JPH07505719A - ｐ５３及びＨＳＰ７０のコンプレックスを含む腫瘍の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｐ５３及びＨ３Ｐ７０のコンプレックスを含む腫瘍の検出方法本発明は、ＮＣ＋ 助成Ｉ　Ｆ３２　ＣＡＯ８８９９−０１にＭづ（政府援助によりなされた。政府 は本発明に対し幾らかの権利を有する。

関連出願 本出願は、１９９２年４月１４日に出願した、同時係属出願番号第０７／８６９ ．２９２号の一韻継続であり、該出願の開示を引用して明細書記載の一部とする 。

発明の分野 本発明は、Ｈ３Ｐ７０に結合するミュータントル５３蛋白のクラスが、血、＊自 ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子中の変異は、多種の一部ヒト癌で高頻度に見られ る。例えばＭホルスタイン等、サイエンス２５３．４９−５３（１９９１）参照 。

乳癌はｐ５３関与に関連するヒト癌の典型であり、約１０％の乳癌患者はｐ５３ 蛋白に向けられた抗体を循環していると報告されている。Ｌ、クロウホード等、 インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー３０．４０３−４０８　（ １９８２）。しかしながら、循環ｐ５３５３Ｄ診断上の重要性は明らかでない。

良性乳房線維腺腫を有するｗ者の２１％は腫瘍組織試料中、高いレベルのｐ５３ 蛋白を示すこと、血ｆｆ１ｐ５３抗体を有する患者の半分以上は腫瘍組織中ｐ５ ３の上昇を示さないことが判った。Ｌ、クロウホード等、モレキュラー・バイオ ロジイ・アンド・メディノン２．２６１−２７２（１９８４）。

発明の要約 本発明に導く研究において、ｐ５３免疫原性は特に腫瘍細胞により発現されてい るｐ５３ミュータントの皇及びこれらの蛋白の７０　ｋｄＭ　／Ｅソック白との 結合能力に関しては、乳癌患者で試験した。以下に詳細に検討したように、我々 は今やＨ３Ｐ７０に結合するミュータントル５３蛋白のクラスが血清自己抗体を 惹起するミュータントル５３蛋白のグループを明らかにすることを見出した。Ｈ ３Ｐ７０を結合する蛋白（まより腫瘍形成性となる傾向がある（Ｐヒンズ等、セ ル・クロス・アンド・ディファレンシエインヨン１．　５７１−５８０（１９９ ０）：Ｏ，ヘイルビイ等、サイエンス２５０．１１３−１１６（１’１９（１） ）ので、本発見は疾病の診断及び予知に血ｆｆ１ｐ５３自己抗体を使用する方法 を提供する。

前述を考２すると、本発明の第一の局面は、そのような腫瘍細胞を有する患者で の血ｒｌｌｐ５３自己抗体生成能力についての腫瘍細胞の分類方法である。本方 法は、帝１者から腫瘍細胞の試料を収集すること、次いで（例えば共免疫沈降に より）腫瘍細胞中、ｐ５３蛋白と７０キロダルトン熟ノヨツク蛋白（ｈｓｐ７０ ）のコンプレックスの存在を検出することを含む。本コンプレックスの存在は、 腫１ｊ！細胞が低置に血清ｐ５３自己抗体を惹起させる能力を有することを示す 。−態様では、１ｍ細胞は腫瘍（例えば−次腫瘍）内に含まれ、検出段階は患者 から腫瘍を除去する段階と同時に行われる。他の態様では腫瘍細胞は腫１（例え ば−次腫瘍）に含まれ、検出段階は患者から腫瘍を除去する段階に続く。患者か らの腫瘍除去段階は、任意に低置の血清ｐ５３自己免疫抗体の出現を検出する段 階に続けつる。

該自己免疫抗体出現は患者の腫瘍細胞の生育又は存在を示す。

本発明の第二の局面は、７０キロダルトン熱ノヨノク蛋白（ｈｓｐ７０）とコン プレックスを形成することができるミュータンｔ−ｐ５３蛋白を発現する腫瘍細 胞を検出する方法である。その方法は、宙者から生物学的液の試料を収集するこ とと、次いて生物学的液中のｐ５３自己抗体を検出することを含み、生物学的液 中のｐ５３自己抗体の存在は、腫瘍細胞がｌ＋５ｐ７０とコンプレックスを形成 することができるミュータントル５３ｍ白を発現することを示す。

本発明の第三の局面は、腫瘍細胞を有する患者のより攻撃的な疾病を起こすこと ができる腫瘍細胞を識別する方法である。その方法は、患者から生物学的液の試 ＃１を収集すること、次いで生物学的ｉ＋に中のｐ５３自己抗体を検出すること を含み、生物学的液中のｒ、５３自己抗体の存在は、腫瘍細胞がより攻撃的な疾 病を起こすことができることを示す。

本発明の第四の局面は、ＩＩｉ［ｌ細胞を有すると既１こ診断されたψ者の疾病 の再発について患者を観察する方法であり、患者は該腫瘍細胞の数を減少させる 処置を以前に受けている。その方法は、患者から生物学的液の試料を収集するこ とと、３自己抗体の存在は、患者の腫瘍細胞の数が増加したことを示す。典型的 には、引用される処置は生物学的液中のｐ５３自己抗体の量を減少させるのに有 効なものであり、腫瘍細胞は該細胞中、７０キロダルトン熱ノヨソク蛋白とコン プレックスを形成することができるミュータントル５３蛋白を発現する。検出段 階は、疾病の再発を続いて観察することを予め考慮して複数の場合に反ｉＭシつ る。その方法は、処置の前に患者のｐ５３自己抗体を検出する段階を任意にさら に含みつる。

本発明の第五の局面は、腫瘍細胞を有すると予め診断されていない患者の攻撃的 疾病を検出する予知方法である。その方法は、患者から生物学的液の試料を収集 することと、次いで生物学的液中のｐ５３自己抗体を検出することを含む。生物 学的液中のｐ５３自己抗体の存在は、患者がより攻撃的である腫瘍細胞を含むこ とを示す。

本発明の第六の局面は、患者の癌を検出する診断方法である。その方法は、ψ者 から生物学的液の試料を収集することと、次いで生物学的液中のｐ５３自己抗体 を検出することを含む。生物学的液中のｐ５３自己抗体の存在は、患者が腫瘍細 胞を含むことを示す。

本発明の前述の及び池の目的並びに局面は、本出願の図面及び以下の明細書で詳 細に説明される。

図面の簡単な説明 図１は、抗−ｐ５３抗体について、乳癌のψ者からの血清のスクリーニングを示 す。ＰＡｂ１８０１、正常ヒト血清（口１）、Ｓ１５による乳癌細胞系、ＢＴ− ２０からの代謝評識蛋白抽出物の免疫沈降はその腫瘍がｐ５３蛋白を過剰発現（ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）　Ｌ／なかった乳癌史２者からである。５７−ＡＮＡ は他の（明らかでない）抗核抗体からである。Ｓ１１、Ｓ３３、Ｓ７、Ｓ４５、 Ｓ３９、Ｓ５０及びＳ５６は、その腫瘍が高レベルのミュータントル５３蛋白を 発現した乳癌ψ者からである。

図２は、乳癌患者ｓｌｌからの血清による野生型及び種々のミュータントｐ５３ 蛋白の回収を示す。全７抗体陽性血清は、ＮＩ　８３Ｔ３細胞由来の野生型マウ スｐ５３（データ示さず）に加えて、本パネルの多様なｐ５３ｆｆｌ白を認識し た。

図３は、抗ｐ５３抗体を有する、ψ者からの腫瘍中、ｐ５３及びｌ−Ｉ　Ｓ　Ｐ 　７０のみの共免疫沈降を示す。腫瘍組織からの蛋白抽出物は、抗ｐ５３抗体（ Ｐ）又は抗１４ＳＰ７０抗体（■］）により免疫沈降し、次いで（、へ）ウサギ 抗１−Ｉ　Ｓ　Ｐ　７０血清及び（Ｂ）ＰＡｂ１８０１でプローブした。

図４は、それぞれ正常人、直腸癌、肺癌及び乳癌の患者からの血清試料中のｐ５ ３抗体の存在を検出する酵素イムノアッセイフォーマットでの一部アノセイの結 果を示す。０４２７単位／ＩＩｌカソトフ値も示す。

図５は、６血清検体からｐ５３自己抗体の存在を確認するための酵素イムノアツ セイフォーマットでの確認アッセイの結果を示す。ｒｃａＪは癌を示し、ｒＡｔ ＪＴＯＡＢＪは自己抗体を示す。

発明の詳細な説明 本明細書に開示する方法は、癌（内皮及び上皮器管の癌、例えば直腸、肺、乳又 は子宮癌腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない）、特に乳癌を有することが 推測されるｐ者に用いられ、又、癌を有すると既に診断された患者（癌に対する 処置を受けたψ１者を含む）を観察すること、そして癌を有するとまだ診断され ていない轡、者をスクリーンすることのいずれにも用いうる。本発明の獣医学的 応用（即ち、イヌ、ネコ、ウマ等の処置での）も意図されるが、患者は典型的（ 二（まヒトの男性又は女性である。既に診断が行われている場合、診断は典型的 には触診、放射線診断、細胞学又は体液性マーカーの検出による塊の同定による 。癌の処置は、典型的には細胞減少（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）外科手術に より、抗癌剤の投与により、又はその組合せ、例えば細胞減少外科手術、続く抗 癌剤による処置である。

上で示したように、本発明は、患者が癌を「ｆするかどうか、又、それかより攻 撃的な形の癌かどうかを診断するのに用いることができる。本発明は又、腫瘍再 発について患者のその後の観察方法をｔｉｔｔｔする。ミュータントル５３Ｂｔ 白を発現する癌を有するψ者では、ｐ５３蛋白に対する抗体反応が時々誘発され る。腫瘍の除去により抗体反応は元に復する。患者が二次部位、即ち転移で腫瘍 を形成する場合、抗体反応は再び現れる。本抗体反応はｐ５３変異を含む腫瘍を 有する患者に特異的である。従って、ｐ５３抗体の存在をアッセイすることによ り、腫瘍の存在は不存在を決定できる。しかしながら、ｐ５３ミュータント蛋白 のサブセ・ノドのみが本免疫反応を誘発する。今や本サブセントは、ｈｓｐ７０ と安定なコンプレックスを形成することができるこれらのｐ５３ミュータント蛋 白として確認された。本コンプレックスの存在は、例えばｐ５３及びｈｓｐ７０ に対する抗体による共免疫沈降により一次腫瘍組織内でアッセイできる。従って 、−次腫瘍組織の試料によって、どの患者がｐ５３に対する抗体反応を増すかを 予報できる。これは、−次腫瘍が小さ過ぎて反応を有効に誘発できないか、又は 患者が免疫反楔を除くか又は弱める化学療法又は放射で前処置された場合でも有 効である。患者が免疫反経回復し、腫瘍再発すると、免疫反応を増すことが期待 でき、それは容易にアッセイできる。又、アッセイできる免疫反応は、−次腫瘍 が免疫反応を起こすのに十分な大きさに生長したときに生じ、それは又、再発の 場合のように二次又は転移腫瘍が免疫反応を起こす場合である。もしｐ５３／ｈ ｓｐ７０コンプレ・クラスが一次腫瘍で検出されると、患者は腫瘍再発を知らせ るｐ５３抗体反応の出現を観察される。

本明細書で用いられる字句「より攻撃的な疾病」は、（ａ）速やかに生育する癌 細胞から起こる疾病、（ｂ）速やかな転移を受ける癌細胞から起きる疾病、及び （Ｃ）処置後、再発の確率が高い疾病を言う。

本明細書で記載される検出段階で使用するため四者から採られた試料は、一般に 生物学的液、例えば血清、血液血漿又は腹水である。血清及び血液血漿、特に血 清が好ましい。自己抗体は、そのような抗体を産生じた全細胞が結局、消失する 前に除去されたｉｌ、少しの間岩者に留まることが期待されるので、患者は、腫 瘍細胞を現在、含むと要はない。

疾病の再発を検出する目的で試料が患者から採られる場合には、試料は好ましく は、残余自己抗体の持続中、消失するのに十分な処！（外科手術的、化学的等） 後、採取する。一般に、収集段階は少なくとも処置ｔ＆８週に行われるが、処置 （ここで処置は、処置の過程、例えば化学療法の過程を含み、本時間はその最終 開始から測定する）後、３力月、６力月又は１年でも実施しつる。そのような試 料は周期的に数回患者から収集し、疾病の再発を連続して観察するのに供しうる 。そのような試料を採る間の期間は疾病の型及び状態によって変化するであろう 。典型的には試料は、６力月から１年の間隔で収集されるが、患者が発達した癌 の処置を受けた場合、収集の間隔は約３カ月でありうる。続く処置レジンは、要 すれば、それまでの処置と共に開始した観察プログラムがまだ実施されている間 に開始しつる。

生物学的液の試料中のｐ５３自己抗体を検出する段階は、既知技術に従って実施 しつる。例えばり、クロウホード等、インターナショナル・ジャーナル・オン・ キャンサー３０．４０３−４０８（１９８２）；Ｌ　クロウホード等、モレキュ ラー・バイオロジイ・アンド・メディンン２．２６１−２７２（１９８４）参照 。適当なアッセイの例はラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素結合イ ムノアッセイなどを含む。当業者は、本明細書で開示された方法を実施するのに 有用でありうる多数の特異的イムノアッセイフォーマント及びその変形に精通し ているであろう。一般にＥ、マキオ、エンザイムーイムノアソセイ（１９８０） 　（ＣＲＣ・プレス・インコーポレイテッド、ポカ・ラドン、ＦＬ）参照。

本発明を以下の実施例中でより詳しく説明する。実施例は特に、（１）Ｈ３Ｐ７ ０を結合するミュータントル５３蛋白が血清自己抗体を誘発する、（２）迎に抗 ｐ５３自己抗体の存在は、ｈｓｐ７０を結合するｐ５３変異の存在を反映する。

（３）従って抗ｐ５３自己抗体の存在は、ｈｓｐ７０結合ミュータンｔ−ｐ５３ を生成する働者の体内で生育の存在を確立する、（４）抗ｐ５３自己抗体の検出 は、体内に生成されたｐ５３ミュータントのクラスをホ１１定するのに用いるこ とができる、（５）抗ｐ５３自己抗体の検出は、体内のどこかの生育が癌性であ り、ｈｓｐ７０結合ｐ５結合ｐ−３ミユータント蛋白ていることを決定する、及 び（６）ｐ５３自己抗体の検出は−より攻撃的な腫瘍を示す、ことを示す。実施 例１で、ノース・カロライナ、ノーラム、ジューク・ユニバー７テイーのツヤツ ク・キーン、エリツク・ウィナ−及びロバート・バストが患者血清を供給した。

温度は、特に標示しない限り摂１、材料及び方法 星！　ンユーク・ユニバーンティー・メディカル・センターで行った乳房バイオ プンー及び乳房切除からの片を外科手術除去後、収集し、直ちにフラッシュ凍結 し、−１２０℃で保存した。病理学部の一員によりその腫瘍が一次侵入乳癌と診 断された６０名の患者からの検体を研究した。これらの腫瘍の３０は免疫組織化 学分析によりｐ５３蛋白を過発現することを示し、一方、３０は正常な低レベル の蛋白を発現した。

粗壁系　確立された細胞系ＨＢＬ１００、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、Ｔ４７Ｄ 及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８Ｂをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション から得た。ＨＢＬｌｏｏは野生型ｐ５３　（２４）を発現する５Ｖ４Ｑ−形質転 換ヒト乳房上皮細胞系である。ＢＴ２０、ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ及びＭＤＡ−Ｍ Ｂ−４６８は、それぞれコドン１３２．２８５．１９４及び２７３で変異を伴う ｐ５３蛋白を発現するヒト乳癌派生細胞系である。Ｊ、ニグロ等、ネイチャー３ ４２．７０５−７０８（１９８９）；　Ｊ、バーチク等、オンコシン５．８９３ −８９９（１９９０）参照。キャノイ　Ａ、フィンレイ博士（プリンストン・ユ ニバージティー、分子生物学部）から得たＩ３細胞系は、マウスミュータントル ５３クローンＬＴＲｃＧ−ｖａｌ’　”により固定されたラット胎児線維芽細胞 系である。Ｐ、ヒンズ等、ジャーナル・オン・バイオロジイ　６３．７３９−７ ４６（１９８６）。細胞は、ウシインツユリン（１０ｎ／ｍｌ）　、グルタミン （３００ｍｇ／Ｌ）及び１０％０％ラン血清を補足したＰＲＭ１１６４０中３７ ℃で生育した。正常ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥｃ）を、減小乳房形成後、収集し 、標準的技術に従って短期間培養に保持した。■４バンド及びＲ，セイガー、プ ロノーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミイ・オン・す（エン／７：　Ｕ ＳＡ　８６．１２４９　１２５３（１’１８９）ｖ照。

■俸　−次、浸入乳癌の患者からの血清を診断時に得て一２０℃で保存した。

ＰＡｂ１８０１　（Ａｂ−２、オンコシン・サイエンス）は、アミノ酸３２と７ ９の間のエピトープでヒトｐ５３と特異的に反応するマウス抗ｐ５３モノクロー ナル抗体である。Ｌ、バンクス等、ヨーロピアン・／ヤーナル・オン・バイオケ ミストリイ　１５９．５２９−５３４（＋９８６）。ＰＡｂ４２１は、アミノ酸 ３７０と３７８の間の吐乳動物＋）５３のエピトープと反応するマウス抗ｐ５３ モノクローナル抗体であり（Ａ、ウェイト−エバンス及びＪ、ジェンキンス、Ｅ ＭＢＯジャーナル４゜６９９−７０６　（＋９８５））　、アーノルドＪ　レビ ン博士（プリンス］・ン・ユニバージティー、分子生物学部）から得たハイブリ ドーマ細胞系から生成される。ｌ−Ｉ　５Ｐ７２／７３　（Ａｂ−１、オンコシ ン・サイエンス）は、吐乳動物細胞中１１５　Ｐ７０蛋白と反応するマウスモノ クローナル抗体である（クローンＷ２７、Ｅ、バーロウ）。熱ンヨンク蛋白族の 少なくともｈｓｃ７０及びｈｓｐ７Ｑメンバーの最後の２１アミノ酸を表現して いるヒトＣ末端エピトープに対して向けられたウサギ抗血清、ヒイリップス・ヒ ンズ等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロノイ７、２８６３−２８６ ９（１９８７）は、Ｐ、ヒンズ博士（ホワイトヘッド・インスチチュート、分子 生物学部）から得た。ＴＡ−１、抗ＨＥ　Ｒ２／ｎｅｕマウスマウＣ；、モノク ローナル抗体（シュポン）、正常ヒト血清及び自己免疫疾患に関係した抗核抗体 を有する１５名のψ者からの血清（Ｊ、Ｄ、キーン博士、ジューク・ユニバーン ティー、微生物学部より得た）を対象抗体として用いた。

配列分析　ｍＲＮＡからｐ５３遺伝子の高保存部分の配列決定は既知の技術に従 って実施した。例えばＡディビド７等、プロノーディンゲス・オン・ナショナル ・アカデミイ・オン・サイエンシズＬＪＳＡ　８８．５００６−５０１０（＋９ ９１）参照。

要約すると、プライマーとしてエキソン１０からのアンチセンスオリゴヌクレオ チドを用い、ＭｕＬ〜ｌ逆転写酵素（ベテスダ・リサーチ・ラホラトリーズ）に よ６ｐ５３第−鎮ｃＤＮＡ合成用の鋳型として１ルの全ＲＮＡを用いた。次いで エキソン４−１０を、エキソン４からのオリゴプライマーとＴａｑＤＮΔポリメ ラーゼ（プロメカ）を加えることによりポリメラーゼ連鎖反応を用い増幅した。

本反応の７１２ｂｐ生成物をゲル精製し、ｉＱび増幅し、セファ０−スＣＬ−６ １３（ファルマンア）スピンカラムを通すＩ！！過、エタノール沈殿及び水中へ の再溶解により再度精製した。本材料は、配列２０（ユナイテッド・スティン・ バイオケミカル）を用いるジデオキシ配列決定用の鋳型であった。エキソン５． ６．７及び８の各々に近接するオリゴヌクレオチドを用い、反応を開始し、反応 はプライマー鋳型をまず煮沸し、水上で１０分間”Ｐ−ｄＡＴＰで標識し、次い で４５℃で１０分、終結反応をランニングすることにより実施した。生成物はポ リアクリルアミドゲル上で電気泳動に付し、次いてゲルを１０％酢酸／１２％メ タノールに浸漬し、乾燥してコダソクＸＡＲフィルムと七ントシた。

免疫沈降　細胞系は５０μＣｉ／ｍｌ　３ＳＳ−メチオニン（アマ−ジャム）で ２時間、代謝的に標識した。標識期間の終わりで細胞をこすり落とし、溶解緩衝 液（５０ｍＭｌ−リス、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ａ＋Ｍ　ＮａＣ１，０，５％ ＮＰ４０．１１ＩｌｖｌＰＭｓＦ）中て均一にし、次いで１０秒間５ｗ／ｓで超 音波処理した。１００．０００ｇで遠心後、上清を集め、プロティンＧ−セファ ０−ス（ファルマンア）により１時間４℃で前吸着させた。１２．０００　ｇで 遠心後、上清を集め、取込みをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿により定量した。

ｐ５３の免疫沈降は、各細胞系から５×１０・ＴＣＡ沈降可能カウントから行っ た。溶解質は、１μｌのヒト血清又は０゜１ａｇのモノクローナル抗体と４℃で １時間インキュベートし、次いで２０声１プロティンＧ−セファロースと結合さ せた（４℃、２時間）。セファロースを溶解緩衝液で３回洗浄し、等量の５ＤＳ −負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝液（１００ＩＩＭトリスｐＨ＝６．８．４％ＳＤ Ｓ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール、５０ｍＭβ−ＭＥ ）中で５分間省沸することにより変性させ、１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上に乗せた。試料の電気泳動後、蛋白を４００園八で２時間、エレクトロブ ロッティングによりニトロセルロース膜（ンユライソヤー・アンド・ツユエル） に移した。膜を乾燥し、コダソクＸＡＲフィルムと一晩組織をポリトロ／（ブリ ンクマン）を用い均一化した以外、上記のように実施した。２５０ｇｇの未標識 全蛋白（ＩＩＭＥｃ及びＮｌｌｌ３Ｔ３細胞、２１ｇ）を上記のように患者血清 又はモノクローナル抗体と反応させ、回収蛋白を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル上で電気泳動に付し、次いでニトロセルロース膜に移した。膜は、次いで遮断 溶液（リン酸緩衝食塩水ｒＰＢＳＪ中、３％ウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０ ．２％ツイーン２０．０．０２％ナトリウムアジド及び１ｍＭＥつ化ナトリウム ）中で一晩処理し、５％ＢＳＡ中１；３希釈したＰＡｂ４２１上清と３７℃で９ ０分プローブした。ＰＢＳで洗浄後、プロットは５ｍｌ　５％ＢＳＡ中ビオチン 化Ｆ　（ａｂ’　）ｚヤギ抗マウス血清（タボ）で１時間プローブした。ＰＢＳ 中で最終洗浄後、抗体結合をアビンン接合イムノベルオキ／ノーセ検出システム （ベクター）で可視化した。

共免疫沈降　−次漫人乳癌の患者からの腫瘍中のｐ５３及びＨＳ　Ｐ　７０の共 免疫沈降は、抗ｐ５３抗体又は抗Ｈ３Ｐ７０抗体のいずれかと腫瘍組織からの蛋 白抽出物（２５０ａｇ）の第一反応により実施した。４つの免疫沈降反応、各抗 体による２つ、を各組織からの蛋白抽出物上で実施した。コンプレックス中のＨ ３Ｐ７０を検出するため、免疫沈降を１１μｇのマウスモノクローナル抗体、Ｐ Ａｂ１８０１及びＨ３Ｐ７２／７３で実施した。コンプレックス化ｐ５３を検出 するため、免疫沈降をヒト抗ｐ５３抗血清、ｓｌｌ及びウサギ抗Ｈ３Ｐ７０抗血 清の一つで実施した。これらの免疫沈降物を上記のように電気泳動に付し、プロ ットした。ＨＳ　Ｐ　７０のプローブは、５％ＢＳＡ中１０μｌウサギ抗ＨＳ　 Ｐ　７０血清で実施 した。ｐ５３のプローブは１．ＯａｇＰＡｂ１８０１で実施した。マウスモノク ローナル自体がヒオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ検出システムで一；５Ｑｋｄｉ白 として検出されるので、不均質様抗血清をこれらの免疫沈降に用いた。結合は、 ビオチン化ヤギ抗ウサギ（ベクター）又は適当なものとして抗マウスで検出した 。可視化を再びイムノペルオキシノーセ検出システムで実施した。

びその腫瘍が検出不能のｐ５３蛋白を発現した３０名の、ψ者から手術１υ１間 に収集した血ｌ＋１を抗ｐ５３抗体のｒｒ在についてスクリーンした。１１１１ の各血清を確立したヒ上乳癌細胞系ＢＴ２０からの代謝標識蛋白溶解質と反応さ せた。本細胞系は高レベルの、コドン１３２で変異を念むｐ５３蛋白を発現する 。ｊ、バーケラト等、オンコノン５．８９３−８９９（１９９０）参照。ｐ５３ を過発現した腫瘍を有する７名の患者からの血清は、モノクローナル抗体、ＰＡ ｂ１８０１と免疫沈降したｐ５３と共移動した５３ｋｄ蛋白を免疫沈降した抗体 を含有した（図１）。これらの血清の希釈分析は、イムノグロブリンアフィニテ ィ精製ｐＡＢ１８０１に類似する最強のものに関して、それらの反応性で〉１０ 倍の変化を示した。本分子量の蛋白に対応するバンドは、ｐ５３陰性腫瘍を有す る患者からの血清のいずれによっても免疫沈降しなかった。加えて５３ｋｄ蛋白 は、抗核抗体を有することが知られた、自己免疫疾密を有する１５名のψ者から の血清によりＢＴ２０ｉ８解質から回収されなかった。

これら７血請の各々がｐ５３オンコノンを認識したことを確識するために、イム ノブロッティングを実施した。未標識蛋白抽出物は、各血清で免疫沈降し、電気 泳動に付し、固体支持体に移し、次いてＰＡｂ４２１でプローブした。各ケース でｐ５３モノクローナル抗体により検出された５３ｋｄ蛋白の特異回収は、免疫 沈降蛋白の同一性を確認した（図２）。異なる確立されたヒ］・及びマウス細胞 系からの免疫沈降は各抗血清が広範囲のｐ５３蛋白、両ミュータント及び野生型 を認識することを明らかにした（図２）。

ｐ５３変異は免疫反応と相関する　幾つかの可能性がなぜミュータントル５３蛋 白を発現する乳癌のサブセットだけがｐ５３抗体を誘発するかを説明できる。

ミュータント蛋白の１は、非常に可変性で、細胞死後、これらの腫瘍中、高レベ ルで免疫原性を獲得する。しかしながら、免疫組織化学により、ｐ５３発現のレ ベルでの王ｌヨ違いは、これらの腫瘍では観察されなかった（データ示さず）。

別途、幾つかのミュータントル５３蛋白だけが、抗体自体はミュータント特異性 でなくても免疫原性でありうる。これを試験するため、ＰＣＲ増幅ｐ５３ｃＤＮ Ａの直接スクリーニングを蛋白を過発現している１５の乳癌から実施した。各ケ ースで蛋白のコート配列を変化した遺伝子の高変換！！１９分で、変異が見られ た（表１）。

これらの変ンｄの一般に一員したクラスター形成が観察された。ｐ５３に応答す る抗体を増加しなかった各中者は、ｐ５３遺伝子のエキソン７又は８に変異を含 む腫瘍を有した。逆に、抗体陽性である７名の暦者の５名はエキソン５又は６に 変異を伴う腫瘍ををした。２つの例外は患者３３及び４５であった。彼らの腫瘍 は、それまで患者が強い免疫反応を増した、コドン２７５（エキソン８）及び２ ３８（エキソン７）に変異を含んだ。両ケース共、′Ｒ′ｊＬは蛋白の長範囲４ 級構造を変えることが予言されたソステイン残基を変化した。

表１ 遺伝子変異の部位、免疫原性及び１５の乳癌のＨＳ　Ｐ　７０とコンプレックス を作る能力に関するミュータントル５３蛋白の特性のクラスター形成は、Ｍｉ線 繊培養細胞中熱／ヨノク結合について分析したヒト及びマウスミュータントル５ ３蛋白て明らかである。エキソン５に゛良ンζを八む１）５３蛋白は、７０ｋｄ 熱／ヨツク蛋白に結合し、一方、エキソン８に位置する変異を伴う幾つかの蛋白 は、コンプレックスを形成しない。Ｐ　ヒンズ等、セル・グロス・アンド・ディ フ７レンノエインヨン１．　５７１−５８０（１９９０）；Ｏ，ヘイルビイ等、 サイエンス２５０．１１３−１１６（１９９０）参照。抗原提示においてＨＳ　 Ｐ２Ｏの可能な機能を与えて、免疫原性ｐ５３ミュータントがインビボで本熱シ ヨツク蛋白とコンプレックスを形成するかどうかを測定することは興味あること である。ｐ５３変異を含む１５腫瘍のうち１４の蛋白抽出物が抗ｐ５３及び抗帖 ショック抗体と免疫沈降した。プロッティング後、分離膜は、これらの蛋白の共 沈殿を検出するために抗ｐ５３及び熱ノヨック抗体でプローブした。ｐ５３抗体 が循環している全７名の、轡者からの腫瘍組織は、共沈殿ｐ５３及び７０ｋｄ！ ！Ｉシヨツク蛋白を含んだ（図３）。逆に、ｐ５３／熱ショック蛋白コンプレッ クスは、検出可能なｐ５３抗体に欠けている７名の患者からの組織で検出されな かったが、それでも抗体陽性組織に類似する両ｐ５３及びＨ３Ｐ７０のレベルは 存在した。そのように、コンプレックスの欠失を説明するｐ５３又はＨＳ　Ｐ　 ７０が不存在であることのようには見えない。それらの抗血清を用いて識別され ない７Ｏｋｄ熱シヨツク蛋白の幾つかの種（即ち、ｈｓｐＳｈｓｃ及びｈｓｘ） が存在するので、コンプレックスに欠ける組織は適当な数の熱シヨツク蛋白ファ ミリーを合成しない可能性がある。

しかしながら、異なるミュータントが、薩歯類線維芽細胞において、ｈｓｃ７０ とコンプレックスを形成する、異なる内因性能力を有することを示した。ｐ５３ に対し内因性の性質が、これらの乳癌でのコンプレックス形成に関与することを 示唆するＰ、ヒンズ等、上湯、Ｏ，ヘイルビイ等、上１６参照。

本研究での発見は、ヒトＭｉ瘍での２つのクラスのｐ５３変異を識別する方法を 示唆する。証拠の幾つかのラインが、これが変異を類別する機能的に重要な方法 でありうるという着想を支持する。熱ノヨック蛋白を結合するｐ５３変異は、ｒ ａｓと共に、より有効な優性形質転換遺伝子である。Ｐ、ヒンズ等、セル・アン ド・クロス・ディファレンンエインヨン１．　５７１−５８０（１９９０）。熱 ノヨツク蛋白／ｐ５３コンプレックスは、野生型Ｐｇｉ瘍サプレッサー蛋白の隔 離により、帖ノヨノつてコンプレックスを）じ１戊し得ないミュータ／＋−ｐｓ ３蛋白よりも多分より口欲にｐ５３仲介形質転換を促進する可能性がある。又、 転写活性化でのミュータントル５３蛋白の作用能力に差があるようである。コド ン２７３に変異を含むＧＡＬ４／ｐ５３溶解蛋白（ヒト）は本作用を維持するが 、一方、コドン１３５の変異（ネズミ）は、ＧＡＬ４標識配列にトランス作用す る能力が破壊している。

Ｌ、レイクロフト等、サイエンス２４９．１０４９−１０５１（１９９０）　： 　Ｓ、フィールズ及びＳ、ジャンク、サイエンス２４９．１０４６−１０４９（ １９９０）。

しかしながら、線維芽細胞を形質転換する能力のＨ３Ｐ結合と非結合ｐ５３蛋白 との差は、リーフラウメニ症候群を伴う患者に見出された遺伝性ｐ５３変異が結 果として有効なオンコノンの減少となるという信念を支持しうる。これらの変異 はｐ５３遺伝子のコドン２５０付近でクラスター形成するようであり（Ｓ、スリ バスタバ等、ネイチャー３４８．　７４７（１９９０）　＋　Ｄモーキン等、サ イエンス２５０、１２３３（１９９０））　、従って、Ｈ５Ｐを結合しないと、 そして多分、腫瘍原性が少ないと予測される。本研究から患者６３は、リーフラ ウメニフ７ミリイ（コドン２４５、Ｇｌｙ→Ａｓｐ）に見出され、乳癌のＨ３Ｐ と結合しないものと同一の変異を含有した。これは、なぜ多くのこれらの患者が 、生殖細胞系ｐ５３変異を有するのに、症候群の特徴的悪性疾患を表す前に若い 成人期に達することができるかを説明しうる。

実施例２ 以下は、中５者の生物学的液、例えば血清中のｐ５３自己抗体の存在を検出する イムノアッセイ方法を示す。本イムノアッセイ方法は一部アッセイと呼ばれるで あろう。確認試験として作用し、確認アッセイと呼ばれるであろう一部アノセイ の修肺変化も示される。−次アッセイによりｐ５３自己抗体が陽性であると試験 された試料は、試料が真に陽性か又は偽の陽性かを決定するため、確認アッセイ により再試験できる。これらのアッセイ、例えばサンドイッチアッセイ及び競合 アッセイを実施する一般的方法は、当業者に知られている。本発明の特異的実例 では、−次アッセイは２つの本質的要素、（１）ｐ５３抗原に結合した固相（本 明細書ではｐ５３．Ｓと称する）及び（２）ヒトイムノグロブリンに向けられた 標識抗体を有する。確認アッセイは、−次アノセイ中の２つの要素プラス第３要 素、遊離（即ち、非固相結合）競合ｐ５３抗原（本明細書ではｐ５３Ｃと称する ）を含む。

ｐ５３Ｓ及びｐ５３Ｃの潜在的志願者は野生型又はミュータント全長天然又は組 換えｐ５３蛋白及びその断片である。好ましくは、断片はｐ５３自己抗体により 王に認識された天然、組換え又は化学合成ポリペプチド又はペプチドである。例 えば、これらのｐ５３蛋白又は断片は粗製細胞抽出物から得ることができ、天然 発生又は組換え細胞又は細胞系から精製できる。ｐ５３ｍ白の起原の例は、異な る形のミュータントル５３蛋白を発現する癌性生細胞系である。例えば、セクシ ョンｒｎ、ＥＩＡフォーマットを用いる確認アッセイ」の下に以下に記載した確 認アッセイで、ｐ５３自己抗体結合の阻止は、ｐ５３Ｃを与えた５Ｗ６２０細胞 の抽出物により観察された。ｐ５３Ｃの他の起原は、乳腫瘍から誘導され、コド ン１９４でロイノン残基に代えてフェニルアラニンが置換されたミュータントル ５３蛋白を発現するＴ−４７Ｄ細胞系（ＡＴＣＣＨＴＢ１３３と称する、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能）である。ｐ５３Ｃは、 それがｐ５３Ｓに関し以下にさらに記載される交叉反応エピトープをきまな（て ちよいという１４加的要求を有する。

ｐ５３ｓを結合する固相は、イムノアッセイに用いられる如何なるものでもよい 。それらは、天然及び合成ポリマー、ゲル及び粒子を含む。ポリマーは、セルロ ース又はセルロース誘導体、ファイバーグラス及び塩化ビニルであることができ る。標識抗ヒトイムノグロブリン抗体は、商業的に入手しうるか又は当業者によ り製造できる。抗体は、酵素、放射活性、蛍光又は化学標識により標識できる。

−次アンセイでは患者の生物学的液を固相上でインキュベートシ、それにｐ５３ Ｓを結合させた。インキュベーション期間は、ｐ５３ｓを結合した固相の患者試 料中に存在しつる如何なる抗ｐ５３自己抗体（本明細書ではａｐ５３と称する） への結合をも可能にし、　１（ｐ５３　ＳＸδｐ５３］　の固相コンプレックス を形成するのに十分に長くあるべきである。次に、未結合試薬を分離する。例え ば未結合試薬を水性媒体に溶解し、固相から洗浄除去し、固相に結合した（（ｐ ５３ＳＸδｐ５３］　のコンプレックスを残す。次に、固相は標識抗ヒトイムノ グロブリン抗体（本明細書では、零〇ＩｇＧと称する）と十分な時間インキュベ ートし、ｐ５３自己抗体を含む咀者試料について、固相に結合するコンプレック スＩ（ｐ５３　ＳＸδｐ５３Ｘ本δＩｇに］　を形成させる。これは続いて他の 分離段階て未結合試薬を除き、ｉ＆Ｉ：　１（ｐ５３　Ｓ　Ｘθｐ５３０本δＩ ｇＧ）ｌ　コンプレックスを結合した固相を残す。コンプレックスの形成は、抗 ヒトイムノグロブリン抗体上の標識により検出する。従ッテ、　Ｉ（ｐ５３ＳＸ ａｐ５３Ｘ本ａ　ＩｇＧ］　：）　ンプレクラスノ形成は、轡者血清中のｐ５３ 自己抗体の量に直接比例する。

２つのインキュベーションと洗浄段階（二段階アッセイ）を有する代わりに単一 のインキュベーションと洗浄段階（一段階アッセイ）も、未結合試薬を洗浄し、 コンプレックスの存在を検出する前に、ｐ５３Ｓを結合した固相、本δＩｇＧ及 び轡９者の試料を、　Ｉ（ｐ５３５Ｘδｐ５３）（零〇ＩｇＧ］　コンプレ・グ ラスを結合した固相のし成に十分な期間、同時にインキュベーションすることに より可能である。

さらに一段階及び二段階アッセイのいずれても、残留する未結合本δＩｇＧ（７ ）１１を測定することもでき、それは轡、者試料中のｐ５３自己抗体の存在に逆 比例する。

！、ｔＩ、者の試料が一部アノセイの結果、陽性であるときは確認アッセイで再 試験しうる。試１１がｐ５３抗原に特ンく的な自己抗体をａむときは、確認アツ セイにより真に陽性であると確認されるであろう。同様に、試料がｐ５３抗原に 特異的ではないがｐ５３Ｓと交叉反応する抗体を含むときは、確認アッセイによ り偽の陽性であると確認されるであろう。患者試料中のイムノグロブリンは、２ つの理由：１）その性質により、用いたｐ５３Ｓが交叉反応性エピトープを含み うる、例えば組換えｐ５３蛋白は、患者のイムノグロブリンが結合する、人工的 に誘導された外部非ｐ５３構造（それは細胞培養生成物中、ｐ５３蛋白の調節、 発現又は回収を促進する）を含みうる；又は２）固相へのｐ５３の結合が、例え ばｐ５３抗原に対し自然でない交叉反応性エピトープを創造するためにｐ５３Ｓ の横這を変化しつる、よりｐ５３Ｓと交叉反応できた。

確認アッセイは、患者の試料も遊離競合ｐ５３抗原（即ちｐ５３Ｃ）とインキュ ベートする以外、−次アノセイと同様に実施した。患者の試料は、−次試験がｐ ５３Ｃを含むが二次試験がきまない（ｉ＆者はネガティブコントロールとして役 立アッセイにおいて、本二次試験が、−次試験と並んで実施される以外、−次ア ッ叉反応しないコントロール蛋白、細胞抽出物、ポリペプチド又はペプチドを含 むことができる。本蛋白、細胞抽出物、ポリペプチド又はペプチドは、ｌ）５３ ｍ白又はその断片ではなく、又、例えばｐ５３自己抗体と交叉反応する類似ｐ５ ３蛋白又はその断片でもないであろう。好ましくは、コントロールの形は、蛋白 、細胞抽出物、ポリペプチド又はペプチドで、−次試験でｐ５３Ｃに用いた形と 同じである。即ち、−次試験がｐ５３Ｃとしてｐ５３ペプチド断片又は完全長ｐ ５３を使用すると、二次試験はｐ５３と関連しないペプチド断片又は等長の蛋白 を使用するであろう。同様に、−次試験がｐ５３Ｃの起原としてｐ５３蛋白を含 む細胞抽出物を用いると、二次試験は以下の実施例に示すように、ｐ５３蛋白を 含まない細胞抽出物を用いる。−次試験では、唐者の試料は、ｐ５３Ｃと予め混 合し、次いでｐ５３Ｓとインキュベートする。ｐ５３Ｃは、ｐ５３Ｓに関し上記 した交叉反応性エピトープを含んではならｌｉい。従って、ｐ５３Ｃの起原は、 高レベルの天然（それらは野生型又はミュータントである）抗原を生成するヒト 細胞系てありうる。一つのそのような細胞系は５Ｗ６２０である。ｐ５３Ｓとの インキュベーションの間、ｐ５３Ｃは、ｐ５３抗原に特異的な自己抗体に結合す るためにｐ５３Ｓを結合した固相と競合する。ｐ５３Ｃは、ｐ５３Ｓと交叉反応 性のイムノグロブリンに結合するためにｐ５３Ｓを結合した固相と競合しない。

ｐ５３Ｃは、　Ｉ（ｐ５３　Ｓ）（θｐ５３Ｘ本δＩｇＧ）ｌ　コンプレックス の形成を最適に阻止する量で用いるべきことに留意する。本明細嘗て記載される 確認アッセイの場合、水量は、例えばｐ５３特異自己抗体を含むことが知られて いる患者試料を用いる確認−次及び二次試験を実施する（ｔ＆者は、例えば実施 例１に記載される免疫沈降により測定できる）こと、並びに−次及び二次試験の 結果を比較することにより測定できた。５０ないし１００９６阻止が好ましい。

二次試験では、患者の試料はｐ５３Ｃの不存在でｐ５３Ｓとインキュベートする 。

本試験はネガティブコントロールとして役立つ。、轡者の試料がｐ５３抗原に特 異的な自己抗体を含むと、−次試験（ｐ５３Ｃを含む）は、そのネガティブコン トロール相対物に比べて１（ｐ５３　Ｓ）（δｐ５３）（零〇１ｇＧ））コンプ レックスの形成を減じ、試料は真の陽性と確認されるであろう。患者の試料がｐ ５３Ｓと交叉反応性のイムノグロブリンを含むと、−次試験は、そのネガティブ コントロール相対物に比べてコンプレックスの形成が減少せず、試料は偽の陽性 と確認されるであろう。

さらに、確認アッセイは、第一アッセイなしに、ｐ５３自己自己−「真に陽性」 として働者の試料を確認することのみに実施できる。

上記検討及び以下の詳細な説明も、ｐ５３Ｓを結合した固相がｐ５３抗原に特異 的でＩＪいイムノグロブリンと交叉反応するエピトープを有しない場合、第一ア ッセイは確認アッセイを実施しないで本ｐ５３Ｓと首尾よく用いることができる 。

第−及び確認アッセイを一般的に記載したので、次に酵素イムノアッセイ（ＥＩ Ａ）フォーマントで用いられるアッセイの特異的実施例を述べる。

１、ＥＩΔフォーマットを用いるｐ５３自己自己−第一アッセイ（＋）イムロン −１１ミクロタイタープレート（グイナテソク・ラボラトリーズ・インコーボレ イテノ１、チャンティリイ、■△）を：）７゛″Ｃで２時間ウェル当り１００ｄ の被覆溶液で被覆した。被覆溶液は、０．０５Ｍ炭酸水素／炭酸ナトリウム、ｐ Ｈ９，４中、０．２ｐｇ／ｍ１組換えヒト野生型ｐ５３蛋白を含有した。組換え ｐ５３はモノクローナル抗体ＰＡｂ１８ｏ１、ＰＡｂ２４０及びＰＡｂ４２１　 （ｔンコノン・サイエンシズ・インコーホレイテッド、ユニオンディル、Ｎ、Ｙ 、からそれぞれηタログ番号Ａｂ−２、Ａｂ−３及びＡｂ−１）を結合する。コ ーチングインキュベー／Ｂン後、ウェルを洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢ Ｓ）中、０゜０５％ツイーン２０，０．０１％ＳＤＳ及び０．０１％チメロサー ル）で３回洗浄した。次いでウェルは、ウェル当り２００１１１の、０．０１Ｍ 炭酸水素／炭酸ナトリウム、ｐＨ９，４中１％ウン血清アルブミン（ＢＳＡ）で ３７℃で１時間、保護液Ｑ［（ｏｖｅｒｃｏａｔ）　した。保護被覆段階後、ウ ェルを上記したように洗浄した。

（２）次いでウェルに、検体希釈液中１ｏｏｏ倍希釈した１ｏｏｔ＋１の血清検 体を加えた。これらの血清検体は、臨床上の症状を伴わない患者、良性状態の患 者及び種々の癌を有する患者に由来した。検体希釈液は吐■６，８で、緩衝剤と してＰＢＳ及びトリスを、金属キレート剤としてエチレングリコール−ビス（β −アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）及びエチ レンジアミン四酢９　（ＥＤＴＡ）を、ヒトイムノグロブリンの非特異的結合を 最小にするデターノエントとしてツイーン２０を、防腐剤としてナトリウムアン ドを、蛋白安定剤として並びに非特異的結合を最小にするためにウシ胎児血清及 び正常ヤギ血清を含有した。各希釈検体は反復実験で試験した。又、反復実験ウ ェルは、１゜Ｏμｌの検体希釈液を加え、「背景」ノブナル、１００μｌの低ポ ンチイブコントロール及び１００μｍの高ポジティブコノトロールのみを与えた 。ポジティブコントロールは、検体希釈液に希釈され、ＥＩＡでそれぞれ「低」 陽性値と「高」陽性値を与えるｐ５３自己自己−陽性の専用（ｄｅｄｉｃａｔｅ ｄ）血清検体であった。全試料をウェルに加えた後、プレー１−を覆い、室温で 一晩（１６−１８時間）インキュベートした。

（３）−晩インキュベーション後、ウェルを洗ｔＩＩ緩衝液で４回６Ｌｉ″Ｆｌ 、た。次いでウェルに１００μｌの接合溶１１ｋを加えた。接合溶液は、ｐｉ− １７，２の抱合体希釈液中、０．２ｎ／ｍｌのＡ・キ抗ヒｌ　ＩｇＧ　（ｌｌ＋ Ｌ）−西洋ワサビペルオキ／ダーゼ抱合体（カタログ番号０４−１０−０６、カ ークガード・アンド・ペリイ）であった。抱合体希釈液は、緩衝剤としてＰＢＳ 及びＨＥＰＥＳを、防腐剤としてベンノルアルコールを、データジエントとして トリトン×１００を、蛋白安定剤として及び非特異的結合を最小にするためにウ シ胎児血清及び正常ヤギ血清を含有した。

プレートは、３７℃で２時間インキュベートした。抱合体インキュベーション後 、ウェルを上記のように４回洗浄した。

（４）洗浄後、ウェルに１００１１１のＯＰＤ　（オフエニレンジアミン−２Ｈ Ｃ１）基質溶液を加えた。ＯＰＤ基質溶液は、５ｍｌのＯＰＤについての希釈液 （インビトロ試験番号５６９５、アボット・ラボラトリーズ、アボンド・パーク 、ＩＬ）当り１　ＯＰＤ錠（インビトロ試験番号７１８１Ｅ、アボット・ラボラ トリーズ、アボット・パーク、ＩＬ）を溶解することにより調製した。プレート は室温で３０分間、暗所でインキュベートし、その後、ウェル当り１００μｍの ＩＮ硫酸を加えた。ウェルの吸収をミクロプレート・オートリーダー（＃ＥＬ３ １０、バイオ−チック・インスティチューツ、バーリントン、ＶＴ）を用い４９ ２ｎｍで読み取った。

（５）各試料の反復実験吸収値の平均を計算した。平均「背景」シグナルを各試 料平均ノブナルから引き、背景吸収を補正した。補正試料吸収を低ボッチイブコ ントールの補正吸収で割った。これらの結果は、１０００倍希釈で試験した血清 検体の単位／１１１でのｐ、５３自己抗体値を与えた。１０００倍希釈で目盛外 読み取りを与えた血清検体は、さらに希釈して目盛内読み取りを与え、読み取り を再″Ａ製して１０００倍希釈の単位／ｍｌ値を表すようにした。

（６）０．４２７単位／ｍｌのカソトフ値を、７３正常血清検体の平均プラス４ 標準偏差である第一アッセイについて確立した。０．４２７単位／ｍｌと等しい か又はより大きい値を与える血清検体をｐ５３自己自己−陽性と記録し、アッセ イの結果を以下の表２に示す。

表２ 陽性検体は０．４３３−７６１単位／ｍｌに及ぶ。

将来のアッセイてのカノトフ値は、試験した正常血清の数とそのような正常血清 が得られる群に依存して異なりうる。好ましくは、多数の正常血清が用いられ、 そして血清は試験されたｔ者群の代表である正常固体から得られる。図４は、３ ４名の正常個体、５０名の直腸癌、４３名の肺癌及び３２名の乳癌患者の群につ いてのｐ５３自己抗体値の例を示す。本検体群において、陽性ｐ５３自己抗体値 は、０４２７単位／ｍ１カソトフ値より以上から８．２単位／ｍｌに及ぶ。

ｎ、ＥＩＡフォーマントを用いる確認アッセイ（１）上記した第一アソセイてｐ ５３自己抗体に陽性と試験された血清検体を確認アッセイての試験に付した。確 認試験操作は、（上記第一アッセイの段階２の）血清検体の調製以外は、上記Ｅ ＩＡ−次アソセイのものと実質的に同じであった。

血清検体を記載のように１０００倍に希釈したが、癌細胞系抽出物を２ｍｇ／ｍ ｌ抽出蛋白の最１！濃度に添加した。低及び高ポジティブコントロールを含む各 血清検体は２つの異なる細胞抽出物のいずれかの存在でこの方法を試験した。− 細胞抽出物は５Ｗ６２０細胞（ライボヒス等、キャンサー・リサーチ３６　：　 ４５６２−４５６９（１９７６）　細胞系は寄託され、ＡＴＣＣＣＣＬ２２７と 称され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシヨン、ロックヒル、ＭＤよ り入手可能）から調製した。本細胞系は、−次直腸癌のリンパ節透過因子から誘 導され、コドン２７３てヒスチ／／残基がアルギニン残基と置換したミュータン ｔ−ｐ５３蛋白を発現する。他の抽出物は、５ａｏｓ−２細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ ８５と称され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、 ＭＤより入手可能）から調製した。本細胞系は骨肉腫から誘導され、両ｐ５３遺 伝子が欠けているので、それはいずれのｐ５３蛋白も発現しない。

（２）上記細胞抽出物は、以下のように：Ａ製した　新鮮な生育細胞を７＠ＰＢ Ｓ中て３回洗浄した。洗浄細胞を玲溶解緩衝液中、５０Ｘ１０’細胞／ｍｌて竪 濁した。（溶解緩衝液は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，２，５ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０５％ノニデノトＰ−４０（ＮＰ−４０、ノグマ・ ケミカル・カンパニイ、セ／ト・ルイス、ＭＯから商業的に入手可能ン、１＋ｎ Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１μＲ／ｌｌ１ｌアプ ロチニン、１ｇｇ／ｍ１０イベプチン、５＋＋Ｍ　ＮａＦ及び１ｍＭＮη０４Ｖ である。）細胞響濁液は１５秒間超音波処置し、次いで＋００．０ＯＯＸ　ｇで １時間遠心した。上清を注意しながら取り、細胞抽出物として用いた。抽出物の 蛋白をブランドフォード蛋白方法（カタログ番号５００−０００６、バイオ−ラ ド・ラボラトリイーズ、リッチモンド、ＣＡ）により測定した。

（３）希釈血清検体を細胞抽出物の存在でウェルに加え、ＥＩＡを一部アッセイ について上記したように（即ち、−次アソセイの段階２から４）完成させた。

確認ＥＴＡの原理は、血清検体がｐ５３に特異的な自己抗体を含むと、ＳＷ６２ ０抽出物は５ａｏｓ−２抽出物に比べＥＩＡ値を有意に減少するということであ る。

それは、ウェル上に被覆された組換えｐ５３蛋白へのｐ５３自己抗体の結合を特 異的に阻害する、５Ｗ６２０抽出物中のミュータントル５３蛋白である。Ｓ　ａ ｏｓ〜２抽出物は、それがウェル上に被覆された組換えｐ５３蛋白に結合してい る自己抗体に競合するｐ５３蛋白を含まないので、効果がないであろう。血清検 体がウェル上に被覆された組換えｐ５３蛋白と交叉反応するイムノグロブリンを 含むと、５Ｗ６２０抽出物は５ａｏｓ−２抽出物に比べてＥＩＡ値を有意に減少 しないであろう。

（４）確認ＥＩＡを行った後、５Ｗ６２０及び５ａｏｓ−２抽出物の存在て試験 した各血清検体についての単位／ｍｌのｐ５３自己抗体値を一部アッセイの段階 ５で上記したように計算した。−修飾は、全ての修正試料吸収を単位／ｍ１ｐ５ ３自己抗体を得るために５ａｏｓ−２抽出物の存在で試験された低ポジティブコ ントロールの修正吸収で割ったものであった。各血清検体について、５Ｗ６２０ 抽出物の存在での単位／ｍ１ｐ５３自己抗体を、５ａｏｓ−２抽出物の存在での 単位／１Ｉｌｐ５３自己抗体値から引いた。この差を５ａｏｓ−２抽出物の存在 での血清検体の単位／ｌｌ１ｌｐ５３自己抗体値て割り、１００倍して阻止％を 得た。血清検体は、５０−１００％阻止が駅察された場合、ｐ５３自己抗体につ いての真の陽性を記録した。表３は、最初に試験した結果が陽性である検体の確 認アッセイの結果をまとめている。

表３ 祥つかの血清Ｉ＆体は、確認アッセイで試験したとき、３０−５０％阻止を示し た。この範囲の阻止は、それが特異的ｐ５３自己抗体を示すのがどうかを決定す るためさらに研究を要するであろう。

図５は、正常検体を除き、ｐ５３自己抗体についての一部アッセイで試験の結果 が７．Ｈ（ｉてあった幾つかの固体検体についての確認Ｅｌへの結果を示す。肺 良性及びＧｌ良性を示した２つの良性検体は、５ａｏｓ−２抽出物の存在て、そ れぞれ１３２及び１１００単位／ｍｌのｐ５３自己抗体値を与えた。これらの値 はＳＷ６２　（１抽出物の存在で減少せず、従ってこれらは偽の陽性であると確 認した。迎に、３つの癌検体の値は５Ｗ６２０抽出物の存在で減少率により示さ れるように有！に４ｇ・し、それらが真の陽性であることを証明した。

前述の実施例は本発明を明らかにするものであり、限定するものと解すべきでテ ｉＬ・。発明はその中に含まれるべき請求のｔｉ！［！ＩＩに相当する以下の請 求の範囲により明らかにされるっ 田− ■田／′ＩＡ庸　零■２目ε（ｉｄ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (59)

【特許請求の範囲】
1. １．患者から腫瘍細胞の試料を収集すること、次いで該腫瘍細胞中のコンプレッ クスの存在を検出すること（該コンプレックスはｐ５３蛋白と７０キロダルトン 熱ショック蛋白（ｈｓｐ７０）を含有した）、を含む、そのような腫瘍細胞を有 する患者の血清ｐ５３自己抗体を生成する能力について腫瘍細胞を分類する方法 であって、該コンプレックスの存在は該腫瘍細胞が該患者内で、血清ｐ５３自己 抗体を惹起することが可能であることを示す。
2. ２．該検出段階を共免疫沈降により実施する、請求項１の方法。
3. ３．該検出段階を該患者から該腫瘍を除去する段階と同時に又は後で実施する、 請求項１の方法。
4. ４．該検出段階を、該腫瘍について患者を処置する前に腫瘍細胞の存在を測定す るために実施する、請求項１の方法。
5. ５．該検出段階を血清ｐ５３自己抗体の出現について患者をモニターする段階に 続いて行う請求項１の方法であって、該自己抗体の出現は、該患者内で該腫瘍細 胞の生育を示す。
6. ６．該腫瘍細胞が上皮起原のものである、請求項１の方法。
7. ７．該腫瘍細胞が結腸直腸、肺、乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択され る、請求項１の方法。
8. ８．患者の細胞中に７０キロダルトン熱ショック蛋白（ｈｓｐ７０）とコンブレ ックスを形成する能力を有するミュータントｐ５３蛋白を発現する腫瘍細胞を検 出することにより患者の腫瘍を診断する方法であって、その方法は該患者から生 物学的液の試料を収集すること、次いで該生物学的液中のｐ５３自己抗体を検出 することを含み、該生物学的液中ｐ５３自己抗体の存在は、該腫瘍細胞がｈｓｐ ７０とコンプレックスを形成する能力を有するミュータントｐ５３蛋白を含むこ とを示す。
9. ９．該生物学的液が血清、血液血漿及び腹水からなる群から選択される、請求項 ８の方法。
10. １０．該生物学的液が血清及び血液血漿からなる群から選択される、請求項８の 方法。
11. １１．該腫瘍細胞が結腸直腸、肺、乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択さ れる、請求項８の方法。
12. １２．該腫瘍細胞が乳癌腫瘍細胞である、請求項８の方法。
13. １３．該患者が該腫瘍細胞を有すると既に診断されている、請求項８の方法。
14. １４．該患者が既に該腫瘍細胞を有すると診断されており、該腫瘍細胞の数を減 少させる処置が行われている、請求項８の方法。
15. １５．該検出段階が、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ及び酵素イムノ アッセイからなる群から選択されるアッセイにより実施される、請求項８の方法 。
16. １６．腫瘍細胞を有する患者に、より攻撃的な疾病を住じさせる能力を有する腫 瘍細胞を識別する方法であって、その方法は、該患者から生物学的液の試料を収 集すること、次いで該生物学的液中のｐ５３自己抗体を検出することを含み、該 生物学的液中ｐ５３自己抗体の存在は、該腫瘍細胞が大きな腫瘍形成潜在力を有 し、より攻撃的な疾病を生じさせる能力を有することを示す。
17. １７．該生物学的液が血清、血液血漿及び腹水からなる群から選択される、請求 項１６の方法。
18. １８．該生物学的液が血清及び血液血漿からなる群から選択される、請求項１６ の方法。
19. １９．該腫瘍細胞が結腸直腸、肺、乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択さ れる、請求項１６の方法。
20. ２０．該患者が該腫癌細胞を有すると既に診断されている、請求項１６の方法。
21. ２１．該患者が既に腫瘍細胞を有すると診断されており、該腫瘍細胞の数を減少 させる処置が行われている、請求項１６の方法。
22. ２２．該検出段階がラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ及び酵素イムノア ッセイからなる群から選択されるアッセイにより実施される、請求項１６の方法 。
23. ２３．患者から生物学的液の試料を収集すること、次いで該生物学的液のｐ５３ 自己抗体を検出することを含み、 該生物学的液中ｐ５３自己抗体の存在は、該患者内で該腫瘍細胞の数が増加した ことを示す、腫瘍細胞を有すると既に診断されており、患者は核腫瘍細胞の数を 減少させる処置を既に受けている患者の疾病の再発を検出する方法。
24. ２４．該処置が該生物学的液中のｐ５３自己抗体の量を減少させるのに有効であ る、請求項２２の方法。
25. ２５．該収集段階が複数の時期に繰り返され、疾病の再発をモニターすることを 続ける、請求項２３の方法。
26. ２６．該収集段階が該処置後少なくとも６週間に実施される、請求項２３の方法 。
27. ２７．該収集段階が該処置後少なくとも６カ月に実施される、請求項２３の方法 。
28. ２８．該処置の前に該患者のｐ５３自己抗体を検出する段階をさらに含む、請求 項２３の方法。
29. ２９．該腫瘍細胞が該細胞中７０キロダルトン熱ショック蛋白とコンプレックス を形成しうるミュータントｐ５３蛋白を含む、請求項２３の方法。
30. ３０．該生物学的液が血清、血液血漿及び腹水からなる群から選択される、請求 項２３の方法。
31. ３１．該生物学的液が血清及び血液血漿からなる群から選択される、請求項２３ の方法。
32. ３２．該腫瘍細胞が直腸結腸、肺、乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択さ れる、請求項２３の方法。
33. ３３．該検出段階がラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ及び酵素イムノア ッセイからなる群から選択されるアッセイにより実施される、請求項２３の方法 。
34. ３４．患者から生物学的試料を収集すること、次いで該生物学的試料中のｐ５３ 自己抗体を検出することを含み、該生物学的試料中ｐ５３自己抗体の存在は、該 患者が腫瘍のより積極的な形放を食むことを示す、腫瘍細胞を有するとまだ診断 されていない患者の攻撃的疾病を検出する予知方法。
35. ３５．該生物学的試料が血清、血液血漿、腹水及び組織からなる群から選択され る、請求項３４の方法。
36. ３６．該生物学的試料が血清及び血液血漿からなる群から選択される、請求項３ ４の方法。
37. ３７．該腫瘍細胞が直腸結腸、肺・乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択さ れる、請求項３４の方法。
38. ３８．該検出段階がラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ及び酵素イムノア ッセイからなる群から選択されるアッセイにより実施される、請求項３４の方法 。
39. ３９．患者から生物学的試料を収集すること、次いで該生物学的試料中のｐ５３ 自己抗体を検出することを含み、該生物学的試料中のｐ５３自己抗体の存在が該 患者が腫瘍細胞を含むことを示す、患者の癌を検出する予知方法。
40. ４０．該生物学的試料が血清、血液血漿、腹水及び組織からなる群から選択され る、請求項３９の方法。
41. ４１．該生物学的試料が血清及び血液血漿からなる群から選択される、請求項３ ９の方法。
42. ４２．該腫瘍細胞が直腸結腸、肺、乳及び子宮癌腫瘍細胞からなる群から選択さ れる、請求項３９の方法。
43. ４３．該検出段階がラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ及び酵素イムノア ッセイからなる群から選択されるアッセイにより実施される、請求項３９の方法 。
44. ４４．該ｐ５３自己抗体の存在が、患者はｐ５３変異により生じた腫瘍を有する と診断された患者よりも腫瘍のより積極的形成を示すが、ミュータントｐ５３は ｐ５３自己抗体反応を惹起しないことを示す、請求項３９の方法。
45. ４５．患者の自己抗体を検定することにより癌の攻撃性を評価する方法であって 、ｐ５３自己抗体の存在は、より攻撃的な癌を示す。
46. ４６．（ａ）試料をｐ５３抗原（ｐ５３Ｓ）、抗ヒトイムノグロブリン抗体（∂ ＩｇＧ）及び遊離ｐ５３抗原（ｐ５３Ｃ）を結合した固相に十分な時間さらして ｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝を含むコンプレックスを形成させる 第一試験を実施すること（ｐ５３Ｃはｐ５３蛋白に特異的でないヒトイムノグロ ブリンと交叉反応しなし、）、 （ｂ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスの量を測定す ること、（ｃ）試料をｐ５３抗原（ｐ５３Ｓ）及び抗ヒトイムノグロブリン（∂ ＩｇＧ）を結合した固相に、遊離ｐ５３抗原（ｐ５３Ｃ）の不存在で十分な時間 さらして｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝を含むコンプレックスを形 成させる第二試験を実施すること、並びに （ｄ）段階（ｃ）の｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックス の量を測定すること及びこの量を段階（ｂ）のそれと比較することの段階を含む 、ヒト生物学的液中のｐ５３自己抗体を定量するイムノアッセイ。
47. ４７．（ａ）試料をｐ５３抗原（ｐ５３Ｓ）及び抗ヒトイムノグロブリン抗体（ ∂ＩｇＧ）を結合した固相に十分な時間さらして｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（ ∂ＩｇＧ）｝を含むコンプレックスを形成させ、本コンプレックスの量を測定す ること、（ｂ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスの量 が或るカットフレベル以上の場合は、試料を抗原（ｐ５３Ｓ）、抗ヒトイムノク ロブリン抗体（∂ｌｇＧ）及び遊離ｐ５３（ｐ５３Ｃ）を結合した固相に十分な 時間さらして｛ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝を含むコンプレックスを 形成させること（ｐ５３Ｃはｐ５３蛋白に特異的でないヒトイムノグロブリンと 交叉反応しない）、の段階を含む、ヒト生物学的液中のｐ５３抗体（∂ｐ５３） を検出又は定量するイムノアッセイ。
48. ４８．段階（ｂ）の｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５−３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレック スの量を測定すること、及びこの量を段階（ａ）のそれと比較すること、の段階 をさらに含む、請求項４７のイムノアッセイ。
49. ４９．（ｃ）第二試験を段階（ｈ）の試験と同時に実施すること（第二試験の試 料はｐ５３抗原（ｐ５３Ｓ）、抗ヒトイムノグロブリン（∂ＩｇＧ）を結合した 固相に、遊離ｐ５３抗原（ｐ５３Ｃ）の不存在で十分な時間さらして｛（ｐ５３ Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝を含むコンプレックスを形成させる）、並びに （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）の｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コン プレックスの量を測定し、そしてこれらの量を比較すること、の段階をさらに含 む、請求項４７のイムノアッセイ。
50. ５０．ｐ５３Ｓ及びｐ５３Ｃが、野生型又はミュータント全長天然或いは組換え ｐ５３蛋白及びｐ５３抗体により主に認識される天然、組換え、又は化学合成ポ リペプチド或いはペプチド断片よりなる群から選択される、請求項４６のイムノ アッセイ。
51. ５１．ｐ５３Ｃが野生型又はミュータントｐ５３蛋白を発現する天然に生じる細 胞又は細胞系から得られる、請求項５０のイムノアッセイ。
52. ５２．Ｐ５３Ｃが細胞系ＳＷ６２０又はＴ−４７Ｄにより生成される、請求項５ ０のイムノアッセイ。
53. ５３．ｐ５３Ｓが組換え野生型ｐ５３である、請求項５２のイムノアッセイ。
54. ５４．（ａ）∂ＩｇＧが検出用に標識される、（ｂ）ｐ５３Ｓ及びｐ５３Ｃは同 時又は連続的に試料とインキュベートし、ｐ５３Ｓ又はｐ５３Ｃは、いずれも他 方の前にインキュベートできる、（ｃ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ ）｝コンプレックスの測定は、非コンプレックス化∂ｐ５３、ｐ５３Ｃ及び∂Ｉ ｇＧを｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスから分離した 分離段階後に実施する、請求項４６のイムノアッセイ。
55. ５５．生物学的液が血清、血液血漿及び腹水からなる群から選択される、請求項 ４６のイムノアッセイ。
56. ５６．（ａ）∂ＩｇＧが検出用に標識される、（ｂ）ｐ５３Ｓ及びｐ５３Ｃは同 時に又は連続的に試料とインキュベートし、ｐ５３Ｓ又はｐ５３Ｃは、いずれも 他方の前にインキュベートできる、（ｃ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂Ｉｇ Ｇ）｝コンプレックスの測定は、非コンプレックス化∂ｐ５３、ｐ５３Ｃ及び∂ ＩｇＧを｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスから分離し た分離段階後に実施する、請求項４９のイムノアッセイ。
57. ５７．（ａ）生物学的液試料を癌であることが推測される患者から得ること、（ ｂ）試料をｐ５３抗原（ｐ５３Ｓ）及び抗ヒトイムノグロブリン抗体（∂ＩｇＧ ）を結合した固相に十分な時間さらして｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ ）｝を含むコンプレックスを形成させること（ｐ５３Ｓはｐ５３に特異的でない ヒトイムノグロブリンと交叉反応しない）、並びに （ｃ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスの量を測定す ること、の段階を含む、癌検出のイムノアッセイ。
58. ５８．（ａ）∂ＩｇＧが検出用に標識される、そして（ｂ）｛（ｐ５３Ｓ）（∂ ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスの測定は、非コンプレックス化∂ｐ５３ 及び∂ＩｇＧを｛（ｐ５３Ｓ）（∂ｐ５３）（∂ＩｇＧ）｝コンプレックスから 分離した分離段階後に実施する、 請求項５７のイムノアッセイ。
59. ５９．生物学的液が血清、血液血漿及び腹水からなる群から選択される、請求項 ５８のイムノアッセイ。