BRPI0610267A2 - métodos de detecção de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença em um indivìduo mamìfero, e, uso do método - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se a um método de detecção de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença em um indivíduo mamífero que compreende detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de citado indivíduo mamífero no qual o citado anticorpo é um marcador biológico de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença, o método compreendendo: (a) contactar a citada amostra de teste com uma pluralidade de quantidades diferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo, (b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citado anticorpo e o citado antígeno, (c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citada ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade de antigeno usada em etapa (a) e (d) determinar a presença ou ausência de citado estado doentio ou de citada suscetibilidade à doença baseado na quantidade de ligação específica entre o citado anticorpo e o citado antígeno em cada diferente concentração de antígeno usada.

Description

"MÉTODOS DE DETECÇÃO DE UM ESTADO DOENTIO OU DE UMASUSCETIBILIDADE À DOENÇA EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO EDE DETECÇÃO DE UM ANTICORPO EM UMA AMOSTRA DE TESTE,E, USO DOS MÉTODOS"

Campo da invenção

A invenção geralmente refere-se ao campo de ensaiosdiagnósticos ou prognósticos e em particular à otimização de ensaios para adetecção de anticorpos em uma amostra compreendendo fluido corporal depaciente, na qual tais anticorpos são usados como marcadores biológicos deum estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença.

Fundamentos da invenção

Muitos ensaios de diagnóstico, prognóstico e/ou monitoraçãobaseiam-se na detecção de um marcador biológico de um estado doentioparticular ou de uma suscetibilidade particular à doença. Tais marcadoresbiológicos são comumente proteínas ou polipeptídeos que são característicosde uma doença particular ou associados com suscetibilidade à doença.

Em anos recentes tem se tornado evidente que anticorpos, e emparticular autoanticorpos, também podem servir como marcadores biológicosde doença ou de suscetibilidade à doença. Autoanticorpos são anticorposnaturalmente ocorrentes direcionados para um antígeno que um sistemaimune de indivíduo reconhece como estranho embora aquele antígenorealmente originou no indivíduo. Podem estar presentes na circulação comoautoanticorpos livres circulantes ou na forma de complexos imunescirculantes consistindo de autoanticorpos ligados em sua proteína marcadoraalvo. Diferenças entre uma proteína de tipo selvagem expressada por células"normais" e uma forma alterada da proteína produzida por uma célula doenteou durante um processo doentio pode, em algumas situações, fazer com que aproteína alterada seja reconhecida por um sistema imune do indivíduo como"não-própria" e gerando assim uma resposta imune naquele indivíduo. Estapode ser uma resposta imune humoral (i.e. mediada por célula B) ocasionandoa produção de autoanticorpos imunologicamente específicos para a proteínaalterada.

WO 99/58978 descreve métodos para uso na detecção /diagnóstico de câncer que são baseados na avaliação de resposta imune de umindivíduo para dois ou mais marcadores de tumor distintos. Estes métodosgeralmente envolvem contato de uma amostra de fluido corporal retirada doindivíduo com um painel de dois ou mais antígenos marcadores de tumordistintos, cada um derivado de uma proteína marcadora de tumor separada, edetecção da formação de complexos de antígenos marcadores de tumorligados em autoanticorpos circulantes imunologicamente específicos para asproteínas marcadoras de tumor. A presença de tais autoanticorpos circulantesé considerada como uma indicação da presença de câncer.

Ensaios que medem a resposta imune do indivíduo para apresença de proteína marcadora de tumor em termos de produção deautoanticorpo proporcionam uma alternativa para a medição ou detecçãodireta de proteína marcadora de tumor em fluidos corporais. Tais ensaiosessencialmente constituem detecção indireta da presença de proteínamarcadora de tumor. Por causa da natureza da resposta imune, é provável queautoanticorpos possam ser gerados por uma quantidade muito pequena deproteína marcadora de tumor circulante e métodos indiretos que se baseiam nadetecção da resposta imune aos marcadores de tumor conseqüentemente serãomais sensíveis do que os métodos para a medição direta de marcadores detumor nos fluidos corporais. Métodos de ensaio baseados na detecção deautoanticorpos podem ser portanto de valor particular no começo do processode doença e possivelmente também em relação à triagem de pacientesassintomáticos, por exemplo na triagem para identificar indivíduos "sobrisco" de desenvolvimento de doença dentre uma população de indivíduosassintomáticos, para identificar indivíduos que têm desenvolvido uma doençadentre uma população de indivíduos assintomáticos. Em adição o métodobaseado na detecção de autoanticorpos pode ser de valor particular no começodo processo de doença e possivelmente também pode ser usado paraidentificar indivíduos que têm desenvolvido uma doença dentre umapopulação de indivíduos assintomáticos. Ademais, podem ser úteis paradetecção precoce de doença recorrente. Os métodos de ensaio também podemser de um valor na seleção ou monitoração de terapias para uma doença.

Anticorpos e autoanticorpos também servem como marcadoresbiológicos de outros estados doentios ou suscetibilidades à doença, artritereumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC),tiroidite autoimune (e.g. Tiroidite de Hashimito), gastrite autoimune (e.g.anemia perniciosa), adrenalite autoimune (e.g. Doença de Addison),hipoparatiroidismo autoimune, diabete autoimune (e.g. diabete de tipo 1),miastenia grave são apenas exemplos.

Os presentes inventores têm reconhecido que quando ensaiosbaseados em detecção de anticorpos são usados diagnostica ouprognosticamente para avaliar o estado doentio, a progressão de doença ou asuscetibilidade à doença de um indivíduo dentro de uma população,dificuldades podem decorrer no planejamento de uma metodologia de ensaiopadrão apropriada para a população inteira de indivíduos a seremselecionados porque as quantidades absolutas de anticorpo presentes variamdramaticamente de indivíduo para indivíduo. Isto pode produzir umaincidência alta de resultados negativos falsos, por exemplo dentre indivíduospossuindo uma quantidade baixa de anticorpo. Similarmente há umadificuldade em pontuação de resultados positivos verdadeiros porque avariação em quantidades absolutas de anticorpo de indivíduo para indivíduosignifica que é difícil especificar um limite para um resultado de ensaiopositivo que seja apropriado para todos os indivíduos dentro da populaçãoselecionada.Os presentes inventores agora têm determinado que odesempenho e mais especificamente a utilidade e a confiabilidade clínicas deensaios baseados em detecção de anticorpos, particularmente deautoanticorpos, como marcadores biológicos de doença podem sermelhorados dramaticamente pela inclusão de uma etapa de titulação deantígeno. Pelo teste da amostra suspeita de conter anticorpos contra uma sériede quantidades diferentes de antígeno e construção de uma curva de titulaçãoé possível identificar os resultados de triagem positivos verdadeirosindependentemente da quantidade absoluta de anticorpo presente na amostra.

Uma tal abordagem é contrária aos métodos da arte anterior que titulamantígeno meramente para construir uma curva de calibração para permitiridentificação da concentração de antígeno mais apropriada a ser usada paradetectar anticorpos em amostras de paciente reais. Nestes métodos apenasuma medição de um ponto é proposta para diagnóstico real. Assim, estesmétodos não permitirão variação em quantidades do anticorpo a ser detectadode indivíduo para indivíduo resultando na incidência de positivos falsos enegativos falsos como discutido. Os presentes inventores têm verificado que ométodo de titulação de antígeno da invenção aqui discutido possuiespecificidade e sensibilidade maiores do que a medição de reatividade deautoanticorpo em uma única concentração de antígeno ou métodos nos quais aamostra de soro é titulada em vez do antígeno.

Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção éproporcionado um método de detecção de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença em um indivíduo mamífero que compreende detectarum anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal decitado indivíduo mamífero no qual o citado anticorpo é um marcadorbiológico de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença, o métodocompreendendo:(a) contactar a citada amostra de teste com uma pluralidade dequantidades diferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,

(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno,

(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a) e

(d) determinar a presença ou ausência de citado estado doentioou de citada suscetibilidade à doença baseado na quantidade de ligaçãoespecífica entre o citado anticorpo e o citado antígeno em cada diferenteconcentração de antígeno usada.

De acordo com um segundo aspecto da invenção éproporcionado um método de detecção de anticorpo em uma amostra de testecompreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, no qual ocitado anticorpo é direcionado para uma substância estranha introduzida nocitado indivíduo mamífero, o método compreendendo:

(a) contactar a amostra com uma pluralidade de quantidadesdiferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,

(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno, e

(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a).

De acordo com um terceiro aspecto da invenção éproporcionado um método de detecção de um anticorpo em uma amostra deteste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero no qual ocitado anticorpo é um marcador biológico de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença, o método compreendendo:

(a) contactar a amostra com uma pluralidade de quantidadesdiferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,

(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno, e

(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a) .

Em todos os aspectos da invenção o indivíduo mamífero épreferivelmente um humano.

Em todos os aspectos da invenção o método é preferivelmenterealizado in vitro em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporalobtido ou preparado do indivíduo mamífero.

Uma característica particular da invenção em todos os seusaspectos é que o julgamento de se o anticorpo relevante está ou não presentena amostra de teste é baseado na quantidade de ligação específica observadaem cada diferente concentração de antígeno testada, em outras palavras osvalores coletivos, em vez de apenas uma leitura em uma concentração única.Assim, a detecção da presença ou ausência de estado doentio oususcetibilidade à doença ou anticorpos para uma substância estranha em umaamostra de paciente pode ser seguida baseado diretamente nestes valorescoletivos. Preferivelmente, o julgamento é feito tendo por base a exibição deuma curva geralmente de forma S ou sigmóide quando a quantidade deligação específica é plotada contra a quantidade de antígeno. Como seráevidente dos Exemplos aqui os inventores têm observado que os métodos detitulação de antígeno da invenção possuem especificidade e sensibilidademais altas do que os métodos de diagnóstico ou de detecção baseados em umaúnica leitura e reduzem a incidência de determinações negativas falsas epositivas falsas.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: Medição de autoanticorpos em soro usando umacurva de titulação de antígeno. Soro de paciente com câncer 17766(C) liga-sefortemente no antígeno de teste com uma curva sigmóide característica(-♦-) mas não se liga no controle negativo, VOL (-■-). Em comparação, sorode um indivíduo normal, 18052(N) não se liga no antígeno de teste(-A-) ou no controle negativo (-<-).

Figura 2: Comparação de níveis de autoanticorpo p53 emindivíduos normais e pacientes com câncer de mama primário (PBC)conforme medidos usando o ensaio de titulação de antígeno. Níveis deanticorpo são expressados como a OD65o devido à ligação no antígeno deteste (p53) menos aquele devido à ligação no controle negativo. Corte normal(-----) foi calculado como a média mais 2 desvios padrão da populaçãonormal.

Figura 3 mostra uma comparação de níveis de autoanticorposp53 e NY-ESO em indivíduos normais e pacientes com câncer de pulmãoconforme medidos usando o ensaio de titulação de antígeno. Níveis deautoanticorpo são expressados como a OD650 devido à ligação no antígeno deteste (p53 ou NY-ESO) menos aquele devido à ligação no controle negativo.

Cortes normais (-----) foram calculados como a média mais 2 desvios padrãoda população normal.

Figura 4 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra p53 e NY-ESO em uma amostra de fluido de asciteretirada de um paciente com câncer de mama. Este paciente foi testado masfoi verificado que não produz autoanticorpos contra c-myc.

Figura 5 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra BRCA1, BRCA2 e FIER2 em uma amostra de soro deum paciente com câncer de mama (carcinoma dutal in sitn).

Figura 6 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra NY-ESO em uma amostra de soro de um paciente comcâncer de pulmão. Este paciente foi testado mas foi verificado que não produzautoanticorpos contra p53 ou c-myc.

Figura 7 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra NY-ESO e p53 em uma amostra de soro de um pacientecom câncer de pulmão. Este paciente foi testado mas foi verificado que nãoproduz autoanticorpos contra c-myc.

Figuras 8(a) e 8(b) ilustram os resultados sobre dois ensaios detitulação independentes para autoanticorpos contra p53, c-myc e NY-ESO-1em amostras de soro de um indivíduo "normal" (i.e. um indivíduo semevidência de câncer).

Figuras 9(a) e 9(b) mostram os resultados de dois ensaios detitulação independentes realizados em amostras de soro de um paciente únicocom câncer de mama invasivo usando uma variedade de antígenos diferentes.

Figuras 10(a) e 10(b) ilustram os resultados de ensaios detitulação nos quais amostras de soro de um indivíduo humano clinicamentenormal foram testadas para a presença de autoanticorpos usando antígenosbiotinilados BRCA2, HER2, c-myc e NY-ESO-1, não-biotinilado BRCA1 eprodutos de expressão de controle do vetor "empty" VOL, que codifica aetiqueta biotina mas não antígeno adicional.

Figura 11 ilustra os resultados de análise de autoanticorpo deum paciente com câncer de mama primário usando o ensaio de titulação deantígeno da invenção com respeito aos antígenos p53, c-myc e NY-ESO-1 eos produtos de expressão de controle do vetor "empty" VOL.

Figura 12 ilustra os resultados de uma repetição do ensaiomostrado na Figura 11 mas com soro de um indivíduo normal.

Figura 13 ilustra outros resultados obtidos usando o ensaio detitulação de antígeno em um paciente com câncer de mama primário mas quetambém mostra uma resposta de anticorpo à biotina.

Figura 14 ilustra os resultados de comparação experimentalsobre as amostras entre um ensaio de detecção de autoanticorpo quando oantígeno é titulado de acordo com a invenção e um ensaio de detecção deautoanticorpo no qual a quantidade de antígeno permanece constante mas osoro é titulado.

Figura 15 ilustra os resultados de uma comparaçãoexperimental, em uma amostra de um paciente com câncer de mama primárioentre um ensaio de detecção de autoanticorpo quando o antígeno é titulado deacordo com a invenção e um ensaio de detecção de autoanticorpo quando aquantidade de antígeno permanece constante mas o soro é titulado.

Descrição detalhada da invenção

A invenção em geral proporciona um método de imunoensaio

para detectar um anticorpo que serve como um marcador biológico de umestado doentio ou de uma suscetibilidade à doença, caracterizado pelo fato deque uma amostra a ser testada para a presença do anticorpo é testada paraligação específica contra quantidades diferentes de antígeno específico para oanticorpo e uma curva de titulação para a ligação de anticorpo / antígenoversus a quantidade de antígeno testada.

As características gerais de imunoensaios, por exemploELISA, radioimunoensaios e semelhante, são bem conhecidas por aquelaspessoas experientes na arte (veja Immunoassay, E. Diamandis e T.Christopoulos, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Imunoensaiospara a detecção de anticorpos possuindo uma especificidade imunológicageralmente requerem o uso de um reagente (antígeno) que exibe reatividadeimunológica específica com o anticorpo sob teste. Dependendo do formato doensaio este antígeno pode estar mobilizado sobre um suporte sólido. Umaamostra a ser testada para a presença do anticorpo é contatada com o antígenoe se anticorpos da especificidade imunológica requerida estiverem presentesna amostra eles reagirão imunologicamente com o antígeno para formaremcomplexo de anticorpo-antígeno que podem ser então detectados ouquantitativamente medidos.O método da invenção é caracterizado pelo fato de que umaamostra padronizada a ser testada para a presença do anticorpo é testadacontra uma pluralidade de quantidades diferentes de antígeno (também aquireferido como uma série de titulação). A amostra é testada contra pelo menosduas, e preferivelmente pelo menos três, quatro, cinco, seis ou setequantidades diferentes de antígeno. Ensaios típicos também podem incluir umcontrole negativo que não contém qualquer antígeno.

Neste contexto o termo "antígeno" refere-se a uma substânciacompreendendo pelo menos um determinante antigênico ou epítopo capaz deinteragir especificamente com o anticorpo alvo que é desejado detectar ouqualquer agente de captura interagindo especificamente com a região variávelou regiões determinantes de complementaridade de citado anticorpo. Oantígeno tipicamente será uma macromolécula biológica naturalmenteocorrente ou sintética tal como por exemplo uma proteína ou um peptídeo, umpolissacarídeo ou um ácido nucleico e pode incluir anticorpos ou seusfragmentos tais como anticorpos anti-idiótipo.

Leitores experientes reconhecerão que no método da invençãoa quantidade de determinantes antigênicos ou de epítopos disponíveis paraligação no anticorpo alvo é importante para estabelecer uma série de titulação.

Em muitos formatos de ensaio a quantidade de determinantes antigênicos ouepítopos disponíveis para ligação está diretamente correlacionada com aquantidade de moléculas de antígeno presentes. Contudo, em outrasmodalidades, tais como certos sistemas de ensaio em fase sólida, a quantidadede determinantes antigênicos ou epítopos expostos pode não se correlacionardiretamente com a quantidade de antígeno mas pode depender de outrosfatores, tal como ligação na superfície sólida. Nestas modalidades, referênciaaqui às "quantidades diferentes de antígeno" em uma série de titulação podeser tomada para se referir às quantidades diferentes do determinanteantigênico ou epítopo.A quantidade absoluta ou relativa de ligação específica entreanticorpo e antígeno é determinada para cada quantidade diferente deantígeno (determinante antigênico ou epítopo) usada e utilizada para plotar oucalcular uma curva da quantidade (relativa ou absoluta) de ligação específicaversus a quantidade de antígeno para cada quantidade de antígeno testada.

Resultados típicos são ilustrados, por meio de exemplo apenas,nas Figuras acompanhantes para detecção de numerosos anticorpos diferentes.

A presença na amostra de teste de anticorpo reativo com o antígeno usado noensaio é determinada baseado na quantidade de ligação específica observadaem cada quantidade de antígeno e é geralmente indicada por uma curvageralmente de forma S ou sigmóide. As quantidades absolutas de ligaçãoespecífica entre anticorpo e antígeno são geralmente não materiais, a não serque seja desejado produzir uma medição quantitativa. Para uma simplesdeterminação de sim / não da presença ou ausência de anticorpos é suficienteapenas que uma curva da forma correta seja produzida. Se não houvervariação em ligação detectável sobre as quantidades diferentes de antígenotestadas então isto poder ser pontuado como uma ausência de uma quantidadedetectável do anticorpo. Em modalidades preferidas da invenção o método énão-quantitativo. Portanto ele pode ser uma determinação de sim / não dapresença ou ausência de anticorpo usando uma relação proporcionaladimensional que é independente da força do sinal.

Uma medição da quantidade de anticorpo presente em umaamostra particular pode, se desejado, ser derivada dos resultados de ensaiosde titulação de antígeno.

O método da invenção é vantajoso para uso em ensaiosclínicos de diagnóstico, prognóstico, de predição e/ou de monitoração onde asquantidades absolutas de anticorpo alvo presente podem variar enormementede paciente para paciente. Os inventores têm observado que se tais ensaiossão baseados em detecção de ligação de anticorpo usando uma quantidade /concentração única de antígeno de teste, amostras de paciente contendo umaquantidade de anticorpo que está na extremidade muito baixa ou muito alta dafaixa fisiológica normal de quantidade de anticorpo através da populaçãopodem ser perdidas devido às limitações da metodologia de ensaio; amostrascom uma quantidade de anticorpo muito baixa pode ser pontuada comoresultados negativos falsos, enquanto que aquelas com níveis muito altos deanticorpo podem estar fora da escala para detecção acurada dentro dametodologia de ensaio escolhida.

O método de ensaio de titulação da invenção também éparticularmente adequado para a detecção de anticorpos / autoanticorposcomo marcadores biológicos de estado de doença ou suscetibilidade à doençaonde há variação considerável de paciente para paciente na especificidade ena afinidade dos anticorpos / autoanticorpos pelo antígeno alvo. Respostas deautoanticorpo por causa de sua natureza simples podem variarsignificativamente de paciente para paciente, com variação ocorrendo tantonas quantidades absolutas de autoanticorpo presente quanto na especificidade/ afinidade dos autoanticorpos. O método da invenção pode considerar estavariação de paciente para paciente, permitindo assim que um formato deensaio padrão seja desenvolvido para qualquer dado anticorpo / autoanticorpo.

Interações entre autoanticorpos e seus antígenos alvo sãogeralmente de afinidade baixa mas a força da ligação pode variar de pacientepara paciente, como esboçado acima. O método da invenção é particularmenteadequado para detecção de ligação de afinidade baixa, porque um resultadopositivo pode ser inferido da forma da curva de titulação.

O método da invenção também proporciona uma garantiacontra variação de dia para dia no desempenho de imunoensaios usados paradetecção de autoanticorpos / anticorpos para propósitos de diagnóstico /prognóstico e/ou monitoração (terapia ou estado de doença). Muitas vezes éobservado que pode haver variação considerável de dia para dia em força desinal quando se realizam imunoensaios para detecção de anticorpos emamostras compreendendo fluidos corporais de paciente. Tal variação podedecorrer, por exemplo, por causa de diferenças no modo no qual as amostrasforam obtidas e armazenadas antes do teste. Tais fatores tornam difícilpontuar os resultados de ensaios clínicos com certeza, por exemplo baseando-se em um valor de limite simples de ligação de anticorpo / antígeno. Apresente invenção minimiza os efeitos de uma tal variação de dia para diaporque um resultado positivo para a presença de anticorpo é claramenteevidente da forma da curva de titulação, independente da força de sinal.

Ainda outras vantagens do método da invenção são que elepermite diluição da amostra do paciente, ainda produz resultados consistentes,e também que ele geralmente produzirá o mesmo resultado de triagemqualitativa (positiva / negativa) usando fluidos corporais de fontes diferentesem um indivíduo (e.g. sangue ou soro versus fluido de ascite ou efusãopleural), embora a concentração absoluta de anticorpos possa ser diferente nosfluidos diferentes.

O método da invenção pode ser realizado em qualquer formaadequada que permita o contato entre uma amostra suspeita de conter oanticorpo e múltiplas quantidades diferentes de um antígeno.

Convenientemente, contato entre a amostra e quantidades diferentes doantígeno pode ocorrer em câmaras de reação separadas mas paralelas taiscomo as cavidades de uma placa de microtítulo. Quantidades variadas doantígeno podem ser revestidas sobre as cavidades da placa de microtítulo pelapreparação de diluições seriais de um estoque de antígeno através dascavidades da placa de microtítulo. O estoque de antígeno pode ser deconcentração conhecida ou desconhecida. Alíquotas da amostra de testepodem ser então adicionadas nas cavidades da placa, com o volume e adiluição da amostra de teste mantidos constantes em cada cavidade. Asquantidades absolutas de antígeno adicionadas nas cavidades da placa demicrotítulo podem variar dependendo de fatores tais como a natureza doanticorpo alvo, a natureza da amostra sob teste, a diluição da amostra de teste,etc, como será reconhecido por aquelas pessoas experientes na arte.Geralmente as quantidades de antígeno e a diluição da amostra de teste serãoselecionadas de modo a produzirem uma faixa de força de sinal que cai dentroda faixa de detecção aceitável da leitura escolhida para a detecção de ligaçãode anticorpo / antígeno no método. Quantidades e diluições típicas para testede amostras de soro de humano suspeitas de conterem autoanticorpos de anti-marcador de tumor são dadas nos exemplos acompanhantes.

Convenientemente as quantidades testadas de antígeno podem variar dentroda faixa de 0,01 ug/mL a 10 ug/mL.

Como supracitado, também é possível construir uma curva detitulação partindo de um único estoque de antígeno até mesmo quando aconcentração absoluta de antígeno no estoque for desconhecida. Desde queuma mesma única solução de estoque seja usada e serialmente diluída namesma maneira, é possível comparar os resultados de ensaios de titulaçãoseparados para esta corrida de antígeno sobre diferentes amostras de testeiniciais.

Em uma outra modalidade quantidades diferentes do antígeno(determinantes antigênicos ou epítopos) podem ser imobilizadas em sítios dereação ou localizações discretas sobre um suporte sólido. O suporte inteiropode ser então contatado com a amostra de teste e ligação de anticorpo emantígeno detectada ou medida separadamente em cada um dos sítios de reaçãoou localizações discretas. Suportes sólidos adequados também incluemmicroarranjos, por exemplo arranjos nos quais pontos ou sítios discretos sobreo arranjo compreendem quantidades diferentes do antígeno. Microarranjospodem ser preparados por imobilização de quantidades diferentes de umantígeno particular em sítios de reação resolvíveis, discretos sobre o arranjo.

Em outras modalidades a quantidade real de moléculas de antígenoimobilizadas pode ser mantida substancialmente constante mas o tamanho dossítios ou pontos sobre o arranjo variado com o objetivo de alterar a quantidadede epítopo de ligação disponível proporcionando uma série de titulação desítios ou pontos com quantidades diferentes de um epítopo de ligaçãodisponível. Em tais modalidades a concentração de superfície bidimensionaldo(s) epítopo(s) de ligação sobre o antígeno é importante na preparação dasérie de titulação, em vez da quantidade absoluta de antígeno. Técnicas para apreparação e interrogação de microarranjos de proteína / peptídeo sãogeralmente conhecidas na arte.

Será entendido da discussão acima que em todas asmodalidades da invenção variação na quantidade de antígeno pode seralcançada pela mudança da densidade de antígeno ou epítopo contra o qual aamostra é testada, ou pela manutenção da densidade de epítopo ou antígenomas aumentando a área superficial sobre a qual o antígeno está imobilizado,ou ambos.

Microarranjos podem ser usados para realizar ensaiosmúltiplos para anticorpos de especificidade diferente sobre a amostra únicaem paralelo. Isto pode ser feito usando arranjos compreendendo conjuntosmúltiplos de antígenos diferentes, cada conjunto compreendendo um antígenoparticular em múltiplas quantidades ou concentrações diferentes. O termo"antígenos diferentes" inclui antígenos derivados de proteínas oupolipeptídeos diferentes (tais como antígenos derivados de proteínas nãorelacionadas codificadas por genes diferentes) e também antígenos que sãoderivados de epítopos de peptídeo diferentes de uma única proteína ou de umúnico polipeptídeo. Um dado microarranjo pode incluir exclusivamenteconjuntos de antígenos diferentes derivados de proteínas ou polipeptídeosdiferentes, ou exclusivamente conjuntos de antígenos diferentes derivados deepítopos de peptídeo diferentes de uma única proteína ou de um únicopolipeptídeo, ou uma mistura dos dois em qualquer proporção. Deve sernotado que cada conjunto de antígenos individual de quantidades ouconcentrações diferentes em qualquer modalidade da invenção geralmentecompreenderá apenas um antígeno e não suas misturas.

Como aqui usado o termo "fluido corporal", quando sereferindo ao material a ser testado para a presença ou ausência de anticorposusando o método da invenção, inclui inter alia plasma, soro, sangue inteiro,urina, suor, linfa, fezes, fluido cerebroespinhal, ascite, efusão pleural, fluidoseminal, saliva, aspirado de mamilo, seroma pós-operativo ou fluido dedrenagem de ferimento. Como supracitado, os métodos da invenção sãopreferivelmente realizados in vitro em uma amostra de teste compreendendofluido corporal removido do indivíduo de teste. O tipo de fluido corporalusado pode variar dependendo da identidade do anticorpo a ser testado e dasituação clínica na qual o ensaio é usado. Em geral, é preferido realizar osensaios em amostras de soro ou de plasma. A amostra de teste pode incluiroutros componentes em adição ao fluido corporal tais como por exemplodiluentes, conservantes, agentes estabilizadores, tampões etc.

O termo "antígeno" é aqui usado em um sentido amplo para sereferir a qualquer substância que exibe reatividade imunológica específicacom um anticorpo alvo a ser detectado. Antígenos adequados podem incluir,mas não são limitados a, proteínas naturalmente ocorrentes, polipeptídeos ouproteínas sintéticas ou recombinantes, peptídeos sintéticos, miméticos depeptídeo, etc, também polissacarídeos e ácidos nucleicos. Especificamente,onde "antígeno" é aqui usado é intencionado para incluir qualquer agente decaptura, seja de origem de humano, de origem de mamífero ou diferente,capaz de interação imunológica específica com as regiões variáveis oudeterminantes de complementaridade do anticorpo a ser detectado. Porexemplo anticorpos anti-idiotípicos podem ser considerados como umantígeno para este propósito do mesmo modo que antígenos gerados porexibição de fago.Certos antígenos podem compreender ou ser derivados deproteínas ou polipeptídeos isolados de fontes naturais, incluindo mas nãolimitadas a proteínas ou polipeptídeos isolados de fluidos corporais ou tecidosde paciente. Em tais modalidades o antígeno pode compreendersubstancialmente toda a proteína naturalmente ocorrente; i.e. proteínasubstancialmente na forma na qual ela é isolada da fonte natural, ou podecompreender um fragmento da proteína naturalmente ocorrente. Para serefetivo como um antígeno no método da invenção qualquer tal "fragmento"tem que reter reatividade imunológica com os anticorpos para os quais eleserá usado para teste. Fragmentos adequados podem, por exemplo, serpreparados por clivagem química ou enzimática da proteína isolada.

Dependendo da natureza precisa do ensaio no qual será usadoo antígeno pode compreender uma proteína naturalmente ocorrente, ou seufragmento, ligada(o) em uma ou mais moléculas que proporcionam algumacaracterística desejável não naturalmente presente na proteína. Por exemplo, aproteína ou o fragmento pode ser conjugada(o) em um marcador revelador, talcomo polimerização em suspensão um marcador fluorescente, marcadorcoloridos, marcador luminescente, radiomarcador ou metal pesado tal comooutro coloidal. Em outras modalidades a proteína ou o fragmento pode serexpressada(o) como uma proteína de fusão. Por meio de exemplo, proteínasde fusão podem incluir um peptídeo de etiqueta na terminação-C ou -N paraauxiliar na purificação do antígeno recombinantemente expressado.

Dependendo do formato do ensaio no qual é para ser usado oantígeno pode estar imobilizado sobre um suporte sólido tal como, porexemplo, as cavidades de uma placa de microtítulo, chips ou glóbulos demicroensaio ou glóbulos magnéticos. Imobilização pode ser efetuada viaadsorção não covalente ou ligação covalente.

Qualquer meio de fixação adequado pode ser usado desde quenão afete adversamente a capacidade do antígeno para imunologicamentereagir com o anticorpo alvo em uma extensão significativa.

A invenção não é limitada aos ensaios em fase sólida, mastambém inclui ensaios que no todo ou em parte, são realizados em faselíquida, por exemplo ensaios de glóbulo em fase de solução.

Em uma modalidade, antígenos podem ser marcados com umligante que facilitaria imobilização, tal como biotina. O antígeno pode serentão diluído para uma faixa de titulação adequada e então permitido reagircom autoanticorpos em amostras de paciente em solução. Os complexosimunes resultantes podem ser então imobilizados sobre um suporte sólido viauma interação de ligante-receptor (e.g. biotina-estreptavidina) e o restante doensaio é realizado como descrito abaixo.

Para facilitar a produção de antígenos biotinilados, cDNAscodificadores de um antígeno de comprimento total, uma sua versão truncadaou um seu fragmento antigênico podem ser expressados como uma proteínade fusão marcada com uma etiqueta de proteína ou polipeptídeo na qual o co-fator biotina pode ser fixado via uma reação enzimática. Vetores para aprodução de antígenos biotinilados recombinantes estão comercialmentedisponíveis em numerosas fontes.

Como ilustrado nos exemplos acompanhantes, uma vantagemadicional do uso da abordagem de curva de titulação com antígenosbiotinilados é que o ensaio é capaz de distinguir entre ligação de componentebiotina em anticorpos anti-biotina e ligação verdadeira do antígeno em seuanticorpo cognato. Os inventores têm observado que um número significativode humanos da população humana naturalmente produzem anticorpos anti-biotina que pode levar à produção de resultados positivos falsos em ensaiosbaseados no uso de antígeno biotinilado.

Como supracitado, o "imunoensaio" usado para detectaranticorpos de acordo com a invenção pode ser baseado em técnicas padrãoconhecidas na arte, exceto que quantidades múltiplas de antígeno são usadaspara criar uma curva de titulação. Em uma modalidade mais preferida oimunoensaio pode ser ELISA. ELISAs são geralmente bem conhecidos naarte. Em um ELISA indireto típico um antígeno possuindo especificidadepara os anticorpos sob teste está imobilizado sobre uma superfície sólida (e.g.as cavidades de uma placa de ensaio de microtítulo padrão, ou a superfície deum microglóbulo ou um microarranjo) e uma amostra compreendendo fluidocorporal a ser testado para a presença de anticorpos é contatado com oantígeno imobilizado. Quaisquer anticorpos da especificidade acimamencionada presentes na amostra se ligarão no antígeno imobilizado. Oscomplexos de anticorpo / antígeno ligados podem ser então detectados usandoqualquer método adequado. Em uma modalidade preferida um anticorposecundário anti-imunoglobulina de humano marcado, que especificamentereconhece um epítopo comum para uma ou mais classes de imunoglobulinasde humano, é usado para detectar os complexos de anticorpo / antígeno.

Tipicamente o anticorpo secundário será anti-IgG ou anti-IgM. O anticorposecundário é normalmente marcado com um marcador detectável, tipicamenteum marcador de enzima tal como, por exemplo, fosfatase alcalina ouperoxidase, permitindo detecção quantitativa pela adição de um substrato paraa enzima que gera um produto detectável, por exemplo, um produto colorido,quimioluminescente ou fluorescente. Outros tipos de marcadores detectáveisconhecidos na arte podem ser usados com efeito equivalente.

A invenção refere-se a um método de detecção de anticorposque são marcadores biológicos de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença. Este aspecto particular da invenção preferivelmenteexclui ensaios planejados para testar anticorpos produzidos como umresultado de um desafio de vacina ou protocolo de imunização, diferente devacinação com marcadores de câncer. Portanto, ensaios de acordo com esteaspecto da invenção preferivelmente não incluem ensaios planejados paratestar a presença de anticorpos anti-virais ou anti-bacterianos após vacinação /imunização.

Em certas modalidades da invenção o anticorpo pode ser umautoanticorpo. Como indicado acima, o termo "autoanticorpo" refere-se a umanticorpo naturalmente ocorrente direcionado para um antígeno que o sistemaimune de um indivíduo reconhece como estranho embora aquele antígenorealmente originou no indivíduo. Autoanticorpos incluem anticorposdirecionados contra formas alteradas de proteínas naturalmente ocorrentesproduzidas por uma célula doente ou durante um processo de doença. Aforma alterada da proteína origina-se no indivíduo mas pode ser vista pelosistema imune do indivíduo como "não-própria" e assim gera uma respostaimune naquele indivíduo na forma de autoanticorpos imunologicamenteespecíficos para a proteína alterada. Tais formas alteradas de uma proteínapodem incluir, por exemplo, mutantes possuindo seqüência de aminoácidosalterada, opcionalmente acompanhados por mudanças em estruturasecundária, terciária ou quaternária, formas truncadas, variantes de editoração,glicoformas alteradas etc. Em outras modalidades o autoanticorpo pode serdirecionado para uma proteína que é sobreexpressada em um estado doentio,como um resultado de regulação transcricional anormal ou amplificação degene. Sobreexpressão de uma proteína que não é normalmente encontradapelas células do sistema imune em quantidades significativas pode dispararuma resposta imune acarretando a produção de autoanticorpo. Em aindaoutras modalidades o autoanticorpos podem ser direcionados para uma formafetal de uma proteína que se torna expressada em um estado doentio. Se umaproteína fetal, que é normalmente expressada apenas em estados iniciais dedesenvolvimento antes de o sistema imune se tornar funcional, se tornarexpressada em um estado doentio, a forma fetal pode ser reconhecida pelosistema imune como "estranha", disparando uma resposta imune acarretandoprodução autoanticorpo.

Em uma modalidade o anticorpo pode ser um autoanticorpoespecífico para uma proteína marcadora de tumor, e mais particularmente umautoanticorpo "câncer associado" anti-tumor.

O termo autoanticorpo "câncer-associado" anti-tumor refere-sea um autoanticorpo que é direcionado contra um epítopo presente em formasde proteínas marcadoras de tumor que são preferivelmente expressadas noestado doentio de câncer. A presença de tais autoanticorpos é característica doestado doentio de câncer, ou da predisposição para câncer em pacientesassintomáticos.

Em aplicações preferidas o método da invenção será usadopara detectar a presença de autoanticorpos câncer-associados anti-tumor empacientes ou indivíduos humanos e mais preferivelmente tomará a forma deum imunoensaio in vitro, realizado em uma amostra de teste compreendendouma amostra de fluido corporal retirada do indivíduo / paciente. A amostra defluido corporal pode ser diluída em um tampão adequado ou pode ser tratadapara armazenagem de duração longa ou diferentemente antes do teste.

Imunoensaios in vitro são não-invasivos e podem ser repetidostão freqüentemente quanto considerados necessários para desenvolver umperfil de produção de autoanticorpo em um paciente, quer antes do início dadoença, como na triagem de indivíduos "sob risco", quer durante todo o cursoda doença (adicionalmente discutido abaixo em relação às aplicaçõesrelacionadas do método).

Em modalidades particulares, mas não limitantes, os métodosda invenção podem compreender imunoensaios para (simultaneamente)detectar dois ou mais tipos de autoanticorpos, cada um possuindoespecificidade para epítopos diferentes sobre proteínas marcadoras de tumorrelacionadas ou iguais (e.g. variantes ou isoformas diferentes codificadas porum gene único) ou para epítopos sobre proteínas marcadoras de tumordiferentes (significando proteínas codificadas por genes diferentes). Estesmétodos tipicamente envolverão o uso de um painel de dois ou maisconjuntos de antígenos, cada conjunto de antígenos normalmente sendoderivado de uma proteína marcadora de tumor diferente (diferente nestecontexto significando proteínas que são os produtos de genes diferentes)embora como notado acima um conjunto de antígenos também possa envolverepítopos diferentes sobre a mesma proteína marcadora de tumor. Um conjuntode antígenos refere-se ao antígeno único a ser detectado em quantidades /concentrações diferentes no método da invenção. Estes métodos, que podemser daqui em diante referidos como "ensaios de painel", utilizam um painel dedois ou mais conjuntos de antígenos para monitorar a resposta imune total deum indivíduo para um tumor ou outra mudança neoplásica / carcinogênica.Estes métodos assim detectam um "perfil" da resposta imune em um dadoindivíduo; indicando que marcadores de tumor geram uma resposta imuneresultando em produção de autoanticorpo. O uso de um painel de dois ou maisantígenos para monitorar a produção de autoanticorpos contra dois ou maismarcadores de tumor diferentes é geralmente mais sensível do que a detecçãode autoanticorpos em marcadores únicos e dá uma freqüência muito menorde resultados negativos falsos (veja WO 99/58978 e W0.2004/044590, cujosconteúdos são aqui incorporados em sua totalidade como referências).

Portanto, em uma modalidade não limitante a invençãoproporciona um método de detecção de dois ou mais anticorpos em umaamostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduomamífero no qual pelo menos um dos citados anticorpos é um marcadorbiológica de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença, o métodocompreendendo:

(a) contactar a amostra de teste com dois ou mais conjuntos deantígenos, no qual cada um dos citados conjuntos de antígenos é específicopara um dos citados anticorpos a serem detectados na amostra de teste e noqual cada conjunto de antígenos compreende uma pluralidade de quantidadesdiferentes de citado antígeno,(b) detectar a quantidade de ligação específica entre os citadosanticorpos e os citados antígenos, e

(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada conjunto deantígenos usado em etapa (a).

Em uma modalidade cada um dos citados dois ou maisanticorpos será um marcador biológico de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença, contido está dentro do escopo da invenção combinarum ensaio de titulação para um antígeno marcador de doença com um ensaiode titulação para qualquer outro tipo de anticorpo, que pode ou não ser ummarcador de doença, na mesma amostra de teste.

Qualquer modo de julgamento de se os anticorpos relevantesestão ou não presentes na amostra de teste é baseado na quantidade de ligaçãoespecífica observada em cada uma das concentrações de antígeno diferentescom respeito a cada antígeno diferente no teste, em outras palavras os valorescoletivos para cada antígeno em vez de uma leitura em uma únicaconcentração para cada antígeno. Assim, a determinação da presença ouausência de estado doentio ou de suscetibilidade à doença ou de anticorpospara uma substância estranha em uma amostra de paciente baseado napresença de dois ou mais tipos de anticorpo pode ser baseada nestes valorescoletivos para cada antígeno. Preferivelmente, o julgamento é feito baseadona exibição de uma curva de forma de S ou sigmóide com respeito a qualquerum dos ou a todos os antígenos presentes no teste.

Para evitação de dúvida, ensaios baseados no uso de um tipoúnico de antígeno para detectar anticorpos podem ser aqui referidos como"ensaios de marcador único", enquanto que ensaios baseados no uso de umpainel de dois ou mais antígenos são referidos como "ensaios de painel".

O método da invenção pode ser adaptado para uso na detecçãode autoanticorpos para essencialmente qualquer proteína marcadora de tumorpara a qual um antígeno adequado pode ser preparado, como um ensaio demarcador único ou como um componente de um ensaio de painel. Emparticular, o método pode ser adaptado para detectar / medir autoanticorpospara a proteína receptor de fator de crescimento epidérmico EGFR(Downward et al (1984) Nature. 307: 521-527; Robertson et al. (2001Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126; 177-81), a glicoproteínaMUC1 (Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: 271-283) e asproteínas regulatórias de ciclo celular / transdução de sinal Myc (Blackwood,E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609), p53(Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985)Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893) e ras (or Ras) (Capella, G. et al. (1991)Environ Health Perspectives. 93: 125-131), e também BRCA1 (Scully, R. etal. (1997) PNAS 94:5605-10), BRCA2 (Sharan, S. K. et al. (.1997) Nature.386: 804-810) , APC (Su, L. K. et al. (1993) Câncer Res. 53: 2728-2731;Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50), CA125 (Nouwen, E. J. et al.(1990). Differentiation 45: 192-8), PSA (Rosenberg, R. S. et al. (1998)Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939), antígeno carcinoembrônicoCEA (Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Apr 47(4):624-30), CAI9.9 (Haga, Y.et al (1989) Clin Biochem (1989) Oct 22(5): 363-8), NY-ESO-1 (antígeno decâncer/testículo; Chen, Y.-T. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 94: 19141918,1997), PSMA (antígeno de membrana específica de próstata; Israeli, R. S. etal., Câncer Res. 53: 227-230, 1993), PSCA (antígeno de célula-tronco depróstata; Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 95: 1735-1740, 1998) eEpCam (molécula de adesão celular epitelial; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad.Sei. 87: 3542-3546, 1990), HER2 (também conhecido como c-erbB2Coussens, L. et al., Science-230: 1132-1139, 1985), CAGE (Jager D, et al.,Câncer Res. 1999 Dec 15;59(24):6197-204; Mashino K, et al., Br J Câncer.2001 Sep l;85(5):713-20), citoqueratinas (Moll R, et al., Cell. 1982Nov;31(1): 11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000; 342: 525-533),recoverina (Maeda A, et al., Câncer Res. 2000 Apr 1;60(7): 1914-20,calicreínas (Kim H, et al., Br J Câncer 2001;84:643-650; Yousef GM, et al.,Tumor Biol 2002;23:185-192); anexinas (Hudelist G, et al, Breast CâncerRes Treat. 2004 Aug;86(3):281-91), ct-fetoproteína (Stiller D, et al., ActaHistochem Suppl. 1986;33:225-31), GRP78 (Block TM, et al., Proc NatlAcad Sei USA. 2005 Jan 18;102(3):779-84; Hsu WM, et al., Int J Câncer.2005 Mar 1;113(6):920-7), CA125 (Norum LF, et al., TumourBiol. 2001 Jul-Aug;22(4):223-8; Perey L, et al., Br J Câncer. 1990 Oct;62(4):668-70; DevinePL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun;12(3):709-17); mamoglobina(Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov;50(l l):2069-76; Zehentner BK,Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr;37(4):249-57), raf (Callans LS. et al., AnnSurg Oncol. 1995 Jan; 2(l):38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998Dec; 189(1-2): 119-25), beta-gonadotropina coriônica humana b-HCG (AyalaAR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr-May;3(3): 149-51; Gregory JJ Jr,et al., Drugs. 1999 Apr; 57 (4):463-7), ou antígeno 4-5 (Krause P, et al, JImmunol Methods. 2003 Dec; 283(l-2):261-7). Contudo, a invenção não éintencionada para ser limitada à detecção de autoanticorpos para estesmarcadores de tumor particulares.

Quaisquer métodos de acordo com a invenção baseados nadetecção de autoanticorpos anti-marcador de tumor (na forma de ensaio depainel ou de marcador único) podem ser empregados em uma variedade desituações clínicas diferentes. Em particular, o método pode ser usado nadetecção ou no diagnóstico de câncer, na avaliação do prognóstico de umpaciente diagnosticado com câncer, na predição de resposta à terapia, namonitoração do progresso de câncer ou de outras doenças neoplásicas em umpaciente, na detecção de mudança neoplásica inicial ou carcinogênica inicialem um indivíduo humano assintomático, na triagem de uma população deindivíduos humanos assintomáticos com o objetivo de quer identificar aquelesindivíduos que estão sob risco de desenvolvimento de câncer querdiagnosticar a presença de câncer, na predição da resposta de um pacientecom câncer ao tratamento de anti-câncer (e.g. vacinação, terapias detransdução de sinal ou anti-fator de crescimento, radioterapia, terapiaendócrina, terapia com anticorpo de humano, quimioterapia), na detecção dedoença recorrente em um paciente previamente diagnosticado comopossuindo câncer que tem sofrido tratamento de anti-câncer para reduzir aquantidade de câncer presente, ou na detecção de uma terapia de anti-câncer(e.g. vacinação, terapias de transdução de sinal ou anti-fator de crescimento,radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpo de humano,quimioterapia), para uso em um paciente particular.

Os inventores têm geralmente observado que níveis deautoanticorpos câncer-associados mostram uma correlação positiva com oestado doentio (veja também WO 99/58979, cujo conteúdo é aqui incorporadocomo referência). Conseqüentemente, quando o método da invenção é usadoem aplicações clínicas níveis aumentados de autoanticorpos de marcador detumor, em comparação com controles adequados são geralmente consideradoscomo uma indicação do estado doentio de câncer.

Por exemplo, quando os imunoensaios são usados nodiagnóstico de câncer, a presença de um nível aumentado de autoanticorpos,em comparação com os indivíduos de controle "normais", é consideradacomo uma indicação de que o indivíduo possui câncer. Os indivíduos decontrole "normal" preferivelmente serão controles combinados por idade nãopossuindo qualquer diagnóstico de câncer baseado em critérios clínicos, deimagem e/ou bioquímicos.

Quando os imunoensaios são usados na predição de respostade um paciente canceroso ao tratamento de anti-câncer (e.g. vacinação,terapias de transdução de sinal ou anti-fator de crescimento, radioterapia,terapia endócrina, terapia com anticorpo de humano, quimioterapia), apresença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com osindivíduos de controle "normais", pode ser considerada como uma indicaçãode que se o indivíduo provavelmente responderá ou não ao tratamento de anti-câncer. Os indivíduos de controle "normais" preferivelmente serão controlescombinados por idade não possuindo qualquer diagnóstico de câncer baseadoem critérios clínicos, de imagem e/ou bioquímicos. Para cada um dostratamento listados acima, uma relação entre o nível de autoanticorposcomparado com os controles e provável sucesso do tratamento pode serestabelecida por observação do resultado de tal tratamento em pacientes cujoestado de autoanticorpo é monitorado durante todo o tratamento. A relaçãopreviamente estabelecida pode ser então usada para predizer a probabilidadede sucesso para cada tratamento em um dado paciente baseado na avaliaçãode estado de autoanticorpo.

Quando os imunoensaios são usados em monitoração doprogresso de câncer ou de outra doença neoplásica em um paciente, apresença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com um"controle normal", é considerada como uma indicação da presença de câncerno paciente. O "controle normal" pode ser níveis de autoanticorpos presentesem indivíduos de controle, preferivelmente combinados por idade, nãopossuindo qualquer diagnóstico de câncer baseado em critérios clínicos, deimagem e/ou bioquímicos. Alternativamente, o "controle normal" pode serum nível de "linha base" estabelecido para o paciente particular sob teste. Onível de "linha base" pode ser, por exemplo, o nível de autoanticorpospresente quando foi feito quer um primeiro diagnóstico de câncer quer umdiagnóstico de câncer recorrente. Qualquer aumento acima do nível de linhabase seria considerado como uma indicação de que a quantidade de câncerpresente no paciente tem aumentado, enquanto que qualquer diminuiçãoabaixo da linha base seria considerada como uma indicação de que aquantidade de câncer presente no paciente tem diminuído. O valor de "linhabase" também pode ser, por exemplo, o nível antes de um tratamento novo seriniciado. Uma mudança no nível de autoanticorpos seria considerada comouma indicação da efetividade da terapia. A direção da "mudança" (i.e.aumento versos diminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamentoserá dependente da natureza precisa do tratamento. Para qualquer tratamentodado a direção da "mudança" em níveis de autoanticorpo indicando umresultado positivo pode ser prontamente determinada, por exemplo pormonitoração de níveis de autoanticorpos em comparação com outrosindicadores bioquímicos ou clínicos de resposta ao tratamento.

Quando os imunoensaios são usados em triagem de umapopulação de indivíduos humanos assintomáticos esta pode ser a identificaçãodaqueles indivíduos que estão sob risco de desenvolvimento de câncer,indivíduos possuindo um nível elevado de autoanticorpos, em comparaçãocom indivíduos de controle "normais", são identificados como estando "sobrisco" de desenvolvimento de câncer. Os indivíduos de controle "normais"preferivelmente serão controles combinados por idade não identificados comopossuindo qualquer predisposição para desenvolvimento de câncer ouqualquer risco elevado significativo de desenvolvimento de câncer. Umaexpectativa para isto pode ser onde a própria idade é um fator der risco maior.

Quando os imunoensaios são usados em triagem de umapopulação de indivíduos humanos assintomáticos esta pode ser o diagnósticode câncer naqueles indivíduos que já têm desenvolvido câncer, indivíduospossuindo um nível elevado de autoanticorpos em comparação comindivíduos de controle "normais" sendo pontuados como possuindo câncer oualguma forma de mudança neoplásica. Os indivíduos de controle "normais"preferivelmente serão controles combinados por idade não identificados comopossuindo qualquer predisposição para desenvolvimento de câncer ouqualquer risco significativo de desenvolvimento de câncer. Uma expectativapode ser onde a própria idade é um fator de risco maior. Alternativamente; o"controle normal" pode ser um nível de "linha base" estabelecido para opaciente particular sob teste. O nível de "linha base" pode ser, por exemplo, onível de autoanticorpos presente quando o paciente foi primeiro testado e foiverificado que possui níveis não elevados acima dos de uma população de"controle normal". Qualquer aumento posterior contra esta medição de linhabase seria considerado como uma indicação da presença de câncer naqueleindivíduo. Assim o indivíduo poderia por meio de um tal teste de linha basese tornar seu próprio controle para medição futura de autoanticorpo.

Quando os imunoensaios são usados na monitoração daresposta de um paciente canceroso ao tratamento de anti-câncer (e.g.vacinação, terapias de transdução de sinal ou anti-fator de crescimento,radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpo de humano,quimioterapia), a presença de um nível alterado de autoanticorpos após otratamento é considerada como uma indicação de que o paciente temrespondido positivamente ao tratamento. Um nível de linha base deautoanticorpos considerado antes de o tratamento ser iniciado pode ser usadopara propósitos de comparação com o objetivo de determinar se o tratamentoresulta em um "aumento ou diminuição" em níveis de autoanticorpo. Umamudança no nível de autoanticorpos seria considerada uma indicação daefetividade da terapia. A direção da "mudança" (i.e. aumento versosdiminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamento será dependenteda natureza precisa do tratamento. Para qualquer tratamento dado a direção da"mudança" em níveis de autoanticorpo indicando um resultado positivo podeser prontamente determinada, por exemplo por monitoração de níveis deautoanticorpos em comparação com outros indicadores bioquímicos ouclínicos de resposta ao tratamento.

O método da invenção pode ser usado na predição e/ou namonitoração da resposta de um indivíduo a essencialmente qualquertratamento de anti-câncer conhecido. Isto inclui, por exemplo terapia deanticorpo de humano na qual anticorpos monoclonais ou policlonais sãoadministrados ao paciente, um exemplo específico não-limitante sendo porexemplo tratamento com o anticorpo anti-fator de crescimento Herceptina(Baselga,. J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1996). Apresença de uma resposta de autoanticorpo natural pode intensificar ou inibira efetividade de tratamento com anticorpos terapêuticos artificialmenteadministrados. Com o uso do método da invenção é possível correlacionar aresposta a qualquer tratamento de anti-câncer, incluindo terapia de anticorpo,com níveis naturais de autoanticorpos antes do ou durante o curso dotratamento em qualquer paciente ou grupo de pacientes. Este conhecimentopode ser então por sua vez usado para predizer como outros pacientes (ou omesmo paciente no caso de tratamento repetido) responderão ao mesmotratamento.

Quando os imunoensaios são usados na detecção de doençarecorrente, a presença de um nível aumentado de autoanticorpos no paciente,em comparação com um "controle normal", é considerada como umaindicação de que a doença tem retornado. O "controle normal" pode ser níveisde autoanticorpos presentes em indivíduos de controle, preferivelmentecombinados por idade não possuindo qualquer diagnóstico de câncer baseadoem critérios clínicos, de imagem e/ou bioquímicos.

Alternativamente, o "controle normal" pode ser um nível de"linha base" estabelecido para o paciente particular sob teste. O nível de"linha base" pode ser, por exemplo, o nível de autoanticorpos presentedurante um período de remissão da doença baseado em critérios clínicos, deimagem e/ou bioquímicos.

O método de ensaio da invenção pode ser aplicado na detecçãode muitos tipos diferentes de câncer, cujos exemplos são cânceres de mama,de bexiga, colorretal, de próstata, de pulmão, pancreático e de ovário. Osensaios podem complementar os métodos existentes de triagem e desupervisão. Por exemplo no caso de câncer de mama primário imunoensaiospara autoanticorpos poderiam ser usados para alertar médicos clínicos pararealizar biópsia de lesões pequenas sobre mamogramas que radiograficamentenão parecem suspeitas ou para realizar imagem de mama ou para repetirimagem mais cedo do que o planejado. Em clínica é esperado que os métodosde ensaio da invenção sejam mais objetivos e reproduzíveis comparados comas técnicas de imagem correntes (i.e. mamografia e ultra-som), cujo sucessopode ser dependente do operador.

"Ensaios de painel" podem ser ajustados tendo emconsideração a aplicação clínica particular. Um painel de antígenos paradetecção de autoanticorpos para pelo menos p53 e c-erbB2 é particularmenteútil para muitos tipos de câncer e pode ser opcionalmente suplementado comoutros marcadores possuindo uma associação conhecida com o câncerparticular, ou um estágio do câncer particular, a ser detectado. Por exemplopara câncer de mama o painel pode incluir MUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCA1e/ou BRCA2 e/ou PSA enquanto que para câncer de bexiga o painel podeincluir opcionalmente MUC 1 e/ou c-myc, para câncer colorretal ras e/ouAPC, para câncer de próstata PSA e/ou BRCA 1 e/ou BRCA2 ou para câncerovariano BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou CA125. Há outras modalidades preferidasnas quais p53 ou c-erbB2 não são necessariamente essenciais.

No caso de câncer de mama painéis adequados poderiam serselecionados dos seguintes p53 e MUC 1 com opcional c-erbB2 e/ou c-myc,e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; p53 e c-myc com opcional c-erbB2 e/ou MUC1 e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSAe/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; p53 e BRCA1 com opcional c-erB2 e/ou MUC 1e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; p53 eBRCA2 com opcional c-erbB2 e/ou MUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCA1 e/ouPSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; c-erbB2 e MUC 1 com opcional p53 e/ouc-myc, e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; c-erbB2 e c-myc com opcional p53 e/ou MUC1 e/ou BRCA1 e/ou BRCA2 e/ouPSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; c-erbB2 e BRCA1 com opcional p53 e/ouMUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou BRC1; c-erbB2 e BRCA2 com opcional p53 e/ou MUC 1 e/ou c-myc -e/ou BRCA1e/ou PSA; p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2.

No caso de câncer colorretal painéis adequados poderiam serselecionados por exemplo dos seguintes:

p53 e ras com opcional c-erbB2 e/ou APC; p53 e APC comopcional c-erbB2 e/ou Ras; Ras e APC com opcional p53 e/ou c-erbB2. Taispainéis também podem incluir CEA ou CA 19-9.

No caso de câncer de próstata os painéis adequados poderiamser selecionados por exemplo dos seguintes:

p53 e PSA com opcional BRCA1 e/ou BRCA2 e/ou c-erbB2;c-erbB2 e PSA com opcional p53 e/ou BRCA1 e/ou BRCA2; PSMA, PSCA ecalicreínas.

No caso de câncer ovariano os painéis adequados poderiam serselecionados por exemplo dos seguintes:

p53 e CA125 com opcional c-erbB2 e/ou BRCA1 e/ouBRCA2;

c-erbB2 e CA125 com opcional p53 e/ou BRCA1 e/ouBRCA2;

HER2, anexinas, CAGE e 4-5.

No caso de câncer de pulmão os painéis adequados poderiamser selecionados de:

p53 e NY-ESO-1, opcionalmente com outros marcadores;HER2, anexinas, CAGE e 4-5.

Onde o método da invenção é usado para realizar um "ensaiode painel" baseado em dois ou mais antígenos marcadores de tumor derivadosde proteínas diferentes, pelo menos um dos antígenos no painel tem que sertestado em um ensaio de acordo com a invenção baseado no teste de múltiplasquantidades diferentes do antígeno para formar uma curva de titulação.Preferivelmente cada um dos antígenos formadores do painel é testado deacordo com o ensaio da invenção e uma curva de titulação é plotada /calculada para cada antígeno diferente no painel.

A invenção também contempla que um ensaio de titulaçãopara detecção de pelo menos um anticorpo anti-marcador de tumor pode serusado pode ser usado em combinação com um ensaio planejado para detectarpelo menos uma proteína marcadora de tumor (que pode estar relacionada ounão relacionada com o antígeno usado no ensaio de titulação) na mesmaamostra do paciente. Assim ensaios para autoanticorpos anti-marcador detumor e ensaios para proteínas marcadoras de tumor podem ser realizados emparalelo em uma única amostra de paciente.

Em uma outra modalidade, o método de imunoensaio dainvenção pode ser usado na seleção de uma vacina anti-câncer para uso emum paciente particular. Nesta modalidade uma amostra de fluido corporalretirada do paciente é testada usando um painel de dois ou mais antígenos,cada um correspondendo a uma proteína marcadora de tumor diferente, com oobjetivo de determinar a força relativa da resposta imune do paciente paracada uma das proteínas marcadoras de tumor diferentes. A "força da respostaimune" para uma dada proteína marcadora de tumor ou para proteínasmarcadoras de tumor é indicada pela presença e/ou pela quantidade deautoanticorpos câncer-associados específicos para aquela proteína marcadorade tumor detectada usando o imunoensaio; onde os autoanticorpos sãoquantificados, quanto maior o nível de autoanticorpos câncer-associados, maisforte a resposta imune. A proteína marcadora de tumor ou as proteínasmarcadoras de tumor identificada(s) como geradora(s) da resposta imune maisforte ou das respostas imunes mais fortes no paciente (i.e. o nível mais alto deautoanticorpos) é ou são então selecionada(s) para formar(em) a base de umavacina anti-câncer para uso no paciente.A utilidade do método da invenção não é limitada à detecçãode autoanticorpos anti-tumor, embora o ensaio seja particularmente útil paraeste propósito. Câncer é apenas um exemplo de uma doença na qual detecçãode autoanticorpos pode ser usada como um marcador biológico para estadodoentio / suscetibilidade à doença. Os inventores têm mostrado que vantagenssubstanciais são ganhas pelo uso de uma abordagem de titulação para detectarautoanticorpos em amostras de paciente. Portanto é razoável concluir quevantagens similares serão ganhas pelo uso da abordagem de titulação paradetectar autoanticorpos que são marcadores biológicos para doençasdiferentes de câncer. O método é portanto aplicável para a detecção dequalquer autoanticorpo que serve como um marcador biológico para umestado doentio ou uma suscetibilidade à doença, em qualquer doença que temsido mostrada (ou pode ser mostrada) associada com produção deautoanticorpo.

Outras aplicações do método da invenção incluem, mas nãosão limitadas a, detecçãop de autoanticorpos que são marcadores biológicosde doença autoimune, tais como por exemplo artrite reumatóide, lúpuseritematoso sistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC), tiroiditeautoimune (e.g. tiroidite de Hashimito), gastrite autoimune (e.g. anemiaperniciosa), adrenalite autoimune (e.g. doença de Addison),hipoparatiroidismo autoimune, diabete autoimune (e.g. diabete de tipo 1) oumiastenia grave e triagem de amostras de paciente para doença renal ouhepática acarretando insuficiência ou falha de qualquer órgão, e para triagemde amostras de paciente após transplante para detectar a presença deanticorpos direcionados contra o tecido doente (que tem sido deixado in situapós o transplante) ou contra o tecido transplantado.

Em um outro aspecto a invenção relaciona-se a um método dedeterminação de um anticorpo em uma amostra compreendendo um fluidocorporal de um indivíduo mamífero, no qual o citado anticorpo é direcionadocontra uma substância estrangeira introduzida no citado indivíduo mamífero,o método compreendendo:

(a) contactar a amostra com uma pluralidade de quantidadesdiferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,

(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno, e

(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a).

Preferivelmente, nesta modalidade da invenção o métodoinclui como etapa (d) detectar a presença de citado anticorpo baseado naquantidade de ligação específica entre o citado anticorpo e o citado antígenoem cada diferente concentração de antígeno usada, em outras palavras, osvalores coletivos observados para um antígeno particular. Preferivelmente, apresença na amostra de teste de anticorpo reativo com o antígeno usado noensaio é indicada por uma curva geralmente de forma de S ou sigmóide.

Neste aspecto da invenção a metodologia de titulação pode serusada para avaliar a reposta imune de um indivíduo mamífero, epreferivelmente de um indivíduo humano, para qualquer substância estranhaintroduzida no citado indivíduo.

Em uma modalidade a substância estranha pode ser um agenteterapêutico, tal como por exemplo uma droga ou pró-droga, terapia deanticorpo de humano ou vacina. O método da invenção pode ser usado paraavaliar se a administração de um agente terapêutico a um paciente disparauma resposta imune acarretando a produção de anticorpos específicos para umepítopo sobre o agente terapêutico, ou um componente de um veículo deliberação, excipiente, ou agente de transporte etc. administrado com o agenteterapêutico.

A natureza precisa do agente terapêutico não é limitante para ainvenção. Em modalidades não limitantes o método da invenção pode serusado para avaliar resposta imune às moléculas pequenas sintéticas,substâncias naturalmente ocorrentes, agentes biológicos naturalmenteocorrentes ou sinteticamente produzidos, ou qualquer combinação de dois osmais dos citados acima, opcionalmente em combinação com excipientes,agentes de transporte ou veículos de liberação.

Em uma modalidade útil o método da invenção pode ser usadopara avaliar a resposta imune a uma porção não-alvo de um agente terapêuticoou de uma vacina. Porção "não-alvo" significa uma parte componente doagente terapêutico ou da vacina administrado(a), no caso de um agenteterapêutico, não é intencionada para gerar produção de anticorpos nohospedeiro. A porção não-alvo pode estar presente, por exemplo, para facilitarpurificação de agente terapêutico ou da vacina ou pode ser planejada paraauxiliar na liberação, captação ou triagem de vacina / agente terapêutico.

Exemplos de tais porções "não-alvo" incluem, mas não são limitadas a,ligadores e marcadores comumente ligados em polipeptídeosrecombinantemente expressados tais como marcadores biotina, etiquetashistidina etc.

Em outra modalidade desta aspecto da invenção, a substânciaestranha pode ser um agente infeccioso, tais como fungo, bactéria, vírus ouparasita.

A invenção será adicionalmente entendida com referência aosseguintes exemplos experimentais não limitantes:

Exemplo 1 - Protocolo geral para titulação de antígeno em umensaio de autoanticorpo

Amostras de antígenos marcadores de tumor (biotinilados)podem ser preparadas por expressão recombinante, seguindo métodosanálogos àqueles descritos em WO 99/58978.

Resumidamente, cDNAs codificadores de antígenosmarcadores foram clonados no vetor pET21 (Invitrogen) que tem sidomodificado para codificar uma etiqueta biotina e uma etiqueta óxhistidinapara auxiliar na purificação da proteína expressada. Os clones resultantes sãocrescidos em uma célula hospedeira bacteriana adequada (em corpos deinclusão), as bactérias são lisadas e desnaturadas e os antígenos expressadossão recuperados via colunas de afinidade de quelato de níquel (Hi-trap,comercialmente disponível na Amersham, seguindo o protocolo dofabricante). Os antígenos expressados, foram renaturados por diálise emtampão apropriado e o rendimento de proteína expressada foi avaliado porSDS-PAGE, Western blot e ELISA e quantificado antes da armazenagem.

O controle negativo VOL é vetor empty (i.e. cDNA nãoclonado) que ainda inclui as seqüências de etiqueta de biotina e His).

Números de acesso no GenBank para numerosos cDNAsmarcadores são os seguintes:

P53:B003596

c-myc: V00568

domínio extracelular ECD6 (HER2): Ml 1730 NY-ESO: NM001327

BRCA2: U43746

BRCA1 delta 9-10: NM 007302

1. Antígenos e VOL (controle negativo) foram diluídos paraconcentrações apropriadas em tampão carbonato 0,1 M então diluídosserialmente para formar uma faixa de titulação em semi-log (veja tabela 1).Diluições de antígeno foram dispensadas a 50 uL/cavidade nas filas de umaplaca de microtítulo Falcon de acordo com o leiaute da placa usando umapipeta eletrônica de multicanais. As placas foram cobertas e armazenadas a4°C por 48 horas.

2. Placas foram lavadas uma vez em PBS + 0,1% tween 20usando uma lavadora de placas automática então foram secas sobre papeltecido.

3. Placas foram bloqueadas com tampão de incubação salinoalto (HSB, PBS + 0,5 M NaCl + 0,1% caseína) a 200 ^L/cavidade por umahora ou até requerido para uso (armazenadas cobertas a 4°C).

4. Amostras de soro foram descongeladas, turbilhonadas ediluídas 1/100 em HSB na temperatura ambiente.

5. Placas foram esvaziadas e secas sobre papel tecido. Cadaamostra de soro diluída foi dispensada a 50 uL/cavidade para dentro de todasas cavidades da placa de microtítulo usando uma pipeta eletrônica demulticanais. Anticorpos de controle foram diluídos 1/1000 em HSB edispensados para dentro de cavidades apropriadas da placa final. Placas foramcobertas e incubadas por 1,5 horas na temperatura ambiente com agitação.

6. Etapa de lavagem: Placas foram lavadas três vezes em PBS+ 0,1% tween 20 usando uma lavadora de placas automática então foramsecas sobre papel tecido.

7. Ig de coelho anti-humano conjugada com peroxidase derábano (Jackson, 1/10.000 em HSB) foi dispensada a 50 uL/cavidade emtodas as cavidades da placa de microtítulo. Ig de coelho anti-camundongoconjugada com HRP (1/1000 em HSB) foi dispensada nas cavidades decontrole contendo anticorpo anti-antígeno. Placas foram incubadas natemperatura ambiente por 1 hora com agitação.

8. Placas foram lavadas como na etapa 6.

9. Substrato TMP anteriormente preparado foi adicionado a 50uL/cavidade e a placa foi incubada sobre a bancada por 10 min. Placas foramcuidadosamente golpeadas para misturar.

10. Densidade óptica das cavidades foi determinada a 650 nmusando um protocolo de leitora de placa padrão.Tabela 1: Leiautes de placa padrão

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Placas BRCA

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Exemplo 2 - Detecção de autoanticorpos em câncer de mamaprimário

Os seguintes dados foram obtidos de um estudo piloto paraavaliar a sensibilidade e a reprodutibilidade de um painel de ensaios deautoanticorpo por titulação em câncer de mama primário (PBC). O estudoincluiu soro de 17 mulheres sem evidência de câncer e amostras de soro, antesda operação, de 20 mulheres com câncer de mama primário. Amostras decâncer e normais foram igualadas por idade. Uma amostra normal e trêsamostras de câncer tiveram que ser removidas do estudo porque mostraramevidência de respostas de anticorpo anti-biotina e portanto não puderam seravaliadas usando o ensaio em seu formato presente. E considerado queaproximadamente 10% da população desenvolve uma resposta imune contrabiotina.

O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo dado noexemplo 1 usando os antígenos p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2

Figura 1 dá exemplos de curvas obtidas quando o ensaio detitulação de antígeno foi usado para medir autoanticorpos p53 em soro. Podeser visto que o soro do paciente canceroso 17766(C) liga-se fortemente noantígeno de teste (p53) com uma curva sigmóide característica mas não se ligano controle negativo, VOL. Em comparação, soro de um indivíduo normal,18052(N) não dá uma curva de titulação para ligação no antígeno de teste ouno controle negativo.

Níveis de autoanticorpo foram expressados como a densidadeóptica (650 nm) devido à ligação no antígeno de teste menos aquela devido àligação no controle negativo (VOL). O corte normal foi calculado como 95°percentil (média + 2 desvios padrão) do grupo normal. Isto é mostrado comoa linha tracejada na Figura 2, na qual níveis de autoanticorpo anti-p53 emindivíduos normais são comparados com pacientes cancerosos. Pode ser vistoque o grupo canceroso mostra níveis de autoanticorpo geralmente mais altos etambém possui uma proporção maior de indivíduos com níveis acima docorte.

O painel consistiu de quatro antígenos; p53, c-myc, NY-ESO-1 e BRCA2. A sensibilidade dos ensaios individuais é dada na Tabela 2juntamente com a sensibilidade combinada do painel de quatro antígenos nadetecção de câncer de mama primário (63%).

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Tabela 2: Sensibilidade do ensaio de autoanticorpo portitulação de antígeno. Autoanticorpos contra quatro antígenos diferentesforam medidos e a sensibilidade combinada do painel foi calculada. Níveis decorte foram calculados como média + 2 desvios padrão do conjunto deamostras normais. Indivíduos com respostas de anticorpo anti-biotina foramexcluídas como não capazes de avaliação.

Com o objetivo de avaliar se as medições obtidas usando oensaio de autoanticorpo de titulação foram ou não reproduzíveis, os ensaiosforam realizados em três dias separados e os resultados são mostrados natabela 3. Um ensaio foi considerado reproduzível se todos os três resultadosforam concordantes. Reprodutibilidade de medições feita em soro normal foi94% (15/16) e 88% (14/16) em amostras de câncer de mama.

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Tabela 3: Reprodutibilidade do ensaio de titulação de antígenopara autoanticorpos p53. Ensaios foram realizados em três dias separados(Corridas A, B e C) em amostras de soro de pacientes com câncer de mamaprimário (PBC) ou controles normais. Níveis de corte foram calculados emuma base diária como média + 2 desvios padrão do conjunto de amostrasnormais. AB denota indivíduos que mostraram evidência de uma resposta deanticorpo anti-biotina e que não puderam ser avaliados pelo presente formatode teste. Um ensaio foi considerado reproduzível se todos os três resultadosforam concordantes. Reprodutibilidade dos indivíduos normais foi 94%(15/16) e de pacientes PBC foi 88% (14/16).

Exemplo 3 - Detecção de autoanticorpos em câncer de pulmãoAnálise de respostas de autoanticorpo contra 2 antígenos (p53e NY-ESO) em um estudo piloto de câncer de pulmão (10 plasmas normais e9 plasmas de câncer de pulmão) revelou uma taxa de detecção de 78% (Figura 3).

O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo geral doexemplo 1, exceto que amostras de plasma foram usadas em vez de soro.

Amostras de pacientes positivos exibiram curvas de titulaçãosigmóides similares àquela mostrada na Figura 1. Figura 3 mostra umacomparação de níveis de autoanticorpo p53 e NY-ESO em indivíduos normaise pacientes com câncer de pulmão conforme medido usando o ensaio detitulação de antígeno. Cortes normais foram calculados como a média mais 2desvios padrão da população normal.

Exemplo 4 - Curvas de titulação adicionais

As seguintes curvas de titulação adicionais foram todasgeradas em ensaios baseados na metodologia geral descrita em Exemplo 1. Osresultados indicam que a abordagem da curva de titulação podem seraplicadas para a detecção de uma variedade de antígenos diferentes, em tiposdiferentes de fluidos corporais e em doença diferente (exemplificada pelostipos diferentes de câncer) e também, ilustram a vantagem do método dainvenção na distinção entre resultados positivos "falsos" e "verdadeiros".

Figura 4 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra p53. e NY-ESO em uma amostra de fluido de asciteretirada de um paciente com câncer de mama. Este paciente foi testado masfoi verificado que não produz autoanticorpos contra c-myc.

Figura 5 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra BRCA1, BRCA2 e HER2 em uma amostra de soro deum paciente com câncer de mama (carcinoma dutal in situ).

Figura 6 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra NY-ESO em uma amostra de soro de um paciente comcâncer de pulmão. Este paciente foi testado mas foi verificado que não produzautoanticorpos contra p53 ou c-myc.

Figura 7 mostra uma curva de titulação para detecção deautoanticorpos contra NY-ESO e p53 em uma amostra de soro de um pacientecom câncer de pulmão. Este paciente foi testado mas foi verificado que nãoproduz autoanticorpos contra c-myc.

Figuras 8(a) e 8(b) ilustram os resultados de dois ensaios detitulação independentes para autoanticorpos contra p53, c-myc e NY-ESO-1em amostras de soro de um indivíduo "normal" (i.e. um indivíduo semevidência de câncer). No ensaio mostrado em Figura 8(a) uma linha plana éobservada com quantidades crescentes de antígeno, indicando que a amostrade soro não contém autoanticorpos para qualquer um dos antígenos testados.

Quando uma segunda alíquota da mesma amostra de soro do paciente foitestada de novo usando a mesma metodologia de ensaio o ensaio falhou emproduzir resultados anômalos mostrados em Figura 8(b). A ausência de curvade titulação característica com quantidades crescentes de antígeno indica queisto é um resultado anômalo, em vez de um positivo verdadeiro. Tivesse estaamostra sido testada em um ensaio de ponto único, quantidade fixa deantígeno então poderia ter aparecido como um resultado "positivo falso".

Assim, estes resultados ilustram a vantagem da abordagem da curva detitulação na distinção entre resultados positivos falsos e verdadeiros.

Figuras 9(a) e 9(b) mostram os resultados de dois ensaios detitulação independentes realizados em amostras de soro de uma paciente únicacom câncer de mama invasivo usando uma variedade de antígenos diferentes.

Esta paciente particular mostra autoanticorpos para NY-ESO-1, HER2 eBRCA2. Para cada antígeno positivo um resultado de ensaio de antígenopositivo é indicado por força de sinal crescente à medida que a concentraçãode antígeno aumenta, i.e. um sinal de titulação.

Figuras 10(a) e 10(b) ilustram a utilidade da invenção nadistinção entre respostas (i.e. um marcador de tumor). Nestes ensaiosamostras de soro de um indivíduo humano clinicamente normal foramtestadas para a presença de autoanticorpos usando antígenos biotiniladosBRCA2, HER2, c-myc e NY-ESO-1, BRCA1 não-biotinilado e produtos deexpressão de controle do vetor "empty" VOL, que codifica o marcadorbiotina mas não o antígeno adicional. O indivíduo testado exibe uma respostade titulação para ambos os antígenos biotinilados e para o vetor empty VOL,que é efetivamente apenas biotina, mas não resposta para antígeno BRCA1não-biotinilado, indicando que os resultados "positivos" com os marcadoresbiotinilados são de fato devido à presença de anticorpos anti-biotina nesteindivíduo.

Exemplo 5 - Análise da sensibilidade e da especificidade deensaios de titulação de antígeno comparados com a medição de ponto único

Medições de autoanticorpo (AAb) foram realizadas em 100mulheres com câncer de mama primário (PBC) e em 80 mulheres semevidência de doença maligna usando tanto o método de titulação e a mediçãoem uma concentração única de antígeno (10 ug/mL). Tabelas mostrando umacomparação direta dos dois métodos são mostradas abaixo:

Tabela 4. Comparação da sensibilidade do ensaio de AAb portitulação com uma medição em uma única concentração de antígeno emPBC.

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Tabela 5. Comparação de especificidade de ensaio de AAb portitulação com uma medição em uma única concentração de antígeno emmulheres normais.

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Pode ser visto que pelo uso de vários pontos sobre a curva detitulação de antígeno, tanto uma seletividade maior quanto uma especificidademaior foram obtidas comparado com uma medição de ponto único.

Exemplo 6 - Razões potenciais para sensibilidade eespecificidade mais altas com o ensaio de titulação de antígeno

Sem se basear em teoria, o requerente considera que hánumerosas razões para a especificidade e a sensibilidade mais altasobservadas em um ensaio onde o antígeno é titulado.

(i) Figura 11 mostra os resultados de análise de AAb de sorode uma paciente com câncer de mama primário (PCB) usando os antígenosp53, c-myc e NY-ESO-1 em concentração variada. Estes resultadosdemonstram que em alguns casos a curva de titulação declina em níveis deantígeno altos (curva NY-ESO-1). Este é um fenômeno comumenteobservado em imunoquímica. Se uma medição de ponto único a 10 (iig/mLfosse usada, esta paciente teria sido classificada como negativa com respeitoaos autoanticorpos NY-ESO-1 quando de fato há claramente uma respostapositiva.

(ii) Figura 12 mostra a análise de soro de um indivíduonormal, também usando antígeno titulado p53, c-myc e NY-ESO-1. Estafigura demonstra um efeito que os requerentes têm observado emaproximadamente 10% dos ensaios nos quais a linha base da medição deantígeno (neste caso p53) está deslocada para um nível acima daquele docontrole negativo (VOL). Isto produz uma leitura falsamente alta. Este tipode resultado é facilmente identificável com o ensaio de titulação, mas seriainvisível em um conjunto de ensaios de ponto único. Isto resultaria emespecificidade reduzida devido a estes positivos falsos (veja Tabela 5).

(iii) Como discutido em Exemplo 4, os antígenos que sãousados no ensaio de AAb por titulação possuem uma etiqueta biotina quepode ser usada em purificação da proteína. Contudo, é sabido queaproximadamente 10% da população produz uma resposta de anticorpo àbiotina, que é uma vitamina. Figura 13 demonstra uma resposta de anti-biotina em uma paciente com PBC. Esta resposta pode ser claramenteidentificada usando a curva de titulação como uma resposta de anticorpo fortecontra o controle negativo, VOL (que também está biotinilado). Estesindivíduos têm que ser considerados como não-avaliáveis com o ensaio nesteformato. Contudo, se um ensaio de ponto único fosse usado, os respondedoresanti-biotina poderiam não ser distinguidos de respondedores verdadeiros.

Exemplo 7 - Demonstração de sensibilidade aumentada detitulação de antígeno comparada com titulação de soro

Medições de AAb foram realizadas em duas maneiras em doisexperimentos completamente separados. O primeiro foi o uso do formatopadrão no qual a placa foi revestida com antígeno em uma titulação semi-logde 10 ug/mL para 0,01 ug/mL. Após bloqueio, soro foi adicionado em umadiluição de 1 em 100. Neste segundo, as placas foram revestidas com antígenoem uma concentração de 3 ug/mL e após bloqueio, soro foi adicionado emuma faixa de titulação de semi-log de uma diluição de 1 em 10 para 1 em10.000. Os métodos para o restante dos ensaios foram idênticos. Duasreuniões de soro conhecidamente positivas para p53 e c-myc foram ensaiadasjuntamente com 8 soros de mulheres com PBC e 10 soros de indivíduosnormais. Os resultados são mostrados na tabela 6 abaixo.

Tabela 6. Sensibilidade de ensaios de AAb envolvendotitulação de antígeno comparado com aqueles envolvendo titulação de soro.

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Pode ser visto que o formato de ensaio envolvendo titulação deantígeno é mais sensível do que o formato envolvendo titulação de soro.Amostras que foram fortemente positivas foram detectadas por ambos osformatos, contudo positivos fracos no ensaio de titulação de antígeno foramgeralmente não detectados no ensaio de titulação de soro.

A sensibilidade menor demonstrada pelo formato de titulaçãode soro é devido à ligação não-específica inerente de soro em concentraçãoalta. Isto causa um nível de ligação nas proteínas até mesmo em amostrasnormais (veja Figura 14), que eleva o valor de corte normal com subseqüenteredução em sensibilidade. A especificidade também foi reduzida no formatode titulação de soro (BRCA2 = 90%) comparado com o formato de titulaçãode antígeno (BRCA2 = 100%).

Figura 15 reflete os experimentos mostrados em Figura 4 mascom soro de uma paciente com câncer de mama primário. Foi verificado que apaciente é positiva para autoanticorpos contra p53 e c-myc mas negativa paraautoanticorpos contra BRCA2 quando o método de titulação de antígeno dainvenção foi usado. Contudo, quando autoanticorpos foram medidos dentro deuma faixa de titulação de soro não foram detectados autoanticorpos (vejaTabela 6). Isto é devido à ligação não-específica exibida pelo soro emconcentrações altas (demonstrado pelo nível alto de ligação na proteína decontrole negativo (VOL)) que mascara sinais devido à ligação específica deautoanticorpo. A conseqüência é que com diluição de soro o ensaio poderiadesignar uma paciente com câncer de mama primário negativo. Visto quesensibilidade = positivos verdadeiros / positivos verdadeiros + negativosfalsos isto tem o efeito de aumentar o denominador e portanto diminuir asensibilidade.

Em resumo, os requerentes têm mostrado que os ensaios deautoanticorpo por titulação de antígeno são mais sensíveis e específicos doque a medição de reatividade de autoanticorpo em uma única concentração deantígeno. Isto é porque a titulação de antígeno proporciona o escopo paradetectar ambos anticorpos de afinidade baixa, abundância baixa emconcentrações altas de antígeno bem como anticorpos de abundância alta quede outro modo ligariam em concentração alta de antígeno mas ligariammaximamente bem abaixo da curva de titulação. Também permitediscriminação de ensaios não-avaliáveis dos resultados verdadeiros, que não épossível com medição de ponto único. É crido que ensaios de AAb portitulação de antígeno são mais sensíveis do que a mera titulação de soroporque o nível alto de ligação não-específica observado com soro emconcentração alta eleva os níveis de corte normais diminuindo deste modo asensibilidade.

Claims (47)

1. Método de detecção de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença em um indivíduo mamífero que compreende detectarum anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal decitado indivíduo mamífero no qual o citado anticorpo é um marcadorbiológico de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença, o métodocaracterizado pelo fato de compreender:(a) contactar a citada amostra de teste com uma pluralidade dequantidades diferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno,(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a) e(d) determinar a presença ou ausência de citado estado doentioou de citada suscetibilidade à doença baseado na quantidade de ligaçãoespecífica entre o citado anticorpo e o citado antígeno em cada diferenteconcentração de antígeno usada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelofato de que a presença ou ausência de citado estado doentio ou de citadasuscetibilidade à doença é determinada baseado nos valores coletivos daquantidade de ligação específica para todas as concentrações de antígenotestadas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a presença ou ausência de citado estado doentio ou de citadasuscetibilidade à doença é determinada por triagem da plotagem de etapa (c)para a presença de uma curva geralmente de forma S ou sigmóide.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpoespecífico para uma proteína marcadora de tumor.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o antígeno é uma proteína marcadora de tumor ou um fragmentoantigênico ou epítopo da mesma.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a proteína marcadora de tumor é MUC1, MUC16, c-myc, EGRF,p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, uma citoqueratina, recoverina, umacalicreína, uma anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina, ou raf.

7. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser no diagnóstico, noprognóstico ou na monitoração de câncer.

8. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na triagem de umapopulação de indivíduos humanos assintomáticos para identificar aqueles queestão sob risco aumentado de desenvolvimento de câncer, no qual as amostrasa serem testadas usando o método são amostras de fluido corporal retiradasdos indivíduos, e no qual os indivíduos possuindo um nível elevado deautoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, sãoidentificados como estando sob risco de desenvolvimento de câncer.

9. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6 , caracterizado pelo fato de ser na detecção de mudançaneoplásica inicial ou carcinogênica inicial em um indivíduo assintomático, noqual a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluidocorporal retirado do indivíduo, e no qual a presença de um nível elevado deautoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, éconsiderada como uma indicação de mudança neoplásica inicial oucarcinogênica inicial no indivíduo.

10. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na triagem de umapopulação de indivíduos humanos assintomáticos para identificar aquelesindivíduos que têm desenvolvido um câncer, no qual as amostras a seremtestadas usando o método são amostras de fluido corporal retirado doindivíduos, e no qual os indivíduos possuindo um nível elevado deautoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, sãodiagnosticados como possuindo um câncer.

11. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser no teste de uma populaçãode indivíduos humanos assintomáticos para identificar aqueles indivíduos quetêm desenvolvido um câncer, no qual as amostras a serem testadas usando ométodo são amostras de fluido corporal retirado do indivíduos, e no qual osindivíduos possuindo um nível elevado de autoanticorpos, em comparaçãocom indivíduos de controle normais, são diagnosticados como possuindo umcâncer.

12. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na monitoração doprogresso de câncer ou de outra doença neoplásica em um paciente, no qual aamostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporalretirada de um paciente humano, e no qual a presença de um nível elevado deautoanticorpos, em comparação com um controle normal, é considerada comouma indicação da presença de câncer no paciente.

13. Uso do método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na detecção de doençarecorrente em um paciente humano previamente diagnosticado comopossuindo câncer, cujo paciente tem sofrido tratamento anti-câncer pra reduzira quantidade de câncer presente, no qual a amostra a ser testada usando ométodo é uma amostra de fluido corporal retirada do paciente, e no qual apresença de um nível aumentado de autoanticorpos no paciente, emcomparação com um controle normal, é considerada como uma indicação deque a doença tem retornado.

14. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na avaliação deprognóstico de câncer, no qual a amostra a ser testada usando o método é umaamostra de fluido corporal retirada de um paciente humano, e no qual apresença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com umcontrole normal, é considerada como uma indicação do prognóstico dopaciente de seu câncer.

15. Uso do método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na predição de resposta aotratamento de anti-câncer, no qual a amostra a ser testada usando o método éuma amostra de fluido corporal retirada de um paciente humano, e no qual acomparação do nível de autoanticorpos em citado paciente com uma relaçãopreviamente estabelecida entre níveis de autoanticorpos e provável resultadodo tratamento é usada para proporcionar uma indicação de se o pacienteresponderá ao tal tratamento de anti-câncer.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que o tratamento de anti-câncer é vacinação, terapia de transdução desinal ou de anti-fator de crescimento, radioterapia, terapia endócrina, terapiade anticorpo de humano ou quimioterapia.

17. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser na monitoração da respostade um paciente canceroso humano ao tratamento de anti-câncer, no qual aamostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporalretirada do paciente, e no qual uma mudança no nível de autoanticorpos apóso tratamento é considerada como uma indicação de se o paciente temrespondido ou não ao tratamento.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o tratamento é vacinação, terapia de transdução de sinal ou deanti-fator de crescimento, radioterapia, terapia endócrina, terapia de anticorpode humano ou quimioterapia e uma mudança no nível de autoanticorpos apóso tratamento é considerada como uma indicação de que o paciente temrespondido positivamente ao tratamento.

19. Uso das etapas (a) a (c) do método como definido emqualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser naseleção de um tratamento de anti-câncer para uso em um paciente humanoparticular, no qual o método é realizado usando um painel de dois ou maisantígenos cada um correspondendo a uma proteína marcadora de tumordiferente com o objetivo de determinar a força relativa da resposta imune dopaciente para cada uma das proteínas marcadoras de tumor diferentes, no quala proteína marcadora de tumor ou as proteínas marcadoras de tumoridentificada(s) como gerando a resposta imune mais forte ou as respostasfortes no paciente é ou são selecionadas para formar(em) a base de umtratamento de anti-câncer para uso em citado paciente.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelofato de que o tratamento de anti-câncer é vacinação e a proteína marcadora detumor ou as proteínas marcadoras de tumor identificada(s) como gerando aresposta imune mais forte ou as respostas fortes no paciente é ou sãoselecionada(s) para formar(em) a base de uma vacina anti-câncer para uso emcitado paciente.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo característico de ou associadocom uma doença autoimune.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a doença autoimune é artrite reumatóide, lúpus eritematososistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC); tiroidite autoimune, tiroiditede Hashimito, gastrite autoimune, anemia perniciosa, adrenalite autoimune,doença de Addison, hipoparatiroidismo autoimune, diabete autoimune oumiastenia grave.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo característico de ou associadocom doença renal ou hepática acarretando insuficiência ou falha de qualquerórgão.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é direcionado na direção de um epítopo presentesobre tecido transplantado no indivíduo mamífero.

25. Método de detecção de um anticorpo em uma amostra deteste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, no qual ocitado anticorpo é direcionado contra uma substância estrangeira introduzidaem citado indivíduo mamífero, o método caracterizado pelo fato decompreender:(a) contactar a amostra com uma pluralidade de quantidadesdiferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno, e(c) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citadaligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade deantígeno usada em etapa (a).

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de compreender como etapa (d) detectar a presença de citadoanticorpo baseado na quantidade de ligação entre citado anticorpo e citadoantígeno em cada concentração diferente de antígeno usada.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizado pelo fato de que a detecção da presença de citado anticorpo ébaseada nos valores coletivos da quantidade de ligação específica para todasas concentrações de antígeno testadas.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-25 a 27, caracterizado pelo fato de que a presença na amostra de teste deanticorpo reativo com o antígeno usado no ensaio é indicada por uma curvageralmente de forma S ou sigmóide

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-25 a 28, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um humano.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-25 a 29 , caracterizado pelo fato de que a substância estranha é um agenteterapêutico.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o agente terapêutico é uma droga, pró-droga, ou terapia deanticorpo.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-25 a 29, caracterizado pelo fato de que a substância estranha é uma vacina.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32,caracterizado pelo fato de que a substância estranha é uma porção não-alvo deum agente terapêutico ou de uma vacina.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a porção não-alvo é biotina.

35. Método de acordo com a reivindicações 25 a 29,caracterizado pelo fato de que a substância estranha é um agente infeccioso talcomo fungo, bactérias, vírus ou parasita.

36. Método de detecção de um anticorpo em uma amostra deteste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero no qual ocitado anticorpo é um marcador biológico de um estado doentio ou de umasuscetibilidade à doença, o método caracterizado pelo fato de compreender:a) contactar a amostra com uma pluralidade de quantidadesdiferentes de um antígeno específico para o citado anticorpo,b) detectar a quantidade de ligação específica entre o citadoanticorpo e o citado antígeno ec) plotar ou calcular uma curva da quantidade de citada ligaçãoespecífica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade de antígenousada em etapa (a).

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que a presença na amostra de teste de anticorpo reativo com oantígeno usado no ensaio é indicada por uma curva geralmente de forma S ousigmóide.

38. Método de acordo com a reivindicação 36 ou 37,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo específico parauma proteína marcadora de tumor.

39. Método de acordo com a reivindicações 36 a 38,caracterizado pelo fato de que o antígeno é uma proteína marcadora de tumorou um fragmento antigênico ou epítopo da mesma.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a proteína marcadora de tumor é MUC1, MUC16, c-myc,EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, uma citoqueratina, recoverina,uma calicreína, uma anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina, ou raf.

41. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de ser em diagnóstico,prognóstico ou monitoração de câncer.

42. Uso do método como definido em qualquer uma dasreivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de ser para qualquer uma dasaplicações identificadas em qualquer uma das reivindicações 8 a 20.

43. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo característico de ou associadocom uma doença autoimune.

44. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o autoanticorpo é um autoanticorpo característico de ouassociado com uma doença acarretando insuficiência ou falha de um órgão.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a doença é doença hepática ou de fígado.

46. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é direcionado na direção de um epítopo presentesobre tecido transplantado em um indivíduo mamífero.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-36 a 46, caracterizado pelo fato de que o antígeno é uma proteína oupolipeptídeo naturalmente ocorrente, um polinucleotídeo ou proteínarecombinante, um polipeptídeo ou proteína sintético(a), peptídeo sintético,mimético de peptídeo, polissacarídeo ou ácido nucleico.