JP2017088519A - Ck19に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】サイトケラチン19と抗原抗体反応する第1抗体と標識物質とが結合した標識抗体、および、サイトケラチン19と抗原抗体反応する第2抗体が固相化された抗体捕捉部を備えるクロマトグラフ媒体、を含むイムノクロマトグラフィーによる癌の検出キットであって、第1抗体を受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体とし、第2抗体を受託番号NITE P−02135のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体とする。
【選択図】図1
Description
<1>サイトケラチン19に特異的なモノクローナル抗体であって、受託番号NITE P−02135、または、受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
<2>受託番号NITE P−02135、または、受託番号NITE P−02136のハイブリドーマ。
<3>サイトケラチン19と抗原抗体反応する第1抗体と標識物質とが結合した標識抗体と、サイトケラチン19と抗原抗体反応する第2抗体が固相化された抗体捕捉部を備えるクロマトグラフ媒体と、を含むイムノクロマトグラフィーによる癌の検出キットであって、
第1抗体が受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であり、かつ、第2抗体が受託番号NITE P−02135のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である癌の検出キット。
<4>前記癌の検出キットを用いた、イムノクロマトグラフィーによる癌の検出方法であって、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と前記標識抗体を含む混合液を前記抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)前記試料中のサイトケラチン19と前記標識抗体との複合体が、前記抗体捕捉部で検出された場合に、前記試料に癌細胞が含まれていると判定する工程
を含むことを特徴とする癌の検出方法。
<5>前記<3>の癌の検出キットとして、互いに検出感度の異なる低感度検出キットおよび高感度検出キットの2種を用いた、イムノクロマトグラフィーによる癌の転移の判定方法であって、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と前記標識抗体を含む混合液を前記抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて、前記試料中のサイトケラチン19と前記標識抗体との複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさを超えるマクロ転移が存在すると判定し、
低感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されず、かつ、高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさ以下のマイクロ転移、0.2mm以下のIsolated Tumor Cells (ITCs)、上皮成分の混入のうちの少なくともいずれかが存在すると判定し、
低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されない場合に、癌の転移が存在しないと判定する工程
を含むことを特徴とする癌の転移の判定方法。
<6>リンパ節郭清を行う基準となる転移の大きさは、2mmであることを特徴とする前記<5>の癌の転移の判定方法。
<7>前記低感度検出キットの標識抗体は、粒径20〜60nmの金属コロイドで標識されており、前記高感度検出キットの標識抗体は、前記低感度検出キットの標識抗体の金属コロイドの粒径より大きく、かつ、粒径40〜80nmの金属コロイドで標識されていることを特徴とする癌の転移の判定方法。
試料添加パッド2の材料は特に限定されないが、例えば、セルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル不織布、綿布などの均一な特性を有するものを例示することができる。試料添加パッド2は、添加された試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子などを濾過する機能をも兼ねている。また、分析の際、試料中のCK19が試料添加パッド2に非特異的に吸着し、分析の精度が低下することを防止するため、試料添加パッド2は、予め非特異的な吸着を防止する処理を行うこともできる。
標識抗体保持パッド3の素材としては、例えば、セルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、および不織布などを例示することができる。標識抗体保持パッド3は、標識抗体6を含む懸濁液を抗体捕捉部7が形成されたクロマトグラフ媒体4に直接、塗布・乾燥などすることで形成することができる。また、標識抗体6を含む懸濁液を、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布などに塗布・乾燥させて標識抗体保持パッド3を形成し、抗体捕捉部7が形成されたクロマトグラフ媒体4と毛管で繋がるように配置することもできる。
クロマトグラフ媒体4は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される標識抗体6(第1抗体A1)などと反応しないものであり、かつ、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。
吸収パッド5は、添加された試料や展開液がクロマト移動により物理的に吸収されるとともに、クロマトグラフ媒体4の検出部に不溶化されない未反応の標識物質Lなどを吸収除去する部位である。また、吸収パッド5は、添加された試料のクロマト移動を一定に保つ役割を有している。
クロマトグラフ媒体4は、コントロール用抗体A3を固定化した領域であるコントロール部8を備えることができる。コントロール用抗体は、CK19との反応性を有しておらず、標識抗体6(第1抗体A1)との反応性を有している抗体を適宜使用することができ、具体的には、抗マウスIgGウサギポリクローナル抗体、抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体などを例示することができる。
以上のように、本発明の癌の検出キットは、CK19と抗原抗体反応する第1抗体A1と標識物質Lとが結合した標識抗体6と、CK19と抗原抗体反応する第2抗体A2が固相化された抗体捕捉部7を備えるクロマトグラフ媒体4と、を含むイムノクロマトグラフィーによる癌の検出キットである。そして、第1抗体A1が受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であり、かつ、第2抗体A2が受託番号NITE P−02135のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
本発明の癌の検出方法は、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と標識抗体を含む混合液を抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)試料中のCK19と標識抗体との複合体が抗体捕捉部で検出された場合に、試料に癌細胞が含まれていると判定する工程
を含む。
すなわち、この癌の転移の検出方法は、癌の検出キットとして、互いに検出感度の異なる低感度検出キットおよび高感度検出キットの2種を用いた、イムノクロマトグラフィーによる癌の転移の判定方法であって、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と前記標識抗体を含む混合液を前記抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて、前記試料中のサイトケラチン19と前記標識抗体との複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさを超えるマクロ転移が存在すると判定し、
低感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されず、かつ、高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさ以下のマイクロ転移、0.2mm以下のIsolated Tumor Cells (ITCs)、上皮成分の混入のうちの少なくともいずれかが存在すると判定し、
低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されない場合に、癌の転移が存在しないと判定する工程
を含む。
サイトケラチン19(Homo sapiens keratin 19, KRT19, Accession No. NM_002276.4)のcDNAはOrigene社から購入した(Catalog No. RC209707)。これを、同じくOrigene社のベクター、pEX-N-His-GSTに組み込み、His-GST融合サイトケラチン19発現ベクターを構築した。これを大腸菌に導入して形質転換を行った。この形質転換体を培養することにより、Inclusion bodyと呼ばれる不溶性画分にHis-GST融合サイトケラチン19蛋白質を得た。この画分を6M 尿素を含むPBS溶液(pH 8.0)で可溶化し、Ni-NTAを用いて当該蛋白質の精製品を得た。
抗体産生ハイブリドーマを選別する際には、免疫に用いた蛋白質中の主にGST部分を認識する抗体産生ハイブリドーマを排除する必要がある。そこでスクリーニング用サイトケラチン19蛋白質発現ベクターとして、Origene社から購入したベクター、pCMV6-AC-Myc-Hisにサイトケラチン19のcDNAを組み込んだpCMV6-AC-Myc-His-CK19を構築した。これをFree Style 293細胞にトランスフェクションしたところ、細胞質内に蛋白質発現を認めたため、6M 尿素を含むPBS溶液(pH 8.0)で細胞を可溶化し、Ni-NTAで当該蛋白質を精製した。続いて、透析によって徐々に尿素濃度を下げてリフォールディングを行い、可溶性Myc-His融合サイトケラチン19蛋白質を得た。
Myc-His融合サイトケラチン19蛋白質は、20倍モル濃度のSulfo-NHS-LC-Biotinを用いてBiotin修飾を行った。このビオチン化蛋白質について、既にサイトケラチン19フラグメント(Cyfra21.1)の測定系に用いられている市販抗サイトケラチン19抗体クローンKs19.1を用いて反応性を調べ、これがスクリーニングに使用可能であることを確認した。
実施例1で得た蛋白質溶液を、等量のTiterMax Gold(TiterMax USA, Inc.)と混和して乳剤を調製し免疫源とした。モノクローナル抗体は、K. Watanabe et al., Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis, J. Clin. Invest. 114 (2004), 898-907に記載されている方法で作製した。すなわち、5週齢の雌Balb/c系マウスあるいはA/J系マウスに、投与1回につき、一匹当たり50μgの当該蛋白質を、皮下あるいは腹腔内に等量に分けて投与した。5回の免疫後に、最終のブースター(細胞融合の4日前)を行ったマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。続いて脾細胞とミエローマ細胞(P3U1)との細胞融合を行った。希釈と培養を繰り返し、その都度、抗体価と親和性を測定することにより、親和性の高い10種のモノクローナル抗体(1H1、2G12、2D5、3A6、3E10、4E2、7A9、8C3、14E9、8A9)を産生するハイブリドーマを取得した。
抗血清とハイブリドーマ上清の抗体価の評価は、DELFIA法にて行った。すなわち、ヤギ抗マウスIgG抗体を固相した96穴マイクロプレートに、抗血清あるいはハイブリドーマ上清を添加し、さらにビオチン化Myc-His融合サイトケラチン19蛋白質とEu標識ストレプトアビジンを混合攪拌後、室温で2時間あるいは4℃で終夜反応させた。反応後、洗浄液(0.01% Tween 20と0.1% ProClin 150を含む生理食塩水)にて3回洗浄し、100μLの増強試薬を加え、攪拌後5分間静置し、615nmにおける時間分解蛍光をARVO MX(Perkin Elmer)で測定した。抗血清やハイブリドーマを未添加の場合に得られるシグナルの3倍を超えるシグナル強度を示す場合を陽性と判断した。
取得した10種のモノクローナル抗体(1H1、2G12、2D5、3A6、3E10、4E2、7A9、8C3、14E9、8A9)の親和性とサブクラスを表1に示す。
イムノクロマトグラフィーに適する標識抗体と捕捉抗体の組み合わせを決定するために、獲得したすべての抗体(1H1、2G12、2D5、3A6、3E10、4E2、7A9、8C3、14E9、8A9)についてサンドイッチELISAを行った。これにより良好な抗体の組み合わせが分かるだけでなく、エピトープが重なる組み合せ、類似の特異性を持つ抗体、修飾によって活性が低下する抗体を判別することができる。
実施例5で比較的反応性が高かった5つのクローン(1H1、2D5、3A6、3E10、14E9)について抗体を調製し、イムノクロマトグラフィー用検出キットの作製検討に供した。
抗体 5 種をそれぞれ 1mg/mL に希釈し、塗布溶液とした。塗布溶液をメンブレンに塗布、乾燥させて、抗体(第2抗体)5 種が固定された抗体捕捉部(判定ライン)を形成した後、ブロッキング処理を行い、判定紙(図1におけるクロマトグラフ媒体4)を 5 種作製した。
ニトロセルロース・アセテートメンブレン(ミリポア社製ハイフロープラス(HFC135))を机上に固定し、抗マウスIgG抗体(1mg/mL、10mMリン酸緩衝液で希釈)溶液をディスペンサーを用いてライン状に塗布してコントロール部8を形成した。また、ニトロセルロース・アセテートメンブレンに抗体(第2抗体)5種(1mg/mL、10mMリン酸緩衝液で希釈)の溶液を、ディスペンサーを用いてライン状に塗布して抗体補捉部7を形成した。このニトロセルロースメンブレンを、1重量%のスキムミルクと2重量%のショ糖、0.02重量%のSDSを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.4)中に含浸し、取出した後、乾燥させ、室温で乾燥材入りのバッグに使用するまで保存し、図1に示した抗体補足部7およびコントロール部8が形成されたクロマトグラフ媒体4を得た。
抗体 5 種を使用して、それぞれ同一条件で金コロイド標識された標識抗体(標識化第1抗体)を作製し、支持体に含浸させて乾燥し、試薬紙(図1における標識抗体保持パッド3)を5種作製した。
(2−1)標識化第1抗体の調製
市販の平均粒径40nm(OD530=約1.0)の金コロイド溶液20mLに50mMトリシン緩衝液(pH8.15)を2mL添加して撹拌した。その後、2mMトリシン緩衝液(pH8.15)で0.1mg/mLに希釈した抗体1.6mLを添加して撹拌し、その後、30分静置した。続いて10重量%牛血清アルブミン(pH9.0)2.4mLを添加し、10分撹拌し、得られた混合物を1.5mLチューブに分注し、8℃で10分間、6100×g の遠心分離を行って精製した。沈下した標識化第1抗体のペレットを蒸留水で再懸濁し1mLとし、使用するまで4℃で保存した。
上記(2−1)で得られた標識化第一抗体を、1.5重量%の牛血清アルブミンと2重量%のショ糖とを含む150mMトリシン緩衝液(pH8.15)を用いて希釈した。この時、標識化第一抗体が5容量%となるように希釈した。得られた溶液1mLをガラス繊維濾紙に含浸、乾燥させ、室温で乾燥材入りのバッグに保存した。
5種類ずつの判定紙および試薬紙をそれぞれ組合せてテストストリップを20種類作製した。
片面が粘着加工された乳白ポリエステル台紙を、粘着面を上にして机上に固定し、上記(1)で作製した判定紙(クロマトグラフ媒体4)を貼り合わせた。続いて、上記(2)で作製した試薬紙(標識抗体保持パッド3)を貼り合わせ、クロマトグラフ媒体4と標識抗体保持パッド3とが約2mmの重なりを有した状態で連設した。さらに、ポリエステル不織布からなる試料添加パッド2を、標識抗体保持パッド3を一部覆うように貼り合わせた。また、濾紙を貼り合わせて吸収パッド5とした。
(1)試験1
(i)抗原は、CK19-Hisを使用した。抗原をPBS(pH7.4)で10ng/mLに希釈したものを検体液とした。検体液の濃度調製は、CK19としての濃度で調製した。
(ii)試験チューブに検体液を100μL添加し、テストストリップを試験チューブに挿入した。
(iii)10分後に抗体捕捉部(判定ライン)の着色の度合いを目視判定した。
抗体捕捉部(判定ライン)の着色の度合いは、以下の判定基準に従って目視判定した。
+ :陽性(はっきりと判定ラインが確認できる)
± :弱陽性(ごく薄い判定ラインが確認できる)
Tr :判定ラインの痕跡が認められる(弱陽性より着色が弱い)
− :陰性(判定ラインが確認されない)
(3)結果
結果を表4に示す。
試験1で抽出した 前記の8 種類の組み合わせについて、抗原 MCF7 Lysate 2.5 ng/mL および 5 ng/mL(細胞溶解液で調製)の検出を試みた。試験方法、判定基準は、試験1に準じて行った。
結果を表5に示す。
実施例7の(4)試験2で選択した抗体の組み合わせ(捕捉抗体(第2抗体)×標識抗体(第1抗体):1H1×14E9)について、実施例7の試験1、2と同様に、抗原(CK19-His、MCF7 lysate)の濃度を変更して感度試験を行った。
(1)実施例8で使用したテストストリップ(捕捉抗体(第2抗体)×標識抗体(第1抗体):1H1(受託番号NITE P−02135)×14E9(受託番号:NITE P−02136))について、141例の臨床検体(蛋白抽出液)を用いて、癌(乳癌)の転移の有無を評価した。
(i)手術で摘出したリンパ節をメス刃で2mm幅の割を入れ、メス刃をリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Saline: PBS) 2mLで20回転倒混和して洗浄する。
(ii)割を入れたリンパ節を同じPBSで20回転倒混和して洗浄し、取り出したリンパ節は病理診断に提出する。
(iii)リンパ節洗浄液を1分間遠心分離(5200×g)し、上清を捨てる。
(iv)残った細胞集塊に細胞溶解液40μLを加え、細胞集塊を破砕して3分間待つ。細胞溶解液は、以下の組成試薬を使用した。
0.1%NP40/PBS(pH 7.4)/プロテアーゼ阻害剤
PBS:8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4, 2.68mM KCl, 137mM NaCl
(v)細胞溶解液をフィルターに注入し、15秒間遠心分離(5200×g)する。フィルターを除去し、蛋白抽出液を得る。
実施例8、9で使用したテストストリップ(捕捉抗体(第2抗体)×標識抗体(第1抗体):1H1(受託番号NITE P−02135)×14E9(受託番号:NITE P−02136))について、横置きのハウジングタイプを採用したテストストリップを作製した。
ニトロセルロースメンブレン(GEヘルスケアジャパン製immunoporeRP(孔径8μm))を机上に固定し、抗マウスIgG抗体(1mg/mL、2重量%ショ糖を含む10mMリン酸緩衝液で希釈)溶液をディスペンサーを用いてライン状になるように塗布してコントロール部8を形成した。また、ニトロセルロースメンブレンに補捉抗体(第2抗体:1H1(受託番号NITE P−02135)1mg/mL、2重量%ショ糖を含む10mMリン酸緩衝液で希釈)溶液を、ディスペンサーを用いてライン状に塗布して抗体捕捉部7を形成した。このニトロセルロースメンブレンを、1重量%のスキムミルクと2重量%のショ糖、0.02重量%のSDSを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.4)中に含浸、乾燥させ、室温で乾燥材入りのバッグに使用するまで保存した。
(2−1)標識化第1抗体(標識抗体)の調製
市販の平均粒径60nm(OD530=約2.0)の金コロイド溶液20mLに50mMトリシン緩衝液(pH8.15)を4mL添加して撹拌した。その後、2mMトリシン緩衝液(pH8.15)で0.1mg/mLに希釈した第1抗体14E9(受託番号NITE P−02136)1.0mLを添加して撹拌し、その後、室温で静置した。続いて0.1重量%カゼインを含む20mMトリス緩衝液2.0mLを添加して撹拌し、得られた混合物を1.5mLチューブに分注し、8℃で10分間、3400×g の遠心分離を行って精製した。沈下した標識化第1抗体のペレットを蒸留水で再懸濁し1mLとし、使用するまで4℃で保存した。
上記(2−1)で得られた標識化第一抗体を1.5重量%の牛血清アルブミンと2重量%のショ糖とを含む300mMトリシン緩衝液(pH8.15)を用いで希釈した。この時、標識化第一抗体が5.5容量%となるように希釈した。得られた溶液1mLをガラス繊維濾紙に含浸、乾燥させ、室温で乾燥材入りのバッグに保存した。
片面が粘着加工された乳白ポリエステル台紙を、粘着面を上にして机上に固定し、上記(1)で作製したクロマトグラフ媒体4を貼り合わせた。続いて、透明ポリプロピレンフィルムからなる保護カバーを、粘着面側を下にして貼り合わせた。続いて、上記(2)で作製した標識抗体保持パッド3を貼り合わせ、クロマトグラフ媒体4と標識抗体保持パッド3とが約2mmの重なりを有した状態で連設した。さらに一端を合わせて、ポリエステル製不織布からなる試料添加パッド2を、標識抗体保持パッド3を一部覆うように貼り合わせた。また、濾紙を貼り合わせて吸収パッド5とした。
細胞溶解液で抗原(MCF7 lysate)を所定の濃度に希釈したものを検体液とした。検体液濃度調整は、CK19 としての濃度で調整した。また、細胞溶解液は、以下の組成試薬を使用した。
PBS:8.1mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4、2.68mM KCl、137mM NaCl
そして、調製した検体液を、テストストリップの試料添加パッドに添加して、クロマトグラフ媒体上に展開し、10分後に抗体捕捉部(判定ライン)の着色の度合いを目視判定した。
抗体捕捉部(判定ライン)の着色の度合いは、以下の判定基準に従って目視判定した。
± :弱陽性(ごく薄い判定ラインが確認できる)
Tr :判定ラインの痕跡が認められる(弱陽性より着色が弱い)
− :陰性(判定ラインが確認されない)
結果を表9に示す。
実施例10で作製したテストストリップについて、実施例9と同様に139例の臨床検体(蛋白抽出液)を用いて、癌(乳癌)の転移の有無を評価した。蛋白抽出液は、実施例9と同様の方法で調製した。
実施例8、9で使用したテストストリップ(以下、「低感度テストストリップ」という)と、実施例10で使用したテストストリップ(以下、「高感度テストストリップ」という)の2種のテストストリップを用いる事で、転移巣の大きさを推定するかどうかを検討した。
2 試料添加パッド
3 標識抗体保持パッド
4 クロマトグラフ媒体
5 吸収パッド
6 標識抗体
7 抗体捕捉部
8 コントロール部
A1 第1抗体
A2 第2抗体
A3 コントロール抗体
L 標識物質
Claims (7)
- サイトケラチン19に特異的なモノクローナル抗体であって、受託番号NITE P−02135、または、受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
- 受託番号NITE P−02135、または、受託番号NITE P−02136のハイブリドーマ。
- サイトケラチン19と抗原抗体反応する第1抗体と標識物質とが結合した標識抗体、および、
サイトケラチン19と抗原抗体反応する第2抗体が固相化された抗体捕捉部を備えるクロマトグラフ媒体、
を含むイムノクロマトグラフィーによる癌の検出キットであって、
前記第1抗体が受託番号NITE P−02136のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であり、かつ、前記第2抗体が受託番号NITE P−02135のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする癌の検出キット。 - 請求項3の癌の検出キットを用いた、イムノクロマトグラフィーによる癌の検出方法であって、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と前記標識抗体を含む混合液を前記抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)前記試料中のサイトケラチン19と前記標識抗体との複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、前記試料に癌細胞が含まれていると判定する工程
を含むことを特徴とする癌の検出方法。 - 請求項3の癌の検出キットとして、互いに検出感度の異なる低感度検出キットおよび高感度検出キットの2種を用いた、イムノクロマトグラフィーによる癌の転移の判定方法であって、以下の工程:
(1)被験者のリンパ節由来の試料と前記標識抗体を含む混合液を前記抗体捕捉部へ展開させる工程;および
(2)低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて、前記試料中のサイトケラチン19と前記標識抗体との複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさを超えるマクロ転移が存在すると判定し、
低感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されず、かつ、高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出された場合に、リンパ節郭清を行う基準となる大きさ以下のマイクロ転移、0.2mm以下のIsolated Tumor Cells (ITCs)、上皮成分の混入のうちの少なくともいずれかが存在すると判定し、
低感度検出キットおよび高感度検出キットにおいて前記複合体が前記抗体捕捉部で検出されない場合に、癌の転移が存在しないと判定する工程
を含むことを特徴とする癌の転移の判定方法。 - リンパ節郭清を行う基準となる転移の大きさは、2mmであることを特徴とする請求項5の癌の転移の判定方法。
- 前記低感度検出キットの標識抗体は、平均粒径20〜60nmの金属コロイドで標識されており、前記高感度検出キットの標識抗体は、前記低感度検出キットの標識抗体の金属コロイドの粒径より大きく、かつ、平均粒径40〜80nmの金属コロイドで標識されていることを特徴とする請求項5または6の癌の転移の判定方法。
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