JP2001517206A

JP2001517206A - 免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株およびその使用方法

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Publication number: JP2001517206A
Application number: JP50973298A
Authority: JP
Inventors: エム．パードル、ドゥリュー; エム．ジャフィー、エリザベス; アドゥラー、アダム; エル．トパリアン、スザンヌ; エイ．ローゼンバーグ、スティーヴン
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-04
Publication date: 2001-10-02
Also published as: WO1998006746A2; WO1998006746A3; CA2263503C; ATE283069T1; US6187306B1; EP0929318A2; AU3889997A; DE69731756T2; JP2016106137A; DE69731756D1; CA2263503A1; JP2012001548A; EP0929318B1; JP2008044969A; JP2014012738A

Abstract

(57)【要約】本発明は、（a）１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得し、（b）未改変黒色腫細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように該黒色腫細胞株を改変し、（c）黒色腫を有するかあるいは黒色腫が発生する危険のある哺乳動物宿主に該黒色腫細胞株を投与することを含む、黒色腫の治療または予防方法に関する。好ましくは、該黒色腫細胞株は、該宿主と同種であり且つ宿主とＭＨＣがマッチしないものである。

Description

【発明の詳細な説明】免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株およびその使用方法発明の技術分野本発明は、複数の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する１または２以上の黒色腫腫瘍細胞株をワクチンとして用いた、黒色腫に対する治療または予防方法に関する。特に、本発明は、ワクチンとしての同種黒色腫細胞株の使用方法に関する。本発明はまた、免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株、および該黒色腫細胞株の細胞を含有する組成物に関する。発明の背景腫瘍細胞が細胞ゲノム中にその癌表現型の原因となる複数の特異的な変化を含むことが一般に認められている。これらの変化は、細胞の増殖および分化を制御する遺伝子の発現または機能に影響を及ぼす。例えば、通常これらの変異は、癌遺伝子、すなわちrasのような細胞のトランスフォーメーションの正のエフェクター、および負の増殖調節因子をコードする腫瘍抑制因子遺伝子（すなわち劣性癌遺伝子）中に認められ、その機能を喪失すると癌化表現型の発現を結果としてもたらす。このような劣性癌遺伝子としては、p53、p21、Rb1、DCC、MCC、NFIおよびWTIが挙げられる。免疫療法は癌治療において治療的アプローチとなる可能性がある。免疫療法は、自然に生じる腫瘍を拒絶する免疫系の不全が腫瘍抗原に対して適切に応答する免疫系の不全に関連するという前提に基づいている。機能している免疫系において、腫瘍抗原はプロセッシングされ、ヒトにおいては「ヒト白血球関連」（ＨＬＡ）分子とも呼ばれる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびII分子においては細胞表面上に発現される。ＭＨＣクラスＩおよびII分子と抗原性ペプチドの複合体は、それぞれＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺Ｔ細胞によって認識される。この認識により、一連の二次細胞シグナルと、細胞間相互作用を仲介し、宿主防御を刺激して病気を撃退する特異的なサイトカインもしくは可溶性のいわゆる「生物応答調節剤」のパラクリン放出とが生じる。次いで、サイトカインの放出の結果、抗原特異的Ｔ細胞の増殖が起こる。したがって、能動免疫療法は、腫瘍細胞を注射して、新規な、あるいは増強された全身性免疫応答を生じさせることを含む。腫瘍に対する全身性T細胞応答を増強するこの免疫療法的アプローチの能力は以前に記載されている。例えば、特に国際出願WO 92/05262、Fearonら，Cell，60，397-403(1990)およびDranoffら，Proc．Natl．Acad．Sci.，90，3539-43(1993)を参照。注射される腫瘍細胞は、通常はその免疫原性を高めるために、非特異的なアジュバントと混合したり、あるいはサイトカインもしくは他の免疫共同刺激分子を発現するように細胞を遺伝的に改変したりすることにより改変されている。使用される腫瘍細胞は自己由来、すなわち、治療中の宿主と同一の宿主由来であってよい。あるいは、腫瘍細胞はＭＨＣがマッチする、すなわち、同一もしくは少なくともいくつかは同一のＭＨＣ複合体分子を有する、別の宿主由来であってもよい。ほとんどの完全細胞の癌ワクチンは、患者自身の腫瘍細胞を用いて製造される。このように自家ワクチンを用いるのには２つの理由がある。第１に、ネズミの腫瘍での結果に基づいて、各々の腫瘍は各々の患者の腫瘍に独特な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するものだと以前は考えられていた。第２に、Ｔ細胞の認識はＭＨＣ対立遺伝子と特異的抗原の両方に依存するので、患者自身の腫瘍由来の細胞を使用すると、腫瘍もしくはＭＨＣ抗原をマッチさせるいかなる必要も回避できる。しかしながら、自家腫瘍細胞ワクチンの製造に必要な新鮮なヒト腫瘍外植片をインビトロで増殖させることは、労力集約型であり高度な技術を要求され、高度に専門化された研究施設をもってしてもほとんどの組織学的タイプのヒト腫瘍で不可能なことが多い。さらに、各患者の腫瘍からワクチンを製造するのは非常に費用がかかる。また、培養において自家細胞の継代を続けると、このような細胞の抗原性組成は、該細胞株が由来する初代腫瘍に比べて変化し、該細胞がワクチンとして無効になるという本質的な可能性もある。このような変化はすべての樹立細胞株でしばしば起こるので、腫瘍ワクチンとして自家細胞を使用するについては、このアプローチを用いて治療中の各患者の最初に単離したそれぞれの細胞株の凍結保存株を維持しておくことが必要となる可能性があるだろう。 Huangら，Science，264，961-65(1994)の最近の結果はワクチンを用いた癌治療と関連がある。すなわち、Huangらの研究以前は、腫瘍ワクチンストラテジーは、ワクチン接種する腫瘍細胞がそれらのＭＨＣクラスＩおよびII分子上に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し、免疫応答のＴ細胞武装を直接活性化するという理解に基づいていた。対照的に、Huangらの結果は、ワクチン接種する腫瘍細胞ではなく、むしろ宿主の専門的なＡＰＣが免疫応答のＴ細胞武装を準備することを示す。Huangらの研究において、サイトカインＧＭ-ＣＳＦを分泌する腫瘍ワクチン細胞は、腫瘍骨髄由来ＡＰＣの領域を補充する。該骨髄由来ＡＰＣは該腫瘍の細胞蛋白質の全体を取り込んでプロセッシングし、次いで、そのＭＨＣクラスＩおよびII分子上に抗原性ペプチドを提示する。このようにして、ＡＰＣは免疫系のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方の武装を準備し、宿主腫瘍の抗原性エピトープに特異的な全身性の抗腫瘍免疫応答を生じさせる。これらの結果は、癌治療において、自家もしくはＭＨＣがマッチする腫瘍細胞を使用する必要がないかもしれないことを示唆する。また、腫瘍ワクチンの使用に関連して、Ｔ細胞が腫瘍ワクチンによって誘導される全身性抗腫瘍免疫の重大なメディエーターであることが確認されている（Pa rdollにより総説，Trends in Pharmacological Sciences，14，202-08(1993)）。したがって、普遍的な腫瘍ワクチン、すなわち、特定のタイプの癌患者の大多数に適用できるワクチンを製造するには、Ｔ細胞により認識される免疫優性な共有腫瘍抗原の存在についての知識が必要である。現在、Ｔ細胞により認識される免疫優性な共有腫瘍抗原は、１つのヒト腫瘍、黒色腫においてのみ同定されている。黒色腫は、メラニンを形成し得る細胞由来の悪性腫瘍であり、身体のあらゆる部分の皮膚、眼、あるいはあまり一般的ではないが、生殖器の粘膜、肛門、口腔もしくは他の部位で起こり得る。黒色腫はしばしば広く転移し、おそらく局所のリンパ節、肝臓、肺および脳が巻き込まれるだろう。一次的な皮膚悪性黒色腫は皮膚に生じるすべての病気の中で第一の死亡原因である。転移性黒色腫は治療に対して抵抗力があるとしばしば考えられている。事実、転移した黒色腫に最も有効な単独の治療薬であるダカルバジン（ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド、すなわちＤＴＩＣ）は、症例の２０％においてのみ部分的な緩解をもたらすにすぎず、完全な応答を誘発するのは症例の５％未満である(Fitzpatrickら，「皮膚の悪性黒色腫」，「ハリソンの内科学の原理」中，Braunwaldら編，第１１版（McGraw- Hill Book Company:NY，1987）1595-97)）。Ｔ細胞により認識される免疫優性な共有黒色腫抗原は２つの主要なカテゴリーに分類される。抗原の１つのカテゴリーは、黒色腫細胞内で産生され、精巣を除く他のいかなる成体組織内でも産生されない蛋白質を包含する。これら、いわゆる腫瘍特異的共有抗原としては、ＭＡＧＥファミリー抗原であるＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３が挙げられる。これら２つの抗原のうち、ＭＡＧＥ−３はＭＡＧＥ−１よりもより広く産生され、免疫優性であるらしい。ＭＡＧＥ−３はまた、小細胞肺細胞癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺細胞癌（ｎｏｎ−ＳＣＬＣ）、頭および頚の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、結腸癌および乳癌のような他の非黒色腫瘍においても産生される。同様に、ＭＡＧＥ−１はまた、乳癌、神経膠芽腫、神経芽腫、ＳＣＬＣおよび甲状腺の髄癌においても産生される。共有黒色腫抗原のもう１つのカテゴリーは、メラニン細胞系列特異的な分化抗原を包含する。このような系列特異的な分化抗原はメラニン細胞およびそれらの悪性の対応物である黒色腫において産生され、これまでに同定されている他の細胞および組織内では産生されない。このような分化抗原としては、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＧＰ７５およびＧＰ１００が挙げられる。これらの黒色腫抗原および他の抗原（例えば、最近同定された、共有であるか否かわかっていない腫瘍特異的変異抗原）を表１にさらに記載する。さらなる免疫優性な共有黒色腫抗原もおそらく同定されるであろう。表１．Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原これらの共有黒色腫抗原に関する知識は、すべての、もしくは大多数の共有黒色腫抗原を発現する単一の黒色腫細胞株、あるいはすべての、もしくは大多数の共有黒色腫抗原を集合的に発現する一連の細胞株を同定する可能性を提供するだろう。もしこのような黒色腫細胞株を同定できれば、これらの細胞株は、ワクチンとして用いた場合、黒色腫を有する実質的にすべての患者由来の黒色腫と少なくとも１つの、そして大抵の場合は複数の抗原が同じだろう。本発明は、このような細胞株を用いた癌の治療方法、特に、黒色腫の治療方法を提供するが、それは自家もしくはＭＨＣがマッチした腫瘍細胞の使用に頼らず、そのような使用に付随する困難さや欠点がない。本発明のこれらの、および他の目的、および利点、並びに本発明のさらなる特徴は、後記の発明の説明から明らかになるだろう。発明の簡単な要約本発明は、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得し、該黒色腫細胞株を、未改変細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように改変し、黒色腫を有するかあるいは黒色腫が発生する危険のある哺乳動物宿主に該黒色腫細胞株を投与することを含む、黒色腫の治療または予防方法を提供する。好ましくは、該黒色腫細胞株は宿主と同種であるが、必ずしも宿主とＭＨＣがマッチしなくてもよい。好ましい態様の説明本発明の黒色腫の治療または予防方法は、（a）１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得し、（b）該黒色腫細胞株を、未改変黒色腫細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように改変し、（c）黒色腫を有するかあるいは黒色腫が発生する危険のある哺乳動物宿主に該黒色腫細胞株を投与する工程を含む。好ましくは、投与された黒色腫細胞株は宿主と同種であるが、必ずしも宿主とＭＨＣがマッチしなくてもよい。黒色腫本発明の方法は、黒色腫を治療または予防するのに使用することができる。本発明において、「黒色腫の治療」とは、治療的応答を達成する目的で本明細書に記載する黒色腫細胞株を宿主に投与することを包含する。このような治療は他の黒色腫の治療手段（例えば、一次病変の外科的切除）と組み合わせて行うことができる。特に、治療的応答は、ここにさらに記載するように、黒色腫抗原に対する全身性の免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）である。このような応答は、黒色腫の増殖の減衰および／または黒色腫の退縮をモニタリングすることにより評価することができる。「黒色腫の増殖」は黒色腫の大きさおよび／または黒色腫の数の増加を包含する。「黒色腫の退縮」は黒色腫の質量の減少を包含する。本発明において、「黒色腫の予防」とは、新しい黒色腫の形成を防ぐ目的で、感受性の高い宿主（例えば、日光に対する寛容性の乏しい宿主、形成異常性の母斑もしくは大きな先天性のメラニン細胞性母斑を有する患者、一次黒色腫病変の切除を受けたことのある患者他）にここに記載する黒色腫細胞株を投与することを含む。本発明において、「黒色腫」は、皮膚または他の部位のメラニン細胞から生じる悪性腫瘍（それは薄黒い色素を含んでいてもよい）を包含する。この用語は一次腫瘍内に局在するような癌、並びに、例えば、隣接する組織の侵入によって局所的に腫瘍から広がるか、あるいは転移した、腫瘍内に局在しない黒色腫細胞を包含する。該黒色腫の治療または予防方法は、広範な種類の異なる宿主を用いて効果的に行うことができる。例えば、該方法は、種々の動物宿主に使用することができるが、好ましくは、齧歯類、サル、チンパンジー、ネコ、イヌ、有蹄類（例えば反芻動物またはブタ）、並びに特にヒト宿主を含むがそれらに限定されない哺乳動物宿主に使用することができる。黒色腫細胞株本明細書に記載するように、「黒色腫細胞株」は、黒色腫に元来由来する細胞を包含する。黒色腫細胞株はいかなる黒色腫に由来してもよい。このような細胞は通常、何らかの変化を受けて、理論的に培養において無限増殖性を有する。すなわち、限られた時間の間しか培養できない非癌細胞と異なる。癌の治療方法において使用される黒色腫細胞株はいかなる適切な手段によっても得ることができるが、好ましくは、本明細書に記載するように、（a）哺乳動物宿主から黒色腫の試料を取得し、（b）該黒色腫試料から単細胞懸濁液を形成させ、（c）該黒色腫細胞をペレットにし、（d）該黒色腫細胞を標準の無菌培養技術を用いて組織培養物中に移し、（e）該黒色腫細胞が増殖できる条件下で該黒色腫細胞を組織培養中で維持する工程を含む方法によって得られる。より詳細には、黒色腫の試料は通常外科手術の際に得られる。続いて、該黒色腫試料を無菌技術を用い、組織損傷を最小限にするようにして処理および操作する。該組織試料は、無菌容器中、氷上に置き、クリーンベンチに移すのが好ましい。黒色腫細胞株の単離用に使用する黒色腫の部分を該試料から切除し、好ましくは、残りの黒色腫を適切な温度、例えば−７０℃で保存する。単細胞懸濁液の使用に関しては、該懸濁液は細胞を、好ましくは一晩、酵素により消化することにより形成される。例えば、試料をコラーゲナーゼを含む溶液中に懸濁する。該溶液はまた、ＤＮＡｓｅおよび／またはヒアルロニダーゼを含んでもよい。細胞培養培地を使用して消化を実施することができる。得られる単細胞懸濁液をペレット状にし、該ペレットを少量の組織培養培地中に再懸濁する。好ましくは、次いで該再懸濁細胞を、培養中での該細胞の増殖に適当な組織培養培地中に、５×１０⁵腫瘍細胞／ｍｌの密度で接種する。あるいは、新鮮な腫瘍試料を直接培養物中に入れる小片に細かく切り刻む。このもう１つの好適な黒色腫細胞株の単離方法は、（a）哺乳動物宿主から黒色腫の試料を取得し、（b）該試料を細かく切り刻んでその断片を得、（c）該新鮮腫瘍断片を組織培養中に移し、（d）該細胞が増殖できる条件下で組織培養中で該黒色腫細胞を維持する工程を含む。黒色腫細胞を組織培養中に移すのに用いる手段に関わらず（当該分野の通常の技術を有する者にとっては周知の手段等の、いかなる手段も用いることができる）、いったん移植すると、培養は約５〜８％ＣＯ₂の存在下に約３５〜４０℃で維持することができる。好ましくは、細胞増殖に使用される培地は、多くのタイプの細胞培養の増殖を助ける広い適用性があるもの、例えば、重炭酸緩衝系と種々のアミノ酸およびビタミン類を利用する培地である。最適には、培地はＲＰＭＩ１６４０培地であり、ウシ血清（例えば、胎児ウシ血清）を、好ましくは約５ないし約２０％の濃度で補充されたものが望ましい。培地は必要に応じて、例えば、黒色腫細胞の増殖を必要とする場合、あるいは黒色腫細胞を未分化の状態で維持する必要のある場合、種々の付加的因子を含んでもよい。培地および培地成分は容易に入手可能であり、例えば、市販元より入手することができる。腫瘍細胞培養は、必要に応じて例えば、通常１ないし１０日毎に栄養分を補給して再培養することができる。また、腫瘍細胞を分別トリプシン処理にかけて、一次腫瘍培養よりも過剰増殖し得る他の細胞（例えば、基質細胞）を除去することもできる。さらに、培養培地にコレラ毒素（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を補充することにより、線維芽細胞の過剰増殖の抑制を達成することもできる。実質的に純化された黒色腫細胞の培養が得られたらしい時には（例えば、培養の外見または増殖の挙動から判断して）、必要もしくは所望に応じて、種々の試験を実施して該培養が純粋であることを確認することができる。例えば、このことは、フローサイトメトリーまたは免疫細胞学で黒色腫関連蛋白質もしくはガングリオシドの発現を確認することにより確かめることができる。これは容易に入手可能な抗体を用いて行われるが、それは当業者には周知である。免疫優性な共有黒色腫抗原黒色腫細胞株が免疫優性な共有抗原を産生する（すなわち、「発現する」）ことを確認するために、該黒色腫細胞株の細胞上で試験を実施することができる。本発明によれば、好ましくは、黒色腫細胞株は、本明細書に記載するかあるいは将来同定される、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する。「共有の」という用語は、特定の個体自身の腫瘍に独特な抗原は一般に適用できるワクチンとしては有用ではなく、むしろ、特定の腫瘍タイプの複数の（すなわち２以上の）症例に共有される抗原が必要であるという事実を意味する。「免疫優性な」という用語は、プロセッシング、ＭＨＣへの結合または非結合のせいで、ある特定の抗原がワクチン接種された宿主由来のＴ細胞によってより効率よく認識され得るという事実を意味する。特に、本発明によれば、好ましくは２患者以上、最も好ましくは４患者以上に由来する腫瘍浸潤性リンパ球が該黒色腫細胞株を認識することが確認される。さらに、免疫優性な共有黒色腫抗原のＲＮＡ発現および／または蛋白産生を、当業者に公知であり、ここにさらに記載される標準の技術（例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ、ノーザンおよびウェスタンアッセイ、他の免疫学的アッセイなど）を用いて調べることが望ましい。本発明によれば、好ましくは、免疫優性な共有黒色腫抗原は、本明細書に記載するような、あるいは将来ある時同定される、メラニン細胞特異的分化抗原および腫瘍特異的共有抗原からなる群より選択される。特に、免疫優性な共有黒色腫抗原は、１または２以上のメラニン細胞特異的分化抗原または１または２以上の腫瘍特異的共有抗原を含むことが望ましい。最も好ましくは、該黒色腫細胞株は、少なくとも３つの免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する。好ましい実施態様においては、免疫優性な共有黒色腫抗原はＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ −１／メラン−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ −１、ＧＡＧＥ−２、ＧｎＴ−Ｖおよびｐ１５抗原からなる群より選択される。該黒色腫細胞株はまた、腫瘍特異的変異抗原を含んでもよい。例えば、該黒色腫細胞株は、好ましくはｂ−カテニン腫瘍特異的変異抗原を含むことができる。同様に、該黒色腫細胞株はＭＵＭ−１腫瘍特異的変異抗原を好ましく含むことができる。また、該黒色腫細胞株はＣＤＫ４腫瘍特異的変異抗原を含むこともできる。本発明の方法においてワクチンとして使用される黒色腫細胞株は、継続した世代で免疫優性な共有黒色腫抗原の安定な産生を示すことが好ましい。特に、該黒色腫細胞株は、別の免疫優性な共有黒色腫抗原と一緒にＭＡＧＥ−３抗原を発現することが好ましい。望ましくは、該黒色腫細胞株は、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ７５およびｇｐ１００抗原からなる群より選択される２つの免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する。いっそう好ましくは、該黒色腫細胞株は、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ７５およびｇｐ１００抗原からなる群より選択される３つの免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する。望ましくは、該黒色腫細胞株は、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ７５およびｇｐ１００抗原からなる群より選択される４つの免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する。最も好ましくは、該黒色腫細胞株は、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ７５およびｇｐ１００抗原を発現する。特に、本発明の方法に適用される黒色腫細胞株は、好ましくは５２６−ＭＥＬまたは６２４−ＭＥＬである。サイトカイン本発明の癌治療方法において、好ましくは、黒色腫細胞株は、未改変黒色腫細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように改変されている。「サイトカイン」は、この用語が当業者に理解されている通り、宿主内に存在する黒色腫に対する宿主の免疫系の応答性を増強するいかなる免疫強化蛋白（糖蛋白質のような修飾された蛋白質を含む）でもよい。好ましくは、サイトカインは、それ自身は宿主に対して免疫原性がなく、免疫系の細胞の活性を活性化または増強することにより免疫を強化する。本明細書で用いる際、サイトカインとしては、インターフェロン類、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−１ないしＩＬ−１７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。本発明において、黒色腫細胞株を「改変する」とは、対象とするサイトカインの発現の増加をもたらし得る遺伝的材料を導入することを包含する。該遺伝的材料は、裸のＤＮＡの形態であっても、プラスミド、ウイルスもしくは他のビークルのようなＤＮＡ分子を包含する「ベクター」の形態であってもよい。ベクターは１または２以上の異種もしくは組換えＤＮＡ配列（例えば、サイトカイン遺伝子、もしくは機能的なプロモーターあるいはさらにエンハンサーの制御下にあるサイトカインコード配列）を含み、この用語が当業者に理解されているようにベクターとして機能し得る。適当なウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、エプスタインーバールウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。ベクターまたは他のＤＮＡ配列に関して「組換え」というときは、天然から単離される際には通常結合していないＤＮＡ配列が連結していることを単に意味するだけである。「遺伝子」は蛋白質または初期ｍＲＮΛ分子をコードするいかなる核酸配列でもよい。遺伝子はコード配列に加えていかなる非コード配列（例えば、調節配列）を含んでもよいが、「コード配列」はいかなる非コードＤＮＡも含まない。「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は、近傍の遺伝子の転写を刺激または阻害するＤＮＡのシス作動性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、それがどちらの方向にも、数キロ塩基対（ｋｂ）まで離れていても、さらに転写領域の下流に位置していても機能し得る点で、プロモーター中にのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質とのＤＮＡ結合部位（これは「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）と相違する。真核の黒色腫細胞、あるいは特に哺乳動物のような動物黒色腫細胞（例えば、ヒト黒色腫細胞）内に核酸を導入するのに適したいかなる適切なベクターも使用することができる。好ましくは、該ベクターは黒色腫細胞と適合性であり、例えば、サイトカイン遺伝子もしくはコード配列の発現を付与することができるものであり、該黒色腫細胞内で安定にもしくは比較的安定に維持されるものである。望ましくは、該ベクターは複製起点を含む。好ましくは、ベクターはいわゆる「マーカー」機能（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をも含み、該「マーカー」機能によりベクターを同定し選択することができる。サイトカインコード配列が導入されるとき（すなわち、それ自身のプロモーターを有するサイトカイン遺伝子とは対照的に）、最適にはベクターは、コード配列の発現を駆動することができ、且つ該コード配列に機能的に連結したプロモーターも含む。プロモーターがコード配列の転写を指示し得るとき、コード配列はプロモーターに「機能的に連結している」（例えば、コード配列とプロモーターの両方が一緒になって、天然もしくは組換えサイトカイン遺伝子を構成するとき）。本明細書で用いるように、サイトカイン「遺伝子」または「コード配列」は、該遺伝子またはコード配列がサイトカインの特徴的な機能、すなわち宿主の免疫応答を刺激する能力、を有する蛋白質を発現し得るか、あるいは該蛋白質内に発現され得る限り、天然から単離したか、または全合成もしくは部分合成したかにかかわらず、サイトカインのゲノミックまたはｃＤＮＡ配列、そのより大きい配列およびより小さい配列、並びにそれらの変異体を包含する。遺伝子またはコード配列を改変する手段は当該分野でよく知られており、市販のキット（例えば、 New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA;Clontech，Palo Alto，CA）によって行うこともできる。サイトカイン遺伝子またはコード配列はいかなる適当なソースからのものでもよく、例えば、ヒトのようないかなる哺乳動物から単離されたものでもよい。しかしながら、好ましくは該サイトカイン遺伝子またはコード配列はＧＭ−ＣＳＦ配列、特に、ヒトまたはマウスＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ配列を含むヒトまたはマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子またはコード配列を含有する(例えば、Cantrellら,Proc.Natl.Acad.Sci.，82,6250-54(1985)に記載）。本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、すべての適切な転写、翻訳およびプロセッシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル）は、サイトカイン遺伝子またはコード配列がそれが導入された黒色腫細胞内で適切に転写および翻訳されるように、ベクター上に正しく配置されている。宿主細胞内での適切な発現を確実にするためのこのようなシグナルの操作は、当業者の知識および技術の範囲でよく知られている。サイトカイン遺伝子はそれ自身のプロモーターにより制御される（すなわち、機能的に連結している）が、構成的プロモーター（例えば、アデノウイルスの２型（Ａｄ２）もしくは５型（Ａｄ５）の主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および三分リーダー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター／エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート（ＲＳＶ−ＬＴＲ）およびその他のもの）を含む別のプロモーターを、サイトカインコード配列の発現を命令するのに使用することもできる。あるいは、組織特異的プロモーター（すなわち、所定の組織中で優先的に活性化されて、その結果、活性化された組織中で遺伝子産物を発現するプロモーター）をベクター中に使用することもできる。そのようなプロモーターとしては、膵臓の腺房細胞内で活性のあるエラスターゼＩの遺伝子調節領域（Swiftら，Cell ，38，639-46(1984)およびMacDonald，Hepatology，7，425-515(1987)に記載）、膵臓のβ細胞内で活性のあるインスリンの遺伝子調節領域（Hanahan，Nature ，315，115-22(1985)に記載）、肝臓特異的なアルブミンまたはα１−アンチトリプシンのプロモーター（Frainら，Mol．Cell．Biol.，10，991-99(1990)およびCilibertoら，Cell，41，531-40(1985)に記載）、およびどちらも肝臓内で活性のあるアルブミンおよびα１−アンチトリプシンの遺伝子調節領域（Pinkert ら，Genes and Devel.，1，268-76(1987)およびKelseyら，Genes and Devel.，1 ，161-71（1987）に記載）が挙げられるが、それらに限定されない。同様に、Schreweら，Mol．Cell Biol.，10，2738-48(1990)に記載されるように、結腸癌に対する癌胎児性抗原と類似した黒色腫特異的プロモーターをベクター中に使用することもできる。同じ細胞株において、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は胚と成体では異なって転写される）を特定のタイプの癌の遺伝子治療に使用することができる。別の選択肢は、ＴＮＦに応答するＩＬ−８プロモーターまたはインターフェロンに応答する６−１６プロモーターのような誘導プロモーターを使用すること、あるいは宿主内に存在するかもしくは外来的に投与し得る他のサイトカインまたは他の因子に応答する他の同様なプロモーターを使用することである。サイトカイン誘導性プロモーターを使用することは、サイトカイン遺伝子の自己誘導的な発現を可能にするというさらなる利点がある。本発明によれば、所望の結合能力とプロモーター強度を有する限り、いかなるプロモーターも変異誘発により変化させることができる。したがって、本発明は、上記で定義するようなサイトカインをコードする核酸配列を含み、本発明の癌治療方法に使用することができるベクターを提供する。特に、本発明は、ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供する。したがって、好ましくは、本発明はpcDNA3/Neo-GM-CSFと呼ばれるベクターを提供する。これは本明細書でさらに説明する。本発明の方法において、細胞（好ましくは樹立黒色腫細胞株の細胞）に、インビトロでサイトカイン遺伝子またはコード配列を導入するのに、裸のＤＮＡまたは組換えベクターを使用することができる。細胞にインビトロで新しい遺伝的材料を送達するのに種々の方法が使用できる。例えば、このような方法としては、エレクトロポーレーション、リポソームを用いた膜融合、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクタイルの高速射撃、リン酸カルシウムとのインキュベーションによるＤＮＡ沈澱、ＤＥＡＥデキストランを介したトランスフェクション、改変ウイルス核酸を用いた感染、単細胞への直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。他の方法も利用可能であり、当業者に公知である。このように、本発明は、未改変黒色腫細胞株に比べて増加したレベルのサイトカイン（好ましくはＧＭ−ＣＳＦ）を産生し得るように改変されている、実質的に純化された黒色腫細胞株を提供する。改変された黒色腫細胞により産生されるサイトカインのレベルは、本発明に関しては免疫刺激的応答を得る目的で重要である。好ましくは、改変された（例えば、トランスフェクトまたは形質転換された）黒色腫細胞株は、改変されていない（すなわち、親の）黒色腫細胞株で観察されるサイトカインのレベルよりも増加したレベルのサイトカインを産生する。いっそう好ましくは、改変された細胞株は、３６ｎｇ／１０⁶細胞／日より多いサイトカイン分泌を生じさせるレベルのサイトカインを産生する。本発明はまた、サイトカインが投与された黒色腫細胞によって提供されるのではなく、他の手段によって提供される黒色腫の治療または予防方法をも包含する。この方法は、単に、（a）１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得し、（b）黒色腫を有するか、黒色腫が発生する危険のある哺乳動物宿主に該黒色腫細胞株を投与することを含むだけである。この方法では、黒色腫細胞株は、投与に先立って、サイトカインの産生レベルが増加し得るように改変されることはない。その代わりに、サイトカインは当該分野で知られている他のある手段により提供される。例えば、該黒色腫細胞株の細胞を、マイクロスフェアー（例えば、Golumbekら，Cancer Research，53，1-4(1993)を参照）またはリポソーム（例えば、Nabelら，Proc．Natl．Acad．Sci.，90，11307-11(1993)を参照）中に包まれたサイトカインとともに投与することができる。黒色腫細胞株の投与哺乳動物宿主への黒色腫細胞株の細胞の「投与」とは、黒色腫細胞、特に改変された（すなわち、サイトカイン産生）黒色腫細胞を宿主に実際に物理的に導入することをいう。黒色腫細胞を宿主に導入する、いかなるそしてすべての方法を本発明では意図している。該方法はいかなる特定の導入手段にも依存するものではなく、また、そのように解すべきではない。導入手段は当業者には周知であり、そのような導入手段のいくつかは本明細書において例示されている。投与される黒色腫細胞株は宿主の黒色腫と共通するいくつかのＭＨＣ抗原を有し得ると予想されるが、本発明の目的のために、投与される黒色腫細胞は宿主の黒色腫と共通のＭＨＣ抗原を有する必要はない。したがって、本発明は宿主に対して同種の（すなわち、異なる個体由来の）、必ずしも宿主とＭＨＣがマッチしていない黒色腫細胞株の投与を包含する。本発明によれば、黒色腫細胞株が宿主と共通のいかなるＭＨＣ抗原も共有していないとき、あるいは同種黒色腫細胞ワクチンを用いるときに通常はＭＨＣがマッチするＭＨＣ抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原、特にＨＬＡ−Ａ２）のいずれも宿主と共有していないとき、黒色腫細胞株は宿主と「ＭＨＣがマッチしていない」ということである。また、好ましくは、黒色腫細胞株（例えば、改変された黒色腫細胞株）を、投与の前に、細胞複製および起こり得るインビボでの黒色腫形成を防ぐために放射線照射される。黒色腫細胞を放射線照射するには、通常、黒色腫細胞を集めて液体培地中、試験管に移し、¹³⁷Ｃｓ源を用いて室温にて照射を行う。好ましくは、約５０ないし約２００ラド／分、いっそう好ましくは約１２０ないし１４０ラド／分の線量速度で細胞を照射する。大多数の細胞、好ましくは約１００％の細胞がインビトロで増殖するのを阻害するのに十分な総線量を細胞に照射することが好ましい。したがって、望ましくは、約１０，０００ないし３０，０００ラドの総線量を細胞に照射する。さらに、黒色腫細胞株（例えば、改変された黒色腫細胞株）は、最適にはその免疫原性を増強するために投与の前に処理される。好ましくは、この処理は、本明細書で説明するように、さらに遺伝子操作、例えば、他のサイトカインまたは免疫共刺激機能を導入するような遺伝子操作、あるいは非特的アジュバントとの（例えば、フロイントの完全または不完全アジュバント、細菌およびマイコバクテリアの細胞壁成分より構成される乳化物等が挙げられるがそれらに限定されない）との混合を含む。したがって、患者自身の黒色腫に対する全身性の抗黒色腫免疫応答を生じさせるために、黒色腫を患者にワクチン接種するのに同種黒色腫細胞株を用いることができる。ＭＡＧＥ−３はＳＣＬＣ、非ＳＣＬＣ、ＳＣＣＨＮ、結腸癌および乳癌のような他の非黒色腫瘍でも産生されるし、また、ＭＡＧＥ−１は乳癌、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、ＳＣＬＣおよび甲状腺の髄様癌でも産生されるので、ＭＡＧＥ−３および／またはＭＡＧＥ−１抗原を発現する本発明の同種黒色腫細胞株は、これら他の非黒色腫瘍の治療にも使用することができる。投与を容易にするために、本発明の同種黒色腫細胞株、特に、投与の前に免疫原性を増強するように処理された改変同種黒色腫細胞株を、適当な、そして医薬上許容される担体または希釈剤とともに、インビボでの投与に適した医薬組成物またはインプラントに製造することができる。このような組成物またはインプラントの製造手段は当該分野で記載されている（例えば、「レミントンの薬科学」，第１６版，Mack編，(1980)を参照）。適当な場合、黒色腫細胞株はカプセル剤、液剤、注射剤、吸入剤またはエアロゾルのような半固形または液状の製剤に、それぞれの投与経路用の通常の方法で製剤化することができる。標的組織または器官に到達するまで組成物の放出および吸収を防止または最小限にするために、あるいは組成物の定時的な放出を確実にするために、当該分野で公知の手段を利用することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の組成物の効力を失くさない医薬上許容される形態を使用する。したがって、望ましくは、黒色腫細胞株を、平衡塩類溶液、好ましくはHanksの平衡塩類溶液、あるいは通常の食塩水を含有する医薬組成物に製造することができる。したがって、本発明は、ここに記載するように、医薬上許容される担体、および本発明の黒色腫細胞株または１または２以上の免疫優性な共有抗原を発現する他のいずれかの黒色腫細胞株の細胞を含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明は、医薬上許容される担体、および増加したレベルのサイトカイン、最適にはＧＭ−ＣＳＦを生産するように改変されている黒色腫細胞株を含有する医薬組成物、特に、該黒色腫細胞株が５２６−ＭＥＬまたは６２４−ＭＥＬである該医薬組成物を提供する。本発明はまた、好ましくは医薬上許容される担体および複数の本発明の黒色腫細胞株の細胞を含有する医薬組成物を提供する。例えば、該組成物は、好ましくは２以上の本発明の細胞株の細胞を含有し、最も好ましくは２以上の細胞株、例えば、５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬ細胞を含有するか、あるいは５２６−ＭＥＬ、６２４−ＭＥＬおよび他のある細胞株からなる群より選択される細胞を含有する。医薬投与形態において、組成物は単独でまたは適当な関連性にて、並びに他の医薬上活性な化合物および治療方法と組み合わせて用いることができる。例えば、癌治療、特に黒色腫の治療に本発明の方法を適用する場合、このような治療は、他の癌（特に黒色腫）治療手段、例えば外科的切除、放射線照射、化学療法等と組み合わせて用いることができる。化学療法についていえば、ダカルバジン、ダクチノマイシン、カルムスチン、プロカルバジン、ビンブラスチンおよびインターフェロン、並びに黒色腫の治療に使用される他の薬剤に加えて、本発明の組成物を使用することができる。本発明の医薬組成物は、特定の効果を達成するために種々の経路により、また哺乳類（特にヒト）の体の種々の部位に送達することができる。２つ以上の経路を投与に用いることができるが、ある特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を与えることが当業者には理解されるであろう。局所または全身送達は、体腔への製剤の適用または滴注、エアロゾルの吸入または通気を含む投与により、あるいは筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、または皮内投与を含む非経口導入により行うことができる。好ましくは、送達は皮下または皮内投与により行う。本発明の組成物は、単独でまたは他の活性薬剤との適当な組み合わせで、各投与単位（例えば、注射剤）が所定量の組成物を含む単位投与形態で提供することができる。本明細書で用いる「単位投与形態」という語は、ヒトおよび動物の患者にとって単回投与形態として適当な物理的に分離した単位をいい、各単位は所望の効果を生じさせるのに十分な量として算出された所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて、適当な場合、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に含有する。本発明の新規な単位投与形態の詳細については、特定の宿主における医薬組成物に関連する特定の薬力学により決定される。好ましくは、本明細書でさらに説明するように、組成物中に十分な数の修飾された黒色腫細胞が存在し、宿主細胞によりサイトカインが発現されるように宿主内に導入され、続く黒色腫部位へのＡＰＣの補充により、残存する宿主黒色腫に対してこのような治療を行わないときに比べてより大きい免疫応答が生じる。従って、投与されるワクチン細胞の量は、投与経路を考慮に入れなければならないし、所望の治療（すなわち、免疫強化）応答を達成するために十分な数の黒色腫細胞が導入されるようにしなければならない。さらに、本明細書に記載する組成物に含有される各活性薬剤の量（例えば、各細胞当たりの接触する量、またはある体重当たりの量）は適用ごとに異なる。一般に、修飾された黒色腫細胞の濃度は、好ましくは少なくとも約１×１０⁶〜約１×１０⁹黒色腫細胞、より好ましくは１×１０⁷〜約５×１０⁸黒色腫細胞を、治療される宿主内で提供すれば十分であるが、より多い、例えば５×１０⁸細胞より多い、またはより少ない、例えば１×１０⁷細胞より少ない適当な量を利用することもできる。これらの値は、本発明を実施するために本発明の方法を最適化した後に、実施者により利用される各成分の範囲の一般的なガイダンスを与えるものである。本明細書に記載するそのような範囲は、特定の適用において正当だと認められるであろうように、成分のより多いまたはより少ない量の使用を排除するものではない。例えば、実際の投与量および投与スケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかにより、または個人間の薬物動態、薬物素質、および代謝の相違により変わり得る。当業者は特定の状況における必要性に従って必要な調整を容易に行うことができる。さらに、組成物の有効量は癌細胞、特に黒色腫細胞の増殖を阻害することが知られている他の化合物との類似性によりさらに概算することができる。当業者はまた、本発明の組成物を投与したときに治療的（すなわち、全身性免疫）応答をモニターするための手段を知っている。特に、治療的応答は黒色腫増殖の減衰および／または黒色腫退縮をモニターすることにより評価することができる。治療に対する応答における黒色腫増殖の減衰または黒色腫退縮は、当業者に知られている幾つかのエンドポイント法（例えば、黒色腫の数、黒色腫質量または大きさ、または転移の減少／予防を含む）を用いてモニターすることができる。記載したこれらの方法は包括的なものではなく、特定の適用に適したさらなる方法が当業者には明らかであろう。実施例以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことは言うまでもない。実施例１この実施例では、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得および培養する方法について説明する。黒色腫細胞株を外科的切除標本から樹立した。以前に記載され、当業者に公知の標準的手段を使用して、細胞株を単離した（例えば、Freshney，「動物細胞の培養」（第３版）Wi1ey-Liss，Inc.，NY(1993)を参照）。詳細には、コラーゲナーゼ、ＤＮＡｓｅおよびヒアルロニダーゼで一晩酵素的に消化することにより、腫瘍を単細胞懸濁液に分散させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。次いで、標準的な無菌組織培養技術を用いて該細胞を培養中で繁殖させた。実施例２この実施例では、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株の特性解析について説明する。免疫優性な共有抗原が黒色腫細胞株内に存在することは、黒色腫患者由来の、該患者自身の黒色腫を認識するＴ細胞が、問題となる特定の同種黒色腫細胞株をも認識することを示すことによって確認することができる。この測定を行うためには、Ｔ細胞が由来する患者と試験される黒色腫株との間で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原が共有されていなければならない。白人のほぼ５０％の個体において発現するので、このような目的に使用される最良のＭＨＣ抗原の１つはＨＬＡ−Ａ２である。すなわち、新鮮な腫瘍懸濁液をFicoll-Hypaque勾配（リンパ球分離用培地，Or ganon Technical Corporation，Durham，North Carolina）に通して単離し、黒色腫を認識するＴ細胞集団を増殖させた。生きている腫瘍細胞とリンパ球とを含む該勾配の界面を洗浄し、全細胞濃度をｍｌあたり約２．５ないし約５．０×１０⁵細胞に調整して、完全培地中で培養した。完全培地は、１０％熱非働化ＡＢ型ヒト血清、５０ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン(Biofluids,Rockville,MD)、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン(GIBCO Laborator ies，Chagrin Falls，OH)、１０ｍＭＨＥＰＥS緩衝液（Biofluids）および２ｍＭＬ−グルタミン（MA Bioproducts，Walkersville，MD）を含むＲＰＭＩ１６４０からなる。該培地に６０００ＩＵ／ｍｌＩＬ−２およびＬＡＫ細胞の培養上清を補充した。培養は、２４穴プレートや１７５ｃｍ²フラスコを含む、種々の組織培養容器中で、３７℃、５％ＣＯ₂加湿雰囲気中で維持した。これらの条件下では腫瘍浸潤性Ｔ細胞が選択的に増殖する。腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の培養をＩＬ−２中で少なくとも４週間増殖させた。黒色腫細胞株のＴＩＬによる認識（Topalianら，J．Immunol.，142，3714(198 9)）を分析するために、これらの細胞株に対する培養したＴＩＬの細胞溶解活性を標準的な４時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイを用いて調べた。あるいは、腫瘍細胞と共培養したＴＩＬによる特異的なサイトカイン分泌をモニタリングした。これらの実験結果を表２に示す。表２．ＨＬＡ−Ａ２制限黒色腫ＴＩＬによるＨＬＡ−Ａ２⁺黒色腫の溶解表２に示される通り、８つの異なるＨＬＡ−Ａ２⁺患者由来のＴＩＬ培養（すなわち、ＴＩＬ６２０、ＴＩＬ１０７３、ＴＩＬ１１４３、ＴＩＬ１２３５、ＴＩＬ５０１、ＴＩＬ６６０、ＴＩＬ１０７４およびＴＩＬ１１２８）を、７つの異なる樹立黒色腫細胞株（すなわち、５２６−ＭＥＬ、５５３−ＭＥＬ、６２４− ＭＥＬ、６７７−ＭＥＬ、６９７−ＭＥＬ、１１０２−ＭＥＬおよび１０１１− ＭＥＬ）、並びに樹立線維芽細胞株（５６０−ｆｉｂｒｏ）およびDaudiリンパ腫細胞株に対して試験した。クロム放出アッセイにおいてエフェクター対腫瘍細胞の比（Ｅ：Ｔ）が４０の時の特異的溶解が＞１０％であることによって確定されるように、２つの腫瘍細胞株、すなわち、５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬが、すべてのＴＩＬ培養により認識された。１０１１−ＭＥＬ（ＨＬＡ−Ａ２陰性）を除く他の黒色腫細胞株は、大多数または少なくとも１つのＴＩＬ培養によって認識された。５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬを、ＭＺ２−Ｅ（またはＭＡＧＥ−１）、ＭＺ２−Ｄ（またはＭＡＧＥ−３）、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ＧＰ１００およびＧＰ７５抗原の発現について、逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ −ＰＣＲ）またはノーザンブロッティングにより試験した。該細胞株のチロシナーゼ産生について、チロシナーゼ特異的ヘルパーＴ細胞株による認識を通じて調べた。また、該細胞株のＧＤ３産生について、特異的モノクローナル抗体を用いた染色により調べた。これらの実験結果を表３に示す。表３．黒色腫細胞培養による共有黒色腫抗原の発現表３に示される通り、どちらの細胞株も、ＭＡＧＥ−１抗原を除いて、これらのアッセイで試験されたすべての一般的な共有抗原を発現していた。これらの結果は、５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬ黒色腫細胞株が大多数の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現することを確認するものである。さらに、これらの結果は、ここに記載される方法が、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得および／または同定するのに使用できることを確認するものである。実施例３この実施例では、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を、そのサイトカイン産生量が増加するように改変する方法について説明する。サイトカイン顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、前臨床黒色腫モデルにおける全身性の抗黒色腫応答を生じさせることにおいて、他のサイトカインよりも強力である可能性がある（例えば、Dranoffら，P roc．Natl．Acad．Sci.，90，3539-42(1993)を参照）。したがって、黒色腫細胞株をＧＭ−ＣＳＦを分泌するように改変した。実施例１に記載される黒色腫細胞株５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬを１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する同種黒色腫細胞株の代表として使用した。細胞株の操作を容易にするために、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をpcDNA3/N eo（Invitrogen）にクローニングした。得られた組換えベクターを以下、pcDNA3 /Neo-GM-CSFと称する。すべてのクローニング反応およびＤＮＡ操作は、当業者によく知られ、当該分野で記載された方法（例えば、Maniatisら，「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」，第２版（Cold Spring Ha rbor Laboratory，NY，(1982))を参照）を用いて行った。これらの反応に使用した酵素は市販の業者（例えば、New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA;Clont ech，Palo Alto，CA;Boehringer Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN;他）より入手し、製造者の推奨に従って使用した。プラスミドpcDNA3/Neo-GM-CSFは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にヒトＧＭ−ＣＳＦサイトカインコード配列を含み、また、別個のＣＭＶプロモーターにより制御されるネオマイシン耐性遺伝子を含む。ＣＭＶプロモーターはほとんどの真核細胞において比較的高レベルの遺伝子発現を駆動し得るので使用した（Boshartら，Cell，41，521-30(1985)）。ヒト黒色腫細胞株への遺伝子導入にこのベクターを用いた初期の研究により、ネオマイシン耐性で選択後、３６ｎｇ／１０⁶細胞／日を超えるレベルのＧＭ−ＣＳＦの分泌が達成されたことが確認されている。これらの初期研究により、pcDNA3/Neo-GM-CSFプラスミドが真核細胞で機能的であることが確認される。さらに、これが、マウスモデルにおける適切な抗黒色腫免疫応答を生じさせるのに必要なＧＭ−ＣＳＦの用量である。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持するレトロウイルスベクターで形質導入したか、あるいはしていない黒色腫細胞を種々の濃度で用いた希釈実験により、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫系においては、ＧＭ−ＣＳＦの分泌が３６ｎｇ／１０⁶細胞／日を下回ると、この閾値を上回る分泌レベルにおいて見られる強力な抗黒色腫免疫を生じさせることができないことが確認されている。これらの発見は、高レベル且つ持続したレベルのＧＭ−ＣＳＦを、関連する黒色腫抗原のソースであるワクチン接種した黒色腫細胞の部位に直接送達することが重要であることを強調している。５２６−ＭＥＬおよび６２４−ＭＥＬ細胞株を、リン酸カルシウム法により、 pcDNA3/Neo-GM-CSFでトランスフェクトした。これらの実験につき、５２６−ＭＥＬは培養第３２継代において、６２４−ＭＥＬは培養第２８継代においてトランスフェクトした。ＧＭ−ＣＳＦレベルはＥＬＩＳＡにより測定した。これらの実験結果を表４に示す。表４．トランスフェクトされた黒色腫細胞株によるＧＭ−ＣＳＦの分泌５２６−ＭＥＬ細胞株で観察されたＧＭ−ＣＳＦ分泌レベルは１０ｎｇ／１０⁶ 黒色腫細胞／日未満であった。５２６−ＭＥＬ細胞株についてのＧＭ−ＣＳＦ分泌は、異なるトランスフェクション用発現ベクターを使用するか、あるいはより高レベルの発現を示す黒色腫細胞株を選択することによって増加させ得る。これに比べて、黒色腫細胞株６２４−ＭＥＬで観察されたＧＭ−ＣＳＦ分泌レベルは８０ｎｇ／１０⁶黒色腫細胞／日を超えていた。トランスフェクトされていない黒色腫は測定可能な量のＧＭ−ＣＳＦを分泌しなかった。この実施例で使用された方法は、増加したレベルの他のサイトカインを生産し得る黒色腫細胞株を生じさせるのにも用いることができ、また、他の黒色腫細胞株にも用いることができるが、それらはすべて同様にワクチンとして使用することができる。実施例４この実施例では、宿主へのＧＭ−ＣＳＦ投与に関する付加的研究について説明する。さらなる研究により、ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、このサイトカインの公知のパラクリン生理に近似する必要があることが確認されている。詳細には、前記実施例に記載したように、分泌は関連する抗原（すなわち、黒色腫細胞）の部位で起こらなければならず、また、数日間高レベルが持続しなければならない（例えば、 Dranoff ら，上述；Golumbekら，上述）。しかしながら、黒色腫細胞自身がＧＭ−ＣＳＦの分泌源である必要はないらしい（Golumbekら，上述）。黒色腫細胞と共に注射された生分解性ポリマーからＧＭ−ＣＳＦを徐放させると、レトロウイルスにより形質導入したサイトカイン発現黒色腫細胞で見られるのと類似の免疫学的防御および組織学的浸潤を生じさせることができる。さらに、もし交差反応しない第二の腫瘍をＧＭ−ＣＳＦ分泌性黒色腫と共に注射すれば、両方の腫瘍に対する免疫学的防御が生じ得るだろう。しかしながら、単に黒色腫細胞と一緒に可溶性ＧＭ−ＣＳＦを注射しただけでは、このサイトカインの局所におけるレベルを持続できず、全身性免疫は生じない（Golumbekら，上述）。そこで、インビボでのサイトカインの送達に、宿主細胞とＭＨＣがマッチしない同種黒色腫細胞を使用することの有効性を調査した。マウスモデルにおいて、傍観者である同種黒色腫細胞によるＧＭ−ＣＳＦの送達によって生じる抗黒色腫免疫が、標的黒色腫細胞自身によってＧＭ−ＣＳＦが送達された場合に達成されるそれに匹敵することが実証された。詳細には、これらの実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに放射線照射したＣＴ２６結腸癌細胞を、レトロウイルスにより形質導入したＣＴ２６細胞またはレトロウイルスにより形質導入したＢ１６−Ｆ１０細胞とともに皮下接種した。２週間後、マウスにＣＴ２６野生株を注射して再度チャレンジした。ＣＴ２６結腸癌細胞株はある固有の免疫原性を有しているが、同系の細胞によってであれ、同種（異系）の細胞によってであれ、ワクチン接種部位でＧＭ−ＣＳＦが分泌されると、より大きな防御が見られた。どの程度、あるいはどのようなメカニズムによって、同種黒色腫細胞が抗ＣＴ２６免疫を増強できるのかは明らかではないが、これらの結果は、おそらくは本発明のＧＭ−ＣＳＦの同種送達が自家黒色腫の送達と少なくとも同程度に有効らしいことを強く示唆している。実施例５この実施例では、本発明に従って、１または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株、好ましくは同種であるが必ずしも宿主とＭＨＣがマッチしない黒色腫細胞株を、宿主に投与することによる癌の治療方法について説明する。ＧＭ−ＣＳＦを、好ましくは３６ｎｇ／１０⁶黒色腫細胞／日を超えるレベルで分泌する黒色腫細胞株を取得して使用する。該改変黒色腫細胞を組織培養フラスコからトリプシン処理して回収する。該細胞を通常の食塩水を用いて洗浄し、ペレット状にし、Hanksの平衡塩類溶液またはインビボでの導入に適当な他の塩類溶液中に再懸濁させる。細胞は約１×１０⁶ないし約１×１０⁸黒色腫細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。この再懸濁混合液約０．１ないし約０．５ｍｌをワクチンとして使用する。したがって、好ましくは約１×１０⁶ないし約１×１０⁹黒色腫細胞、最も好ましくは約１×１０⁷ないし約５×１０⁸黒色腫細胞が、全部で注射される。改変黒色腫細胞はマウスでは皮下注射されるが、ヒトにおいては皮内注射するのが好ましい。注射の前に、改変黒色腫細胞を、例えば¹³⁷Ｃｓ源を用いて放射線照射することができる。このような放射線処理は腫瘍細胞の複製を防ぐが、培養中で少なくとも１週間、該細胞がＧＭ−ＣＳＦを分泌し且つ代謝学的に活性であり続けることを許す。好ましくは、放射線照射は、¹³⁷Ｃｓ源を用いて約１２０〜１４０ラド／分の線量速度で約１５，０００ラドの総線量を送達するように実施することができる。改変黒色腫細胞株はまた、その免疫原性を増強するように変化させることもできる。例えば、細胞をさらに遺伝子操作したり（例えば、他のサイトカインまたは他の免疫刺激核酸配列（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ以外の、またはそれに加えて、あるサイトカイン）を挿入することによって）、あるいは非特異的アジュバント（例えば、フロイントの完全または不完全アジュバント、細菌およびマイコバクテリアの細胞壁成分からなる乳化物等）と混合したりすることができる。本発明は、黒色腫を有するか、あるいは黒色腫が発生する危険のある哺乳動物（特にヒト）に使用することができる。本明細書に記載するような免疫療法の前に、あるいはそれに加えて（すなわち、同時または直後に）、例えば、外科的切除、放射線照射、化学療法等の、癌治療に使用される方法をいくつでも用いて、患者を処置し得ることも予期される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パードル、ドゥリューエム. アメリカ合衆国、メリーランド州 20833、ブルークヴィル、ジェイムズクリークコート 19400 (72)発明者ジャフィー、エリザベスエム. アメリカ合衆国、メリーランド州 21093、ルーサーヴィル、サマーフィールズコート 20 (72)発明者アドゥラー、アダムアメリカ合衆国、メリーランド州 21208、パイクスヴィル、アパートメント３ビー、クインパーコート５ (72)発明者トパリアン、スザンヌエル. アメリカ合衆国、メリーランド州 20833、ブルークヴィル、ジェイムズクリークコート 19400 (72)発明者ローゼンバーグ、スティーヴンエイ. アメリカ合衆国、メリーランド州 20854、ポトマック、アイアンゲイトロード 10104

Claims

【特許請求の範囲】１．(a) １または２以上の免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する黒色腫細胞株を取得し、 (b) 未改変黒色腫細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように該黒色腫細胞株を改変し、 (c) 黒色腫を有するかあるいは黒色腫が発生する危険のある哺乳動物宿主に該黒色腫細胞株を投与することを含む、黒色腫の治療または予防方法。２．該黒色腫細胞株が該宿主と同種であり、且つ宿主とＭＨＣがマッチしないものである請求の範囲１の方法。３．該免疫優性な共有黒色腫抗原が、黒色腫特異的分化抗原および腫瘍特異的共有抗原からなる群より選択される請求の範囲１〜２のいずれかの方法。４．該免疫優性な共有黒色腫抗原が、１または２以上の黒色腫特異的分化抗原および１または２以上の腫瘍特異的共有抗原を含むものである請求の範囲１〜３のいずれかの方法。５．該黒色腫細胞株が少なくとも３つの免疫優性な共有黒色腫抗原を発現する請求の範囲１〜４のいずれかの方法。６．該免疫優性な共有黒色腫抗原が、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ− １／メラン−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ− １、ＧＡＧＥ−２、ＧｎＴ−Ｖおよびｐ１５からなる群より選択される請求の範囲１〜５のいずれかの方法。７．該黒色腫細胞株がＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ７５およびｇｐ１００抗原を発現する請求の範囲１〜６のいずれかの方法。８．該黒色腫細胞株が５２６−ＭＥＬまたは６２４−ＭＥＬである請求の範囲１〜７のいずれかの方法。９．投与の前に該黒色腫細胞株を放射線照射する請求の範囲１〜８のいずれかの方法。１０．投与の前に該黒色腫細胞株をその免疫原性が増強するように処理する請求の範囲１〜９のいずれかの方法。１１．該処理が遺伝子操作または非特異的アジュバントとの混合を含む請求の範囲１０の方法。１２．該遺伝子操作が、未改変黒色腫細胞株に比べてサイトカインの産生レベルが増加し得るように該黒色腫細胞株を改変することを含む請求の範囲１１の方法。１３．該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲１２の方法。