JPH04504063A - 悪性疾病を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性疾病を検出する方法 本発明は、悪性疾ＩＰ４を検出する方法及びこのために好適な試薬に関する。

臨床診断学では、従来から、悪性疾病を立証する指示薬物質が！まれて−る。広 い組！＆特異性を有する腫瘍マーカーとして、ＣＫＡ（癌胚芽性抗原）及びＴＰ Ａ（組織ポリベグチド抗原）に望みがかけられていた。

しかしながら、その間、双方の蛋白質はこの期待を満足させることができなりこ とが明らかになつｔ。

その間に、例えば結腸癌の治療看視における（ＩＡの使用は著るしく減少し、Ｔ ＰＡは、特異性及び感度の不足に基づき治療看視用に僅かな指示の目的を達せす ることができｔにすぎなめ。他の非常に多くの蛋白質が既に悪性疾病の指示薬と して試験されｔが、全てが満足することはできながつ友。

サイトケラチン（Ｃｖｔｏｋｅｒａｔｉｎｅ　：　ＣＫ　）の群も膿瘍と関連さ せた。これらは、中間フィラメント蛋白質として表皮細胞の細胞骨格の成分であ る。１９種のサイトケラチンが公知であり、そのうちサイトケラチン１〜８は塩 基性ナイトケラチンと称され、サイトケラチン９〜１９は酸性サイトケラチンと 称される。サイトる。この際、１個のテトラマーは、各々２個の塩基性及び２個 の酸性のサイトケラチン−分子より成る。テトラマーの線状凝集によりフィラメ ントが生じる。無傷のナイトケラチン分子は、上皮細泡の中間フィラメントのイ ンテグラル成分として水不溶性である。サイトケラチンの複合性及び組成は、異 なる上皮組織中では異なり、即ち、上皮細胞は、その組織にとって典型的なサイ トケラチン−組成を有する。いずれにせよ、従来は、悪性疾病が体液中のサイト ケラチンの出現に関連することは知られてｂなかつｔｏ ところで、本発明の課題は、悪性疾病の存在を診断することのできる方法を提供 することであった。

この課題は、次のような悪性疾病の検出法によって解決される：これは、体液試 料を少なくとも２種のレセプターＲ１及びＲ２と共にインキユベートシ、この際 、少なくともレセプターＲ１及びＲ２と試料液中の検出すべき物質との結合によ って信号変化を得、かつ、その際、双方のレセプターの１万は、サイトケラチン １９のアミノ酸配列２９１〜３５５に結合するモノクローナル抗体を含有し他の レセプターはサイトケラチン１９のアミノ酸配列３４６〜５６７に結合するモノ クローナル抗体を含有し、この結合に基因する試料中の信号変化を測定すること より成る。

意外にも、主として上皮１瘍組織内で７ラグメントは、完全なサイトケラチン１ ９のアミノ酸配列最高２１９〜３６７、最低３１１〜３５９を有し、アミノ酸配 列２９１〜３５５及び３４６〜３６７の上に前記のモノクローナル抗体又はその 誘導体と特異的に結合することができ、更に体液中に見出すことのできるエピト ープを有するサイトケラチン１９より成ることがａ認された。サイトケラチン１ ９（ｃｘ１９）ｉ！、４００個のアミノ酸よりなるアミノ酸連鎖を有する。

この配列はスタシアク（５ｔａｓｉａｋ　）　Ｐ、　Ｃ等によるＪ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　９２　（１９８９）、７０７〜７１６殊 に７１２頁に記載されており、３個のドメイン１Ａ。

１Ｂ及び２に区分されている６本発明により検出すべきフラグメントは、ドメイ ン２（へりクス２）に由来する。前記の２つの抗体と特異的に結合するこのＣＫ １９−フラグメントは殊に、気管支癌、乳癌、胃癌、胆道癌、肝臓癌及び結腸癌 の場合に検出可能であることが判明しｔ０相応する組織の炎症性上皮疾病を有す る患者の場合には、一般にこのフラグメントは検出できなかった。

本発明のために、セルラインＥｃＡｃｃ　８９１１２８０３（配列２９１〜３３ ５特に配列５１１〜３３５に結合する）及びＥｃＡｃｃ　８９１１２８０４　（ アミノ酸配列３４６〜３６７特１ｃ３４６〜３５に結合する）から形成されるモ ノクローナル抗体を使用するのが有利でああるか又は、不所望の臨床特性を有す る反応を示す。

このことは、例えばｍＡＢｓ及びＡ１１Ｃｉ及びｂ１７０？用いて実施しｔ例３ の比較実験が示している。Ａ８１はアミノ酸配列１５３〜２１９上の工ぎトープ に結合し、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１　（１９８６）、４６４６〜 ４６５４及びＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９５　（１９８２）、５８０〜５ ８８に記載されている。ｂ１７０はアミノ酸配列３５６〜３４５上の即ち、本発 明の有利な２個のｍＡＢｓの間のエピトープに結合し、’Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ。

５５（１９８６）４９７〜５０４により入手される。

これら実験の結果を次表に示す： 膿瘍　膿瘍なし ８０３１）＋　８０４２）　２４　１１　２４　４８０５＋ｂ１７０　２４　０ 　２Ａ　２ｂ１７０＋８０４　２４　４　２４　１ＡＥ１＋８０４　２４　０　 ２４　０ １）　＝　ＥＣＡＣＣ８９１１２８０３２）　−ｇｃＡｃｃ　８９１１２８０４ この検出は、体液中特に血清中で実施される。この測定は自体公知の免疫学的方 法で行なう。本発明により所望の免疫学的測定法の実施の究めに、ここで好適で ある非常に多くの変法が公知である。例えば、２個又は３個又はそれ以上のレセ プターを使用することができ、個々のレセプターとのインキュベーションは、種 々の順序で、均−相又は不均一相で行なうことができる。それぞれ、少なくとも ２個のレセプターと試料淋 ＃ＦＷ中の検出すべきフラグメントとの結合により生じる信号変化を評価する。

これらの変法は、当業者にとっては周知であり、ここで詳述する必要はない。本 発明による測定は、均一相で、例えば凝集−分析の原理により（この際、レセプ ターとして被覆され九粒子例えば、特異的に結合可能なレセプターと検出すべき 物質との結合により架橋し、これにより凝集するラテックス粒子又は赤血球が使 用される）又は不均一相で、有利にサンドイッチ−イムノアッセイとして行なう のが有利である。いずれの場合にも、少なくとも２個のレセプターＲ工及びＲ２ が使用され、そのうちの１万はＣＫ１９の配列２９１〜３３５に結合するモノク ローナル抗体を含有し、他のレセプターは、ＣＫ１９の配列３４６〜３６７に結 合するモノクローナル抗体を含有する。

当該抗体との充分なエビトープーオーバーラッピング（Ｅｐｉｔｏｐ−Ｕｅｂｅ ｒｌａｐｐｕｎｇ　）が存在する抗体も好適である。このエビトープーオーバラ ツぎングは競争性テスト系を用いて容易に検出することができる。このために、 例えば酵素−イムノアッセイを用−て、１抗体と、前記の２つの結合配列の１つ を免疫原として用匹て得られｔ１抗体とが、特定の基質もしくは特定のエピトー プへの結合に関してどの程度競争するかを検査する。この定めに、相応する配列 のフラグメントラ含有する溶液を、標識されｔ形の本発明により製造された特定 の抗体及び過剰の当該抗体と共にインキエベ−トする。生じる複合体の不動態化 、液相から固相の分離及びこのシアの相の１方中の結合された標識の立証により 、当該モノクロナール抗体が結合から特定の抗体をどの程度排除できるかを容易 に測定することができる。１０６倍過剰の際の最低５０％の排除（Ｖｅｒｄｒａ −ｅｎｇｕｎｇ　）が得られると、エピトープ−オーバラッピングが存在し、相 応する抗体は、本発明の方法に使用するために好適である。

本発明の几めに好適なｍＡＢは当業者に周知の方法で、前記定義の好適な配列を 有するか又はそれより成るＣＫ１９−７ラグメントの使用下に得られる。完全Ｃ Ｋ際に、Ｒ１、サイトケラチン１９−７ラグメント及びＲ２からなる複合体が生 じる。これらのレセプターは、その中でＲ１もＲ２もナイトケラチン１９−７ラ グメントと結合している複合体のみが、信号変化を生じ、この方法で２つの特異 的な抗体と結合しうるような７ラグメントのみを確認するように選択される。

本発明による測定はサンドイッチ−イムノアッセイフラグメント及びレセプター Ｒ＝からの複合体が生じる。

固相に結合していて、標ｗ＆を有する複合体のみが評価される。

この実権形で、レセプターＲ１は固相への結合を媒能でありうる。有利な１！ｌ ！施形では、レセプターＲ１は前記の特異性を有するモノクローナル抗体及び特 異的に結合可能な物質からの接合体である。１Ｆ＋異的に結合可能な物質と結合 可能なパートナ−は固相に結合している。特異的に結合可能な対（ｐａａｒ　） としては、例えば抗原−抗体、ハゲテン−抗体、ビオチン−抗ピオチンー抗体、 ビオチン−アビジン、ビオチンーストレグトアビクン、プロティンＡ−免疫−Ｔ −グロブリンが挙げられる。これらの実施形で、Ｒ１としては、前記のモノクロ ーナル抗体とビオチンとの接合体を、かつ固相としてはその表面にストレプトア ビジンを有するマトリックスを使用するのが特に有利である。′ｖｃ−で、この ビオチンとストレプトアビジンとの結合にの表面で、レセプターＲ１を得るため に使用されたモノクローナル抗体のＦｅ一部に対する抗体又はプロティンＡ−分 子が結合される実権形も有利であり、この際は、Ｒ１のモノクローナル抗体の２ ０一部の結合により免疫化が行なわれる。

もう１つの有利な実施形では、マトリックスにビオチン分子が結合してｂで、レ セプターＲ１として、ピ疫学的反応の実施により行なうことができる。

固相としては、免疫学的方法で通例使用される物質が好適である０例えば、ポリ マー材料並びにがラスを使用することができる。特に、ポリスチロール、ポリメ タクリレート、テフロン、ポリアミド、スチロールとアクリロニトリルとのコポ リマー、がラス−及びセルロース製品が特に好適であると判明し几。マトリック スは、任意の形で例えば小管、マイクロ滴定グレート、球、膜、粉末、粒子又は 繊維７リースとして存在していてよい。例えば、西ドイツ特許（Ｄｇ−Ａ）第５ ６４０４１２号明細書に記載の方法で得られｔ固相が好適である。

レセプターＢ２は、この実施形では、それぞれ、本発明で必要である他のモノク ローナル抗体又はその誘導体’ｔｔ；ｗする。このレセプターＲ−の標識付けは 公知の方法で行なう。標識としては、放射性物質、ＮＬ（Ｒ−信号発生物質、酵 素及び螢光発生物質が好適である。

ここで、標識の検出は、公知方法で行なう。標識として酵素を使用するのが有利 である。＃素としては、殊に、ベルオキシダーぜ、アルカリホスファターゼ及び β−がラクトシダーゼが好適である。酵素の検出は、基質の添Ｘ及び生じる色の 測定により行なう。

凝集検定（Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｓａｓｓｓａｙ　）のもう１つの有利な 実施形で、レセプターＲ１は、２つの定義すれｔ抗体の１万で被覆され九粒子で あり、他のレセプターは、他の抗体で被覆され九粒子である。検出すべき物質へ の粒子の結合により凝集が起こり、これは濁り変化を介して検出することができ る。

本発明の方法により、沢万の使用抗体と結合可能である２個のエビドーグを含有 するサイトケラチン１９の特定の７ラグメントの存在を検出することができる。

このような７ラグメ／トは主として腫瘍組織内に生じる。

本発明のもう１つの課題は、悪性疾病を検出する試薬であり、これは、少なくと ′４ｈ２個のレセプターＲ１及びＲ２’を含有し、ここで双方のレセプターの一 万はナイトケラチン１９の配列２９１〜３５５に結合するモノクローナル抗体及 び他方のレセプターはサイトケラチン１９の配列５４６〜３６７に結合するモノ クローナル抗体又は同等に結合しうる抗体又はその誘導体を含有する。

この試薬は、セルラインｇｃＡｃｃ　８９１１２８０３により産生され、セルラ インＥＣＡＣＣ８９１１２８０４により産生さｎｔｍＡＢ　ｔ−含有するのが有 利である。

本発明の目的智は、ヨーロピアン・コレクション・オデーアニマル番セル・コレ クション（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ １ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｐｒｏｔ　ＤｏＷｎ。

（ＧＢ）　）に寄託されｔ細胞培養物ｇｃＡｃｃ　８９１１２８０４及びＥＣＡ ＣＣ８９１１２８Ｄ　！ｌ　（これらは、サイトケラチン１９に対する抗体ｔａ 生する）及びこれらセルラインにより産生され之抗体そのものでもある。

サイトケラチン１９の特異的エピドーグとのその反応性に基づき、双方のｍＡＢ の各々は、エピトープ−陽性及びエピトープ−陰性の組織の間の生体内区別の定 めに使用することができる。このために、抗体又はｔａｂ−もしくは（Ｆａｂ’ 　）　２−フラグメントそのものを、この目的に好適なラベルに結合させ、好適 な伝達媒体例えば注射により血管を介してニート−ブー陽性組織（例えば腸瘍、 転移）まで搬送し、そこに結合させる。

次いで画象形成法により、この結合したＡＫｔ−描出すＩｎ−１１１及び核磁気 共鳴造影用のＦｅ”ｕ　ｓ　Ｍｎ。

Ｇｄ又はＦである。

これにより、悪性疾病の生体内診断法が可能になり、この方法では本発明により 使用されている２個のレセプターの少なくとも１方を体組織に付け、その特異的 結合を免疫シンチグラフイで測定する。

本発明を次の！Ｉ！捲例で説明する。

例　１ モノクローナル抗体ａ　Ｍ　１９　ｇｃＡｃｃ　８９１１２８０４免疫原 免疫原として、ＭＣＦ　−７−細胞の細胞骨格（Ｚｙｔｏｓ−ｋｅｌｅｔｔ　） 　ｔ−使用しｔ、この免疫原の製造のＪ［、ｉｉ’は、特にＭｅｔｈ、　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３４、！＋５５′ＩＩ以降（１９８６）及びＢｘｐ、　Ｃ ａ１ｌ　Ｒａｇ、　１７９．１７１［以降（１９８７）に記載されている。まと めると、ＭＣＦ　−７−細胞約１０１０個から、界面活性剤緩衝液（１％）リド ン）を用いて抽出物を得た。このホモジネートの２５００ＩＩでの遠心の後に、 残分を高塩緩衝液で抽出しｔ、この抽出後の不溶分は、ＣＫ−７ラクシヨンに相 当した。

この分を免疫原として使用しｔ。

免疫化 ６〜８週齢のＢａ１ｂ／ｃ−マウスを、完全７０インドアジユバント中のＣＫ− １９＝抗原含７ｆｆＤＫ−７ラクシヨン７０μｇを用い腹腔内で免疫化し友。３ ケ月のリズムで、不完全７０インドアジユバント中の抗原各７０μｇを用いて更 に５回免疫化を実施し几。

６５６骨髄＠　（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ　８５７５　）とを１：１の割合で、Ｊ、　 ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｏｔｈ、　３９巻、２８５〜５０８に記載の標準法 によりｓ合させ友。

サブクローニングの間に、ＣＫ−特異性クローンをその陽性反応により免疫螢光 顕微鏡法で選択取り出し友、この免疫螢光顕微鏡法の究めに、培養細胞（ＭＣＦ −７）’Ｙｔヒト組織（肝臓）と同様に使用した。

腹水の誘導 ／％イデリド細胞２〜５　Ｘ　１０’個を、プリスタン（ｐｒｉｓｊａｎ　）で 前処理されたマウスの腹腔内に注入し几、１５〜２０日後に、抗体濃度５〜１０ 岬／―を宵する腹水を得ることができた。

抗体は、サブクラスｒｇＧ　２　ｔ＋　’ｉ有する。これは、プロット−分析で 、種々の組織（例えば表皮、筋１１）及び培養細胞（例えばＭＣＦ　−７、ＲＴ １１２、Ａ　４５１）からのＣＫ、もっばらＣＫ１９と反応する。

例　２ モノクローナル抗体Ｋｓ　１９．１ＫＣＡＣＣ８９１１２８０３（１ｇ０２ａ） 免疫原としてヒトセルラインＭＣ？　−７の生細胞金側Ｂａ１ｂ　／　ｃ−マウ スを、生細胞約１０７個を用い、腹腔内で５回免疫化させ念。

融合及びクローニング 電子融合を実施しｆｔ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　０ｎｃｏ１．２１．７ ３３以降（１９８５））。融合パートナ−とじて、グラスマサイト−ムライン（ ｐｌａｓｍａ−ｃｙｔｏｍｌｉｎｉｅ　）ｘ６３−ｋｇ８−６５５を用いた。

腹水の誘導 ハイデリド細胞２〜５　Ｘ　１０’個をプリスタンで前処理されたマウスに腹腔 内注入し友。１０〜１５日後に、抗体濃度１０〜１５Ｉ＃９／ｄを有する腹水が 得られた。

体液中のＣＫ１９のフラグメントの測定の几めに、サンドイッチ−酵素−イムノ アッセイを実施した。この際、ピオチン接合体としてのモノクローナル抗体−１ ９，１（！１μｇ／ｌ）は、ＰＢＳ　１００μを中の量で、室温で１時間の間に ストレプトアビジン被覆されｔマイクロ滴定プレートキャピテイに結合され＊、 ０．０５１ツイーン／ＰＢＳで４回洗浄の後に、血清試料とのインキュベーショ ン（ＰＢＳ　１００μを当り血清２μｔ＞’を室温で９０分間行なつｔｏその後 、改めて、ｏ、ｏｓｓツイーン／　ＰＢＳで４回洗浄謳泉。引続き、七ツクロー ナル抗体ＢＭ１５’と共にインキュベートし、室温で９０分の間にペルオキシダ ーゼに結合させ几（最終濃度２５０ｍσ／コ）。ｏ、ｏ　５　＊ライ−ｙ　／　 ＰＢＳでの改めての４回洗浄の後に、酵素基質溶液ＡＢＴ８　（発会商標）（燐 酸塩−クエン酸塩−緩衝液（ｐＨ５−０）１００ｍモル／１．過ホウ酸ナトリウ ム１．４７ｍモル／ｌ、ＡＢ’ｒ８９．１ｍモル／１）と共に室温でインキュベ ートし、３０分後に、抽出物を分析濃度の尺度としてのＡ　Ｑ　５　ｎｍでの吸 収を測定した。

この検査は、覆々の疾病ｆ：有する患者の血清中で実施した。結果を次の表に示 す。

ｔ　正常血清　１９０ ２　良性疾病 婚娠　２０２ 腎不全　５１ 膵炎　２０ 肝硬変症　５３ 乳腺症　１０ 子宮筋騰　２０ 自己免疫疾病　５１ ｐｒｉｍ、ｂｉｌ。

硬変症　５１ ５　悪性疾病 乳癌　５７　２０ 膵臓癌　５１ 胃癌　５５ 気管支ｓ　９　Ａ 頚癌　５５ １次肝細胞癌　５４ ＨＮＯ−癌　３０ 胆道癌　４４ プラスマ細胞＠５０ 例　４ モノクローナル抗体ＥＣＡＣＣ８９１１２８０４を用匹て抗体のエビトープーオ ーバーラッピングを測定した。

この検査は、曖争性＃累イムノアッセイの範囲で行な８９１１２８０５Ｃ３μｇ ／ゴ）ｔ−／オチンー接合体として、ＰＢＳ　１００　μｔ（ＮａＣ２８Ｊｉ’ ／　１％ＫＣ２Ｏ，２ｇ／　ｔ、　ＮａＨ２ＰＯ４ｘ、　２ＦＩ２０１．１４　 ｇ／　ｔ％ＫＨ，Ｐｏ、　０．２９／ｌ）の量中で、室温で１時間の間にストレ プトアビジン被覆されｔマイクロ滴定プレート−キャビティに結合させる。ｏ、 ｏ　５　％ツイーン２０／ＰＢＳで４回洗浄の後に、高滴定濃度（ｈｏｃｈｔｉ ｔｒｉｇｅｎ　）の血清試料（ＰＢＳ　１００μを上の血清２μｔ）と共に室温 で９０分間インキュベートし九〇その後、改めてｏ、ｏ　ｓ　ｓツイーン２　Ｑ 　／　ＰＢＳで４回洗浄し九〇引続き、室温で、同時に９０分間モノクローナル 抗体例えばｇｃＡｃｃ８ｓ；’１１２８１％ト共にインキュベートシ、ベルオキ シダーＪｅ（最終濃度２５０　ｍＵ／ｄ　）及び評価すべき抗体で標識し友。

０．０５　％ツイーン２０／ＰＢ８で改めて４回洗浄の後に、酵素基質溶液ＡＢ ＴＳ　（ＡＢＴＳ　−２、２’−アジノージ−〔６−ニチルベンズチアジンンー スルホン酸（６）　）　−ジアンモニウム塩）と共に室温でインキュベートし、 ３０分後に、抽出物を分析濃度に関する尺度としてのＡ　０５　ｎｍでの吸光度 を測定した。この値を、モノクローナル抗体ＥＣＡＣＣ８９１１２８０４のみと 共にインベき抗体の１０５倍までの過剰が＃累接合体（２５０ｍＵ　／　Ｌ　） が少なくとも５０チの競争率を認識すべきである場合に、エビドーグオーバーラ ッピングが存在ａ）ｒ−１２５による抗体の標識性は 例１〜４に記載の抗体又はフラグメントそのものをクロラミン−Ｔ−法によりＩ 　−１２５１ｍＣ１で沃素化する（　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　８９．１１４〜 １２３（１９６３））。

引続き、未反応の沃素全セファデックスＧ−５０−カラム（ｐｈａｒｍａｃｉａ 　）　ｋ通して分離し、このモノクローナル抗体の免疫反応性をＥＬＩＳＡで検 査する。

ｂ）沃素標識されたモノクローナル抗体での腫瘍局在化 ヌードマウス（Ｂａ１ｂ　／　ｃ　ｎｕ　／　ｎｕ　）の腹腔内にＨｅ　Ｌａ− 細胞（Ｔｙｐ　２　）　５〜５　ｘ　１０１ＯｋＷ種する。約８週後に、接続性 １瘍が形成されているそのマウスにＰＢＳ　（燐酸塩−緩衝塩）中のＫＩ（沃化 カリウム）（１■／ＩＩＬｔ）２００μｍｔ−注射する。ＫＩ注注射２待もしく は相応するモノクローナル抗体−フラグメンドア０μｇ全注射する。放射能の分 布を、オートラジオグラフィ装置（例えばＧｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　 ）　ｆ用いて２０日間にわたり観察する。この際、持続性１瘍の範囲内の放射能 の蓄積が双方のモノクローナル抗体との要　約　書 悪性疾病の検出のために、体液試料を少なくとも２つのレセプターＲ３及びＲ１ と共にインキュベートし、この際、レセプターＲ１及びＲ，の少なくとも１方と 試料液中の検出すべき物質との結合により信号変化を得、かつこの際、双方のレ セプターの１方は、サイトケラチン１９のアミノ酸配列２９１〜３３５に結合す るモノクローナル抗体を含有し、他のレセプターは、サイトケラチン１９のアミ ノ酸配列３４６〜３６７に結合するモノクローナル抗体を含有し、この結合に基 づく試料中の信号変化を測定する。

国際調査報告 ｍ論１−−ｌ鰺−５にテ／ＥＰ　９０１０２３１４−１−一〜−一−ｍ　ＰＣｒ ／ＥＰ　９０１０２３１４国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．悪性疾病を検出する方法において、体液試料を、少なくとも２種のレセプタ −Ｒ１及びＲ２と共にインキユベートし、この際、少なくとも、レセプタ−Ｒ１ 及びＲ２と試料溶液中の検出すべき物質との結合により信号変化を得、かつ、こ こで、双方のレセプターの１方が、サイトケラチン１９のアミノ酸配列２９１〜 ３３５に結合するモノクローナルを含有し、他のレセプターはサイトケラチン１ ９のアミノ酸配列３４６〜３６７に結合するモノクローナル抗体を含有し、この 結合に基づく試料中の信号変化を測定することを特徴とする、悪性疾病を検出す る方法。 ２．レセプタ−Ｒ１として、固相への結合を媒介するレセプターを使用し、レセ プタ−Ｒ２として、標識されたレセプターを使用し、液相からの固相の分離の後 に、双方の相の１方中り標識を測定する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．ストレプトアビジンで被覆されている固相及びレセプタ−Ｒ１として請求の 範囲第１項で定義されている２つの抗体の１方とビオチンとの接合体を使用し、 この際、固相へのモノクローナル抗体の結合を、ストレプトアビジンヘのビオチ ンの結合により行なう、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．レセプタ−Ｒ２として、請求の範囲第１項で定義されていて、蛍光性又はＮ ＭＲ−信号を発する物質又は酵素で標識されている、放射性のモノクローナル抗 体を使用する、請求の範囲第２項又は第３項に記載の方法。 ５．その１方はサイトケラチン１９配列３１１〜３３５に結合し、他方はサイト ケラチン１９の配列３４６〜３５９に結合するモノクローナル抗体を使用する、 請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に記載の方法。 ６．配列３１１〜３３５に結合する抗体としてセルラインＥＣＡＣＣ８９１１２ ８０３から形成された抗体又は同等に結合しうる抗体を使用する、請求の範囲第 ５項に記載の方法。 ７．配列３４６〜３５９に結合する抗体として、セルラインＥＣＡＣＣ８９１１ ２８０４から形成された抗体又は同等に結合しうる抗体を使用する、請求の範囲 第５項に記載の方法。 ８．少なくとも２種のレセプタ−Ｒ１及びＲ２を含有し、双方のレセプターの１ 方はサイトケラチン１９の配列２９１〜３３５に結合するモノクローナル抗体を 含有し、他方のレセプターは、サイトケラチン１９の配列３４６〜３６７に結合 するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする悪性疾病を検出するための 試薬。 ９．レセプタ−Ｒ２として、サイトケラチン１９のアミノ酸配列２９１〜３３５ 又は３４６〜３６７に結合するモノクローナル抗体を含有する、請求の範囲第８ 項に記載の試薬。 １０．ストレプトアビジンで被覆されている固相及びレセプタ−Ｒ１としての、 サイトケラチン１９のアミノ酸配列２９１〜３３５又は３４６〜３６７に結合し 請求の範囲第９項記載の抗体とは異なるモノクローナル抗体とビオチンとの接合 体を含有する、請求の範囲第８項又は第９項に記載の試薬。 １１．サイトケラチン１９のアミノ酸配列３１１〜３３５に結合するモノクロー ナル抗体を含有する、請求の範囲第９項又は第１０項に記載の試薬。 １２．セルラインＥＣＡＣＣ８９１１２８０３により形成された抗体又は同等に 結合しうる抗体を含有する、請求の範囲第１１項に記載の試薬。 １３．サイトケラチン１９のアミノ酸配列３４６〜３５９に結合するモノクロー ナル抗体を含有する、請求の範囲第９項又は第１０項に記載の試薬。 １４．セルラインＥＣＡＣＣ８９１１２８０４により形成された抗体又は同等に 結合しうる抗体を含有する、請求の範囲第１３項に記載の試薬。 １５．セルラインＥＣＡＣＣ８９１１２８０３により産生された抗体。 １６．セルラインＥＣＡＣＣ８９１１２８０４により産生された抗体。 １７．ヒルラインＥＣＡＣＣ８９１１２８０３．１８．セルラインＥＣＡＣＣ８ ９１１２８０４。 １９．請求の範囲第１項に記載の２種のレセプタ−Ｒ１及びＲ２の１方を体組織 に施与することを特徴とする、生体内の悪性疾病を検出する方法。 ２０．レセプタ−Ｒ１又はＲ２は、シンチグラフイ又はエミツショントモグラフ イ検出のための放射性又はＮＭＲ−信号を生じる標識を有すする、請求の範囲第 １９項に記載の方法。