JPH026756A

JPH026756A - 細胞組織標本の起源の同定方法

Info

Publication number: JPH026756A
Application number: JP1016078A
Authority: JP
Inventors: Gerda Dr Bruder; ゲルダ　ブルーダー; Werner Wilhelm Dr Franke; ヴェルナー　ヴィルヘルム　フランケ
Original assignee: Progen Biotechnik GmbH
Current assignee: Progen Biotechnik GmbH
Priority date: 1988-01-26
Filing date: 1989-01-25
Publication date: 1990-01-10
Anticipated expiration: 2013-08-06
Also published as: EP0337057A1; DE3815932A1; JP2784200B2; EP0337057B1; DE58904104D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、細胞組織標本中または体液中に存在する不溶
竹中間径細系タンパク質を可溶性フラグメント好ましく
はぞのα−ヘリックス中間部分の形に可溶化し、このフ
ラグメントの特異的抗体との免疫反応によりその起源組
織型を同定する細胞組織標本または体液中の細胞組織断
片の分化状態および起源の同定方法に関する。

この場合の溶液はひとつには、組織から調製することが
でき、この目的では、組織をホモジナイズし、ついでプ
［１テアーゼで処理する。この方法は、腫瘍の分類、と
くに腫瘍［４織とは別の型に属する組織中の転移層の同
定に使用することができる。この場合の溶液はまた天然
の体液であってもよい。体液中にＩＦタンパク質、ｊ３
よびそのフラグメントが見出されることは、病的状態で
なげれば細胞内に不溶性で局在するＩＦ構造タンパク質
の遊離を招くような細胞障害の存在の証明となる。

下記の代表的なＩＦタンパク質について組織との関係が
現在までに知られている。これを第１表に簡単に示す。

第１表代表的起源＃Ｉｌ織中間径細糸タンパク質筋肉組織神経組織（神経細胞）デスミン神経細糸タンパク質（ＮＦ−Ｌ、　Ｎ［−Ｈ，Ｎｒ−１１）結合織（間質細
胞）ビメンチン神経組織（星状グリア細胞）グリア相系タンパク質（１！ｉ性グリア細糸タンパク質ともいう）上皮組織サイトケラチン「サイトケラチン」の概念は、Ｆｒａｎｋら（Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１１６：４２９−４４５）によって
この文献に導入されたのと同じ意味で、本明細において
も用いられる、。

ＷＯ３５１０３１３２号には、患者血清中に含まれる血
清りイトケラチンを特定の免疫学的抗体によって同定す
る方法が記載されている。しかしながら、このような［
細胞外サイ１へケラチン」に関するＷＯ３５１０３１３
２号の記載は２つの重要な点で誤っている。ずなわち、
細胞外サイトケラチンのアミン末端は遮断されていない
（これまでに分析された細胞内サイトケラチンはすべて
、他のＩＦタンパク賀と同様、アミン末端はきわめて圧
倒的に遮断されているという点で文献の記載は一致して
いて、多くの場合、遮断基はアセチル残基であることが
明らかにされている）ばかりか、血清を含め細胞外空間
内への完全な４ノイトク゛ラチンの、ＷＯ３５１０３１
３２号に記載された方法での「分泌１は全く成功してい
ない。す４ヱわち、勺イ１ヘケラチンに特異的なすべて
の公知のＩＦタンパク質のアミノ酸配列［ヒトシイ１〜
ケラチンにツイテは、Ｈｏ１ｌ、Ｒ，、ＦｒａｎｋｅＪ
、Ｗ、、５ｃｈｉｌｌｅｒ、　Ｄし　　Ｇｅ１ａｅｒ、
Ｂ、＆　　Ｋｒｃｐｌｅｒ、Ｒ，：Ｃｅ１ｌ、３　１　
　：　　１　１　−　２４　、　１９８２　；　Ｑｕｉ
ｎｌａｎ、Ｒ，Ａ、、５ｃｈｉｌｌｃｒ、Ｄ、Ｌｌｌａ
ｔｚｆｅｌｄ　　Ｈ，Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ、Ｔ、
、Ｈｏ１ｌ、ｌｉ、、Ｊｏｒｃａｎ。

Ｊ、Ｌ、、Ｈａｇｉｎ、Ｔ、Ｈ，＆　Ｆｒａｎｋｅ、Ｗ
、Ｗ：Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１’ｉ　ｌａｍ
ｅｎｔｓ（Ｗａｎｇ、　Ｅ、　Ｆｉｓｃｈｍａｎ、　Ｄ
、　、　Ｌｉｅｍ、　Ｒ，Ｋ、　Ｈ８ｕｎ、丁、−１１
編）、４５５巻、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＡｃａｄｅ
ｍｙ　　ｏｒ　　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
ｐｐ２８２−３０６．１９８５に記載されている］は、
分泌過程に必要なすべての分子生物学的条件を欠いてい
るのである。サイトケラチンは血清に全く溶解しないか
ら、ＷＯ３５１０３１３２号に記載されている血ン＾学
的証明は、完全なサイトケラチンについてのものではな
く、リーイトケラヂンの可溶性断片についてのものであ
るにすぎない。したがって、この公開された記述は、定
量的な測定を可能にするものではない。

正常および腫瘍哺乳動物組織におけるサイ１〜ケラチン
の組織学的および免疫学的証明は、Ｆｒａｎｋｅ、　Ｗ
　　ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｉ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、Ｕｓ八７５　：５０へ４−５０３８、１９７８　）　
、　ｒｒａｎｋｃ、Ｗら（ＤｉＨｃｒｅｎｔｉａｔｉｏ
ｎ　　、　　１　５　　：　　７−２５．　１９７９＞
ならびにＢａｎｎａｓｃｌ＋　Ｐ　　ら（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃＵＳ＾７７：４９４８−４．９
５２．１９８０＞の報告によりよく知られている５、シ
かしながら、腫瘍組織の組織学的同定はその可能性をけ
まい範囲に置いたもので、その際の切片に限定され、集
積的な方法としての適格性をもつものではない。

本発明の目的は、冒頭に述べたような方法を開発し、そ
のために適当な抗体を提供することにある。

本発明はこの目的を、ＩＦタンパク質の起゛源組織型の
同定、好ましくは一義的同定に適し、さらに前述の各中
間径細糸タンパク質の精製モノマーからの再構築によっ
て得られる標準のα−ヘリックス中間部分または■ピ１
〜−プを−ｂつそのフラグメントと、多くの様々なよく
知られた試験方法に従って免疫学的に反応する抗体を用
いることによって解決する。

標準は好ましくは、同定すべき中間部分またはエピ１〜
−プをもつフラグメントから製造される。

すなわち、相当する組織または適当な細胞系から抽出お
よび精製によって単一の細胞骨格ポリペプチドを単離し
、このポリペプチドからまたサイトケラチンの場合は塩
基性（ＩＩ型）および酸性（■型）亜群のりイトケラチ
ンポリペプチドの等モル混合物から次の下位単位として
ダイマーついでテトラマー、最後にプロトフィラメント
を形成させ、次にプロテア−Ｌによる制御された消化に
よってテトラマーとしての中間径細糸のα−ヘリツクス
中間部分を遊離させ、単＋ｍｔ精製し、標準として使用
する。

試験すべき標本は細胞組織からの標本であってもよい。

また、体液たとえば血液、血清、脳脊髄液、尿、羊水ま
たは穿刺液でもよく、この場合、体液に溶解している細
胞骨格タンパク質フラグメントが検出、定量される。

同定すべき中間径細糸タンパク質の可溶化は、各２個の
中間部分フラグメン１〜へのα−ヘリツクス中間部分の
単回分裂が好ましくは最大になるまで行い、そのエピト
ープが単回分裂によって影響されずこの中間部分ノラグ
メントに最小１個存在するような抗体を使用し、この］
ニエビ−一プをもつ中間部分フラグメン１〜の数を測定
してα−へリツクス中間部分の定量および同定を行い。

この場合、プロアアーげによる可溶化は、同定すべき中
間径細糸タンパク質のすべてからα−へリツクス中間部
分またはエビ１−−プをもつそのフラグメン１〜が遊離
するように設定した酵素対基質の関係および分解時間を
用いて行うのが最善である。

予備研究および実験に基づいて、前述の公知の組織学的
同定に適した公知の抗体がＩＦタンパク質の同定に適し
ている事実を利用づることが好ましい。これらの抗体か
ら、特別な方法で、血清学的同定に適し、また各α−ヘ
リックス中間部分に存在してさらにタンパク質分解や他
の分解処理に付しても比較的安定なエピトープに対づる
抗体が選択される。

たとえば、以下に述べる最も頻繁に存在するすイ１ヘケ
ラチン８，１８および１９に対しでは次の入手可能な抗
体が使用される。すなわちＣＡＭ５　、　２　（Ｂｅｃ
ｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　）４ｔｎ、Ｖｉｃｗ　Ｃ
八、ＵＳＡから入手可能）　：　ＫＯ２、１３（Ｂｉｏ
Ｈａｋｏｒ、ＲｅｈｏｖｏｔＩｓｒａｅｌから入手可能
）；Ｋｓｐａｎｌ−８［Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂ
ｅｒｇ　　（ドイツ連邦共和国）カラ入手可能：　Ｅ　
ＣＡ　ＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　ｏｆ＾ｎｉｍａｌ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ
　　Ｐ旧−３ＣＡＨＲＰｏｒｔｏｎ　　ＤｏｗｎＳａｌ
ｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓ、英国）に寄託番号箱８８０
１１９０１として寄託されている。第２表参照］；ＣＫ
　−２［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ　　
（ドイツ連邦共和国）から入手可能］　；　Ｋ８１９　
、２　［Ｐｒｏｏｅｎｌｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　（ドイ
ツ連邦共和国から入手可能；ＥＣＡＣＣに寄託番号第８
７１１１３０２号として寄託されている］を挙げること
ができる。抗体Ｋｓ１９．２はサイトケラチン１９に特
異的である（第３表参照）。

本発明の応用に際して使用できるその伯の抗体としては
、サイトケラチン８に特異的な抗体であるＫｓ８−１７
．２　（ＥＣＡＣＣに寄託番号箱８７１１０６０１号と
しＣ寄託されている；　ＬＩＦの第４表参照）；サイ１
〜ケラチン１８に特異的な抗体であるＫｓ　１８　２７
ＩＶ　（Ｅ：ＣＡＣＣに寄託番号箱８７１１３０１とし
て寄託されている；以上の第５表参照）；サイトケラチ
ン１８に特異的な抗体であるＫｓ１８−９８１　（第６
表に示ずようにＥＣＡＣＣに寄託されている）およびビ
メンチン特異的抗体ＶＩＭ　　３Ｂ４（ＥＣＡＣＣに寄
託番号第８７１１０６０２号として寄託されている：以
下の第７表参照）がある。

とくに、４８ｉのそれ自体公知の試験方法、イムノブロ
ツ１〜（ウエスタンブロツ１〜）、ドツトプロット、Ｅ
ＬＩＳＡおよび蛍光抗体顕微鏡法を組み合わ−ｌて用い
ることにより、適当な抗体が選択される。

これらの方法は好ましくは以下のように実施される。

（１）　　イムノプロット（Ｔｏｗｂｉｎら：　Ｐｒｏ
ｃ、ＮａｔＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７６：４３５
．１９７９ににるウエスタンブロツ１〜） α−へリツクス中間部分であるＩＦタンパク質標準は、
ポリアクリルアミドゲル（１５ｍｍＮａｔｕｒｅ、　２
２７　：　６８、１９７０ににる５ＤＳＰＡＧＥ）上電
気泳動で分離すると、Ｍｒ約３８゜０００・〜４．３．
ＯＯＯを示す１．１Ｆタンパク質の完全なモノマーのば
かその断ハとも、ブ［１ツ１〜で陽性反応を示す抗体の
みを選ぶ。サイ１〜ケラチン８、１８および１９につい
てのイムツブ［１ット反応は、Ｆｒａｎｋｅら（Ｅｘｐ
、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、、　１７３　：　１７−３７．１
９８７）およびＨａｔｚ４ｅｌｄら（Ｊ、Ｈｏ１Ｂｉｏ
１．．１９７：２３７・〜２５５，１９８７）により詳
細に記載されている。

（ＩＩ）　　　Ｆｒａｎｋｅら　（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　
　Ｒｅｓ、　　１７３　：　１７３７．１９８７）によ
るドツトプロットテトラマーおよびプロフィラメントの
形式に適当な緩衝条件下（４Ｍの尿素を添加）、精製し
たＩＦタンパク質および公知方法で製造したα−ヘリッ
クス中間部分を、上澄分画と比較しながら二］〜ロセル
ロース上に載せ、抗体の免疫反応を調べた。上澄分画は
、組織標本をホモジプイズし、このホモシネ−１〜をブ
［１テアーゼ（たとえばキモトリプシン）とインキュベ
ーションし、一定のインキュベーション時間後に酵素活
性を停止させるかまたは酵素を除去し、ホモジネートを
遠心分離することにより得られる。上澄には、タンパク
分解によって切断されて溶解した上述のＩＦタンパク質
のα−へリツクス中間部分が認められる。イムノプロッ
ト法（ウェスタンプロット）と異なり、ドツトプロット
におけるこのフラグメント−タンパク質は、免疫反応前
に変性することがなく、各抗体と天然の状態に相当する
配置のポリペプチド鎖ので反応する。

（１）　　ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノツルベン１〜検
定）この公知方法は、生理的条４！］下に可溶性のＩＦタン
パク質についてのみ使用される。この場合、標準として
調製したα−ヘリックス中間部分を、緩笥液または対照
血清および伯の天然体液ならびに組織のホモシネ−ジョ
ンおよび消化後の上澄に溶解する。この試験では、ＩＦ
−フィラメントタンパク質は変性されず、各抗体と天然
の状態で反応する。

（ＩＶ　）　　蛍光抗体顕微鏡法組織から凍結切片を調製し、この場合、細胞を破壊して
、中間径細糸の網状構造に抗体が近づ【プるようにする
。この場合の免疫反応は、非変性条件下ではなく、無傷
の中間径細糸タンパク質である抗原の天然の位置で起こ
る。

とくに、上述の■〜ＩＶのすべての方法で明らかに陽性
と評価される抗体のみが、本発明での結合に使用される
。

試験される抗体の判定に有用４１、再現性があり比較可
能な条件を設定するため、標準に対する試験が行われる
。

相当する組織から抽出および精製によって単一・のＩＦ
タンパク質を得ることにより標準を調製することが好ま
しい。

サイトケラチン中間部分を調製する場合には、塩基性サ
イケラヂンと同じ組織型に属する酸性り〜イトケラチン
の等モル量を尿素に溶解し、尿素を透析すると、とくに
ア１へラマーが形成される。

勺イ１−ケラチンに由来しないＩＦ中間部分を形成する
場合には、同じ型の精製タンパク質から直接、１０トフ
イラメン１〜およびフィラメントの前駆体として、再構
築によりテ１−ラマーを形成さぜる。

いずれの場合も、次にプ［１テア−Ｕ好ましくはキモト
リプシンによる制御された消化を行い、テトラマーとし
てα−へリツクス中間部分を遊離させ、ついで単１ＩＩ
Ｎ製を行えば、標準として使用することができる。

本発明の応用に際し標準として使用されるαヘリックス
中間部分は、ＩＦタンパク質を産生ずる任意の細胞系ま
たは組織からの単離により得ることができる。

精製された単一　ＩＦタンパク質の再構築はたとえば、
特異的に精製された非ケラチン性ＩＦタンパク質の添加
または酸性および塩基性型のサイトケラヂンの等モル量
の配合によって行われ、ついで但澹度塩緩衝液に対して
テトラマーを透析する３゜プロ１〜フイラメントおよび
ＩＦの形成は電子顕微鏡を用い、Ｈａｔｚｆｅｌｄ　Ｈ
ら（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　　１０１　：１８２
６−１８４１．１９８５＞の陰性染色検査によって制御
できる。

再構築されたＩＦタンパク質はついで、好ましくはトリ
プシン、キモトリプシンまたはトロンビンを添加して限
定タンパク分解に付す１．タンパク分解の程度は、ゲル
電気泳動により、Ｍｒ３８゜０００〜４０，０００の成
分が最大になるように制御される。ついでα−へリツク
ス中間部分を、好ましくはゲルクロマトグラフィーまた
は逆相ＨＰＬＣによって単離する。

同定すべきＩＦタンパク質または再構築タンパク質の可
溶化の際には、まずタンパク分解にＪ：つてα−ヘリッ
クス中間部分に付着している頭部および尾部部分が切断
される。さらにタンパク分解が進むとα−ヘリックス中
間部分のほぼ中央で単回分裂が起こり、この時点で短い
断片が認められるようになって、α−ヘリックス構造は
破壊される。この方法で単回分裂によってそれぞれの中
間部分から２個の中間部分フラグメントが生じ、その中
の少なくとも一方が上述の抗体と反応するエピトープを
右する。

本発明による同定方法およびその標準化は、この方法で
α−へリツクス中間部分の一部またはずべてが単回分裂
を受りれば、不都合ではなく精度も得られる１、抗体が
自由に到達できるエビ１〜−プの総数は影響されず、試
験の定量的結果も変動しない。

この方法では可溶化に際して一定の許容誤差を生じる。

すべての中間部分を甲＃［され’ｎｆ溶化される場合の
許容公差をどこに置くか、また中間部分の一部もしくは
すべての中純分裂の公差をどこまで認めるかによって生
じるものである。

したがって、単回分裂によって影響を受けず、それぞれ
これらの中間部分フラグメン１〜のひとつに存在する１
ピト−ブに対する抗体を使用することが好ましい。同定
の定量化には、分裂された中間部分をエピトープを右す
る中間部分フラグメントによって測定すればよい。

抗体としては、少なくともサイトケラチンＮｏ、　８のモノマーに由来
するα−ヘリックス中間部分の同定にＫｓ８１７、２少なくともサイトケラチンＮｏ、　１８のモノマーに由
来するα−ヘリックス中間部分の同定にＫ　　１８−２
７ＩＶおよび／もしくはＫｓ１８−９少なくともサイ１
〜ケラチンＮｏ、　１９の七ツマ−に由来するα−へリ
ツクス中間部分の同定にＫｓ１９．２少なくどもサイ］−ケラチンＮｏ、　１〜８の１秤また
は２種以上のモノマー１秤まは２種以上に由来するα−
へリツクス中間部分の同定にＫ　ｓ　ｐａ　ｎ　１８、
ならびに／またはビメンチンのα−ヘリックス中間部分の同定にＶＩＭ　
　３Ｂ４を使用することが好ましい。

これらの抗体は以下に実施例を用いてざらに詳細に説明
するように一義的に同定できることが証明されている。

上述の抗体については以下の表に詳述する。

第２表塩基性サイトケラチン用１群（Ｎ（１１〜８）のサイ１
〜ケラチンに対するモノクローナル抗体抗体：　　　　
　抗体Ｋｓｐａｎ１−８はハイブリドーマ細胞系Ｋｓρ
ａｎ１−８によって産生される。

このハイブリドーマ細胞系は１９８８年１月１９日、ＥＣＡＣＣ８８０１１９０１号として寄託されている。

種類：　　　　　マウスＢＡＬＢ／Ｃ株と融合パードナ
ー：骨髄肺細胞系Ｘ６３−Ａｏ８、６５３からのモノクローナル抗体免疫グロブリン　Ｉｃ＋Ｇ２ａクラス：抗原：　　　　　培養ヒトＭＣＦ−７細胞から反応性ポ
リペプチド：反応種：既知の構造。

抗原９組織腸性反応を示す培養細胞系：既知ヒト腫瘍：の細胞骨格タンパク質各種塩基性力イトケラヂン（ＩＩ型）亜群（ＧＫ１〜８〉に共通の１ピトープヒト、ウシたとえば、表皮、歯肉、舌。

食道、肝細胞および胆管、小腸２．結腸腟および子宮頚部皮膚、胸腺上皮および心筋上皮。

胸腺の網状組織上皮１毛髪形皮細胞および毛髪を含む全土皮細胞ＭＣＦ−７，ＲＴ−１１２゜Ｄｅｔｒｏｉｔ　５６２．　ＲＰＭ　Ｉ　２６５０、Ｈ
Ｔ−２９，５ＣＣ −１２くすべてヒト）；ＢＭＧＥ、ＭＤＢＫ　（すべてウシ）基底細胞腫２表皮の輔細胞癌。

舌２食道、肺および頚部の扁応用：平上皮細胞局、肺、結腸および頚部の腺癌、腎細胞癌、乳癌、ＩＦｌｌＩｌ胞癌病理（とくに腫瘍、および各種層様病変間の鑑別診断第３表サイトケラチン１９に対するモノクローナル抗体抗体：
　　　　　抗体Ｋｓ１９．２はハイブリドーマ細胞系Ｋ
ｓ１９．２によって産生される。このハイブリドーマ細胞系は１９８７年１１月１３日、ＥＣＡＣＣ８７１１１３０２号として寄託されている。

種類：　　　　　マウスＢ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　Ｃ株と
融合パードナー：骨髄肺細胞系ＮＳＯからのモノクローナル抗体免疫グロブリンクラス：Ｉ　　Ｑ　Ｇ　２　ｂ抗原：反応性ポリペプチド：反応種：既知の構造。

抗原９組織：培養ヒ１〜Ｍ　ＣＦ−７細胞からの細胞骨格サイトケラチン１９（Ｍｒ＝約４．３，０００）のみヒト、ウシ特定の上皮細胞とのみ反応。

陽性の上皮細胞は、賜粘膜。

胆管、膵臓、胃粘膜、腎の集台管、尿管、膀胱、Ｎ嚢、前立線、中皮、卵管、子宮内膜上皮、頚部内膜、気管支上皮。

胸腺（ｌ管、細葉）、胸腺の網状１１１１上皮、咽頭おにび喉頭上皮、皮膚の腸上皮、Φ層上皮系の基底細胞層（たとえば肛門上皮、膣、外頚部、尿道２食道、舌および口腔粘膜。

歯肉。陰性の上皮は、たとえば、大部分の体幹領域の上皮、各種多重１−皮の大部分の段階の上基底層（たとえば外頚部。

膣、舌１食道）、肝細胞、膵臓の腺勇細胞、近位尿細管。

章丸、すべての間菓組織、大部の筋肉様組織、神経組織。

レンズ組織、内皮細胞およびその他の血管要素陽性反応を示す　ＭＣＦ−１，Ｉ」“ｒ　−２９。

ヒト培養細胞系：ｌ−１ｅｔ−ａ、　ＲＴ−１１２゜Ｄ
ｅｔｒｏｉｔ　５６２　、　ＲＰＭ　Ｉ　２６５０．５
ＳＣ−１２結腸、胃、膵臓、胆嚢、子宮内膜、頚部の腺癌、肝臓の胆管癌、腎細胞癌、膀胱の転移細胞癌、卵巣癌、頚部の扁平上皮癌、中皮層、気管皮および肺の扁平上皮癌、肺の人絹胞癌、肺の小細胞癌（中間既知ヒｌ−腫瘍：型）、気管支のカルチノイド腫瘍、乳癌応用：第２表に同じ参考文献：１）　　Ｆｒａｎｋｅ、Ｗ、Ｗ、ら：　Ｃｅ１ｌ　Ｔｙ
ｐｉｎｇ　ｏｆＥｐｉｔｈｅｒｉａ　ａｎｄ　Ｃａｒｃ
ｉｎｏｍａｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＦｅｍａｌｅＧｅｎｉｔ
ａｌ　Ｔｒａｃｔ　Ｕｓｉｎｇ　Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔ
ａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｓＨａｒｋｅｒｓ、Ｂａｎ
ｂｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ２１　：　Ｖｉｒａｌ　Ｅｔｉ
ｏｌｏｇｙｏｆ　Ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ；ｐｐ　１２１　（１９８６）２）　　Ｈｏ１ｌ
、Ｒ，ら：Ｃｅ１ｌ、　３１　：１１−２４　（１第４
表サイトケラチン８に対するモノクローナル抗体抗体：　
　　　　抗体Ｋｓ８−１７．２はハイブリドーマ細胞系
Ｋｓ８１７．２によって産生される。

このハイブリドーマ細胞系は種類：１９８７年１１月６Ｈ１ＥＣＡＣＣ８７１１０６０１号として寄託されている。

マウス　Ｂ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　ｃ株および融合パー１
〜す一二骨髄腫細胞系Ｘ６３−Ａｇ３．６５３からのモノク［１−ナル抗体クラス：抗原：　　　　　　ＭＣＦ−７培養細胞（ヒト細胞系）
からの細胞骨格反応性ポリペブ　サイ１〜ケラヂン８（Ｍｒ−約ヂド：
　　　　　　　５２，５００）のみ反応種　　　　　ヒ
１〜．ウシ既知の構造、　　陽性の上皮には、肝臓（肝細抗原、組
織：　　胞、胆管）、賜、舌の腺−し皮およびすべての
単純上皮が含まれる陽性反応を丞す　Ｍ　ＣＦ−７、ｌ−１ｅ　ｌ−ａ　。

ヒト培養細胞系：Ａ−４３１既知ヒト腫瘍：　陽性な癌には肝細胞癌、結腸。

肺、乳房の腺癌が含まれる応用：　　　　　第２表に同じ第５表サイ１〜ケラチン１８に対するモノクローナル抗体抗体
：　　　　　　抗体Ｋｓ１８−２７ｒＶはハイブリドー
マ細胞系Ｋｓ１８２７ｒＶから産生される。ハイブリドーマ細胞系Ｋｓ１８２７ＩＶ　Ｇ、１１９８７年１１月１３日にＥＣＡＣＣ８７１１１３０１号として寄託されている。

マウスＢ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　０株と融合パー１〜すｍ
：骨髄腫細胞系５Ｐ２１０Ａｏ１４からのモノクローナル抗体種類：免疫グロブリンクラス：ａＧ１抗原　　　　　　　Ｍ　ＣＦ　−７培養細胞からの細胞
骨格反応ポリペブブド：＋ｊイトケラヂン１８（Ｍｒ＝約４
５．０００）のみ反応種：　　　　　ヒト、ウシ既知＃１３造、　　　　陽性の上皮には、単層上皮お抗
原９組織：　　　よび腺、たとえば肝Ｒ（肝細胞、胆管
）、腸、膀胱（尿道）のりイトケラヂンフイラメントが包含される。多層上皮（たとえば膣、舌）では基底層の特定の細胞のみ既知ヒ１−師瘍：　　結腸癌、乳癌、各種臓器の腺癌陽性反応を示す　　ＭＣＦ−１，１−１ｅｌ−ａ、Ａ−
ヒト培養細胞系　　４３１．　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５６２
゜Ｔ−１１２応用：　　　　　　第２表のとおり第６表サイトケラチン１８に対するモノクローナル抗体抗体：
　　　　　抗体Ｋｓ１８−９８１はハイブリドーマ細胞
系Ｋｓ１８９Ｂ１により産生される。このハイブリドーマ細胞系Ｋｓ１８−９８１は１９８９年１月５日、ＥＣＡＣＣ８９０１０５０５号として寄託されている。

マウスＢ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　ｃ株および融合パードナ
ー：骨髄肺細胞系Ｘ　６３−　Ａ　Ｑ　８　、６５３　カらのモノクロ
ーナル抗体種類：免疫グロブリンクラス：１（７Ｇ１抗原：既知の構造。

抗原２組織：再構築サイトケラチン８：１８（ウシ肝臓から）単ａ−Ｆ皮および腺、たとえば肝臓（肝細胞、胆管）、腸７Ｉ既知ヒト腫瘍：ヒ１〜培養細胞との陽性反応：応用：（−ト皮）、膀胱のサイトノイクメン１〜．＠層上皮（たとえば膣、舌）では基底細胞層の特定の細胞のみ結腸癌、乳癌およびそのリンパ節転移癌、各種臓器の腺癌ＭＣＦ−７，ＨｅＬＡ。

Ａ−４，３１，Ｄｅｔｒｏｉｔ　５６２゜Ｒ’ｒ−１１
２第２表に同じ第７表ビメンチンに対する［ツクロープル抗体抗体：　　　　
　抗体ＶＩＭ３Ｂ４はハイブリドーマ細胞系ＶＩＭ３Ｂ
４によって産生きれる。このハイブリトーン細胞系ＶＩＭ３Ｂ４は１９８７年１１月６日。

［ＣΔＣＣ８７１１０６０２号として寄託されている。

種類：免疫グロブリンクラス：マウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／　ｃ株と融合パードナー：骨髄腫細胞系× ６３−ＡＱ８，６５３からのモノクローナル抗体ＩｇＧ　　２ａ抗原：反応ボリペプブー　ド　：既知種（現在までに試験されたもの）組織特異性：ウシ水晶体から精製されたビメンチンごメンチン（ＳＤＳＰＡＧＥによるＭｒ−約５７゜０００）に特箕的ヒト、ウシ、げつ歯頚（ラット、マウス、ハムスター）。

９８９９両生類（アフリカッメガエル）ビメンチンに対する抗血清に陽性を示した全細胞が抗体ども陽性反応を示した。間質起源の細胞、および内皮細胞と特定の血管平滑筋細胞、線維芽細胞、結合繊、全種類の血株細胞、単層胸腺細胞９章丸の間質およびセルトリ細胞。

卵巣の濾胞細胞。他の中間径フイラメン１〜とビメンチンの共発用が知られている。

陽性反応を示す　　ＲＤ細胞、神経膠腫細胞、線既試験
培養細胞系：維芽細胞（ＳＶ−８０，３Ｔ３）、ＢＨＫ既知ヒト肺癌：　　ビメンチン実験腫瘍のすべて、たと
えば肉肺（単層筋肉腫）。

リンパ腫、黒色腫等応用：　　　　　　第２表に同じ神経細糸タンパク質およびダリア細糸タンパク質の同定
には、神経細糸タンパク質に対する抗血清（Ｎ　Ｆ　−
８：　Ｐｒｏｇｅｎ、ｔｌｅｉｄｃｌｂａｒｇ、ＢＲＤ
から入手できる）ならびにクリア細糸タンパク質に対す
る抗体くモルモツ１−−抗血清ＧＦ−１００，ハイブリ
ドーマ細胞系ＧＦ　１２．２４．、　Ｐｒｏｇｅｎから
入手できる）が使用できる。神経細糸タンパク質に対す
る他の抗体は、Ｂｏｅｎｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｃｉ
ｎ（ＢＲＤ）から入手できる。

好ましい方法は、体液中たとえば面清中のαヘリックス
中間部分をＥＬＩＳＡ試験を用いて免疫学的に同定する
ことを特徴とするものである。

すなわち、タイタープレートに固定する捕捉抗体として
は特許請求の範囲第１項に記載の免疫学的に多義的に反
応する抗体を用い、検出抗体としては特許請求の範囲第
１項に記載の免疫学的に一義的に反応する抗体を用い、
試験すべき溶液について得られた力価の測定結果を、試
験すべき溶液に相当する組織型から得られた特許請求の
範囲第２項または第３項による標準の検定溶液について
４ｑられた力価の測定結果と比較する。

多義性の捕捉抗体を使用することにより、ついで−機付
の検出抗体を用いて一義的な同定を行えば、１個の同一
のタイタープレート上で様々なＩＦタンパク質の同定が
可能である。

この意味において、サイトケラチンに対し捕捉抗体とし
てＫｓｐａｎｌ−８がＸｔめられる。これは各サイＩ〜
ケラヂンノイラメンＩ〜に含まれるサイ１〜クラヂン１
から８までの塩Ｍｔ、モノマーの少なくとも１種ど反応
するので、例外なくづ−べてのサイ１〜クラヂンが捕捉
され、したがってそれと対をな酸性モノマー９から１９
までに基づき、特異的な検出抗体による同定が可能にな
る。すなわち、サイ１〜クラヂン１から１９までの１種
に対する検出抗体としてたとえば第３表力日ら第６表に
示したサイ１〜クラヂン８，１８および１９に対する抗
体が使用される。

検出抗体は、放射能、醇素または蛍光発光物質で標識さ
れていてｂ　Ｊ：い。

標本中のＩＦタンパク買に対する抗体の同定は固定相試
験によって実施することもできる。この場合、相当する
ＩＦタンパク質である抗原を固定化し、標本とインキコ
ベーシ」ンし、洗浄し、標本からの結合抗体をたとえば
第二の標識抗体によって同定する。

存在するＩＦタンパク質のその中間部分による同定は、
実際上、多かれ少なかれ、組織標本と試験の前処置およ
び操作方法次第である。したがって、外来の、試験すべ
き組織に本来属さない中間部分について測定された絶対
値は、決定的な証明とはならない場合がある。これに対
し、測定された外来ＩＦタンパク質と存在する関係組織
に典型的なＩＦタンパク質との比を求めれば、より好ま
しい結果を期待することができる。すなわち、組織の部
分に存在する中間径細糸タンパク質のその起源組織を決
定し、定量するにあたり、試験した組織部分と起源的に
無関係な中間径細糸タンパク質の測定値と試験した組織
部分に起源的に属する中間径細糸タンパク質についての
測定値との比を求め、この比を病的でない標準での比を
尺度として評価することが好ましい。

病巣が一定の細胞を分泌し、これがとくに近くのリンパ
節に集まることがある（いわゆるリンパ節転移）。本発
明はさらにこの状態に対して応用される。すなわち、癌
の原発臓器を検出するためにリンパ節を試験し、ビメン
チンの測定値と他の組織型に属する中間径細糸タンパク
質それぞれの測定値の比を求めることかできる。

以下の実施例は上述の本発明の方法をざらに例示するが
、これは本発明を限定するものではない。

多くの条件およびパラメーターに対しざらに任意の修飾
および調節が、本発明の精神および範囲から逸脱するこ
となく可能なことは本技術分野の熟練者に自明のとおり
である。

例１サイ１〜クラヂンを例に応用した方法を記述するが、処
理方法はすべてのＩＦタンパク質に適用されるものであ
る。

１．１．完全なポリペプチドの精製ヒ１−サイトケラヂン（たとえば８、１８および１９）
をほぼＡｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ’、　Ｔ、ら（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、１３４　：３５５〜３７１．
１９８６＞の記載に従い、ヒ１〜培養細胞系Ｍ　ＣＦ−
７から得た。

ウシサイトケラブン８、１８および１９（命名法はＢａ
ｄｅｒ、　Ｂ、　Ｌ、ら：ＥＨＢＯＪ、５：　１８６５
〜１８７５．１９８６参照）は、ウシ膀胱の内表面を剥
離し、膀胱の尿道細胞から得た。剥離した細胞層をホモ
ジナイズする（　Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒら：前出の
記載に番よぼ従う）。単一のサイトケラヂンーボリペブ
チドは、１ｌａｔｚｆｅｌｄ　＆　Ｆｒａｎｋｅ　１９
８５　；Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒら、１９８６　；　
Ｂａｄｅｒ　　ら、１９８６およびＱｕｉｎｌａｎら、
１９８６の記載にほぼ従って、ＤＥＡＥ−セルロース（
Ｄ　Ｅ　５２　；　ＷｈａｔｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ　
５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ、、Ｃｌ１ｆｔｏｎ、Ｎ
Ｊ、ＵＳＡ　）上陸イオン交換クロマトグラフィーによ
り、８Ｍ尿素緩衝液（８Ｍ尿素、２，５１１１８ジチオ
エリスリー１・−ル、　３０ｍＨＴｒ　ｉ　ｊ！−１−
１ｃｊ！、ｐＨ８，０）を用いて精製した。簡単に説明
すると、細胞骨格物質を９．５Ｍ尿素（５ｍＮジヂオエ
リスリトール、１０ｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ、Ｉ）ｔ
１８、　Ｏ）で２時間抽出し、１００．０ＯＯＸＱ　（
Ｏは重力定数）で遠心分離して得られた上澄抽出液を８
Ｍ尿素緩衝液に対して透析し、ついでこの緩衝液で平衡
化しＩＣＤ　Ｅ　Ａ　Ｅセルロースカラムに載せた。結
合したタンパク質をＯ〜１１００１ＩＩグアニジン［９
塩勾配で溶出した。ポリペプチド分画はＳＤＳ／ボリア
クリルアミドグル電気泳動（ＰＡＧＦ）によって検出し
た。精製された分画をざらに逆相高圧液体クロマトグラ
ノィーに付した精製した。この場合、０．０１％（ｖ／
ｖ）　ｌ−リノルオロ酢＃（ＴＦＡ）（Ｆｌｕｋａ、Ｂ
ｕｃｌｌｓ　、スイス）を水ｔ！ｉ溶媒Ａとして、アセ
トニトリル（クロマ１〜グラフィー用、　ＨｅｒＣｋＤ
ａｒｍｓｔａｄｔ　Ｂｌ？Ｄ　）を有機相（溶媒Ｂ）と
して、またＢ＋ｏＲａｄ−ＲＰ−３０４−カラム（Ｂｉ
ｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、Ｃ＾、ｌｌ５Ａ）を逆相で使用した。ピークの分画
を集め、アｆ＝　＋−ニトリルを真空下に蒸発さゼて除
き、凍結乾燥した。

精製サイ］へクラチンを９．５Ｍの尿素を含む緩衝液に
溶解した。■型および■型すイトケラヂンの哲モル吊の
＃８８！度が約０．５ｍ３／厩になるように混合すると
、プロトフィラメントおよびＩＦタンパク質が得られ、
ポリペプチド溶液を低イオン強度の緩衝液に対して透析
したく緩衝液としてはＨａｔ、Ｊｅｌｄ、Ｈ，＆　Ｆｒ
ａｎｋｅ、Ｗ、Ｗ、：Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　１
０１　：１８２６〜１８４１．１９８５に記載されたし
のを使用した）。プロトフィラメントおよびＩＦタンパ
ク質の形成は、陰性対照シン１ルを用い、電子顕微鏡に
検出した（Ｈａｔｚｆｅｄ、Ｈ，＆　ＦｒａｎｋＪ、Ｗ
、　：前出参照）。

タンパク分解は様々のプロ１アーゼを用いて実施した。

代表的な製造例では、キモトリプシン（ＥＣ３，４，２
１，１，ウシ膵臓由来、たとえばＦａ、Ｓｉｇｍａ、Ｈ
ｕｎｃｈｅｎより入手）を、酵素対基質比（重量／重量
）が、サイトケラチン８：１８対で６．６　：　１００
０．サイトケラチン８：１９対で９　：　１０００にな
るように使用した。いずれのキモｊ・リブシン負荷でも
分解時間の至適化が必要である。タンパク分解は、分解
住成物のゲル電気泳動分析によって制御し、線状の中間
部分（Ｍｒ＝３８、０００〜４０，０００）ｌ／）成分
が最大になるように至適化した。最適条件は３０℃で約
２０分であった。相当する分解時間が経過したのち、５
ｍＨのフェニルメチルスル小ニルフルＡリドを添加して
、酵素活性を停止させた。

１．４．α−ヘリツクス中間部分の精製タンパク分解さ
れた中間部分およびその単純フラグメントを５ｅｐＨａ
ｒｏｓｅ　Ｃ１，６Ｂカラム士クロマトグラフィーまた
は直接、逆相高速液体クロマ１〜グラフイーに付した。

ずなわら、ＢｉｏＲａｄＲＰ　３０４−カラムを逆相で
用い、上記１．に述べた溶媒系を使用した。ざらに精製
するには、主分画を溶媒Ａでアセトニトリル濃度が約２
０％（Ｖ／Ｖ）に低下スルマチ希釈し、直接、Ｍｙ−Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８−カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ
５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｈｉｌｆｏｒｄ、ＨＡ）に逆相で適
用した。主分画を凍結乾燥し、サンプルを１次元および
２次元ゲル電気泳動に付して、α−ヘリツクス中間部分
の存在を調べた。精製されたαへソックス部分は、一部
、ヘリックス構造が破壊される切断点で短い平均の断ハ
である各２個の中間部分フラグメン１〜に単回切断され
て存在し、対照物質あるいは検出系の検品および免疫感
作に際しての標準物質として使用された。

性２適当な抗体の選択および製造中間径細糸タンパク質に対する特異的抗体は、特別に生
成させたものおよび市販品を入手できるものを含めて、
例１で得られた標準物質のようなα−ヘリックス中間部
分フラグメントとの免疫反応性について、以下の方法で
試験した。

２．１．イムノプロット（ウェスタンプロット；変性抗
原との反応）精製したタンパク質フラグメント（たとえば１）−イト
ケラチン８：１８−、サイトケラチン８：１９−または
ビメンチンーフラグメント）および組織部分くたとえば
リンパ節または肝臓〉からの細胞骨格プレバレージョン
を、キモトリプシンにＪ：るタンパク分解反応（例３参
照）に何す前および後に、電気泳動（ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気電動）に付し、
タンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移し、問
題の特異的抗体とインキュベーションした。免疫反応は
、標識プロティンＡまたは標識抗−マウス抗体を用いて
検出した。α−へリツクス中間部分（Ｍｒ＝３８，００
０〜４０，０００　＋塩早性ケラチンの場合にはＭｒ＝
２０．０００−２２゜０００）と免疫反応を示した抗体
を選択した。

２．２．ドツトプロット（天然または再生抗原との反応
）約２×１０６ｇのＭ製ＩＦタンパク質（５０×ｉｏ　　
ｉの５０　ｍＨＮ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４緩衝液、　ｐＨ
７，４に溶解）またはキモトリプシン分解後の組織標本
ホモジネートの上澄分画を、直接ニトロセルロースに結
合さｆ（たとえば、５ｃｈｌｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅ
１１．Ｄａｓｓｅｌ（ＢｌｉＤ）の５ＲＣ９６旧ｎＨｏ
１ｄ　Ｉドツドブロワ１〜装砺で）、問題の特異的抗体
とインキュベーションした。以下の操作は１．に述べた
とおりである、。

２．３．ＥＩＩＳΔ（天然または再生抗原との反応）約５０ｘ１０’ｙの精製タンパク質フラグメン＝６１−（１００ＸＩＯ１の５０　ｍＨＮ　ａ　Ｈ’ＣＯｓ
、ｒｌＮ９．６に溶解）または４モトプシン分解後の組
織標本ホモジネートの上澄分画のタンパク質２×１０　
　ｙ（１００ｘｌＯ−６ｊ！中）を、９６穴ミクロタイ
タープレートの各つ■ルでインキュベーションし、結合
したタンパク質を問題の特異的抗体どインキュベーショ
ンした。以下の操作は１．に述べたとおりである。

２．４．蛍光抗体顕微鏡法標準方法は、たとえばＣ１ｏｃｃａ、Ｄ、Ｒ，＆　Ｂｊ
ｅｒｃｋｅＲ，Ｊ、によりＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、　１２１　：　５６２　ヘ５７９に詳細に記載さ
れている。

上述の方法で陽性を示した抗体はＫｓ１９．２：Ｋｓ１
８−９Ｂ１　；のＫｓ１８−２７ｒＶ：Ｋｓ８１７．２
：Ｋｓｐａｎｌ−８：ＶｒＭ３Ｂ４である。

２．５．α−ヘリックス中間部分に対するモノクロ−プ
ル抗体の製造特異的抗体の製造には、各精製ポリペプチドから形成さ
れたｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構築フィラメントのみを注射し
て、免疫感作を行った。１雌性６〜８週齢のＢＡＬＢ／
ｃマウスを、その細胞骨格ブレバレージョンまたは再構
築フィラメントの１回あたり３０〜３００Ｘ１０６！？
タンパク質の注射によって免疫感作した。抗原はリン酸
塩緩衝食塩溶液に懸濁し、第１回目の注射に際してはフ
１］インドのアジュバン１〜（完全）で乳化した。以後
の注射では、すべて７０インドのアジュバント（不完全
）を使用した。動物に約３週間隔で３回皮下注射を行い
、細胞融合前３日間は３０〜８０ｘ１０’ｇの抗原を腹
腔に反復注射した。免疫感作マウスの稗臓細飽を、マウ
ス骨髄腫細胞系５ｐ２１０Ａｃｎ４゜Ｘ６３−ＡＯ８，
６５３およびＮＳＯ／Ｕ（Ｓｈｕｌｍａｎｎ　Ｈ，ら：
Ｎａｔｕｒｅ　　２７６：２６９−２７０　、１９７８
　：　Ｋｅａｒｎｅｙ、１．Ｆら；　Ｊ、　ｌｍｌｌ１
ｕｎｏ１．１２３　　：　　１　５４８〜１５５０．　
１９７９　　；Ｃ１ａｒｋ　　＆Ｈ＋１ｓｔｅｉｎ：Ｓ
ｏｍａｔｉｃ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　　
７　　：　　６５７〜６６６．１９８１によって記載さ
れている）と、はぼにｏｅｈｌｅｒ　Ｇ、＆　Ｈｉｌｓ
ｔｅｉｎ　Ｃ，：Ｎａｔｕｒｅ　　２５６　：４９５〜
４９７．１９７５の記載に従って１０＝１の割合で融合
した。ハイブリドーマの上澄を、ヒトまたはウシ組織の
凍結切ハ上（Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ、　Ｔ、ら：旧Ｈｅｒｅｎ
ｔｉａｔｉｏｎ、３　ｉ　：２０６〜２２７．１９８６
の記載にほぼ従って）または特別に被覆加工したスライ
ドまたはデツキガラス上で培養した培養細胞上で、蛍光
抗体顕微鏡法によって試験するが、または酵素連結イム
ノアトソープション法（ＥＬＩＳＡ）によりたとえばミ
クロタイタープレートで精製抗原を用いて試験した。陽
性のクローンは制御された希釈によって２回ザブクロー
ニングを行った。ＩＱ”ｊブクラスは０ｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ、０．＆　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｌ、八（Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　ｏｆＥＸｐ（３ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｗｅｉｒ、Ｄ、Ｈ，編、第１巻、第１９章
、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓＯｘｆｏｒｄ、　　１９．７８　、
１〜１９頁）に従って決定された。

２．６．ベルオキダーＵへの検出抗体のカップリング検出抗体として標識したモノクローナル抗体は、Ｂ、■
＋ｊｓｓｅｎ（ＬａｂＯｒａｔＯｒＶ　　ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　　ｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　　１
５　：Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ
　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ。

Ｒ，１１，Ｂｕｒｄｏｎ　　＆　　Ｐ、１１．ｖａｎ　
　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｑ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、八ｍ
ｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、０ｘｆｏｒｄ　
；　　２　３　８　頁）によ゛つて記載された方法に従
い、ベルオキシダゼにカップリングさせた。

ペルオキシダーゼ　５　ｍｇを炭酸すｌ・リウム緩衝液
（１００ｍＨ，ｐＨ９，２）０．５ｄに溶解し、室温、
遮光下に、１０ｍＨＮａＩＯ４溶液０．！Ｍで酵素を酸
化して、カップリングの準備をする。

ついで所望の抗体＜１００ｍＭ炭酸すＩ〜リウム緩衝液
１）Ｈ９，２，２ｍに１０ｍｇを溶解）を加え、０．５
ｙの乾燥５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　２５（Ｆａ、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を添加してさらＫｓ
時間遮光下にインキュベーションした。得られた抱合体
を５ｅｐｈａｄｅｘ物質から炭酸ナトリウム緩衝液で溶
出し、０．１ｍＨＮａＯＨ中０．５％ＮａＢＨ４溶液１
／２０容と混合した。３０分後に同じ溶液１／１０容を
加え、４℃で１時間インキュベーションした。抱合体を
ＰＢＳに対して真空透析して約０．５威に濃縮し、つい
で５ｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ−２００（Ｆａ、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）カラム（１，ＯＸ５０ｃｍ＞十で分画した。各分
画について酵素活性と抗体の含量を調べ、高いＩｇ濃度
と高い酵素活性を同時に示す分画を集めた。

放ユリンパ組織における転移の検出ど定量まず、リンパ節組織の湿重量を測定する。組織を３倍容
量（湿重量に基づいて計算）のリン酸塩緩衝食塩溶液（
ＰＢＳ）（１０ｍＨリン酸ナトリＣクムＦｌｌ１７．４
．　１５０ｆＩＩＨＮａＣｊり中、ナイフ付ホ王ジナイ
ザーに、より、かゆ状の粘度にＭｇｈ化した（　Ｆｉｒ
ｍａ　Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、　Ｌｕｚｅｒｎ、スイス
のポリトロン−ホモジナイザーの使用が推賞される）。

このホモジネートをキモ１〜リプシンとインキュベーシ
ョンする。

この目的には、予めマトリックス（ＣＮＢｒ−活性化５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　、　Ｆａ、Ｆａｒｍａｃｉ
ａ、Ｆｒｃｉｂｕｒｇ）に結合したキモトリプシンを使
用する。ずなわち、ＣＮＢｒ−活性化５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　ｉ４．　Ｂ　、　１．９を１ｍＨＨＣｌ中で１５分
間膨利きせ（グル容研約３．５ｄ／ｇ）、１ｍＨＨＣｊ
！計２００　ｍ（ｌで洗浄する。

塩酸溶液を吸引濾過し、７１〜リツク物質をカップリン
グ緩衝液（０，５Ｍ　　ＮａＣ１，０，１ＭＮａＨＣＯ
３，１）ｆ１８、Ｏ）で洗浄する。十［トリプシン１０
ｑをカップリング緩衝液５ＩＲ１に溶解し、カップリン
グ緩衝液中でマトリックス物質と室温で２時間、たえず
撹拌しながらインキュベーションザる。残った封鎖され
なかったカップリング部位は０．２Ｍグリシン溶液（ｐ
Ｈ８、’　Ｏ）　５ｄを添加して遮断する。ついでゲル
物質をカップリング緩衝液の過剰量（約５０威）および
酢酸塩緩衝液（０，５Ｍ　　Ｎａ（１，０，１ＭＭＭナ
トリウム、１）ｔ１４．０）　１０ｍで洗浄する。この
条件で、使用したキモ１〜リブシンの約６０％が結合し
、５ｅｐＨａｒｏｓｅ　４　Ｂ−グルはカップリングし
たキモトリプシン１．７＃１９／−を含有することにな
る。好ましい操作では、ゲルをＦ）　Ｂ　Ｓ中に２倍に
希釈する（キモ１〜リブシン濃度０．８５１１！？／ｄ
）。

かゆ状の組織にキモ１〜リブシン（ＥＣ３，４゜２１．
１：ウシ膵臓から：たとえばＦａ、Ｓｉｇｍａ＋１Ｊｎ
ｃｈｅｎから入手）を約１：１０００の割合で（組織の
湿重量に基づいて計算）加える。イン１コベーシヨン工
程は３０°で（好ましくは断熱下または水浴中で）行う
。ホモジネートを水中で５分間冷却して、３０分後に分
解反応を停Ｊ１させる。

ホモジネートを２×１０４ｇで３０分間遠心分離し、遠
心分離上澄を直ちに分離する。カップリングしたキモト
リプシンは沈殿中に認められる。

この条件で、α−ヘリツクス中間部分物質の８５〜９５
重量％が、なお同定可能な状態で、ＩＦタンパク質から
上澄分画中に遊離され、また名工の無傷なＩＦタンパク
質も溶解状態で認められる。

３．２．ビメンチン含量の定量遠心分離上澄中のビメンチンをサンドイッチＥＬＩＳＡ
によって免疫学的に定量する。この場合、α−ヘリツク
ス中間部分に対す第一の抗血清、ＧＰ−８を捕捉抗体と
して用い、第一の抗体のエピトープとは無関係の異なる
α−ヘリツクス中間部分の他の１ピトープに対する第二
のモノクロ−プル抗体、Ｖ　Ｉ　Ｍ　−３１３４を捕捉
抗体として使用する。捕捉抗体（ＧＰ−８＞は５ＱｍＨ
Ｎａｌ−ＩＣＯ３（ｐＨ９，６）中に１０Ｘ１０　９／
威の濃度に溶解し、ミクロタイタープレー１〜を被覆す
る（各ウェルあたり１５０ｘ１０６Ａ）。濃度１０　ｎ
ｇ／ｍｆ！　〜５．００　ｎｇ／ｍｌの粕製ビメンチン
フラグメンｈ　（１５０ｍＨＮａＣｊ！、１ＱｍＨＮａ
　　ＨＰＯ４ｐＨ７，４，０，０５％ｒｗｅｅｎ　２０
の緩衝液に溶解）を用いて標準曲線を作成する。

遠心分離上澄中のごメンチン濃度の測定には、これを最
後に挙げた緩衝液で１：１００〜１：５００に希釈する
。ペルオキシダーゼで標識した検出抗体、ＶＴ’Ｍ　　
３Ｂ４を緩？Ｉｆｉ液（１！５０ｍＭＮａ（１，１０ｍ
ＨＮａ　　ＨＰＯ４ｐＨ７，４，１％ウシ血ｍアルブミ
ン、０．０５％ｌ’ｗｅｅｎ　２０　）で０．５Ｘ１０
６ｇ／ｄの濃度に希釈し、各ウェルに１５０Ｘ１０−６
ｊ！を添加する。基質としては、Ｏ−フェニレンジアミ
ンまたはＡＢＴＳ　（２゜２′−アジノージ−（３−王
チルベンズチアゾリンスルホネート（６）））を用いる
。得られたビメンチン値は、他の測定結果の定量的評価
に際しての標準値として有用である。

遠心分離上澄中に存在するサイトケラチンをリンドイツ
デーＥｌ　ＩＳＡによって免疫学的に決定する。この場
合、第一のサイトケラチント−８に典型的な■ピトーブ
に対する第一のモノクローナル抗体、Ｋ８ｐａｎ１−８
を、いわゆる捕捉抗体として使用する。捕捉抗体、Ｋ８
ｐａｎ１−８を５０ｍＨＮａＨＣＯ３（ｐＨ９，６）に
２０×１０’ｇ／−濃度で溶解し、ミクロタイタープレ
ートを被覆する（各ウェルあたり１５０Ｘ１０’矛）。

標準曲線の作成には、たとえば、サイトケラチン８：１
８と８：１９を組み合わせた精製サイトケラチン−フラ
グメントを５ｎ（１／ｒＲｆ！、・−５００ｎｇ／ｍｆ
ｌの濃度で用いる（１５０ｍＨＮａ（、！、１０ｍＨＮ
ａ　　１−ＩＰＯ４ｐＨ７，４，０，０５％Ｔｗｅｅｎ
２Ｑの緩衝液に溶解）。ベルオキシダー１がカップリン
グされた検出抗体としては、たとえＧ、ｆＫ８１８−２
７ｒＶＪ５よびＫｓ１８−９８１　（’＋イトケラチン
１８フラグメン１−に対して）、Ｋ８１９．２（サイ１
−り一うヂン１９フラグメントに対して）およびＫｓ８
−１７．２　＜勺イ１〜ケラチン８フラグメントに対し
て）を使用する。遠心分離上澄中のサイトケラチン濃度
の測定には、これを緩衝液（１５０ｍ、ＨＮ　ａ　Ｃ１
，１０ｔＨＮａ２１−ＩＰＯ４，ｐＨ７，４−，０，０
５％　１’ｗｅｅｎ２０）で１：１００に希釈する。

標準化には、例１に、従って得られたサイ１〜ケラヂン
栓準の既知量をリンドイツデーＥＬＩＳＡに付す。各標
準化υイトケラチンの濃度に相当する酵素活性を、濃度
に伺してプロットし、濃度から未知量の各サイトケラチ
ンを内挿する標準曲線を得ることができる。組織サンプ
ルについて測定されたサイ１〜ケラチンとピネンチンの
関係によって、癌の転位の稈度を示すことが可能になる
。

例４４．１．ミクロタイタープレートの被覆各ウェルに２Ｘ
１０　　ｇの捕捉抗体ＫｓＤａｎ１−８（５０ｍＨ炭酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ９，６゜１００〜１５０×１０６
ｊ！中に溶解）をピペットで加える。プレートを覆い、
−夜４℃でイントユベーションする。

４．２．洗浄および遮断各ウェルから過剰の抗体溶液を吸引して除去する。各ウ
ェルに２００Ｘ１０−６Ａの洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ　：　１５０ｍＨＮａＣｊ！、　１０＋ｎＨリン
酸ナトリウム緩衝液１）Ｏ７，４，０，０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０　）をピペツ１〜で３回反復して加えて洗浄し、
プレートを裏返して緩衝液を除去する。残った水分は、
何枚も重ねた紙タオルで軽くたたいて除く。

各つ１ルに２００Ｘ１０−６ｊ！の遮断緩衝液（１５０
ｍＨＮａＣ１，１０ｍＭリン酸す１〜リウム緩衝液ｐＨ
７，４，０，０５％ｒｗｅ、ｅｎ　２０　、１％ウシ血
清アルブミン、５％サッカロース；長期間保存する場合
はさらに０．０１％のヂメ［１リールを添加）を満たし
、少なくとち１１待間、室温でイン１コベーシヨンする
。

４．３．抗原または血清標本どのイン１ユベーシヨン例１で得られたサイトタラチン８：１９の標準タンパク
質を、５　ｎ（Ｊ／ｌｄ、　〜５００　ｎ（１／ｄの濃
度で（そのとぎの捕捉抗体による）対照血清（Ｈｅｒｚ
＆ＤａｄｅのＨｏｎ１ｔｒｏｌまたはＢｃｈｒｉｒ＋ｏ
のＫｏｎｔｒｏｌ　ｌｏｇｅｎＬおよび１−Ｕ）に加え
る３、対照血清も、ぞの検出抗体に応じて、１：１０〜
１：１００に希釈して用いる。各ウェルに１００×１０
−６１の標準タンパク質溶液または血清標本（１：１０
・−１：１００に希釈）をピペットで加え、室温で９０
分間インキュベーションする。ついで２００Ｘ１０−６
ｊ！の洗浄Ｍ耐液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、上述したと同
じ）（・４回洗浄する。

４．４．検出抗体とのインキュベーションペル第１シダ
ーゼをカップリングさけた検出抗体、Ｋ８１９．２を緩
衝液（１５０ｍＨＮａＣ１、ｌＱｍＨリン酸す１〜リウ
ム緩衝液ｐＨ７，４，１％つシ血清アルブミン）に希釈
しく至′Ｉ！４満浪は０．２−．０．５Ｕ／−である）
、これをミクロタイタブレートの各ウェルにピペットで
１００Ｘ１０−６１加え、室温で９０分間イン゛ヤユベ
ーションする。

ｉｎ緩［２（上述シタト同Ｌ；　Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅ
ｎ　）　２００Ｘ１０’Ｊ！で２回、および流水で４回
洗浄する。

４．５．基質反応ミクロタイタープレート用に、１個の基質錠剤（１０ｍ
ｇ＞のＯ−フェニレンジアミン（［ａ。

Ｓｉ（ｌｌｌｌａ　）とｌ０ＸＩＯ１の３０％Ｈ２Ｏ２
を、１０−のＯ，１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ１１６
．０）またはクエン酸−リン酸緩衝液（０，０３４７Ｍ
　　クエン酸、０．０６６７Ｍリン酸水素二ナトリウム
、ｐＨ５，０）のいずれかに溶解する（クエン酸−リン
酸緩衝液を使用した場合の方が、高率の吸着が達成され
る。各ウェルに１００Ｘ１０’ｊ！の基質溶液をピペッ
トで加える（室温に調節）。ミクロタイタープレートは
、先住用の優先する反応を遮断するために覆い（たとえ
ばアルミホイルで）、適当な強度の色が発色するまで（
１５分〜３０分）インキュベーションする。

４．６．酵素反応の停止５０Ｘ１０　１の１２．５％ト１２Ｓ０４溶液を添加し
てペルオキシダーゼの反応を停止させる。

定量的測定の場合は、標準タンパク質の場合と試験血清
の場合の酵素反応を同時間経過後に停止させるように注
意すべぎである。。

４．７．評価ミクロタイタープレートは、ＥＩＩＳＡ−ホトメーター
を用い、４９２　ｎｍですべて測定する。

例５その他の操作は例４と同様に実施する。

５．２．検出抗体として、ベルオキシダー１をカップリ
ングした抗体Ｋｓ８−１７．２　（サイトケラチン−８
７ラグメントに対する抗体）を使用する。その他の操作
は例４と同様に実施する。

要約中間径細糸タンパク質の可溶性α−へリツクス中間部分
を免疫学的に同定するために、中間径細糸タンパク質の
その起源組織型による同定に適し、天然の七ツマ−から
の再橘築によって得られる標準と免疫学的に反応する抗
体を使用する。この同定は、生体における組織障害（腫
瘍壊死、炎症および他の病原）の発見に有用である。

量５．１．検出抗体Ｋｓ１９．２の代わりに、ベルオキシ
ダー１をカップリングした抗体Ｋｓ１８２７、　ＩＶ；
１ｔｆＧ＊Ｋｓ１８−９８１　（刀イケラチン１８−７
ラグメント・に対する抗体を使用する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞組織標本中または体液中に存在する不溶性中
間径細糸タンパク質を好ましくはそのα−ヘリックス中
間部分の可溶性フラグメントの形に可溶化し、得られた
フラグメントまたは付加的処理をしないでもすでに標本
中に存在したフラグメントを特異的抗体との免疫反応に
よりその起源組織型を同定する細胞組織標本または体液
中の細胞組織断片の分化状態および起源の同定方法にお
いて、抗体として中間径細糸タンパク質の起源組織型の
同定、好ましくは一義的同定に適し、さらに上記各中間
径細糸タンパク質の精製モノマーからの再構築によつて
得られる標準のα−ヘリツクス中間部分またはエピトー
プをもつそのフラグメントと、多くの各種公知試験方法
において免疫学的に反応する抗体を用いることを特徴と
する方法。
（２）標準は、同定すべき中間部分またはエピトープを
有するそのフラグメントから製造され、相当する組織ま
たは適当な細胞培養系から抽出および精製によつて単一
の細胞骨格ポリペプチドを単離し、ついでこのポリペプ
チドからまたサイトケラチンの場合は比較的塩基性（I
I型）および酸性（ I 型）亜群ポリペプチドとの等モル
混合物から次の下位単位としてダイマーついでテトラマ
ー、最後にプロトフィラメントを形成させ、ついでプロ
テアーゼによる制御された消化により、ダイマーまたは
テトラマーとして中間径細糸のα−ヘリックス中間部分
を遊離させ、単離精製し、標準として使用することを特
徴とする特許請求の範囲第１項の方法。
（３）同定すべき中間径細糸タンパク質のタンパク分解
による可溶化は、各２個の中間部分フラグメントへのα
−ヘリックス中間部分の単回分裂が最大になるまで行い
、そのエピトープが単回分裂によつて影響されずこの中
間部分フラグメントに最小１個存在する抗体を用い、こ
のエピトープをもつ中間部分フラグメントの数を測定し
てα−ヘリツクス中間部分の定量を行うことを特徴とす
る特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの方法
。
（４）プロテアーゼによる可溶化は、同定すべき中間径
細糸タンパク質型のすべてから、α−ヘリツクス中間部
分またはエピトープを有するそのフラグメントが遊離す
るような酵素対基質の関係および分解時間を用いて行う
特許請求の範囲第３項の方法。
（５）抗体として、少なくともサイトケラチンＮｏ．８
のモノマーに由来するα−ヘリックス中間部分の同定に
Ｋ＿ｓ８−１７．２、少なくともサイトケラチンＮｏ．
１８のモノマーに由来するα−ヘリックス中間部分の同
定にＫ＿ｓ１８−２７IVおよび／もしくはＫ＿ｓ１８−
９Ｂ１、少なくともサイトケラチンＮｏ．１９のモノマ
ーに由来するα−ヘリックス中間部分の同定にＫ＿ｓ１
９．２、少なくともサイトケラチンＮｏ．１〜８の１種
または２種以上のモノマー１種または２種以上に由来す
るα−ヘリックス中間部分の同定にＫ＿ｓｐａｎ１−８
、ならびにビメンチンのα−ヘリックス中間部分の同定
にＶＩＭ３Ｂ４を使用することを特徴とする特許請求の
範囲第１項から第４項までのいずれかの方法。
（６）α−ヘリックス中間部分またはエピトープを有す
るそのフラグメントはＥＬＩＳＡ試験を用いて同定され
、ミクロタイタープレートに固定する捕捉抗体としては
、動物血清からまたはハイブリドーマ法によりモノクロ
ーナル抗体として得られ、複数のエピトープまたは複数
のサイトケラチン由来エピトープの１種と反応する特許
請求の範囲第１項に記載の抗体を用い、検出抗体として
はただ１種の中間径細糸ポリペプチドとのみ一義的に反
応する特許請求の範囲第１項に記載の抗体を用い、試験
すべき溶液で得られた力価の測定結果を特許請求の範囲
第２項に従つて得られる標準の検定溶液について得られ
た力価の測定結果と比較することを特徴とする特許請求
の範囲第１項から第５項までのいずれかの方法。
（７）サイトケラチン抗体の捕捉抗体として、サイトケ
ラチン１〜１９の群のサイトケラチン１〜８の１種と反
応するＫ＿ｓｐａｎ１−８を使用することを特徴とする
特許請求の範囲第４項の方法。
（８）検出抗体として、サイトケラチンＮｏ．８にはＫ
＿ｓ８−１７．２、サイトケラチンＮｏ．１８にはＫ＿
ｓ１８−２７ＮもしくはＫ＿ｓ１８−９Ｂ１、サイトケ
ラチンＮｏ．１９にはＫ＿ｓ１９．２、サイトケラチン
Ｎｏ．１〜８の１種もしくは２種以上にはＫ＿ｓｐａｎ
１−８、および／またはビメンチンにはＶＩＭ３Ｂ４を
使用することを特徴とする特許請求の範囲第４項または
第５項のいずれかの方法。
（９）試験すべき標本は、血液、血清、脳脊髄液、尿、
羊水穿刺液または他の体腔たとえば胸膜もしくは腹腔の
穿刺液からなる群より選ばれ、溶解した細胞骨格タンパ
ク質フラグメントを検出および定量することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれかの方法。
（１０）試験すべき組織標本を採取してこれを組織泥ま
たはホモジネートにし、ついでこの組織標本を、プロテ
アーゼの添加によりタンク分解に付し、次に沈殿物を遠
心分離し、遠心分離の上澄についてα−ヘリツクス中間
部分またはエピトープを有するそのフラグメントの存在
または含有量を調べることを特徴とする特許請求の範囲
第１項から第９項までのいずれかの方法。
（１１）組織の部分に存在する中間径細糸タンパク質を
その起源組織により分類し、定量するにあたり、試験し
た組織部分と起源的に無関係な中間径細糸タンパク質の
測定値と試験した組織に起源的に属する中間径細糸タン
パク質についての測定値との比を求め、この比を病的で
ない標準での比を尺度として評価することを特徴とする
特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれかの方
法。
（１２）腫瘍組織の検出のためにリンパ節組織部分を試
験し、ビメンチンの測定値と他の組織型に属する中間径
細糸タンパク質それぞれの測定値との比を求めることを
特徴とする特許請求の範囲１１項の方法。
（１３）上皮組織および骨髄組織の生検試料からなる群
より選ばれる標本について試験する特許請求の範囲第１
１項の方法。
（１４）マウスＢＡＬＢ／ｃ株と融合パートナーとして
の骨髄腫細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ｓｐ２／ＯＡ
ｇ１４およびＮＳＯ／Ｕからのハイブリドーマ細胞系、
ならびに１９８８年１月１９日にＥＣＡＣＣ８８０１１
９０１号として、１９８７年１１月１３日にＥＣＡＣＣ
８７１１１３０２号として、１９８７年１１月６日にＥＣＡＣＣ８７１１０６０１号として、１９８７年１１
月１３日にＥＣＡＣＣ８７１１１３０１号として、１９
８７年１１月６日にＥＣＡＣＣ８７１１０６０２号とし
ておよび１９８９年１月５日にＥＣＡＣＣ８９０１０５
０５号としてそれぞれ寄託されたハイブリドーマ細胞系
。
（１５）塩基性（II型）亜群（ＣＫ１〜８）の各種サイ
トケラチンに共通のエピトープを抗原として反応し、Ｅ
ＣＡＣＣ８８０１１９０１号として寄託された細胞系に
よつて産生される免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａの抗
体。
（１６）サイトケラチン１９を抗原として反応し、ＥＣ
ＡＣＣ８７１１１３０２号として寄託された細胞系によ
つて産生される免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ｂの抗体
。
（１７）サイトケラチン８を抗原として反応し、ＥＣＡ
ＣＣ８７１１０６０１号として寄託された細胞系によつ
て産生される免疫グロブリンクラスＩｇＧ１の抗体。
（１８）サイトケラチン１８を抗原として反応し、ＥＣ
ＡＣＣ８７１１１３０１号またはＥＣＡＣＣ８９０１０
５０５号として寄託された細胞系によつて産生される免
疫グロブリンクラスＩｇＧ１の抗体。
（１９）ビメンチンを抗原として反応し、ＥＣＡＣＣ８７１１０６０２号として寄託された細胞系
によつて産生される免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａの
抗体。
（２０）組織障害の起源を発見する方法において、精製
された相当する組織型のポリペプチドもしくはそのフラ
グメントから形成された試験プレパラートを、血液、血
清、穿刺液もしくは他の体液よりなる群から選ばれる体
液中に存在する可能性のある抗体に曝露し、この試験物
質に結合した抗体を定性的および定量的に決定すること
を特徴とする方法。