RU2636532C2 - Улучшенные способы иммуноанализа - Google Patents
Улучшенные способы иммуноанализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2636532C2 RU2636532C2 RU2010149267A RU2010149267A RU2636532C2 RU 2636532 C2 RU2636532 C2 RU 2636532C2 RU 2010149267 A RU2010149267 A RU 2010149267A RU 2010149267 A RU2010149267 A RU 2010149267A RU 2636532 C2 RU2636532 C2 RU 2636532C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- autoantibodies
- cancer
- titration
- Prior art date
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 256
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 255
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 255
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 91
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 27
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 58
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 36
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 18
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 18
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 14
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 67
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 67
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 89
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 66
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 55
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 51
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 51
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 49
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 41
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 38
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 38
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 38
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 37
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 37
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 37
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 29
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 29
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 29
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 28
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 26
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 25
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 25
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 23
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 22
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 12
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 12
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 12
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 11
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 9
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 101100206185 Arabidopsis thaliana TCP18 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100206195 Arabidopsis thaliana TCP2 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100004651 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) brc1 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000009261 endocrine therapy Methods 0.000 description 5
- 229940034984 endocrine therapy antineoplastic and immunomodulating agent Drugs 0.000 description 5
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 4
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000037396 Intraductal Noninfiltrating Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010073094 Intraductal proliferative breast lesion Diseases 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000005000 autoimmune gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000020176 autoimmune hypoparathyroidism Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 208000028715 ductal breast carcinoma in situ Diseases 0.000 description 2
- 201000007273 ductal carcinoma in situ Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 2
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100111629 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 101150028578 grp78 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000009607 mammography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000007392 microtiter assay Methods 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012950 reanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для обнаружения антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость организма субъекта-млекопитающего. При этом указанное антитело направлено на чужеродный антиген, введенный в указанного субъекта-млекопитающего. Способ включает стадии: (а)приведение тестируемого образца в контакт со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении антитела, (b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена стадии (а), и (c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (а). На присутствие в тестируемом образце антитела указывает в основном S-образная или сигмовидная кривая. Изобретение обеспечивает выявление антител, в качестве биологических маркеров болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию. 9 з.п. ф-лы, 15 ил., 6 табл., 7 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
В целом изобретение относится к области диагностических или прогностических анализов, в частности к оптимизации анализов для выявления антител в образце, содержащем жидкость организма пациента, где такие антитела используют в качестве биологических маркеров болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Многие диагностические, прогностические анализы и/или анализы для наблюдения основаны на выявлении биологического маркера конкретного болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию. Такие биологические маркеры представляют собой обычные белки или полипептиды, характерные для конкретного заболевания или связанные с предрасположенностью к заболеванию.
В последние годы стало очевидно, что антитела, а особенно аутоантитела, также могут служить в качестве биологических маркеров заболевания или предрасположенности к заболеванию. Аутоантитела представляют собой природные антитела, направленные против антигена, который иммунная система индивида распознает как чужеродный, даже если этот антиген на самом деле образовался у индивида. Они могут находиться в кровотоке в виде циркулирующих свободных аутоантител или в виде циркулирующих иммунных комплексов, состоящих из аутоантител, которые связаны с их маркерным белком-мишенью. Различия между белком дикого типа, экспрессируемым "нормальными" клетками, и измененной формой белка, продуцируемой пораженной заболеванием клеткой или в процессе заболевания, могут в некоторых случаях приводить к тому, что измененный белок распознается иммунной системой индивида как "чужеродный", и, таким образом, у этого индивида развивается иммунная реакция. Это может быть гуморальная (т.е. опосредуемая B-клетками) иммунная реакция, приводящая к продукции аутоантител, которые иммунологически специфичны в отношении измененного белка.
В WO 99/58978 описаны способы выявления/диагностики рака на основе оценки иммунной реакции индивида на два или более различных маркеров опухоли. Как правило, эти способы включают в себя контактирование полученного у индивида образца жидкости организма с набором из двух или более различных антигенов, являющихся маркерами опухоли, где каждый получен из отдельного белка-маркера опухоли, и регистрацию образования комплексов антигенов-маркеров опухоли, связанных с циркулирующими аутоантителами, которые иммунологически специфичны в отношении белков-маркеров опухоли. Присутствие таких циркулирующих аутоантител рассматривают как указание на наличие рака.
Анализы, посредством которых у индивида измеряют иммунную реакцию на наличие белка-маркера опухоли на уровне продукции аутоантител, представляют собой альтернативу непосредственному измерению или выявлению белка-маркера опухоли в жидкостях организма. В основном такие анализы связаны с косвенной регистрацией присутствия белка-маркера опухоли. По-видимому, вследствие природы иммунной реакции образование аутоантител может быть вызвано очень небольшим количеством циркулирующего белка-маркера опухоли, и, соответственно, косвенные способы на основе регистрации иммунной реакции на маркеры опухоли являются более чувствительными, чем способы прямого измерения количества маркеров опухоли в жидкостях организма. Поэтому способы анализа на основе регистрации аутоантител могут представлять особую ценность в начале процесса заболевания, а также, возможно, и в отношении отбора пациентов с отсутствием симптомов, например в отборе для выявления в популяции индивидов с отсутствием симптомов, обнаруживаемых у тех индивидов, которые "имеют риск" развития заболевания, для выявления в популяции индивидов с отсутствием симптомов тех индивидов, у которых развилось заболевание. Кроме того, способ на основе регистрации аутоантител может представлять особую ценность в начале процесса заболевания, а также, возможно, его можно использовать для выявления в популяции индивидов с симптомами тех индивидов, у которых развилось заболевание. Кроме того, способы могут быть эффективны для более раннего выявления повторного заболевания. Также способы анализа могут представлять ценность для выбора или наблюдения за вариантами лечения заболевания.
Также антитела и аутоантитела могут служить в качестве биологических маркеров других состояний заболевания или предрасположенности к заболеваниям, только лишь примерами которых являются ревматоидный артрит, системная красная волчанка (SLE), первичный билиарный цирроз (PBC), аутоиммунный тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото), аутоиммунный гастрит (например, злокачественная анемия), аутоиммунное воспаление надпочечников (например, болезнь Аддисона), аутоиммунный гипопаратиреоз, аутоиммунный диабет (например, диабет типа 1), тяжелая миастения.
Авторы настоящего изобретения выявили, что когда анализы на основе регистрации антител используют в диагностических или прогностических целях для оценки болезненного состояния, развития заболевания или предрасположенности к заболеванию у индивида в популяции, то могут возникать сложности в разработке стандартизированного способа анализа, приемлемого в целом для популяции индивидов, подлежащих скринингу, поскольку абсолютные количества присутствующего антитела значительно отличаются от индивида к индивиду. Это может приводить к высокой частоте ложноотрицательных результатов, например, среди индивидов с низким количеством антитела. Сходным образом, существует проблема количественной оценки истинных положительных результатов, поскольку различия в абсолютных количествах антитела от индивида к индивиду обуславливают сложность установления порогового значения для положительного результата анализа, которое было бы приемлемым для всех индивидов в популяции, подлежащей скринингу.
К настоящему времени авторы настоящего изобретения определили, что проведение, а более конкретно, клиническое использование и достоверность, анализов на основе выявления антител, особенно аутоантител как биологических маркеров заболевания, можно значительно улучшить посредством включения стадии титрования антигена. Тестирование образца, в котором предполагается наличие антител против серий различных количеств антигена, и построение кривой титрования дает возможность достоверно выявить истинные положительные результаты скрининга, независимо от абсолютного количества антитела, присутствующего в образце. Такой способ отличается от способов предшествующего уровня, в которых антиген титровали только для построения калибровочной кривой, позволяющей установить наиболее подходящие концентрации антигена, которые следует использовать для выявления антител в настоящих образцах от пациентов. В этих способах для фактической диагностики предложено измерение только одной точки. Таким образом, эти способы не позволяют определить различие в количествах антитела от индивида к индивиду, что, как было сказано, приводит к возникновению ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что описанный в настоящей заявке способ титрования антигена согласно изобретению имеет более высокую специфичность и чувствительность, чем измерение реактивности аутоантител при одной концентрации антигена, или чем способы, в которых титруют образец сыворотки, а не антиген.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте изобретение относится к способу выявления болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию у млекопитающего, где способ включает в себя выявление антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма указанного млекопитающего, где указанное антитело является биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ включает в себя
(a) контактирование указанного тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,
(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена,
(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a), и
(d) определение наличия или отсутствия указанного болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию на основе величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена для каждой отдельной используемой концентрации антигена.
Во втором аспекте изобретение относится к способу выявления антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма млекопитающего, где указанное антитело направлено против чужеродного вещества, введенного в организм указанного млекопитающего, где способ включает в себя
(a) контактирование тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,
(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена, и
(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a).
В третьем аспекте изобретение относится к способу выявления антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма млекопитающего, где указанное антитело представляет собой биологический маркер болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ включает в себя
(a) контактирование тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,
(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена, и
(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a).
Предпочтительно во всех аспектах изобретения, чтобы млекопитающим являлся человек.
Предпочтительно во всех аспектах изобретения, чтобы способ осуществлялся in vitro для тестируемого образца, содержащего жидкость организма, извлекаемую или получаемую у млекопитающего.
Особым свойством изобретения во всех его аспектах является то, что решение относительно наличия или отсутствия соответствующего антитела в тестируемом образце основано на величине специфического связывания, наблюдаемой для каждой отдельной тестируемой концентрации антигена, иначе говоря, на совокупных величинах, а не только на считывании при одной концентрации. Таким образом, определение наличия или отсутствия болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию или антител против чужеродного вещества в образце от пациента можно осуществлять на основе непосредственно этих совокупных величин. Предпочтительно, чтобы оценка осуществлялась на основе обычно S-образной или сигмовидной кривой, когда строят график зависимости величины специфического связывания от количества антигена. Как очевидно из представленных в настоящей заявке примеров, авторами изобретения было выявлено, что способы титрования антигена согласно изобретению имеют более высокую специфичность и чувствительность, чем способы диагностики или регистрации, основанные на единичном считывании, а также снижают частоту ложноположительных и ложноотрицательных определений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1: измерение количества аутоантител в сыворотке с использованием кривой титрования антигена. Сыворотка 17766(C) от пациента с раком в значительной степени связывает тестируемый антиген с характерной сигмовидной кривой 
, но не связывается с отрицательным контролем, VOL 
. В сравнении с этим, сыворотка от здорового индивида, 18052(N), не связывается с тестируемым антигеном 
или с отрицательным контролем 
.
Фиг.2: сравнение уровней аутоантитела против p53 у здоровых индивидов и пациентов с первичным раком молочной железы (PBC), как измерено с использованием анализа титрования антигена. Уровни аутоантитела выражены в виде разности величины OD650, обусловленной связыванием с тестируемым антигеном (p53), и величины OD650, обусловленной связыванием с отрицательным контролем. Нормальный уровень (-----) рассчитывали как среднее значение плюс 2 стандартных отклонения для обычной популяции.
На фиг.3 представлено сравнение уровней аутоантител против p53 и NY-ESO у здоровых индивидов и пациентов с раком легких, как измерено с использованием анализа титрования антигена. Уровни аутоантител выражены в виде разности величины OD650, обусловленной связыванием с тестируемым антигеном (p53 или NY-ESO), и величины OD650, обусловленной связыванием с отрицательным контролем. Нормальные отсекаемые уровни (-----) рассчитывали как среднее значение плюс 2 стандартных отклонения для обычной популяции.
На фиг.4 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против p53 и NY-ESO в образце асцитной жидкости, полученной у пациента с раком молочной железы. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против c-myc.
На фиг.5 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против BRCA1, BRCA2 и HER2 в образце сыворотки от пациента с раком молочной железы (карцинома протоков in situ).
На фиг.6 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO в образце сыворотки от пациента с раком легких. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против p53 или c-myc.
На фиг.7 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO и p53 в образце сыворотки от пациента с раком легких. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против c-myc.
На фиг.8(a) и 8(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования для аутоантител против p53, c-myc и NY-ESO-1 в образцах сыворотки от "здорового" индивида (т.е. индивида без признаков рака).
На фиг.9(a) и 9(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования, выполненных для образцов сыворотки от одного пациента с инвазивным раком молочной железы с использованием диапазона различных антигенов.
На фиг.10(a) и 10(b) представлены результаты анализов титрования, в которых образцы сыворотки от клинически нормального человека тестировали на наличие аутоантител с использованием биотинилированных антигенов BRCA2, HER2, c-myc и NY-ESO-1, небиотинилированного BRCA1 и контрольных продуктов экспрессии "пустого" вектора VOL, кодирующего биотиновую метку, но без дополнительного антигена.
На фиг.11 представлены результаты анализа аутоантител у пациента с первичным раком молочной железы с использованием анализа титрования антигена согласно изобретению в отношении антигенов p53, c-myc и NY-ESO-1 и контрольных продуктов экспрессии "пустого" вектора VOL.
На фиг.12 представлены результаты повторного анализа, представленного на фиг.11, но с использованием сыворотки от здорового индивида.
На фиг.13 представлены дополнительные результаты, полученные с использованием анализа титрования антигена в соответствии с данным изобретением для пациента с первичным раком молочной железы, у которого, однако, также наблюдают реакцию антител на биотин.
На фиг.14 на нормальных образцах представлены результаты экспериментального сравнения полученных при анализе регистрации аутоантител, когда антиген титруют в соответствии с изобретением, и при анализе регистрации аутоантител, когда количество антигена остается постоянным, а титруют сыворотку.
На фиг.15 представлены результаты экспериментального сравнения для образца от пациента с первичным раком молочной железы, полученные при анализе регистрации аутоантител, когда антиген титруют в соответствии с изобретением, и при анализе регистрации аутоантител, когда количество антигена остается постоянным, а титруют сыворотку.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В целом изобретение относится к способу иммуноанализа для выявления антитела, служащего биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ характеризуется тем, что образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, тестируют на предмет специфического связывания с различными количествами специфичного в отношении антитела антигена, и получают кривую титрования по связыванию антиген-антитело в зависимости от количества тестируемого антигена.
Общие характеристики иммуноанализов, например, ELISA, радиоиммунных анализов и т.п., хорошо известны специалистам в данной области (см. Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Как правило, иммуноанализы для выявления антител с конкретной иммунологической специфичностью требуют использования реагента (антигена), обладающего специфической иммунологической реактивностью в отношении тестируемого антитела. В зависимости от схемы анализа, этот антиген может быть иммобилизован на твердом носителе. Образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, приводят в контакт с антигеном, и если антитела требуемой иммунологической специфичности присутствуют в образце, то они иммунологически взаимодействуют с антигеном, образуя комплексы антиген-антитело, которые затем можно выявлять или измерять количественно.
Способ согласно изобретению характеризуется тем, что стандартизированный образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, тестируют против множества различных количеств антигена (также называемых в настоящей заявке сериями титрования). Образец тестируют против по меньшей мере двух, а предпочтительно, трех, четырех, пяти, шести или семи различных количеств антигена. Также обычные анализы могут включать отрицательный контроль, не содержащий какого-либо антигена.
В этом контексте термин "антиген" относится к веществу, содержащему по меньшей мере одну антигенную детерминанту или эпитоп, способный специфически взаимодействовать с антителом-мишенью, которое требуется выявить, или к любому веществу для захвата, специфически взаимодействующему с вариабельной областью или гипервариабельными участками указанного антитела. Как правило, антиген представляет собой природную или синтетическую биологическую макромолекулу, такую, например, как белок или пептид, полисахарид или нуклеиновая кислота, и может содержать антитела или их фрагменты, например антиидиотипические антитела.
Специалисты в данной области понимают, что в способе согласно изобретению количество антигенных детерминант или эпитопов, доступных для связывания с антителом-мишенью, является важным для получения серий титрования. Во многих схемах анализа количество доступных для связывания антигенных детерминант или эпитопов прямо связано с количеством присутствующих молекул антигена. Однако в других вариантах осуществления, например, в определенных системах твердофазного анализа, количество подвергающихся воздействию антигенных детерминант или эпитопов может не быть прямо связано с количеством антигена, а может зависеть от других факторов, таких как прикрепление к твердому носителю. В этих вариантах осуществления ссылки в настоящей заявке на "различные количества антигена" в сериях титрования могут относиться к различным количествам антигенной детерминанты или эпитопа.
Относительную или абсолютную величину специфического связывания антитела и антигена определяют для каждого отдельного используемого количества антигена (антигенной детерминанты или эпитопа) и применяют для построения или расчета кривой (относительной или абсолютной) величины специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого тестируемого количества антигена. Характерные результаты проиллюстрированы на прилагающихся фигурах, только с целью примера, в отношении выявления множества различных антител. Наличие в тестируемом образце антитела, которое реакционноспособно в отношении используемого в анализе антигена, определяют на основе величины специфического связывания, наблюдаемого для каждого количества антигена, и обычно указывают посредством, в основном, S-образной или сигмовидной кривой. Как правило, абсолютные величины специфического связывания антитела и антигена не являются вещественными, за исключением случая, когда требуется осуществить количественное измерение. Для простого определения да/нет в отношении наличия или отсутствия антител достаточно только получить кривую надлежащей формы. Если различие в выявляемых величинах связывания для различных тестируемых количеств антигена отсутствует, то это можно оценивать как отсутствие поддающегося выявлению количества антитела. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ не является количественным. Таким образом, он способен обеспечить определение да/нет в отношении наличия или отсутствия антитела при использовании безразмерного пропорционального соотношения, которое не зависит от интенсивности сигнала.
Оценку количества антитела, присутствующего в конкретном образце, можно, при необходимости, получать из результатов анализов титрования антигена.
Способ согласно изобретению предпочтителен для использования в клинических, диагностических, прогностических, предсказательных и/или контролирующих анализах, где абсолютные количества присутствующего антитела-мишени могут значительно отличаться от пациента к пациенту. Авторами настоящего изобретения было выявлено, что если такие анализы основаны на регистрации связывания антитела с использованием единственной величины количества/концентрации тестируемого антигена, то образцы от пациентов, содержащие антитело в количестве, которое находится у самой нижней или самой верхней границы нормального физиологического диапазона для количества антитела среди популяции, могут быть пропущены вследствие ограничений способа анализа; образцы с низким количеством антитела могут быть оценены как ложноотрицательные результаты, тогда как образцы с очень высокими уровнями антитела могут выходить за пределы шкалы точной регистрации для выбранного способа анализа.
Также способ анализа титрования согласно изобретению особенно эффективен для регистрации антител/аутоантител как биологических маркеров болезненного состояния или предрасположенности, где от пациента к пациенту существуют значительные различия в специфичности и аффинности антител/аутоантител в отношении антигена-мишени. По самой своей природе реакции аутоантител могут значительно различаться от пациента к пациенту, где различия возникают как в абсолютных количествах присутствующих аутоантител, так и в специфичности/аффинности аутоантител. В способе согласно изобретению может учитываться такое различие от пациента к пациенту, что, таким образом, обеспечивает возможность разработки стандартной схемы анализа для любого рассматриваемого антитела/аутоантитела.
Как правило, взаимодействия между аутоантителами и их антигенами-мишенями обладают низкой аффинностью, однако прочность связывания может различаться от пациента к пациенту, как указано выше. Способ согласно изобретению особенно эффективен для регистрации связывания с низкой аффинностью, поскольку положительный результат можно выводить из формы кривой титрования.
Также способ согласно изобретению обеспечивает защиту от различий от суток к суткам в проведении иммуноанализов, используемых для выявления аутоантител/антител в целях диагностики, прогнозирования и/или наблюдения (за состоянием заболевания или лечением). Часто наблюдают, что при проведении иммуноанализов для выявления антител в образцах, содержащих жидкости организма пациента, могут быть значительные различия величины сигнала от суток к суткам. Такое отличие может возникать, например, вследствие различий в способе получения и хранения образцов до тестирования. Такие факторы затрудняют достоверную количественную оценку результатов клинических анализов, например, на основе простой пороговой величины для связывания антитело/антиген. Настоящее изобретение минимизирует эффекты такого различия от суток к суткам, поскольку положительный результат в отношении наличия антитела четко виден из формы кривой титрования вне зависимости от величины сигнала.
Дополнительные преимущества способа согласно изобретению состоят в том, что он предоставляет возможность разведения образца от пациента, обеспечивая при этом достоверные результаты, а также в том, что, как правило, способ приводит к получению одинакового по качеству результата скрининга (положительного/отрицательного) при использовании жидкостей организма из различных источников из одного индивида (например, кровь или сыворотка в сравнении с асцитной жидкостью или плевральным выпотом), даже если абсолютная концентрация антител в различных жидкостях может отличаться.
Способ согласно изобретению можно осуществлять по любой приемлемой схеме, позволяющей контактирование образца, в котором предполагают наличие антитела, и антигена во множестве различных количествах. Удобно, что контактирование образца и различных количеств антигена можно осуществлять в отдельных, но параллельных реакционных камерах, таких как лунки планшета для микротитрования. Различные количества антигена можно наносить в лунки планшета для микротитрования посредством получения серийных разведений из исходного источника антигена на протяжении лунок планшета для микротитрования. Исходный источник антигена может иметь известную или неизвестную концентрацию. Затем в лунки планшета можно добавлять аликвоты тестируемого образца при сохранении в каждой лунке постоянного объема и разведения тестируемого образца. Абсолютные количества антигена, добавляемого в лунки планшета для микротитрования, могут различаться в зависимости от таких факторов, как природа антитела-мишени, природа тестируемого образца, разведение тестируемого образца и т.д., как понимают специалисты в данной области. Как правило, количества антигена и разведение тестируемого образца выбирают таким образом, чтобы получить диапазон интенсивности сигнала, входящий в приемлемый регистрируемый диапазон для считывания данных, выбранного в способе для выявления связывания антитело/антиген. Общепринятые количества и разведения для тестирования образцов сыворотки человека, в которых предполагают наличие аутоантител против маркеров опухоли, приведены в прилагаемых примерах. Удобно, что тестируемые количества антигена могут различаться в диапазоне от 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл.
Как указано выше, также существует возможность строить кривую титрования, начиная с единственного исходного источника антигена, даже если абсолютная концентрация антигена в исходном источнике неизвестна. При условии, что используют один и тот же единственный исходный раствор и осуществляют серийные разведения одним и тем же способом, существует возможность сравнивать результаты отдельных анализов титрования этого антигена, осуществляемых с различными исходными тестируемыми образцами.
В другом варианте осуществления различные количества антигена (антигенных детерминант или эпитопов) могут быть зафиксированы в отдельных положениях или реакционных участках на твердом носителе. После этого весь носитель можно приводить в контакт с тестируемым образцом и регистрировать или измерять связывание антитела с антигеном в каждом из отдельных положений или реакционных участков. Приемлемые твердые носители также включают в себя микрочипы, например чипы, где отдельные участки или точки на чипе содержат различные количества антигена. Микрочипы можно получать фиксированием различных количеств конкретного антигена в отдельных, поддающихся разрешению реакционных участках на чипе. В других вариантах осуществления фактическое количество фиксированных молекул антигена можно поддерживать практически постоянным, однако размер участков или точек на чипе меняют для изменения количества доступного связывающего эпитопа, обеспечивая серии титрований участков или точек с различными количествами доступного связывающего эпитопа. В таких вариантах осуществления для получения серий титрования важна концентрация двумерной поверхности связывающего эпитопа(ов) на антигене, а не абсолютное количество антигена. Способы получения и считывания данных для белковых/пептидных микрочипов общеизвестны в данной области.
Из приведенного выше описания понятно, что во всех вариантах осуществления изобретения различие в количестве антигена можно получать изменением плотности антигена или эпитопа, против которого тестируют образец, или посредством поддержания плотности антигена или эпитопа, но при увеличении площади поверхности, на которой закреплен антиген, или посредством обоих способов.
Микрочипы можно использовать для проведения параллельно множества анализов для антител различной специфичности для одного образца. Это можно осуществлять с использованием чипов, содержащих множество наборов различных антигенов, где каждый набор содержит конкретный антиген во множестве различных количеств или концентраций. Термин "различные антигены" включает антигены, получаемые из различных белков или полипептидов (например, антигены, получаемые из неродственных белков, которые кодируются различными генами), а также антигены, получаемые из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида. Рассматриваемый микрочип может содержать только наборы различных антигенов, полученных из различных белков или полипептидов, или только наборы различных антигенов, полученных из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида, или смесь двух наборов в любом соотношении. Следует отметить, что каждый отдельный набор антигена в различных количествах или концентрациях в любом из вариантов осуществления изобретения, как правило, содержит только один антиген, а не его смеси.
В рамках настоящей заявки термин "жидкость организма" в отношении вещества, подлежащего тестированию на наличие антител с использованием способа согласно изобретению, включает, наряду с прочим, плазму, сыворотку, цельную кровь, мочу, пот, лимфу, фекалии, спинномозговую жидкость, асцитную жидкость, плевральный выпот, сперму, мокроту, аспират из сосков, послеоперационное опухолевидное скопление сыворотки или жидкость в результате дренирования раны. Как указано выше, способы согласно изобретению предпочтительно осуществляют in vitro для тестируемого образца, содержащего жидкость организма, которую получают у тестируемого индивида. Тип используемой жидкости организма может различаться в зависимости от природы антитела, подлежащего тестированию, и клинического состояния, при котором используют анализ. Как правило, предпочтительно проводить анализы для образцов сыворотки или плазмы. В дополнение к жидкости организма тестируемый образец может содержать добавочные компоненты, такие как, например, разбавители, консерванты, стабилизаторы, буферные вещества и т.д.
В рамках настоящей заявки термин "антиген" используют в широком смысле для обозначения любого вещества, проявляющего специфическую иммунологическую реактивность в отношении подлежащего выявлению антитела-мишени. Приемлемые антигены могут включать в себя, но ими не ограничиваются, природные белки, рекомбинантные или синтетические белки или полипептиды, синтетические пептиды, пептидомиметики и т.д., а также полисахариды и нуклеиновые кислоты. Конкретно, при использовании в настоящей заявке термина "антиген" подразумевают, что он включает в себя любое вещество для захвата, имеет ли оно человеческое происхождение, происхождение от млекопитающего или иное, где вещество способно к специфическому иммунологическому взаимодействию со множеством гипервариабельных участков антитела, подлежащего выявлению. Например, с этой целью в качестве антигена можно также рассматривать антиидиотипические антитела, как можно рассматривать антигены, получаемые посредством фагового дисплея.
Определенные антигены могут содержать или быть получены из белков или полипептидов, которые выделяют из природных источников, включая в себя, но ими не ограничиваясь, белки или полипептиды, выделяемые из ткани или жидкостей из организма пациента. В таких вариантах осуществления антиген может содержать практически весь природный белок, т.е. белок практически в том виде, в котором его выделяют из природного источника, или он может содержать фрагмент природного белка. Для того чтобы быть эффективным в качестве антигена в способе согласно изобретению, любой такой "фрагмент" должен сохранять иммунологическую реактивность в отношении антител, для которых его используют в тестировании. Например, приемлемые фрагменты можно получать химическим или ферментативным расщеплением выделенного белка.
В зависимости от точного характера анализа, в котором его используют, антиген может содержать природный белок или его фрагмент, связанный с одной или несколькими дополнительными молекулами, которые придают некоторые желаемые характеристики, отсутствующие у белка в природе. Например, белок или фрагмент можно конъюгировать с регистрируемой меткой, такой как, например, флуоресцентная метка, цветная метка, люминесцентная метка, радиоактивная метка или тяжелый металл, такой как коллоидное золото. В других вариантах осуществления белок или фрагмент можно экспрессировать в виде слитого белка. В качестве примера, слитые белки могут содержать пептид-метку на N- или C-конце для способствования очистке рекомбинантно экспрессируемого антигена.
В зависимости от схемы анализа, в котором его подлежит использовать, антиген может быть зафиксирован на твердом носителе, таком как, например, лунки планшета для микротитрования, гранулы микрочипов или чипы или магнитные гранулы. Фиксацию можно осуществлять нековалентной адсорбцией или ковалентным присоединением.
Можно использовать любые приемлемые способы присоединения при условии, что это в значительной степени не оказывает неблагоприятного эффекта на способность антигена иммунологически реагировать с антителом-мишенью.
Изобретение не ограничено твердофазными анализами, но также включает анализы, которые полностью или частично проводят в жидкой фазе, например анализы с гранулами в жидкой фазе.
В одном из вариантов осуществления антигены могут быть мечены лигандом, способствующим фиксации, например биотином. Затем антиген можно разводить до приемлемого диапазона титрования и после этого позволять реагировать в растворе с аутоантителами в образцах от пациентов. После этого получаемые иммунные комплексы можно фиксировать на твердом носителе посредством взаимодействия лиганд-рецептор (например, биотин-стрептавидин) и проводить остальную часть анализа, как описано ниже.
Для способствования получению биотинилированных антигенов для использования в способах анализа согласно изобретению кДНК, кодирующие полноразмерный антиген, его усеченный вариант или его антигенный участок, можно экспрессировать в виде слитого белка, меченного белковой или полипептидной меткой, к которой можно посредством ферментативной реакции присоединять вспомогательный биотиновый фактор. Векторы для получения рекомбинантных биотинилированных антигенов коммерчески доступны во множестве источников.
Как проиллюстрировано в прилагаемых примерах, дополнительное преимущество использования способа кривой титрования вместе с биотинилированными антигенами состоит в том, что анализ позволяет различить связывание биотинового компонента с антителами против биотина и истинное связывание антигена с родственным ему антителом. Авторами изобретения было выявлено, что у значительного количества популяции людей в природе продуцируются антитела против биотина, что может приводить к ложно-положительным результатам в анализах, основанных на использовании биотинилированного антигена.
Как указано выше, "иммуноанализ", используемый для выявления антител согласно изобретению, может быть основан на известных в данной области общепринятых способах, за исключением использования множества количеств антигена для построения кривой титрования. В наиболее предпочтительном варианте осуществления иммуноанализ может представлять собой ELISA. Как правило, ELISA хорошо известна в данной области. В обычном "непрямом" ELISA антиген, обладающий специфичностью к тестируемым антителам, фиксируют на твердом носителе (например, лунки обычного аналитического планшета для микротитрования или поверхность микрогранулы или микрочипа), и образец, содержащий жидкость организма, которую подлежит тестировать на наличие антител, приводят в контакт с зафиксированным антигеном. Любые антитела с желаемой специфичностью, присутствующие в образце, связываются с зафиксированным антигеном. Затем связавшиеся комплексы антитело/антиген можно выявлять любым приемлемым способом. В одном из предпочтительных вариантов осуществления для выявления комплексов антитело/антиген используют меченое вторичное антитело против иммуноглобулина человека, специфически распознающее эпитоп, общий для одного или нескольких классов иммуноглобулинов человека. Как правило, вторичное антитело представляет собой антитело против IgG или IgM. Обычно вторичное антитело метят поддающимся выявлению маркером, как правило, таким ферментом-маркером, как, например, пероксидаза или щелочная фосфатаза, делая возможным количественную регистрацию посредством добавления субстрата для фермента, образующего поддающийся регистрации продукт, например окрашенный, хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт. С равным эффектом можно использовать другие известные в данной области выявляемые метки.
Изобретение относится к способу выявления антител, являющихся биологическими маркерами болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию. Предпочтительно, этот конкретный аспект изобретения исключает анализы, сконструированные для тестирования на предмет антител, продуцируемых в результате введения вакцины или схемы иммунизации, отличной от вакцинации маркерами рака. Поэтому анализы по этому аспекту изобретения, предпочтительно, не включают анализы, сконструированные для тестирования на наличие антител против вирусов или против бактерий после вакцинации/иммунизации.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитело может представлять собой аутоантитело. Как указано выше, термин "аутоантитело" относится к природному антителу, направленному против антигена, который иммунная система индивида распознает как чужеродный, даже если этот антиген на самом деле образуется у индивида. Аутоантитела включают антитела, направленные против измененных форм природных белков, продуцируемых пораженной заболеванием клеткой или в течение процесса заболевания. Измененная форма белка образуется у индивида, но может рассматриваться иммунной системой индивида как "чужеродная" и, таким образом, вызывать у индивида иммунную реакцию в виде аутоантител, иммунологически специфичных к измененному белку. Например, такие измененные формы белка могут включать мутантные формы с измененной аминокислотной последовательностью, необязательно, сопровождающиеся изменениями во вторичной, третичной или четвертичной структурах, усеченные формы, варианты сплайсинга, измененные гликоформы и т.д. В других вариантах осуществления аутоантитело может быть направлено против белка, который при состоянии заболевания сверхэкспрессируется вследствие амплификации гена или патологической регуляции транскрипции. Сверхэкспрессия белка, обычно не встречающегося в значительных количествах клеткам иммунной системы, может вызывать иммунную реакцию, приводящую к продукции аутоантител. В еще одном варианте осуществления аутоантитело может быть направлено против зародышевой формы белка, который начинает экспрессироваться при состоянии заболевания. Если зародышевый белок, который обычно экспрессируется только на ранних стадиях развития до становления иммунной системы функциональной, начинает экспрессироваться при состоянии заболевания, то зародышевая форма может распознаваться иммунной системой как "чужеродная", вызывая иммунную реакцию, которая приводит к продукции аутоантител.
В одном из вариантов осуществления антитело может представлять собой аутоантитело, специфичное к белку-маркеру опухоли, а более конкретно, "связанное с раком" аутоантитело против опухоли.
Термин "связанное с раком" аутоантитело против опухоли относится к аутоантителу, направленному против эпитопа, присутствующего на вариантах белков-маркеров опухоли, предпочтительно экспрессирующихся при состоянии заболевания раком. Наличие таких аутоантител характерно для состояния заболевания раком или предрасположенности к раку у пациентов с отсутствием симптомов.
В предпочтительных вариантах применения способ согласно изобретению используют для выявления наличия связанных с раком аутоантител против опухоли у относящихся к человеку индивидов или пациентов, и, наиболее предпочтительно, способ имеет форму иммуноанализа in vitro, выполняемого для тестируемого образца, который содержит образец жидкости организма, полученный у индивида/пациента. Перед тестированием образец жидкости организма можно разводить в приемлемом буфере или можно обрабатывать для длительного хранения или иным образом.
Иммуноанализы in vitro являются неинвазивными, и их можно повторять так часто, сколько предполагается необходимым для получения профиля продукции аутоантител у пациента или до возникновения заболевания, например, при скрининге индивидов "с риском развития заболевания", или на протяжении хода заболевания (дополнительно описано ниже в отношении предпочтительных вариантов использования способа).
В частности, но без ограничения, варианты осуществления способов согласно изобретению могут включать иммуноанализы для (одновременного) выявления двух или более видов аутоантител, где каждое обладает специфичностью к различным эпитопам на одинаковых или родственных белках-маркерах опухоли (например, различных изоформах или вариантах, кодируемых одним геном) или к эпитопам на различных белках-маркерах опухоли (подразумевая белки, кодируемые различными генами). Как правило, эти способы включают использование панели из двух или более наборов антигенов, где каждый набор антигенов обычно получают из отличного белка-маркера опухоли ("отличный" в этом контексте обозначает белки, являющиеся продуктами различных генов), хотя, как указано выше, набор антигенов также может содержать различные эпитопы на одном и том же белке-маркере опухоли. Набор антигенов относится к одному подлежащему тестированию антигену в различных количествах/концентрациях в способе согласно изобретению. В этих способах, которые ниже могут быть названы "анализы панелей", используют панель из двух или более наборов антигенов для наблюдения общей иммунной реакции индивида на опухоль или другое канцерогенное/неопластическое изменение. Таким образом, этими способами регистрируют "профиль" иммунной реакции у рассматриваемого индивида, выявляя, какие маркеры опухоли вызывают иммунную реакцию, приводящую к продукции аутоантител. Как правило, использование панели из двух или более антигенов для наблюдения продукции аутоантител против двух или более различных маркеров опухоли является более чувствительным, чем выявление аутоантител против отдельных маркеров, и приводит к значительно более низкой частоте ложноотрицательных результатов (см. WO 99/58978 и WO 2004/044590, содержания которых приведены здесь полностью в качестве ссылки).
Таким образом, в неограничивающем варианте осуществления изобретение относится к способу выявления двух или более антител в тестируемом образце, содержащем жидкость организма млекопитающего, где по меньшей мере одно из указанных антител является биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ включает в себя
(a) контактирование тестируемого образца с двумя или более наборами антигенов, где каждый из указанных наборов антигенов специфичен к одному из указанных антител, подлежащих выявлению в тестируемом образце, и где каждый набор антигенов содержит множество различных количеств указанного антигена,
(b) выявление величины специфического связывания указанных антител и указанных антигенов, и
(c) построение графика или расчет кривой для величины указанного специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого набора антигенов, используемого на стадии (a).
В одном из вариантов осуществления каждое из указанных двух или более антител является биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, при этом в объем изобретения входит сочетание анализа титрования для антигена-маркера заболевания и анализа титрования для любого другого вида антитела, которое может являться или может не являться маркером заболевания, в том же самом тестируемом образце.
Так или иначе, оценка того, присутствуют или нет соответствующие антитела в тестируемом образце, основана на величине специфического связывания, наблюдаемой для каждой из различных концентраций антигена в отношении каждого различного антигена в тесте, иначе говоря, на суммарных величинах для каждого антигена, а не на считывании данных для единственной концентрации для каждого антигена. Таким образом, определение наличия или отсутствия болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, или антител против чужеродного вещества в образце от пациента, исходя из присутствия двух или более видов антитела, может быть основано на таких суммарных величинах для каждого антигена. Предпочтительно, оценку осуществляют на основе изображения, в основном, S-образной или сигмовидной кривой в отношении какого-либо или всех антигенов, присутствующих в тесте.
Во избежание недоразумений анализы, основанные на использовании одного вида антигена для выявления антител, могут быть названы в настоящей заявке "анализами одного маркера", тогда как анализы, основанные на использовании панели из двух или более антигенов, названы "анализами панелей".
Способ согласно изобретению можно приспосабливать к использованию в выявлении аутоантител практически для любого белка-маркера опухоли, для которого может быть получен приемлемый антиген, или в виде анализа одного маркера, или в виде компонента в анализе панелей. В частности, способ можно приспосабливать к выявлению/измерению аутоантител против белка рецептора эпидермального фактора роста EGFR (Downward et al. (1984) Nature 307:521-527; Robertson et al. (2001) Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126:177-81), гликопротеина MUC1 (Batra, S.K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology, 12:271-283) и регуляторных белков передачи сигналов/клеточного цикла Myc (Blackwood, E.M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5:597-609), p53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3:3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1887-1893) и ras (или Ras) (Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93:125-131), а также BRCA1 (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94:5605-10), BRCA2 (Sharan, S.K. et al. (1997) Nature 386:804-810), APC (Su, L.K. et al. (1993) Cancer Res. 53:2728-2731; Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92:3046-50), CA125 (Nouwen, E.J. et al. (1990) Differentiation. 45:192-8), PSA (Rosenberg, R.S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248:935-939), карциноэмбрионального антигена CEA (Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Apr 47(4):624-30), CA19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Biochem (1989) Oct 22(5):363-8), NY-ESO-1 (антигена рака/семенников; Chen, Y.T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94:1914-1918, 1997), PSMA (специфического мембранного антигена простаты; Israeli, R.S. et al., Cancer Res. 53:227-230, 1993), PSCA (антигена стволовых клеток простаты; Reiter, R.E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95:1735-1740, 1998) и EpCam (молекулы адгезии клеток эпителия; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:3542-3546, 1990), HER2 (также называемого c-erbB2 Coussens, L. et al., Science 230:1132-1139, 1985), CAGE (Jager D, et al., Cancer Res. 1999 Dec 15;59(24):6197-204; Mashino K, et al., Br J Cancer. 2001 Sep 1;85(5):713-20), цитокератинов (Moll R, et al., Cell. 1982 Nov;31(1):11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000;342:525-533), рековерина (Maeda A, et al., Cancer Res. 2000 Apr 1;60(7):1914-20), калликреинов (Kim H, et al., Br J Cancer 2001;84:643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002;23:185-192); аннексинов (Hudelist G, et al., Breast Cancer Res Treat. 2004 Aug;86(3):281-91), α-фетопротеина (Stiller D, et al., Acta Histochem Suppl. 1986;33:225-31), GRP78 (Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jan 18;102(3):779-84; Hsu WM, et al., Int J Cancer. 2005 Mar 1;113(6):920-7), CA125 (Norum LF, et al., Tumour Biol. 2001 Jul-Aug;22(4):223-8; Perey L, et al., Br J Cancer. 1990 Oct;62(4):668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun;12(3):709-17); маммоглобина (Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov;50(11):2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr;37(4):249-57), raf (Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. 1995 Jan;2(1):38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998 Dec;189(1-2):119-25), бета-хорионического гонадотропина человека b-HCG (Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr-May;3(3):149-51; Gregory JJ Jr, et al., Drugs. 1999 Apr;57(4):463-7) или антигена 4-5 (Krause P, et al., J Immunol Methods. 2003 Dec;283(1-2):261-7). Однако подразумевают, что изобретение не ограничивается выявлением аутоантител против этих конкретных маркеров опухоли.
Способы анализа согласно изобретению, основанные на выявлении аутоантител против маркеров опухоли (в виде одного маркера или в виде анализа панелей), можно использовать во множестве различных клинических случаях. В частности, способ можно использовать для выявления или диагностики рака, в оценке прогноза для пациента с диагностированным раком, в прогнозе реакции на лечение, в наблюдении за развитием у пациента рака или другого неопластического заболевания, для выявления раннего неопластического или раннего канцерогенного изменения у человека с отсутствием симптомов, в скрининге популяции людей с отсутствием симптомов для выявления тех индивидов, кто обладает повышенным риском развития рака, или для диагностирования наличия рака, в прогнозе реакции пациента с раком на противораковое лечение (например, вакцинацию, варианты лечения, направленные против фактора роста или передачи сигналов, лучевую терапию, эндокринную терапию, лечение антителами человека, химиотерапию), в наблюдении реакции пациента с раком на противораковое лечение (например, вакцинацию, варианты лечения, направленные против фактора роста или передачи сигналов, лучевую терапию, эндокринную терапию, лечение антителами человека, химиотерапию), для выявления повторного заболевания у пациента, у которого ранее диагностировали рак и который подвергался противораковому лечению для уменьшения степени присутствующего рака, или в выборе противоракового лечения (например, вакцина, варианты лечения, направленные против фактора роста или передачи сигналов, лучевая терапия, эндокринная терапия, лечение антителами человека, химиотерапия) для использования для конкретного пациента.
В целом, авторами настоящего изобретения было выявлено, что уровни связанных с раком аутоантител проявляют положительную взаимосвязь с состоянием заболевания (см. также WO 99/58979, содержания которого приведены здесь полностью в качестве ссылки). Таким образом, при использовании способа согласно изобретению в клинических вариантах применения повышенные уровни аутоантител против маркеров опухоли в сравнении с соответствующими контролями, как правило, рассматривают как признак состояния заболевания раком.
Например, при использовании иммуноанализов в диагностике рака наличие повышенного уровня аутоантител в сравнении с "нормальными" контрольными индивидами рассматривается как показатель наличия у индивида рака. Предпочтительно, "нормальные" контрольные индивиды представляют собой соответствующих по возрасту контрольных индивидов, у которых отсутствует какой-либо диагноз рака на основе клинических, полученных посредством визуализации и/или биохимических показателей.
При использовании иммуноанализов в прогнозировании реакции пациента с раком на противораковое лечение (например, вакцинацию, варианты лечения, направленные против фактора роста или передачи сигналов, лучевую терапию, эндокринную терапию, лечение антителами человека, химиотерапию) наличие повышенного уровня аутоантител в сравнении с "нормальными" контрольными индивидами может рассматриваться как показатель вероятности того, ответит ли индивид на противораковое лечение или нет. Предпочтительно, "нормальные" контрольные индивиды представляют собой соответствующих по возрасту контрольных индивидов, у которых отсутствует какой-либо диагноз рака на основе клинических, полученных посредством визуализации и/или биохимических показателей.
Для каждого из указанных выше вариантов лечения взаимосвязь уровня аутоантител, сравниваемого с контролями, и вероятной эффективности лечения можно выявлять посредством наблюдения за результатом такого лечения у пациентов, у которых на протяжении лечения наблюдают состояние аутоантител. Затем ранее выявленную взаимосвязь можно использовать для прогнозирования вероятности эффективности каждого варианта лечения для рассматриваемого пациента на основе оценки состояния аутоантител.
При использовании иммуноанализов в наблюдении развития у пациента рака или другого неопластического заболевания наличие повышенного уровня аутоантител в сравнении с "нормальным контролем" рассматривается как показатель наличия у пациента рака. "Нормальный контроль" может представлять собой уровни аутоантител, присутствующие у контрольных индивидов, предпочтительно, соответствующих по возрасту, у которых отсутствует какой-либо диагноз рака на основе клинических, полученных посредством визуализации и/или биохимических показателей. Альтернативно, "нормальный контроль" может представлять собой "исходный" уровень, устанавливаемый для конкретного тестируемого пациента. Например, "исходный" уровень может представлять собой уровень аутоантител, присутствующих при первом диагностировании рака или диагностировании повторного рака. Любое превышение исходного уровня рассматривается как показатель повышения степени присутствующего у пациента рака, тогда как любое уменьшение ниже исходного уровня рассматривается как показатель уменьшения степени присутствующего у пациента рака. Также "исходная" величина, например, может представлять собой уровень до начала нового лечения. Изменение уровня аутоантител рассматривается как показатель эффективности лечения. Направление "изменения" (т.е. повышение или снижение), указывающее на положительную реакцию на лечение, зависит от точного характера лечения. Для любого заданного варианта лечения направление "изменения" уровней аутоантител, указывающее на положительный результат, можно легко определить, например, наблюдением уровней аутоантител в сравнении с другими клиническими или биохимическими показателями реакции на лечение.
При использовании иммуноанализов в скрининге популяции людей с отсутствием симптомов, что можно проводить для выявления тех индивидов, которые обладают повышенным риском развития рака, индивидов с увеличенным уровнем аутоантител в сравнении с "нормальными" контрольными индивидами определяют как "обладающих риском" развития рака. Предпочтительно, "нормальные" контрольные индивиды представляют собой соответствующих по возрасту контрольных индивидов, у которых не выявлено какой-либо предрасположенности к развитию рака или какого-либо значительно повышенного риска развития рака. Исключением из этого может являться случай, когда возраст сам по себе представляет основной фактор риска.
При использовании иммуноанализов в скрининге популяции людей с отсутствием симптомов, что можно проводить для выявления тех индивидов, у которых уже развился рак, индивидов с повышенным уровнем аутоантител в сравнении с "нормальными" контрольными индивидами оценивают как пораженных раком или другим видом неопластических изменений. Предпочтительно, "нормальные" контрольные индивиды представляют собой соответствующих по возрасту контрольных индивидов, у которых не выявлено какой-либо предрасположенности к развитию рака или какого-либо значительно повышенного риска развития рака. Исключением из этого может являться случай, когда возраст сам по себе представляет основной фактор риска. Альтернативно, "нормальный контроль" может представлять собой "исходный" уровень, устанавливаемый для конкретного тестируемого пациента. Например, "исходный" уровень может представлять собой уровень аутоантител, присутствующий, когда пациента тестировали в первый раз и не обнаружили у него повышенных уровней в сравнении с "нормальной контрольной" популяцией. Любое превышение исходного уровня после этого рассматривается как показатель наличия рака у этого индивида. Таким образом, посредством такого исходного теста индивид может стать своим собственным контролем для будущего измерения аутоантител.
При использовании иммуноанализов в наблюдении за реакцией пациента с раком на противораковое лечение (например, вакцинацию, варианты лечения, направленные против фактора роста или передачи сигналов, лучевую терапию, эндокринную терапию, лечение антителами человека, химиотерапию) наличие измененного уровня аутоантител после лечения рассматривается как показатель того, что пациент положительно отреагировал на лечение. Исходный уровень аутоантител, рассматриваемый до начала лечения, можно использовать в целях сравнения для определения того, приводит ли лечение к "повышению или понижению" уровней аутоантител. Изменение уровня аутоантител рассматривается как показатель эффективности лечения. Направление "изменения" (т.е. повышение или снижение), указывающее на положительную реакцию на лечение, зависит от точного характера лечения. Для любого заданного варианта лечения направление "изменения" уровней аутоантител, указывающее на положительный результат, можно легко определить, например, наблюдением уровней аутоантител в сравнении с другими клиническими или биохимическими показателями реакции на лечение.
Способ согласно изобретению можно использовать в прогнозировании и/или наблюдении реакции индивида на практически любой известный вариант противоракового лечения. Например, такие варианты включают в себя лечение антителами человека, где пациенту вводят инфузией моноклональные или поликлональные антитела, неограничивающим специфическим примером чего является лечение антителом против фактора роста HerceptinTM (Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1995). Наличие естественной реакции аутоантитела может усиливать или ингибировать эффективность лечения искусственно вводимыми инфузией терапевтическими антителами. С использованием способа согласно изобретению можно соотносить реакцию на какой-либо вариант противоракового лечения, включая лечение антителами, с природными уровнями аутоантител у какого-либо пациента или группы пациентов до и в течение курса лечения. Затем эти данные можно в свою очередь использовать для прогнозирования того, как другие пациенты (или тот же самый пациент в случае повторного лечения) отреагируют на такое же лечение.
При использовании иммуноанализов для выявления повторного заболевания наличие у пациента повышенного уровня аутоантител в сравнении с "нормальным контролем" рассматривается как показатель повторного развития заболевания. "Нормальный контроль" может представлять собой уровни аутоантител, присутствующие у контрольных индивидов, предпочтительно, соответствующих по возрасту, у которых отсутствует какой-либо диагноз рака на основе клинических, полученных посредством визуализации и/или биохимических показателей. Альтернативно, "нормальный контроль" может представлять собой "исходный" уровень, устанавливаемый для конкретного тестируемого пациента. Например, "исходный" уровень может представлять собой уровень аутоантител, присутствующий в период ремиссии заболевания, что основано на клинических, полученных посредством визуализации и/или биохимических показателях.
Способ анализа согласно изобретению можно использовать для выявления множества различных видов рака, примерами которых являются рак молочной железы, мочевого пузыря, прямой и ободочной кишки, предстательной железы, легких, поджелудочной железы и яичников. Анализы могут дополнять существующие способы скрининга и наблюдения. Например, в случае первичного рака молочной железы иммуноанализы для аутоантител можно использовать для указания клиницистам получить биопсию незначительных участков повреждения на маммограммах, которые радиографически не вызывают подозрений, или провести визуализацию молочной железы, или повторить визуализацию молочной железы в более ранний период времени, чем планировалось. Предполагают, что в клинике способы анализа согласно изобретению будут более объективными и воспроизводимыми, чем существующие в настоящее время способы визуализации (т.е. маммография и ультразвуковое исследование), эффективность которых может зависеть от управляющего процессом индивида.
"Анализы панелей" могут быть приспособлены в отношении конкретного клинического варианта использования. Панель антигенов для выявления аутоантител, по меньшей мере, против p53 и c-erbB2 является особенно эффективной для многих видов рака и может быть, необязательно, дополнена другими маркерами, для которых известна связь с конкретным вариантом рака или стадией конкретного варианта рака, подлежащим выявлению. Например, в случае рака молочной железы панель может содержать MUC 1 и/или c-myc, и/или BRCA1, и/или BRCA2, и/или PSA, тогда как в случае рака мочевого пузыря панель, необязательно, может содержать MUC 1 и/или c-myc, в случае рака прямой и ободочной кишки ras и/или APC, в случае рака предстательной железы PSA и/или BRCA1, и/или BRCA2 или в случае рака яичника BRCA1 и/или BRCA2, и/или CA125. Существуют другие предпочтительные варианты осуществления, в которых p53 или c-erbB2 не являются существенно необходимыми.
В случае рака молочной железы приемлемые панели можно выбирать из следующего:
p53 и MUC 1, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или c-myc, и/или BRCA1, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
p53 и c-myc, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или MUC 1, и/или BRCA1, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
p53 и BRCA1, необязательно, вместе с c-erB2 и/или MUC 1, и/или c-myc, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
p53 и BRCA2, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или MUC 1, и/или c-myc, и/или BRCA1, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
c-erbB2 и MUC 1, необязательно, вместе с p53 и/или c-myc, и/или BRCA1, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
c-erbB2 и c-myc, необязательно, вместе с p53 и/или MUC1, и/или BRCA1, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
c-erbB2 и BRCA1, необязательно, вместе с p53 и/или MUC 1, и/или c-myc, и/или BRCA2, и/или PSA, и/или NY-ESO-1, и/или BRC1;
c-erbB2 и BRCA2, необязательно, вместе с p53 и/или MUC 1, и/или c-myc, и/или BRCA1, и/или PSA;
p53, c-myc, NY-ESO-1 и BRCA2.
В случае рака прямой и ободочной кишки приемлемые панели можно выбирать, например, из следующего:
p53 и ras, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или APC;
p53 и APC, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или Ras;
Ras и APC, необязательно, вместе с p53 и/или c-erbB2.
Также такие панели могут содержать CEA или CA19-9.
В случае рака предстательной железы приемлемые панели можно выбирать, например, из следующего:
p53 и PSA, необязательно, вместе с BRCA1 и/или BRCA2, и/или c-erbB2;
c-erbB2 и PSA, необязательно, вместе с p53 и/или BRCA1, и/или BRCA2;
PSMA, PSCA и калликреины.
В случае рака яичников приемлемые панели можно выбирать, например, из следующего:
p53 и CA125, необязательно, вместе с c-erbB2 и/или BRCA1, и/или BRCA2;
c-erbB2 и CA125, необязательно, вместе с p53 и/или BRCA1, и/или BRCA2;
HER2, аннексины, CAGE и 4-5.
В случае рака легких приемлемые панели можно выбирать из:
p53 и NY-ESO-1, необязательно, вместе с дополнительными маркерами;
HER2, аннексины, CAGE и 4-5.
Если способ согласно изобретению используют для проведения "анализа панели", основанного на двух или более антигенах-маркерах опухоли, полученных из различных белков, то по меньшей мере один из антигенов в панели необходимо протестировать в анализе согласно изобретению, основанному на тестировании множества различных количеств антигена для формирования кривой титрования. Предпочтительно, каждый из формирующих панель антигенов тестируют в соответствии с анализом согласно изобретению и строят график/вычисляют кривую титрования для каждого отдельного антигена в панели.
Также согласно изобретению подразумевают, что анализ титрования для выявления по меньшей мере одного антитела против маркера опухоли можно использовать в сочетании с анализом, сконструированным для выявления в образце от того же самого пациента по меньшей мере одного белка-маркера опухоли (который может быть родственным или неродственным антигену, используемому в анализе титрования). Таким образом, анализы для аутоантител против маркеров опухоли и анализы для белков-маркеров опухоли можно выполнять параллельно для одного образца от пациента.
В другом варианте осуществления способ иммуноанализа согласно изобретению можно использовать в выборе противораковой вакцины для использования для конкретного пациента. В этом варианте осуществления получаемый от пациента образец жидкости организма тестируют с использованием панели из двух или более антигенов, где каждый соответствует отдельному белку-маркеру опухоли, для определения относительной величины иммунной реакции пациента на каждый из отдельных белков-маркеров опухоли. На "величину иммунной реакции" для заданного белка- или белков-маркеров опухоли указывает наличие и/или количество связанных с раком аутоантител, специфичных к тому белку-маркеру опухоли, который выявлен с использованием иммуноанализа; в случае количественного подсчета аутоантител чем выше уровень связанных с раком аутоантител, тем сильнее иммунная реакция. Затем белок- или белки-маркеры опухоли, которые выявляют как вызывающие наиболее сильную иммунную реакцию или сильные реакции у пациента (т.е. наивысший уровень аутоантител), отбирают для формирования основы противораковой вакцины для использования для пациента.
Использование способа согласно изобретению не ограничено выявлением аутоантител против опухоли, хотя для этой цели анализ является особенно эффективным. Рак представляет собой только один из примеров заболевания, где выявление аутоантител можно использовать в качестве биологического маркера для болезненного состояния/предрасположенности к заболеванию. Авторами изобретения было показано, что посредством использования способа титрования для выявления аутоантител в образцах от пациентов достигаются значительные преимущества. Поэтому допустимо заключить, что сходные преимущества достигаются при использовании способа титрования для выявления аутоантител, являющихся биологическими маркерами для отличных от рака заболеваний. Таким образом, способ применим для выявления любого аутоантитела, служащего биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию для любого заболевания, для которого была показана (или может быть показана) связь с продукцией аутоантител.
Другие варианты использования способа согласно изобретению включают в себя, но ими не ограничиваются, выявление аутоантител, являющихся биологическими маркерами аутоиммунного заболевания, такого как, например, ревматоидный артрит, системная красная волчанка (SLE), первичный билиарный цирроз (PBC), аутоиммунный тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото), аутоиммунный гастрит (например, злокачественная анемия), аутоиммунное воспаление надпочечников (например, болезнь Аддисона), аутоиммунный гипопаратиреоз, аутоиммунный диабет (например, диабет типа 1) или тяжелая миастения, а также скрининг образцов от пациентов на предмет заболевания почек или печени, приводящего к недостаточности или отказу обоих органов, и скрининг образцов от пациентов после трансплантации для выявления наличия антител, направленных против пораженной заболеванием ткани (которая осталась в участке после трансплантации) или против трансплантированной ткани.
В другом аспекте изобретение относится к способу выявления антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма млекопитающего, где указанное антитело направлено против чужеродного вещества, введенного в указанного млекопитающего, где способ включает:
(a) контактирование тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного к указанному антителу,
(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена, и
(c) построение графика или расчет кривой для величины указанного специфического связывания в зависимости от количества антигена при каждом количестве антигена, используемом на стадии (a).
Предпочтительно, в этом варианте осуществления изобретения способ включает в качестве стадии (d) определение наличия указанного антитела на основе величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена при каждой отдельной используемой концентрации антигена, иначе говоря, на суммарных величинах, наблюдаемых для конкретного антигена. Предпочтительно, на наличие в тестируемом образце антитела, реактивного по отношению к используемому в анализе антигену, указывает, в целом, S-образная или сигмовидная кривая.
В этом аспекте изобретения способ титрования можно использовать для оценки иммунной реакции у млекопитающего, а предпочтительно человека, на любое чужеродное вещество, введенное указанному индивиду.
В одном из вариантов осуществления чужеродное вещество может представлять собой терапевтическое средство, такое как, например, лекарственное средство или пролекарство, антитела человека для лечения или вакцина. Способ согласно изобретению можно использовать для оценки того, вызывает ли введение пациенту терапевтического средства иммунную реакцию, приводящую к продукции антител, специфичных к эпитопу на терапевтическом средстве или к компоненту инертного вещества для доставки, эксципиента, носителя и т.д., которые вводят вместе с терапевтическим средством.
Точный характер терапевтического средства изобретением не ограничен. В неограничивающих вариантах осуществления способ согласно изобретению можно использовать для оценки иммунной реакции на синтетические небольшие молекулы, природные вещества, природные или полученные синтетически биологические средства или на любое сочетание двух или более из указанного выше, необязательно, в сочетании с эксципиентами, носителями или инертными веществами для доставки.
В одном из эффективных вариантов осуществления способ согласно изобретению можно использовать для оценки иммунной реакции на не являющийся мишенью участок терапевтического средства или вакцины. Под "не являющимся мишенью" участком подразумевают составную часть вводимого терапевтического средства или вакцины, который, в случае терапевтического средства, не вносит непосредственный вклад в терапевтическую активность или, в случае вакцины, не предназначен для вызова продукции антител в организме-хозяине. Например, не являющийся мишенью участок может присутствовать для способствования очистке терапевтического средства или вакцины или может быть сконструирован для способствования доставке, поглощению или нацеливанию терапевтического средства/вакцины. Примеры таких "не являющихся мишенью" участков включают в себя, но ими не ограничиваются, линкеры или особые участки, обычно присоединяемые к рекомбинантно экспрессируемым полипептидам, такие как биотиновые метки, гистидиновые метки и т.д.
В другом варианте осуществления этого аспекта изобретения чужеродное вещество может представлять собой инфицирующее вещество, такое как грибок, бактерии, вирус или паразит.
Дополнительно изобретение понимают на основе следующих неограничивающих экспериментальных примеров:
Пример 1
Общая схема титрования антигена в анализе аутоантител
Образцы (биотинилированных) антигенов-маркеров опухоли можно получать рекомбинантной экспрессией в соответствии со способами, аналогичными способам, которые описаны в WO 99/58978.
Вкратце, кДНК, кодирующие интересующие антигены-маркеры, клонировали в вектор pET21 (Invitrogen), который был модифицирован для кодирования биотиновой метки и 6×-гистидиновой метки для способствования очистке экспрессируемого белка. Получаемые клоны выращивают в приемлемой бактериальной клетке-хозяине (в тельцах-включениях), бактерии лизируют и денатурируют, а экспрессируемые антигены выделяют посредством колонок для аффинной хроматографии с хелатообразующим никелем (Hi-trap, коммерчески доступно в Amersham, в соответствии с протоколом производителя). Экспрессируемые антигены восстанавливали диализом в соответствующем буфере, а выход экспрессируемого белка оценивали посредством SDS-PAGE, Вестерн-блоттинга и ELISA и определяли количественно перед хранением.
Отрицательный контроль VOL представляет собой пустой вектор (т.е. без клонированной кДНК), который однако содержит последовательности гистидиновой и биотиновой меток.
Уникальные идентификаторы банка генов для множества кДНК маркеров являются следующими:
P53: B003596
с-myc: V00568
внеклеточный домен ECD6 (HER2): M11730
NY-ESO: NM_001327
BRCA2: U43746
BRCA1 дельта 9-10: NM_007302
1. Антигены и VOL (отрицательный контроль) разводили до соответствующих концентраций в 0,1 М карбонатном буфере, а затем проводили серию разведений для получения полулогарифмического диапазона титрования (см. таблицу 1). Разведения антигенов распределяли по 50 мкл/лунка по рядам планшета для микротитрования Falcon в соответствии со схемой планшета, используя электронную многоканальную пипетку. Планшеты закрывали и хранили в течение 48 часов при 4°C.
2. Планшеты один раз промывали посредством PBS + 0,1% Tween 20 с использованием автоматического устройства для промывки планшетов, а затем сушили постукиванием о папиросную бумагу.
3. Планшеты блокировали в буфере для инкубации с высоким содержанием соли (HSB, PBS + 0,5 М NaCl + 0,1% казеин) при 200 мкл/лунка в течение одного часа или до тех пор, пока не потребуется для использования (хранили в закрытом состоянии при 4°C).
4. Образцы сыворотки размораживали, встряхивали и разводили 1/100 в HSB при комнатной температуре.
5. Планшеты очищали и сушили постукиванием о папиросную бумагу. Каждый разведенный образец сыворотки распределяли по 50 мкл/лунка по всем лункам планшета для микротитрования, используя электронную многоканальную пипетку. Контрольные антитела разводили 1/1000 в HSB и распределяли в соответствующие лунки конечного планшета. Планшеты закрывали и инкубировали при встряхивании в течение 1,5 часа при комнатной температуре
6. Стадия промывки: планшеты трижды промывали в PBS + 0,1% Tween 20 с использованием автоматического устройства для промывки планшетов, а затем сушили постукиванием о папиросную бумагу.
7. Во все лунки планшета для микротитрования помещали по 50 мкл/лунка конъюгированных с пероксидазой хрена антител кролика против Ig человека (Jackson, 1/10000 в HSB). В контрольные лунки, содержащие антитело против антигена, помещали HRP-конъюгированные антитела кролика против Ig мыши (1/1000 в HSB). Затем планшеты инкубировали при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре.
8. Планшеты промывали, как на стадии 6.
9. Добавляли предварительно полученный субстрат TMB по 50 мкл/лунка, и инкубировали планшет в течение 10 минут на лабораторном столе. Для перемешивания по планшетам осторожно постукивали.
10. Оптическую плотность в лунках определяли при 650 нм с использованием общепринятого протокола для планшет-ридера.
| Таблица 1 | ||||||||||||
| Образцы схем планшетов | ||||||||||||
| Планшеты P53 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| А | р53 10 мкг/мл | с-myc 10 мкг/мл | NY-ESO 10 мкг/мл | VOL 10 мкг/мл | ||||||||
| В | р53 3 мкг/мл | с-myc 3 мкг/мл | NY-ESO 3 мкг/мл | VOL 3 мкг/мл | ||||||||
| С | р53 1 мкг/мл | с-myc 1 мкг/мл | NY-ESO 1 мкг/мл | VOL 1 мкг/мл | ||||||||
| D | р53 0,3 мкг/мл | с-myc 0,3 мкг/мл | NY-ESO 0,3 мкг/мл | VOL 0,3 мкг/мл | ||||||||
| Е | р53 0,1 мкг/мл | с-myc 0,1 мкг/мл | NY-ESO 0,1 мкг/мл | VOL 0,1 мкг/мл | ||||||||
| F | р53 0,03 мкг/мл | с-myc 0,03 мкг/мл | NY-ESO 0,03 мкг/мл | VOL 0,03 мкг/мл | ||||||||
| G | р53 0,01 мкг/мл | с-myc 0,01 мкг/мл | NY-ESO 0,01 мкг/мл | VOL 0,01 мкг/мл | ||||||||
| Н | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | ||||||||
| Планшеты BRCA | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | BRCA1 10 мкг/мл | BRCA2 10 мкг/мл | ECD-6 10 мкг/мл | VOL 10 мкг/мл | ||||||||
| B | BRCA1 3 мкг/мл | BRCA2 3 мкг/мл | ECD-6 3 мкг/мл | VOL 3 мкг/мл | ||||||||
| C | BRCA1 1 мкг/мл | BRCA2 1 мкг/мл | ECD-6 1 мкг/мл | VOL 1 мкг/мл | ||||||||
| D | BRCA1 0,3 мкг/мл | BRCA2 0,3 мкг/мл | ECD-6 0,3 мкг/мл | VOL 0,3 мкг/мл | ||||||||
| E | BRCA1 0,1 мкг/мл | BRCA2 0,1 мкг/мл | ECD-6 0,1 мкг/мл | VOL 0,1 мкг/мл | ||||||||
| F | BRCA1 0,03 мкг/мл | BRCA2 0,03 мкг/мл | ECD-6 0,03 мкг/мл | VOL 0,03 мкг/мл | ||||||||
| G | BRCA1 0,01 мкг/мл | BRCA2 0,01 мкг/мл | ECD-6 0,01 мкг/мл | VOL 0,01 мкг/мл | ||||||||
| Н | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | Карбонатный буфер | ||||||||
Пример 2
Выявление аутоантител при первичном раке молочной железы
Следующие данные были получены из предварительного исследования для оценки чувствительности и воспроизводимости набора анализов титрования с использованием аутоантител при первичном раке молочной железы (PBC). Исследование включало сыворотку от 17 женщин с отсутствием признаков рака и образцы сыворотки от 20 женщин с первичным раком молочной железы до операции. Нормальные образцы и образцы с раком соответствовали по возрасту. Один нормальный образец и три образца с раком необходимо было удалить из исследования, поскольку для них наблюдали признаки реакций антитела против биотина, и поэтому они не могли быть оценены с использованием анализа при его настоящей схеме. Предполагают, что приблизительно у 10% популяции развивается иммунная реакция против биотина.
Анализ проводили в соответствии с указанной в примере 1 схемой, используя антигены p53, c-myc, NY-ESO-1 и BRCA2.
На фиг.1 представлены примеры кривых, полученных при использовании анализа титрования антигена для измерения количества аутоантител против p53 в сыворотке. Можно видеть, что сыворотка от пациента с раком 17766(C) проявляет значительное связывание с тестируемым антигеном (p53) при характерной сигмовидной кривой, но не связывается с отрицательным контролем, VOL. В сравнении с этим сыворотка от обычного индивида 18052(N) не приводит к получению кривой титрования для связывания с тестируемым антигеном или отрицательным контролем.
Уровни аутоантител выражали в виде разницы величины оптической плотности (650 нм), обусловленной связыванием с тестируемым антигеном, и величины, обусловленной связыванием с отрицательным контролем (VOL). Нормальный отсекаемый уровень рассчитывали как 95 процентиль (среднее значение + 2 значения стандартного отклонения) для нормальной группы. Он показан пунктирной линией на фиг.2, где сравниваются уровни аутоантител против p53 у обычных индивидов и пациентов с раком. Можно видеть, что у группы с раком, в целом, наблюдают более высокие уровни аутоантител, а также более высокую долю индивидов с уровнями, превышающими отсекаемый уровень.
Панель состоит из четырех антигенов: p53, c-myc, NY-ESO-1 и BRCA2. Чувствительность отдельных анализов указана в таблице 2 вместе с общей чувствительностью панели из четырех антигенов при выявлении первичного рака молочной железы (63%).
| Таблица 2 | ||||
| Чувствительность анализа титрования антигена с использованием аутоантител | ||||
| р53 | c-myc | NY-ESO-1 | BRCA2 | Панель |
| 6/17 (35%) | 5/17 (29%) | 4/17 (24%) | 4/17 (24%) | 63% |
Измеряли количество аутоантител против четырех различных антигенов и вычисляли общую чувствительность панели. Отсекаемые уровни рассчитывали как среднее значение + 2 значения стандартного отклонения для набора нормальных образцов. Индивиды с реакциями антител против биотина были исключены, как не допускающие оценку.
Для оценки того, были ли воспроизводимыми или нет измерения, полученные с использованием анализа титрования с применением аутоантител, анализы проводили в трое отдельных суток, а результаты представлены в таблице 3. Анализ считали воспроизводимым, если все три результата совпадали. Воспроизводимость измерений, проведенных для нормальной сыворотки, составляла 94% (15/16), а для образцов с раком молочной железы 88% (14/16).
Таблица 3
Воспроизводимость анализа титрования антигена для аутоантител против p53
Анализы проводили в трое отдельных суток (анализы A, B и C) для образцов сыворотки от пациентов с первичным раком молочной железы (PBC) или нормальных контролей. Отсекаемые уровни рассчитывали на суточной основе как среднее значение + 2 значения стандартного отклонения для набора нормальных образцов. AB обозначает индивидов, у которых наблюдали признаки реакции антитела против биотина и для которых была невозможна оценка при настоящей схеме анализа. Анализ считали воспроизводимым, если все три результата совпадали. Воспроизводимость для обычных индивидов составляла 94% (15/16), а для пациентов PBC составляла 88% (14/16).
Пример 3
Выявление аутоантител при раке легких
В анализе реакций аутоантител против 2 антигенов (p53 и NY-ESO) в предварительном исследовании для рака легких (10 нормальных образцов плазмы и 9 с раком легких) была выявлена вероятность регистрации, составляющая 78% (фиг.3).
Анализ проводили в соответствии с общей схемой из примера 1, за исключением использования образцов плазмы вместо сыворотки.
Для положительных образцов от пациентов наблюдали сигмовидные кривые титрования, сходные с кривыми, которые представлены на фиг.1. На фиг.3 представлено сравнение уровней аутоантител против p53 и NY-ESO у обычных индивидов и пациентов с раком легких, как измерено с использованием анализа титрования антигенов. Нормальные отсекаемые уровни рассчитывали как среднее значение + 2 значения стандартного отклонения для нормальной популяции.
Пример 4
Дополнительные кривые титрования
Все следующие дополнительные кривые титрования были получены в анализах, основанных на общем способе, который описан в примере 1. Результаты указывают на то, что способ кривой титрования можно использовать для выявления множества различных антигенов в различных типах жидкостей организма и при различных заболеваниях (например, при различных видах рака), а также иллюстрируют преимущество способа согласно изобретению в различении "истинных" и "ложных" положительных результатов.
На фиг.4 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против p53 и NY-ESO в образце асцитной жидкости, полученной у пациента с раком молочной железы. Этого пациента тестировали, но не выявили продукции аутоантител против c-myc.
На фиг.5 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против BRCA1, BRCA2 и HER2 в образце сыворотки от пациента с раком молочной железы (карцинома протоков in situ).
На фиг.6 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO в образце сыворотки от пациента с раком легких. Этого пациента тестировали, но не обнаружили продукции аутоантител против p53 или c-myc.
На фиг.7 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO и p53 в образце сыворотки от пациента с раком легких. Этого пациента тестировали, но не обнаружили продукции аутоантител против c-myc.
На фиг.8(a) и 8(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования для аутоантител против p53, c-myc и NY-ESO-1 в образцах сыворотки от "обычного" индивида (т.е. индивида без признаков рака). В анализе, представленном на фиг.8(a), для возрастающих количеств антигена наблюдают пологую кривую, что указывает на то, что образцы сыворотки не содержат аутоантител против какого-либо из тестируемых антигенов. Когда вторую порцию образца сыворотки от того же пациента снова тестировали с использованием того же способа анализа, то анализ оказался неудачным, приведя к аномальным результатам, которые представлены на фиг.8(b). Отсутствие характерной кривой титрования при возрастающих количествах антигена указывает на то, что это аномальный результат, а не истинно положительный. Если бы этот образец был протестирован в одноточечном анализе с использованием одного фиксированного количества антигена, то для него могли бы наблюдать "ложноположительный" результат. Таким образом, эти результаты иллюстрируют преимущество способа кривой титрования в различении истинных и ложных положительных результатов.
На фиг.9(a) и 9(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования, выполненных для образцов сыворотки от одного пациента с инвазивным раком молочной железы с использованием диапазона различных антигенов. У этого конкретного пациента наблюдают аутоантитела против NY-ESO-1, HER2 и BRCA2. В случае каждого положительного антигена на положительный результат анализа указывает возрастание интенсивности сигнала по мере увеличения концентрации антигена, т.е. сигнала титрования.
На фиг.10(a) и 10(b) представлена иллюстрация использования изобретения в различении реакций антител против биотина и "истинных" аутоантител против специфического антигена (т.е. маркера опухоли). В этих анализах образцы сыворотки от клинически нормального человека тестировали на наличие аутоантител с использованием биотинилированных антигенов BRCA2, HER2, c-myc и NY-ESO-1, небиотинилированного BRCA1 и контрольных продуктов экспрессии "пустого" вектора VOL, кодирующего биотиновую метку, но без дополнительного антигена. У тестируемого индивида наблюдают реакцию титрования как на биотинилированные антигены, так и на пустой вектор VOL, который фактически представляет собой только биотин, и отсутствие реакции на небиотинилированный антиген BRCA1, что указывает на то, что "положительные" результаты для биотинилированных маркеров действительно обусловлены наличием у этого индивида антител против биотина.
Пример 5
Анализ чувствительности и специфичности анализов титрования антигена в сравнении с одноточечным измерением
Измерения для аутоантитела (AAb) проводили для 100 женщин с первичным раком молочной железы (PBC) и 80 женщин без признаков злокачественного заболевания, используя способ титрования и измерение при единственной концентрации антигена (10 мкг/мл). Ниже приведены таблицы, в которых представлено непосредственное сравнение двух способов:
| Таблица 4 | ||
| Сравнение чувствительности анализа титрования с использованием AAb и измерения при единственной концентрации антигена в случае PBC | ||
| Антиген | Одна точка | Анализ титрования |
| p53 | 17,5% | 18,9% |
| c-myc | 6,2% | 22,9% |
| NY-ESO-1 | 24,7% | 25,0% |
| BRCA2 | 20,6% | 31,3% |
| HER2 | 23,7% | 25,0% |
| MUC1 | 18,5% | 19,8% |
| Панель (из 6 антигенов) | 54,6% | 62,2% |
| Таблица 5 | ||
| Сравнение специфичности анализа титрования с использованием AAb и измерения при единственной концентрации антигена в случае обычных женщин | ||
| Антиген | Одна точка | Анализ титрования |
| p53 | 93,8% | 97,3% |
| c-myc | 93,8% | 94,6% |
| NY-ESO-1 | 90,0% | 93,3% |
| BRCA2 | 90,0% | 94,6% |
| HER2 | 91,3% | 95,9% |
| MUC1 | 92,5% | 95,9% |
| Панель (из 6 антигенов) | 71,3% | 78,4% |
Можно видеть, что в сравнении с одноточечным измерением при использовании нескольких точек на кривой титрования антигена достигали как более высокую чувствительность, так и специфичность.
Пример 6
Возможные причины более высокой чувствительности и специфичности при анализе титрования антигена
Не ограничиваясь теорией, автор заявки полагает, что существует множество причин для наблюдаемой более высокой специфичности и чувствительности в анализе, где титруют антиген.
(i) На фиг.11 представлены результаты анализа AAb сыворотки пациента с первичным раком молочной железы (PCB) при использовании антигенов p53, c-myc и NY-ESO-1 при различной концентрации. Эти результаты показывают, что в некоторых случаях кривая образует провал при высоких уровнях антигена (кривая NY-ESO-1). Это часто наблюдаемое явление в иммунохимии. Если бы использовали одноточечное измерение при 10 мкг/мл, то такого пациента определили бы как отрицательного в отношении аутоантител против NY-ESO-1, хотя на самом деле наблюдается четкая положительная реакция.
(ii) На фиг.12 представлен анализ сыворотки от обычного индивида, где также использовали титруемый антиген p53, c-myc и NY-ESO-1. На этой фигуре показано действие, которое авторы заявки наблюдали в приблизительно 10% анализов, в которых исходный уровень для измерения антигена (в этом случае p53) сдвинут на уровень, превышающий таковой для отрицательного контроля (VOL). Это приводит к ложным высоким показаниям. Этот тип результата легко выявляем с использованием анализа титрования, однако неразличим в наборе одноточечных анализов. Это приводит к сниженной специфичности, обусловленной такими ложноположительными результатами (см. таблицу 5).
(iii) Как описано в примере 4, антигены, используемые в анализе титрования с использованием AAb, содержат биотиновую метку, которую можно применять в очистке белка. Однако известно, что приблизительно у 10% популяции развивается реакция антитела на биотин, являющийся витамином. На фиг.13 показана реакция антител против биотина у пациента с PBC. Такая реакция может быть четко выявлена с использованием кривой титрования как значительная реакция антитела против отрицательного контроля VOL (который также является биотинилированным). Этих индивидов следует рассматривать как не поддающихся оценке посредством анализа при такой схеме. Однако если бы использовали одноточечный анализ, то индивидов с реакций антител на биотин нельзя было бы отличить от истинных реакций.
Пример 7
Проявление повышенной чувствительности титрования антигена в сравнении с титрованием сыворотки
Измерения для AAb проводили двумя способами в двух полностью отдельных экспериментах. В первом использовали обычную схему, в которой на планшет наносили антиген при полулогарифмическом титровании от 10 мкг/мл до 0,01 мкг/мл. После блокирования добавляли сыворотку при разведении 1 в 100. Во втором на планшеты наносили антиген в концентрации 3 мкг/мл, а после блокирования добавляли сыворотку в полулогарифмическом диапазоне титрования от разведения 1 в 10 до 1 в 10000. В отношении остальной части анализов способы были одинаковыми. Анализировали две совокупности сывороток, для которых известно, что они положительны в отношении p53 и c-myc, и 8 образцов сыворотки от женщин с PBC, а также 10 образцов сыворотки от обычных индивидов. Результаты представлены в приведенной ниже таблице 6.
Таблица 6
Чувствительность анализов для AAb, включающих титрование антигена, в сравнении с анализами, включающими титрование сыворотки
Можно видеть, что схема анализа, включающая титрование антигена, является более чувствительной, чем схема, которая включает титрование сыворотки. Образцы, являвшиеся в значительной степени положительными, были выявлены с использованием обеих схем, тогда как слабоположительные в анализе титрования антигена, как правило, не выявлялись в анализе титрования сыворотки.
Более низкая чувствительность, наблюдаемая для схемы титрования сыворотки, обусловлена внутренне присущим неспецифическим связыванием сыворотки при высокой концентрации. Это обуславливает определенную величину связывания с белками даже в обычных образцах (см. фиг.14), что увеличивает нормальную отсекаемую величину вместе с последующим снижением чувствительности. Также специфичность была снижена в схеме титрования сыворотки (BRCA2=90%) при сравнении со схемой титрования антигена (BRCA2=100%).
На фиг.15 представлены эксперименты, приведенные на фиг.4, но вместе с сывороткой от пациента с первичным раком молочной железы. При использовании способа титрования антигена согласно изобретению пациента выявили как положительного в отношении аутоантител против p53 и c-myc, но отрицательного в отношении аутоантител против BRCA2. Однако при измерении аутоантител в пределах диапазона титрования сыворотки аутоантитела выявлены не были (см. таблицу 6). Это обусловлено неспецифическим связыванием, проявляемым сывороткой при высоких концентрациях (представленным высокой величиной связывания с белком, являющимся отрицательным контролем (VOL)), что скрывает сигналы, обусловленные специфическим связыванием аутоантител. Заключение, что при использовании разведения сыворотки в анализе можно выявить пациента с первичным раком молочной железы, является отрицательным. Поскольку величина чувствительности = истинные положительные значения/истинные положительные значения + ложноотрицательные значения, то это приводит к эффекту увеличения знаменателя и, соответственно, уменьшению величины чувствительности.
Таким образом, авторами заявки было показано, что анализы аутоантител с использованием титрования антигена являются более чувствительными и специфичными, чем измерение реактивности аутоантител при одной концентрации антигена. Это обусловлено тем, что титрование антигена обеспечивает возможность выявлять низкоаффинные антитела с низким содержанием при высоких концентрациях антигена, а также антитела с высоким содержанием, которые в ином случае захватываются при высокой концентрации антигена, но максимальное связывание проявляют при дальнейшем спуске кривой титрования. Это позволяет также отличать не поддающиеся оценке анализы от истинных результатов, что невозможно осуществлять с использованием одноточечного измерения. Предполагают, что анализы для AAb с использованием титрования антигена являются более чувствительными, чем простое титрование сыворотки, поскольку высокая величина неспецифического связывания, наблюдаемая при высокой концентрации сыворотки, повышает обычные отсекаемые уровни, снижая тем самым чувствительность.
Claims (13)
1. Способ обнаружения антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость организма субъекта-млекопитающего, где указанное антитело направлено на чужеродный антиген, введенный в указанного субъекта-млекопитающего, где способ включает
(a) приведение указанного тестируемого образца в контакт со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,
(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена стадии (а), и
(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (а), где на присутствие в тестируемом образце антитела, взаимодействующего с используемым в анализе антигеном, указывает в основном S-образная или сигмовидная кривая.
2. Способ по п. 1, который включает в качестве стадии (d) определение присутствия указанного антитела на основе величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена стадии (а) для каждой отдельной используемой концентрации антигена.
3. Способ по п. 1, где определение присутствия указанного антитела основано на всех значениях величины специфического связывания для всех тестируемых концентраций антигена.
4. Способ по п. 1, где субъект-млекопитающее представляет собой человека.
5. Способ по п. 1, где чужеродный антиген представляет собой терапевтическое средство.
6. Способ по п. 5, где терапевтическое средство представляет собой лекарственное средство, пролекарство или терапевтическое средство на основе антитела.
7. Способ по п. 1, где чужеродный антиген представляет собой вакцину.
8. Способ по п. 6 или 7, где чужеродный антиген представляет собой не являющуюся мишенью часть терапевтического средства или вакцины.
9. Способ по п. 8, где не являющаяся мишенью часть представляет собой биотин.
10. Способ по любому из пп. 1-5, где чужеродный антиген представляет собой инфекционный агент, такой как грибок, бактерию, вирус или паразит.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68542205P | 2005-05-27 | 2005-05-27 | |
| GB0510943A GB2426581A (en) | 2005-05-27 | 2005-05-27 | Immunoassay methods |
| GB0510943.4 | 2005-05-27 | ||
| US60/685,422 | 2005-05-27 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007149281/15A Division RU2416095C2 (ru) | 2005-05-27 | 2006-05-26 | Улучшенные способы иммуноанализа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010149267A RU2010149267A (ru) | 2012-06-10 |
| RU2636532C2 true RU2636532C2 (ru) | 2017-11-23 |
Family
ID=41460065
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010149267A RU2636532C2 (ru) | 2005-05-27 | 2006-05-26 | Улучшенные способы иммуноанализа |
| RU2010149266A RU2662555C2 (ru) | 2005-05-27 | 2010-12-01 | Улучшенные способы иммуноанализа |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010149266A RU2662555C2 (ru) | 2005-05-27 | 2010-12-01 | Улучшенные способы иммуноанализа |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9714938B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0610267B8 (ru) |
| CY (2) | CY1109461T1 (ru) |
| IL (3) | IL187481A (ru) |
| NO (2) | NO342101B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ563466A (ru) |
| PT (1) | PT1889059E (ru) |
| RU (2) | RU2636532C2 (ru) |
| SI (1) | SI1889059T1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2894538A1 (en) * | 2013-01-31 | 2014-08-07 | Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Ari | Autoantibody signature for the early detection of ovarian cancer |
| RU2702011C1 (ru) * | 2018-11-26 | 2019-10-03 | Владимир Леонидович Пастушенков | Способ диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний |
| WO2021046466A1 (en) * | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Avail Bio, Inc. | Methods, compositions, and systems for profiling or predicting an immune response |
| WO2022192402A1 (en) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | Avail Bio, Inc. | Methods, compositions, and systems for b-cell isolation sequencing |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999058978A2 (en) * | 1998-05-11 | 1999-11-18 | The University Of Nottingham | Tumour markers |
| WO2004044590A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | The University Of Nottingham | Tumour marker proteins and uses thereof |
Family Cites Families (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4241044A (en) | 1978-12-28 | 1980-12-23 | Abbott Laboratories | Method of diagnosing cancer by detecting elevated anti-T antibody activity |
| NZ211453A (en) | 1984-03-22 | 1989-01-06 | Biotechnology Research Enterpr | Aryl azides, their preparation and use in the detection, localisation and isolation of polynucleotides |
| ATE77700T1 (de) | 1986-03-10 | 1992-07-15 | Imre Corp | Immunkomplextestverfahren. |
| AU2253688A (en) | 1987-07-24 | 1989-03-01 | Xoma Corporation | Methods for breast cancer detection |
| US4937185A (en) | 1987-07-31 | 1990-06-26 | The Ohio State University Research Foundation | Detection of circulating antibodies to a cancer marker protein |
| US7282345B1 (en) | 1989-08-04 | 2007-10-16 | Schering Ag | C-erbB-2 external domain: GP75 |
| US5110911A (en) | 1989-11-02 | 1992-05-05 | Biomira, Inc. | Human tumor-associated thomsen-friedenreich antigen |
| US5157020A (en) | 1990-05-24 | 1992-10-20 | Research Corporation Tech., Inc. | Synthetic senescent cell antigen |
| DK9091D0 (da) | 1991-01-18 | 1991-01-18 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af antistoffer |
| DE4120412C1 (ru) | 1991-06-20 | 1993-01-07 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
| US6322989B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-11-27 | Yoreh Biotechnologies, Ltd. | Whole blood/mitogen assay for the early detection of a subject with ovarian or breast cancer and kit |
| US6280962B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-08-28 | Yoreh Biotechnologies Ltd. | Whole blood/mitogen assay for the early detection of a subject with cancer and kit |
| PT1024191E (pt) | 1991-12-02 | 2008-12-22 | Medical Res Council | Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos |
| WO1993021529A1 (en) | 1992-04-14 | 1993-10-28 | Duke University | Method of detecting tumors containing complexes of p53 and hsp70 |
| US5801005A (en) | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
| US5763164A (en) | 1993-04-16 | 1998-06-09 | Northwestern University | Immunogenic cancer proteins and peptides and methods of use |
| US5747268A (en) | 1993-04-22 | 1998-05-05 | Dade International Inc. | Tumor marker control |
| US5744144A (en) | 1993-07-30 | 1998-04-28 | University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures | Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof |
| US5721105A (en) | 1994-02-20 | 1998-02-24 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Method for the immunological determination of proteins and kit for carrying out the method |
| JPH07294530A (ja) | 1994-04-20 | 1995-11-10 | Nippon Igaku Rinshiyou Kensa Kenkyusho:Kk | 病原体に対する体液中の抗体検出法 |
| CA2148971A1 (en) | 1994-05-26 | 1995-11-27 | Izak Bahar | Calibrator matrix |
| WO1996000084A1 (en) | 1994-06-24 | 1996-01-04 | Torchilin Vladimir P | Use of autoantibodies for tumor therapy and prophylaxis |
| IL110464A0 (en) | 1994-07-26 | 1994-10-21 | Univ Ramot | Novel proteins for the diagnosis, imaging, and therapy of human cancer |
| US5561049A (en) | 1994-09-21 | 1996-10-01 | Behringwerke Ag | Method for detecting antibodies |
| US5876728A (en) | 1995-02-15 | 1999-03-02 | Howard David Kass | Natural composition extracted from plants used in the treatment of cancer |
| AUPN568095A0 (en) | 1995-09-27 | 1995-10-26 | Austin Research Institute, The | Anti-Galalpha(1,3)Gal antibody binding peptides |
| GB9521544D0 (en) | 1995-10-20 | 1995-12-20 | Univ Dundee | Activation of P53 protein and therapeutic applications thereof |
| JPH09189702A (ja) | 1996-01-09 | 1997-07-22 | Hitachi Chem Co Ltd | 抗ムチン抗体の測定法、癌の測定法及び癌診断薬 |
| JP2001517206A (ja) | 1996-08-16 | 2001-10-02 | ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティ スクール オヴ メディシン | 免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株およびその使用方法 |
| AU7713498A (en) | 1997-06-03 | 1998-12-21 | Amdl, Inc. | Immunoassay for the detection of cancer |
| DE19805815C1 (de) | 1998-02-13 | 1999-11-11 | Ansgar W Lohse | Diagnostikum zum Erkennen der autoimmunen Hepatitis |
| JP4083855B2 (ja) | 1998-02-16 | 2008-04-30 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 肺癌予後検査方法 |
| AUPP349098A0 (en) | 1998-05-13 | 1998-06-04 | South Eastern Sydney Area Health Service | A method of monitoring pancreatic tissue viability |
| ATE447713T1 (de) | 1998-11-05 | 2009-11-15 | Univ Michigan | S100-proteine und -autoantikörper als serummarker für krebs |
| US6387639B1 (en) | 1998-11-10 | 2002-05-14 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Ma family polypeptides and anti-Ma antibodies |
| GB9827228D0 (en) | 1998-12-10 | 1999-02-03 | Univ Nottingham | Cancer detection method and reagents |
| US7807810B2 (en) | 1999-04-08 | 2010-10-05 | The Ohio State University Research Foundation | Nucleic acids encoding the major outer membrane protein of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis and peptides encoded thereby |
| RU2181893C2 (ru) * | 1999-05-25 | 2002-04-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ получения референс-панели для контроля качества тест-систем и вакцин против гепатита в |
| US6645465B2 (en) | 1999-08-06 | 2003-11-11 | Michigan, University Of The Regents | Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
| US20020064801A1 (en) | 1999-12-01 | 2002-05-30 | Ryan Jeffrey R. | Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis |
| US6667160B2 (en) | 2000-03-15 | 2003-12-23 | Kenneth D. Fine | Method for diagnosing immunologic food sensitivity |
| US20030138860A1 (en) | 2000-06-14 | 2003-07-24 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
| US20030232399A1 (en) | 2000-06-14 | 2003-12-18 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
| CA2431201A1 (en) | 2000-12-13 | 2002-08-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Standard diluent for multiplex assays |
| US7745141B2 (en) | 2001-06-21 | 2010-06-29 | New York University | Mycobacterial proteins as early antigens for serodiagnosis and vaccines |
| US20030049692A1 (en) | 2002-09-16 | 2003-03-13 | Norman Latov | Detection of anti-glycolipid antibodies by latex agglutination assay |
| JP2005352771A (ja) | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 発現プロファイルによるパターン認識システム |
| US20060141547A1 (en) | 2004-11-16 | 2006-06-29 | Das Hasi R | Novel diagnostic marker, a diagnostic kit and a method for diagnosis of rheumatoid arthritis |
| GB2426581A (en) | 2005-05-27 | 2006-11-29 | Univ Nottingham | Immunoassay methods |
| EP1789435B1 (en) | 2005-09-12 | 2010-02-24 | Industry Foundation of Chonnam National University | A method for production of mature natural killer cell |
| TWI304443B (en) | 2005-12-30 | 2008-12-21 | Nat Health Research Institutes | Alpha-enolase specific antibody and method of use |
| AU2007297310B2 (en) | 2006-09-13 | 2013-11-07 | Oncimmune Limited | Improved immunoassay methods |
| CN101632020B (zh) | 2006-09-13 | 2013-11-27 | 昂西免疫有限公司 | 改进的免疫测定方法 |
| GB0725239D0 (en) | 2007-12-24 | 2008-02-06 | Oncimmune Ltd | Calibrator for autoantibody assay |
-
2006
- 2006-05-26 RU RU2010149267A patent/RU2636532C2/ru active
- 2006-05-26 BR BRPI0610267A patent/BRPI0610267B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-05-26 SI SI200630422T patent/SI1889059T1/sl unknown
- 2006-05-26 NZ NZ563466A patent/NZ563466A/en unknown
- 2006-05-26 PT PT06744011T patent/PT1889059E/pt unknown
-
2007
- 2007-11-19 IL IL187481A patent/IL187481A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-10-05 CY CY20091101028T patent/CY1109461T1/el unknown
-
2010
- 2010-12-01 RU RU2010149266A patent/RU2662555C2/ru active
-
2011
- 2011-10-04 IL IL215527A patent/IL215527A/en active IP Right Grant
- 2011-10-04 IL IL215528A patent/IL215528A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-07-18 CY CY20121100636T patent/CY1113013T1/el unknown
-
2014
- 2014-04-07 US US14/246,610 patent/US9714938B2/en active Active
- 2014-04-07 US US14/246,663 patent/US9719984B2/en active Active
-
2016
- 2016-10-03 NO NO20161585A patent/NO342101B1/no not_active IP Right Cessation
- 2016-10-03 NO NO20161584A patent/NO341484B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999058978A2 (en) * | 1998-05-11 | 1999-11-18 | The University Of Nottingham | Tumour markers |
| WO2004044590A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | The University Of Nottingham | Tumour marker proteins and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CARLSSON H. et al. Titration of antibodies to salmonella 0 antigens by enzyme-linked immunosorbent assay, Infect. Immun. November 1972 vol. 6 no. 5 703-708. Найдено из Интернета [он-лайн] 8.12.2014 на сайте http://iai.asm.org/content/6/5/703.long. DAHLBERG T. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for titration of haemophilus influenza capsular and o antigen antibodies, J. Clin. Microbiol. August 1980 vol. 12 no. 2 185-192. Найдено из Интернета [он-лайн] 8.12.2014 на сайте http://jcm.asm.org/content/12/2/185.long. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0610267A2 (pt) | 2010-06-08 |
| BRPI0610267B8 (pt) | 2021-07-27 |
| IL187481A (en) | 2011-11-30 |
| PT1889059E (pt) | 2009-10-01 |
| RU2010149266A (ru) | 2012-06-10 |
| NO341484B1 (no) | 2017-11-27 |
| US9719984B2 (en) | 2017-08-01 |
| US20140221245A1 (en) | 2014-08-07 |
| BRPI0610267B1 (pt) | 2018-01-30 |
| CY1113013T1 (el) | 2016-04-13 |
| NO20161584A1 (no) | 2008-02-26 |
| US9714938B2 (en) | 2017-07-25 |
| IL215528A (en) | 2015-10-29 |
| IL215527A (en) | 2013-04-30 |
| RU2010149267A (ru) | 2012-06-10 |
| CY1109461T1 (el) | 2014-08-13 |
| IL187481A0 (en) | 2008-02-09 |
| NO342101B1 (no) | 2018-03-26 |
| IL215527A0 (en) | 2011-11-30 |
| NZ563466A (en) | 2009-12-24 |
| IL215528A0 (en) | 2011-11-30 |
| SI1889059T1 (sl) | 2009-12-31 |
| RU2662555C2 (ru) | 2018-07-26 |
| NO20161585A1 (no) | 2008-02-26 |
| US20140234863A1 (en) | 2014-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2416095C2 (ru) | Улучшенные способы иммуноанализа | |
| CN101632020B (zh) | 改进的免疫测定方法 | |
| JP5736598B2 (ja) | 改善されたイムノアッセイ法 | |
| CN106662586B (zh) | 改进的免疫测定方法 | |
| RU2662555C2 (ru) | Улучшенные способы иммуноанализа | |
| CN103257227A (zh) | 改进的免疫测定方法 | |
| AU2012209004B2 (en) | Improved immunoassay methods |