を用いてウエスタンブロットを行った(図4)。血清及び細胞外小胞画分をそれぞれ2μLずつ6%SDS−PAGEゲルに注入して電気泳動した。レーン1〜7が健常人であり、レーン8〜14は肺がん患者の試料である。その後、Immobilon(商標登録)PVDF膜(Merck Millipore、ドイツ)に転写した。タンパク質を転写したPVDF膜を5%スキムミルクにてブロッキングした後、このPVDF膜は、HRP結合抗ヒトCHL1抗体によって室温で1時間反応させた。その後、そのPVDF膜をImmobilon Western Chemiluminescent HRP基質(Merck
Millipore、ドイツ)によって基質反応を行った。そのPVDF膜を露光し、ChemiDoc MP image analyzer(BIO−RAD、カリフォルニア州)によって分析した。
ウエスタンブロット法の結果、血清細胞外小胞画分及び該画分を除いた血清上清のいずれにおいても、肺がん患者でCHL1タンパク質が増加している傾向が見られた。
Claims (10)
- 被検対象由来の生体試料におけるCHL1タンパク質の量を測定する工程を含む、肺がん診断のためのデータ取得方法。
- CHL1タンパク質の量が健常者におけるレベルより高い場合に肺がんに罹患している可能性が高いという基準により、肺がんを診断するためのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記肺がんが、非小細胞肺がんである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記肺がんが、EML4−ALK変異肺がんである、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、血清、血漿、またはそれらの細胞外小胞画分である、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記測定する工程が、免疫測定法による、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 前記測定する工程が、ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)法による、請求項6に記載の方法。
- 前記被検対象が、マウスまたはヒトである、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- CHL1タンパク質の量を測定する試薬を含む、肺がん診断用キット。
- CHL1タンパク質の量を測定する試薬が、少なくとも抗CHL1抗体を含む、請求項9に記載のキット。
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