DE69114299T3

DE69114299T3 - Verfahren und zusammensetzungen für gentherapie und stärkung des immunsystems.

Info

Publication number: DE69114299T3
Application number: DE69114299T
Authority: DE
Inventors: Philip Morris Township FROST; Bert Baltimore Vogelstein; Yuti Chernajovsky; Eric R. Branford FEARON; Drew Baltimore PARDOLL
Original assignee: Johns Hopkins University; University of Texas System
Current assignee: Johns Hopkins University; University of Texas System
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2011-09-13
Also published as: DE69114299D1; GR3018897T3; EP0551401B1; AU8764391A; WO1992005262A1; JP2007277265A; DE69114299T2; EP0551401A1; ATE129746T1; JPH06501161A; CA2091346A1; ES2080341T3; EP0551401B2; JP2009165490A; DK0551401T3; AU659812B2; AU3041295A; CA2091346C

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Immunotherapie von Krebs und insbesondere die Herstellung von Tumorzelllinien mit einem Gehalt an einem exogenen Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das die Immunantwort auf den Tumor potenziert, z. B. Interleukin-2. Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Krebstherapie durch Immunisierung mit der immunopotenzierenden Tumorzelle.
Die Erfindung stellt auch eine Methodik bereit, mit der man genetisch veränderte Tumorzellen selektiv in vitro und in vivo entfernen kann. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung umfasst eine Tumorzelle, die ein erstes exogenes Gen, das für ein immunopotenzierendes Polypeptid kodiert, und ein zweites exogenes Gen enthält, das für ein „letales" oder „suizides" Polypeptid kodiert, vorzugsweise unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Die Einführung des zweiten exogenen Gens trägt zu der Fähigkeit bei, selektiv die Tumorzelle abzutöten, indem man einen Promotor in operativer Verknüpfung mit dem für das letale Polypeptid kodierenden Gen induziert, um die Transkription des Polypeptids zu initiieren. Diphtherie-Toxin oder die Thymidin-Kinase von Herpes-simplex-Virus sind Beispiele für letale Gene. Ein eingesetzter beispielhafter Promotor ist der 6–16-Promotor, der durch geringe Konzentrationen an Interferon induzierbar ist. Verfahren zur Verwendung der Zellen bei der Krebstherapie werden ebenfalls bereitgestellt.
Eine aktive Immunotherapie wird als Erfolg versprechender Weg zur Behandlung und insbesondere zur Verhinderung von Rezidiven von humanem Krebs angesehen. Eine spezifische aktive Immunotherapie, eine der vielversprechendsten untersuchten Möglichkeiten, beinhaltet die Aktivierung der Wirts-Immunantwort gegen den Tumor durch Immunisierung mit Tumorzellen (die durch Mutagenese, durch Behandlung mit einem Hapten oder durch Expression von fremden Proteinen verändert sein können), um spezifische Effektorzellen des Immunsystems, z. B. zytolytische T-Lymphozyten, zu aktivieren. Eine nicht-spezifische aktive Immuntherapie kann sich mikrobieller oder chemischer Immunomodulatoren bedienen, um natürliche Killerzellen (NK), Makrophagen oder durch Lymphokin aktivierte Killerzellen (LAK) zu aktivieren. Unglücklicherweise hat sich der Großteil der Erwartungen in diese Möglichkeiten nicht erfüllt.
Eine der besonders kritischen Fragen bei der Krebs-Immunologie ist die Frage, warum das Immunsystem bei der Beseitigung von Tumoren versagt. In den 70'er Jahren vertrat Hewitt die Ansicht, dass die meisten Tumoren keinerlei tumorspezifische oder Neoantigene exprimieren und somit nicht vom Immunsystem als „fremd" erkannt werden können. Tatsächlich erwiesen sich praktisch keinerlei von Antikörpern erkannte Tumorzellen-Oberflächenantigene als tumorspezifisch. Ferner wurden die meisten spontanen Mäusetumoren als „schwach immunogen" angesehen, wobei sich diese Einstufung aufgrund der Tatsache ergibt, dass sie bei Übertragung auf syngene Wirte nicht beseitigt werden (Hewitt et al., 1976). Jedoch wurden die gleichen Tumoren durch Mutagenese „immunogen" gemacht (Van Pel und Boon, 1982), wenn neue Antigene an der Tumorzelloberfläche exprimiert wurden.
Es ist möglich, dass das Immunsystem bei der Beseitigung von Tumoren nicht deswegen versagt, weil Neoantigene abwesend sind, sondern weil die Antwort auf diese Neoantigene unangemessen ist. Daher würde ein Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität der Tumorzellen unter Potenzierung der Wirts-Immunantwort einen zentralen Fortschritt in der Immunotherapie darstellen.
Die ausbleibende Antwort auf Tumor-Neoantigene kann zumindest teilweise auf ein Versagen der T-Zellen-Unterstützung zurückzuführen sein. Die molekulare Basis für die TH-Funktion ist die lokale Sekretion von Lymphokinen, wie Interleukin-2 (IL-2), die auf CTLs wirken, deren T-Zellrezeptoren zunächst durch den entsprechenden Antigen-MHC-Komplex belegt worden sind (Übersichtsartikel von Moller, 1980). Das zytotoxische Potential von NK- und LAK-Zellen wird ferner durch IL-2 verstärkt (Grimm et al., 1982; Phillips und Lanier, 1986; Ortaldo et al., 1986). Obgleich die Potenzierung der Tumor-Immunität durch systemische Injektion von Interleukin-2 versucht worden ist, wurden diese Untersuchungen durch die Toxizität von systemisch verabreichtem IL-2 behindert. Daher stellt ein Verfahren zur Potenzierung der Immunität gegenüber Tumoren durch Bereitstellung von zusätzlicher T-Zellen-Unterstützung an der Tumorstelle eine attraktivere Option dar, für die in der Krebstherapie seit langem ein Bedürfnis besteht.
Eine zusätzliche Schwierigkeit bei der Immunotherapie ergibt sich aus den Probleme, die naturgemäß bei der Verabreichung einer lebenden neoplastischen Zelle an einen Patienten auftreten. In der Vergangenheit wurden für die Immunisierung eingesetzte Tumorzellen vor der Immunisierung behandelt, um ihr proliferatives Potential zu verringern, beispielsweise durch Bestrahlung oder durch Behandlung mit Mitomycin C. Ungünstigerweise verringert keines dieser Verfahren zur Hemmung der Replikation auch in signifikanter Weise die Immunogenität der Zellen. Es wurde gezeigt, dass mutageninduzierte Varianten, die mit 8.000–10.000 Rad bestrahlt worden sind, nicht mehr immunogen sind (Sella, 1989; Boon, 1985). In ähnlicher Weise verlieren Mäuse-Tumorzellen, die IL-2 oder IFN-γ sezernierten, nach Bestrahlung ihr Immunpotential. Außerdem gelang auch durch Versuche, Membranpräparate von Tumorzellen zu verwenden, kein überzeugender Beweis für eine Immunantwort. Es wäre daher von Vorteil, Mittel zur Verwendung von lebensfähigen immunogenen Tumorzellen, die nach Induktion einer Immunantwort beseitigt werden können, zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue immunopotenzierende Tumorzellvariante bereit, die zur Induktion einer Wirts-Immunantwort gegenüber Tumorantigenen befähigt ist und ein ausgewähltes immunopotenzierendes Gen, beispielsweise Interleukin-2 und ein exogenes letales Gensystem enthält. In einer ersten allgemeinen Ausführungsform stellt die Erfindung ein zelluläres Präparat zur Potenzierung der Tumor-Immunantwort durch einen Wirbeltierorganismus, z. B. von Menschen oder anderen Säugetieren, Vögeln oder Fischen, bereit. Das Präparat umfasst vom Tumor abgeleitete Zellen, die ein exogenes Gen enthalten (z. B. ein durch Insertion von genetischem Material von außerhalb der Zelle, z. B. durch Transfektion und Selektion einer stabil transfizierten Zelllinie eingeführtes Gen), das für ein immunopotenzierendes Interleukin kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Interleukin um Interleukin-2. Obgleich die Anmelderin sich auf keine Theorie festlegt, hat es den Anschein, dass das Interleukin-2-Gen der Zelle die Fähigkeit verleiht, eine spezifische Immunantwort zu induzieren, die vermutlich primär durch T-Lymphozyten vermittelt wird.
In einer damit verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung ferner eine Zusammensetzung zur Verstärkung der nicht-spezifischen Resistenz gegen einen Tumor bereit, wobei diese Ausführungsform ein Präparat von Tumorzellen umfasst, die ein für Interferon, vorzugsweise Interferon-γ, kodierende exogenes Gen enthalten.
Obgleich es für die erfindungsgemäße Praxis nicht erforderlich ist, können verschiedene Genkombinationen erhebliche Vorteile oder sogar synergistische Wirkungen bei der Potenzierung der Immunität gegen den Tumor herbeiführen. Daher stellt die Erfindung auch immunotherapeutische Tumorzellen bereit, die mehr als ein exogenes Gen enthalten können. Beispielsweise können die Zellen entweder ein Interleukin-Gen oder ein Interferon-Gen oder beide sowie ein weiteres Gen, das für ein zusätzliches immunopotenzierendes Polypeptid kodiert, enthalten.
Das immunopotenzierende Polypeptid lässt sich als ein Polypeptid definieren, das die Reaktionsfähigkeit eines Wirts-Immunsystems auf einen im Tier vorhandenen Tumor verstärkt. Für die erfindungsgemäße Praxis können mindestens zwei Kategorien von immunopotenzierenden Genen verwendet werden. Eine erste Kategorie, die „immunopotenzierenden Antigene", umfasst Gene, die für eine Vielzahl von für das Tier fremden Antigenen kodieren, z. B. Virus-Hüllproteine, bakterielle Zellantigene und andere Antigene, die zur Hervorrufung einer Immunantwort in einem mit einer ein derartiges Antigen exprimierenden Zelle immunisierten Tier befähigt sind. Diese Kategorie von Genen wird hier als „immunopotenzierende Antigene" bezeichnet. Zu bevorzugten Spezies in dieser Kategorie gehören beispielsweise virale Hüllproteine, z. B. das Influenza-Hämagglutinin-(HA)-Gen, das Influenza-Neuraminidase-Gen, Vaccinia-Gene oder vesikuläre Stomatitis-Virus-Gene. Zu geeigneten bakteriellen Antigenen gehören beispielsweise das 65 kDa-Antigen von M. tuberculosis und andere bakterielle Antigene. Zu weiteren immunopotenzierenden Genen können solche Gene gehören, die für Histokompatibilitäts-Antigene, die für den Wirt allogen sind, und andere Alloantigene kodieren.
Zu einer zweiten Kategorie von immunopotenzierenden Genen gehören Gene, die für Proteine kodieren, die möglicherweise für den Wirt nicht immunogen sind, die aber dennoch die Immunität durch Aktivierung oder Verstärkung der Aktivität von Zellen des Immunsystems potenzieren, wie T-Lymphozyten, natürliche Killer-Zellen oder Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen. Unter diese Kategorie von immunopotenzierenden Genen fallen solche Gene, die für eine Anzahl der Lymphokine kodieren, die als „Interleukine" klassifiziert werden, und insbesondere Interleukin-2, -4, -5, -6, -1 oder -3. Unter diese Kategorie fallen auch die als Interferone bekannten Proteine, insbesondere Interferon-γ, wenngleich diese auch nicht notwendigerweise nach dem gleichen Mechanismus arbeiten.
Die Gene lassen sich gemäß bekannten molekularbiologischen Techniken erhalten und in eine ausgewählte Zielzelle (die üblicherweise vom Tumor abgeleitet ist) durch Transfektion oder durch Transformation mit einem Vektor, der zur Verwendung mit der speziellen Zielzelle geeignet ist, einführen. Spezielle Techniken, die von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press, 1989 (hierauf wird durch Verweis Bezug genommen) beschrieben sind, können die Praxis bestimmter Aspekte der Erfindung erleichtern.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann man eine Population von ausgewählten Tumorzielzellen verwenden, die mindestens ein für ein immunopotenzierendes Antigen kodierendes Gen und ein zweites immunopotenzierendes Gen, das aus der zweiten Gruppe der vorstehend erörterten immunopotenzierenden Gene ausgewählt ist, enthalten.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Potenzieren der Immunantwort von Wirbeltierorganismen auf einen Tumor durch Einführung eines lebensfähigen Präparats der hier beschriebenen Tumorzellen in den Organismus. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Tumorzellen nach Verringerung der Tumorbelastung, beispielsweise durch chirurgische Resektion, Bestrahlung oder andere geeignete Techniken, verabreicht.
Selbstverständlich kann es in zahlreichen Situationen wünschenswert sein, die verabreichten Tumorzellen nach dem Erreichen der gewünschten Funktion selektiv zu entfernen oder zu zerstören. Daher können die erfindungsgemäßen Tumorzellen, die das immunopotenzierende Gen enthalten, auch ein „letales Gen" enthalten, das das selektive Abtöten der dieses Gen enthaltenden Zellen ermöglicht, sofern dies wünschenswert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das letale Gen mit einem spezifisch induzierbaren Promotor gekuppelt, so dass man durch Behandlung mit dem Induktor spezifisch die Transkription der für das „letale Protein" kodierenden mRNA fördern kann, wobei das letale Protein wiederum dazu befähigt ist, die Wirtszelle direkt oder indirekt abzutöten, beispielsweise durch Hemmung ihres intrazellulären Stoffwechsels.
Somit wird erfindungsgemäß eine Tumorzelle bereitgestellt, die ein erstes exogenes Gen, das für ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, und ein zweites exogenes Gen („letales Gen") unter Einschluss eines Promotors, vorzugsweise eines selektiv induzierbaren Promotors, in funktioneller Verknüpfung mit der für ein zweites ausgewähltes Polypeptid kodierenden DNA enthält. Das zweite ausgewählte Polypeptid, ein „letales Polypeptid", ist zum Abtöten der Tumorzelle befähigt, beispielsweise nach Einführung eines selektiv induzierbaren Promotors oder nach Zugabe eines Substrats für das letale Polypeptid, wobei das Substrat durch das letale Polypeptid in ein Molekül, das für die Tumorzelle toxisch ist, übergeführt wird. Der Ausdruck „funktionelle Verknüpfung" bedeutet, dass sich der Promotor in Bezug zu der für das letale Peptid kodierenden DNA in einer Stellung befindet, die es dem Promotor ermöglicht, die Transkription des Strukturgens für das letale Polypeptid zu dirigieren.
In einer spezielleren, auf die Krebs-Immunotherapie abgestellten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Potenzierung der Immunantwort auf einen Tumor bereit, wobei die Zusammensetzung eine vom Tumor abgeleitete Zelle enthält, wobei die Zelle ein erstes exogenes Gen, das für ein immunopotenzierendes Polypeptid kodiert, und ein zweites exogenes Gen unter Einschluss eines Promotors in funktioneller Verknüpfung mit der für ein zur Abtötung der Zelle befähigtes Polypeptid kodierenden DNA enthält. Vorzugsweise umfasst der Promotor einen spezifisch induzierbaren Promotor, wobei das letale Polypeptid die Zelle bei Induktion des Promotors abtötet.
Obgleich zahlreiche geeignete Promotoren, wie SV40-, Cytomegalovirus- oder Actin-Promotoren, in der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzt werden können, ist der nachstehend beschriebene induzierbare 6–16-Interferon-α/β-Promotor besonders vorteilhaft. Alternativ kann dann, wenn ein Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das die Zugabe eines exogenen Substrats für die intrazelluläre Toxizität benötigt, verwendet wird (z. B. die Herpes-simplex-Thymidin-Kinase, die Gancyclovir benötigt), ein konstitutiver Promotor, wie der Herpes-simplex-Promotor, eingesetzt werden.
Eine Anzahl von geeigneten letalen Genen kann verwendet werden. Zu geeigneten Beispielen gehören das Herpes-simplex-Virus-Thymidin-Kinase-Gen und das für Diphtherie-Toxin-A-Kette kodierende Gen.
Die Tumorzellen, die das immunopotenzierende und das letale Gen enthalten, können auch ein drittes exogenes Gen enthalten, das für ein zweites immunopotenzierendes Polypeptid kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das dritte exogene Gen für ein immunopotenzierendes Antigen, wenn es sich bei dem ersten immunopotenzierenden Polypeptid um ein Cytokin handelt, und für ein Cytokin, wenn es sich beim ersten immunopotenzierenden Polypeptid um ein Antigen handelt.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung der neuen Tumorzellderivate.
Beispielsweise umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Tumorzelle für die Therapie einer ausgewählten Krankheit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Einführung eines ersten exogenen Gens, das für ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, in eine Tumorzelle und Einführen eines zweiten exogenen Gens, das einen Promotor, vorzugsweise einen selektiv induzierbaren Promotor, in funktioneller Verknüpfung mit DNA, die für ein zum Abtöten der Tumorzelle befähigtes Polypeptid kodiert, enthält, in die Tumorzelle, wodurch eine Tumorzelle gebildet wird, die sowohl das erste als auch das zweite exogene Gen enthält. Die Bereitstellung eines selektiv induzierbaren Promotors ermöglicht es, die Tumorzelle nach Induktion des Promotors abzutöten. Die vorstehend beschriebenen Tumorzellen, Gene und Promotoren sowie letalen Gene eignen sich ebenfalls für diesen Aspekt der Erfindung.
Selbstverständlich umfasst die Erfindung auch Verfahren zum Einsatz in der Gentherapie und spezifisch die Immunotherapie von Krebs. Ein beispielhaftes Verfahren für die Gentherapie eines Wirbeltierorganismus umfasst die Einführung eines ersten exogenen Gens, das für ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, in eine Tumorzelle und die Einführung eines zweiten exogenen Gens, das einen Promotor in funktioneller Verknüpfung mit DNA, die für ein zum Abtöten der Zelle befähigtes Polypeptid kodiert, enthält, in die Zelle, wodurch eine Zelle gebildet wird, in der sowohl das erste als auch das zweite exogene Gen in stabiler Weise aufrecht erhalten werden. Ferner umfasst dieses Verfahren die Verabreichung der Zelle, vorzugsweise durch Injektion in den Organismus. In der bevorzugten Ausführungsform, bei der es sich beim Promotor um einen selektiv induzierbaren Promotor handelt, kann die zusätzliche Stufe der Einführung des Promotors zur Förderung der Synthese des letalen Polypeptids dann durchgeführt werden, wenn dies gerechtfertigt ist. Alternativ kann dann, wenn ein konstitutiver Promotor verwendet wird, z. B. in Verbindung mit dem Herpes-simplex-Thymidin-Kinase-Gen die Verabreichung eines zweiten toxischen Mittels, wie Gancyclovir, eine zusätzliche Verfahrensstufe darstellen. Selbstverständlich kann das Herpes-simplex-Thymidin-Kinase-Gen unter Kontrolle eines selektiv induzierbaren Promotors gestellt werden, wobei in diesem Fall sowohl die Induktion des Promotors als auch die Verabreichung des zweiten Mittels erfolgen können.
Die Verfahren können für die Immunotherapie einer Vielzahl von Tumoren, z. B. Melanom, Brustkrebs, Sarkom, Kolonkrebs und Ovarialkrebs, herangezogen werden.
Diese und weitere Aspekte der Erfindung gehen aus einer Beschreibung spezieller Ausführungsformen in Verbindung mit der Zeichnung klarer hervor.
1
Zufuhr von CTLs nach in-vivo-Injektion von CT26-Zellen und IL-2-transfizierten CT26-IL-2⁺-Zellen. Zellen (1 × 10⁶) der Zelllinien CT26 oder CT26-IL-2⁺ wurden subkutan in die linke Flanke von BALB/c-Mäusen injiziert. 2 Wochen später wurden die Splenozyten entfernt und 5 Tage mit Mitomycin-C-behandelten CT26-Zellen in Gegenwart von IL-2 gezüchtet. Nach der Züchtung wurden lebende Zellen mit ⁵¹Cr-markierten CT26-Zielen mit unterschiedlichen Effektor/Ziel-Verhältnissen in einem 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungstest vermischt. (a) CTLs, gebildet aus CT26-Zellen im Vergleich zu CT25-IL-2⁺-Zellen. (b) anti-CD4- und anti-CD8-Blockierung der CT26-Lyse durch Splenozyten aus mit CT26-IL-2⁺-Zellen immunisierten Mäusen. (c) anti-MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Blockierung der CT26-Lyse durch Splenozyten aus mit CT26-IL-2⁺-Zellen immunisierten Mäusen.
2
Schützende Immunität gegen CT26-Zellen, induziert durch Injektion von CT26-IL-2⁺-Zellen. BALB/c-Mäuse erhielten an der linken Flanke eine subkutane Injektion von 1 × 10⁶ CT26-IL-2⁺-Zellen, gefolgt von einer subkutanen Injektion der rechten Flanke mit 1 × 10⁵ CT26-Zellen nach entweder 2 oder 4 Wochen. Ferner gezeigt ist das CT26-Wachstum ohne vorherige Immunisierung mit CT26-IL-2⁺. Das Tumorwachstum wurde jede Woche durch Palpation und Messung bestimmt. Die gepoolten Ergebnisse von 20 Mäusen pro Gruppe sind dargestellt. Die Daten werden in Form eines Kaplan-Meier-Diagramms dargestellt.
3
Einfluss der T-Zellen-Subset-Verarmung auf die in-vivo-Antwort auf CT26-IL-2⁺- und CT26-HA⁺-Zellen. BALB/c-Mäuse wurden in vivo durch intraperitoneale Injektion von gereinigtem anti-CD4 oder anti-CD8 einer Verarmung an CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen unterworfen. Sie erhielten sodann an der linken Flanke eine subkutane Injektion von 1 × 10⁶ CT26-neo-IL-2⁺-Zellen. Dargestellt ist ferner das Wachstum in normalen und CD4 verarmten BALB/c-Mäusen einer CT26-HA⁺-Linie, die durch Transfektion mit dem Influenza-Hämagglutinin-Gen immunogen gemacht worden ist. Das Tumorwachstum wurde jede Woche gemessen und ist wie in 2 dargestellt. Eine spezifische Verarmung an T-Zell-Subsets (Untergruppen) wurde gemäß der Beschreibung der experimentellen Verfahrensweisen dokumentiert.
4
Fluoreszenz-Intensitätsverteilung auf der Grundlage der Bindung von markiertem Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin an SP1- oder CT26-Zellen nach Vorbehandlung mit Mäuse-anti-H2K^k bzw. H2K^d.
5
SP1-Zellen wurden mit 10 U/ml IFN-γ 24 Stunden behandelt. Die Zellen wurden gewaschen, und eine Probe wurde für die FACS-Analyse entfernt. Die Zellen wurden in eine in-vitro-Kultur ohne zusätzliches IFN-γ zurückgegeben. Proben wurden für die FACS-Analyse nach 48, 72 und 96 Stunden entfernt. Diese Fig. zeigt die Fluoreszenz-Intensitätsverteilung auf der Grundlage der Bindung von Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin an mit IFN-γ behandelte SP1-Zellen nach Vorbehandlung mit Mäuse-anti-H2K^k-Antikörper.
6
Drei verschiedene Klone von SP1-Zellen, die mit dem Mäuse-IFN-γ-Gen transfiziert waren, wurden auf ihre H2K^k-Expression getestet. Die Fig. erläutert die Fluoreszenz- Intensitätsverteilung auf der Grundlage der Bindung von Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin an mit Mäuse-anti-H2K^k vorbehandelte Zellen.
7
Eine Gruppe von sechs nackten Mäusen erhielt eine subkutane Injektion von 1 × 10⁵ 6L-Zellen. Zwei der sechs gebildeten Tumoren wurden entfernt, in vitro gezüchtet und auf ihre IFN-γ-Bildung und H2K^k-Expression getestet. Die einzelnen Tumoren 6L-A und 6L-B wurden sodann syngenen Mäusen injiziert und auf ihre tumorerzeugende Wirkung getestet.
Die folgenden Beispiele erläutern ausgewählte Aspekte der Erfindung, sollen aber keine über die Ansprüche hinausgehende Beschränkung der Erfindung darstellen.
Beispiel I (Vergleichsbeispiel)
Verstärkung der anti-Tumorimmunität durch Immunisierung mit Zellen, die mit einem exogenen, für Interleukin-2 kodierenden Gen transfiziert sind
Das folgende Beispiel beschreibt Ergebnisse bei der praktischen Durchführung eines Aspekts der Erfindung, nämlich die Potenzierung einer Antitumor-Immunantwort durch Verabreichen von Zellen, die mit einem Gen, das für ein exogenes immunopotenzierendes Cytokin, in diesem Fall Interleukin-2, transfiziert worden sind.
Experimentelle Verfahren
1. Zellen
CT26-Zellen wurden von M. Brattain erhalten (Brattain et al., 1980). Die F10-Unterlinie von B16-Melanomzellen (Fidler, 1975) wurde von der NIH-DCT-Tumor-Hinterlegungsstelle erhalten. RENCA ist ein Mäuse-Nierenzellkarzinom, das ursprünglich von Murphy und Haushesky (1973) beschrieben wurde. SS-5 ist ein spontanes Mamma-Adenokanthom, das durch Methylcholanthen in einem unserer Laboratorien induziert worden ist (P. F.). YAC-1, eine MHC^–-NK-Ziel-Zelllinie (Kiessling et al., 1975), wurde freundlicherweise von J. Wagner, John Hopkins University, zur Verfügung gestellt.
2. Transfektionen
DNA wurde in Zellen in Form eines Kopräzipitats mit Calciumphosphat eingeführt (Graham und van der Eb, 1973; Wigler et al., 1979). Die CT26-IL-2⁺-Zelllinie wurde durch Transfektion mit 5 μg des Plasmidvektors pBCMG-neo-mIL-2 erhalten, einem Rinder-Papilloma-Virus-Expressionsvektor mit einem Gehalt an einem Mäuse-IL-2-cDNA-Klon unter der transkriptionellen Kontrolle eines Cytomegalovirus-Promotors mit einem Kaninchen-β-Globin-Intron, einer Spleißung und poly(A)-Additionssignalen. Er enthält auch das Th5-Neomycin-Resistenzgen (Karasuyama und Melchers, 1988; Karasuyama et al., 1989). Zellen wurden dem präzipitat 14–16 h ausgesetzt, 1 Mal mit Hanks-ausgewogener Salzlösung ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ gewaschen, mit Dulbeccomodifiziertem Eagle-Medium mit 10% FCS versetzt und bei 37°C inkubiert. Die Auswahl in G418 bei 400 μg/ml begann 48 h nach Behandeln der Zellen mit dem Präzipitat. Die CT26-neo-IL-2^–-Linie wurde durch Transfektion von CT26-Zellen mit einem von pBCMG-neo-IL-2 abgeleiteten Plasmid unter Entfernung des Cytomegalovirus-frühen Promotors, des Kaninchen-β-Globin-Introns und der mIL-2-Sequenzen gebildet. Die Hämagglutinin exprimierende CT26-HA⁺-Zelllinie (beschrieben bei Fearon et al., 1988) wurde durch Kotransfektion von CT26 mit 5 μg des Plasmidvektors pBV1-MTHA und pSV2-neo unter anschließender G418-Selektion gebildet. FACS 3, Klon 5 wurde in den vorliegenden Untersuchungen verwendet. Die B16-IL-2⁺-Transfektante wurde auf ähnliche Weise wie die CT26-IL-2⁺-Transfektante hergestellt, jedoch nach G418-Selektion durch limitierende Verdünnung geklont.
3. IL-2-Tests
Überstände von transfizierten Zellen wurden auf IL-2 gemäß früheren Angaben (Janis et al., 1989) durch Übertragen von Verdünnungen auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einem Gehalt an 3.000 CTLL-2-Zellen pro Vertiefung getestet. Nach 24 h wurde [³H]Thymidin 12 h zugegeben, wonach die Einverleibung mit einem PHD-Zellerntegerät bestimmt wurde. IL-2-Einheiten pro ml wurden als reziproker Wert der Überstandsverdünnung, der eine halbmaximale Vermehrung von CTLL-2 ergab, berechnet.
4. CTL-Tests
Für CTL-Tests wurden Milzorgane aus BALB/c-Mäusen 2 Wochen nach subkutaner Injektion von 1 × 10⁶ CT26- oder CT26-IL-2⁺-Zellen in die linke Flanke entfernt. Eine Mitomycin-C-Behandlung von CT26-Zellen wurde durch 45-minütige Inkubation der Zellen bei 37°C in 50 μg/ml Mitomycin C unter anschließendem 3-maligem Waschen mit RPMI-10 FCS durchgeführt. In-vitro-Stimulationen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen 5 Tage mit 2 × 10⁵ CT26-Stimulatoren und 6 × 10⁶ Splenocyten-Respondern pro Vertiefung plus 20–50 U/ml rekombinantem Mäuse-IL-2 durchgeführt. ⁵¹Cr-Freisetzungstests wurden durch Vermischen verschiedener Zahlenmengen an Effektorzellen mit 5.000 ⁵¹Cr-markierten Zielen pro Vertiefung in V-Bodenplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Nach 4 h bei 37°C wurden 100 μl pro Vertiefung entfernt und in einem γ-Zählgerät gezählt. Die prozentuale spezifische Lyse ([cpm_exp – cpm_min]/[cpm_max – cpm_min] × 100) wurde auf der y-Achse für verschiedene Effektor-Ziel-Verhältnisse aufgetragen. CTL-Tests für das B16-Melanomsystem wurden auf ähnliche Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Inkubationen mit ⁵¹Cr-markierten B16-Zielen 8 h durchgeführt wurden. Für die Antikörperblockierung wurde eine 1 : 100-Verdünnung von mit Ammoniumsulfat gereinigten Präparaten der folgenden Antikörper in die Mikrovertiefungen zu Beginn der ⁵¹Cr-Freisetzungstests gegeben: GK1,5, monoklonaler Antikörper (MAb) gegen CD4 (Dialynas et al., 1983); 2,43, MAb gegen CD8.2 (Sarmiento et al., 1980); M5-114, MAb gegen I-A^d–1-E^d (Battacharaya et al., 1981); 28-14-8, MAb gegen L^d (Ozato et al., 1980); 35-1-2, MAb gegen K^d + D^d (Ozato et al., 1982). Die Titer sämtlicher blockierender Antikörper wurden sorgfältig so eingestellt, dass die eingesetzten Konzentrationen das 5- bis 10-fache der minimalen Konzentration betrugen, die eine Sättigungsbindung an Milz-Lymphozyten, bestimmt durch Durchflusscytometrie-Analyse von seriell verdünntem Antikörper, ergab. Vor der Verwendung wurde die Blockierungsspezifität auf folgende Weise bestimmt: anti-CD4- und anti-MHC-Klasse-II-Antikörper hemmten die sekundären in vitro PPD-proliferativen Reaktionen um mehr als 80% und die allo-CTL-Lyse (B6-anti-BALB/c) um mehr als 5%; anti-CD8- und anti-MHC-Klasse-I-Antikörper hemmten die sekundären PPD-proliferativen Reaktionen um mehr als 5% und die allo-CTL-Lyse um mehr als 80%.
5. In-vivo-Antikörper-Verarmung
Die in-vivo-Antikörper-Verarmung wurde 1 bis 2 Tage vor der Injektion des Tumors begonnen. MAb GK1,5 wurde für CD4-Verarmungen und MAb 2.43 für CD8-Verarmungen verwendet. Mit Ammoniumsulfat gereinigte Ascites-Flüssigkeit (mit einem Titer von > 1 : 2000, bestimmt durch Färben von Thymozyten am GACS) wurde intraperitoneal (0,1 ml pro Maus) während der ersten 3 Wochen jeden 2. Tag und anschließend 1 Mal pro Woche injiziert. Die Verarmung von T-Zell-Untergruppen wurde am Tag der Tumorinjektion sowie 3 Wochen und 5 Wochen nach der Tumorinjektion durch Durchflusszytometrie-Analyse von Lymphknotenzellen, gefärbt mit 2.43 oder GK1.5, anschließend mit Fluorescein-isothiocyanat-markiertem Ziegen-Antikörper gegen Ratten-IgG, bestimmt. Für jeden Analysenzeitpunkt wurde eine > 99% Verarmung der entsprechenden Untergruppe bei normalen Spiegeln der entgegengesetzten Untergruppe (im Fall der alleinigen Verarmung) erreicht.
A. Ergebnisse
1. Bildung von IL-2-transfizierten CT26-Zellen
Die N-Nitroso-Nmethylurethan-induzierte Mäuse-Kolon-Tumorlinie CT26, die für die Untersuchung gewählt wurde, ist schwach immunogen. Eine kleine Anzahl von Zellen (1 × 10³ – 1 × 10⁴) verursacht bei Injektion in syngene (BALB/c) Mäuse einen letalen Tumor und induziert keine nachweisbaren tumorspezifischen CTLs (Fearon et al., 1988). CT26-Zellen wurden mit einem Rinder-Papilloma-Virus(BPV)-Vektor mit einem Gehalt an einem Neomycin-Resistenzgen und einer Mäuse-IL-2-cDNA transfiziert. Transfektanten wurden im Neomycin-Analogen G418 ausgewählt, und eine G418-resistente Linie (CT26-IL-2⁺), die aus mehr als 50 gepoolten Klonen von etwa gleicher Größe präpariert worden war, wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt.
Zur Bestimmung der IL-2-Bildung wurde die CT26-IL-2⁺-Linie in einer Menge von 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgestrichen. Nach 3 Tagen wurden die Überstände (1,5 ml pro Vertiefung) entfernt und in seriellen Verdünnungen auf die IL-2-abhängige CTLL-2-Zelllinie übertragen. Es wurde festgestellt, dass sie 40 U IL-2-Aktivität (1 U ist definiert durch die Induktion von 50% der maximalen CTLL-Stimulation in einem 24-stündigen Test) enthielten, was zeigt, dass CT26-IL-2⁺-Zellen signifikante Mengen an IL-2 sezernierten. Eine nachweisbare IL-2-Aktivität wurde weder in den Überständen der parentalen CT26-Zellen noch in den Überständen der CT26-Zellen, die mit dem BCMG-Vektor, bei dem das IL-2-cDNA-Insert ausgeschnitten worden war, transfiziert worden waren, festgestellt.
2. Durch CT26-IL-2⁺-Zellen induzierte CTL-Bildung
Früher wurde gezeigt, dass eine subkutane Injektion von CT26-Zellen selbst nach einer sekundären in vitro-Stimulation in Gegenwart von IL-2 nur eine geringe, wenn überhaupt nachweisbare systemische CTL-Aktivität hervorruft (Fearon et al., 1988). Jedoch wurde nach subkutaner Injektion der IL-2-bildenden CT26-IL-2⁺-Zellen eine signifikante anti-CT26-CTL-Aktivität in der Milz nach sekundärer in-vitro-Stimulation nachgewiesen (1A). Der Großteil der in vitro-CTL-Aktivität wurde durch Antikörper gegen CD8- und MHC-Klasse I blockiert, jedoch nicht durch Antikörper gegen CD4- oder MHC-Klasse II (1b und 1c). Dies ließ darauf schließen, dass CT26-IL-2⁺-Zellen tatsächlich endogene, MHC-Klasse I-beschränkte CD8⁺-CTLs aktivierten. Tatsächlich wurde keine Zytolyse eines anderen BALB/c-abgeleiteten Tumorziels (SS-5) oder des MHC-Klasse I-NK-Ziels, YAC-1 (< 5% spezifische Lysis bei einem Effektor/Ziel-Verhältnis von 100 : 1) festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Großteil der Effektorzellen, die durch CT26-IL-2⁺- Immunisierung induziert wurden, antigen und MHC-Klasse I-spezifisch waren und dass NK- und LAK-Zellen einen untergeordneten Anteil der in vitro gemessenen Aktivität repräsentieren.
3. Durch CT26-IL-2⁺-Zellen induzierte in-vivo-Immunantwort
Anschließend versuchten wir festzustellen, ob die durch CT26-IL-2⁺-Zellen hervorgerufene CTL-Antwort mit der in-vivo-Immunität korrelierte. Auch im Anschluss an die stärkste subkutane Injektion von bis zu 1 × 10⁶ CT26-IL-2⁺-Zellen, konnten bis zu 8 Wochen nach der Injektion keine Tumoren festgestellt werden. Im Gegensatz dazu waren in sämtlichen Tieren nach Ablauf von 2 Wochen nach Injektion der parentalen CT26-Zellen Tumoren vorhanden (Tabelle 1). Somit waren BALB/c-Mäuse befähigt, CT26-IL-2⁺-Zellen im Vergleich zu parentalen CT26-Zellen in einer 3- bis 4-fach höheren zahlenmäßigen Größenordnung abzustoßen. Um den Nachweis zu erbringen, dass die Abstoßung der CT26-IL-2⁺-Zellen auf die Aktivierung von CT26-spezifischen Effektorzellen durch lokal gebildetes IL-2 zurückzuführen ist, wurden CT26-Zellen mit den gesamten BPV-Vektorsequenzen unter Entfernung des IL-2-Inserts transfiziert. Diese Transfektanten (CT25-neo-IL-2^–), von denen bestätigt wurde, dass sie beim CTLL-Funktionstest IL-2 sezernierten, bildeten Tumoren in BALB/c-Mäuser in einer Geschwindigkeit, die von der Geschwindigkeit bei nicht-transfizierten CT26-Zellen nicht unterscheidbar war (Tabelle 1). Ferner stellten wir fest, dass eine Injektion von 1 × 10⁶ CT26-IL-2⁺-Zellen an der linken Flanke das Wachstum von 1 × 10⁵ CT26-Zellen an der gegenüberliegenden Flanke nicht hemmte. Somit bestand die Wirkung der IL-2-Bildung durch CT26-IL-2⁺-Zellen anfänglich offensichtlich in einer Stimulation einer lokalen und nicht einer systemischen Immunantwort.
Auf der Grundlage des Ergebnisses, dass eine Immunisierung mit CT26-IL-2⁺-Zellen nach 2 Wochen systemische CTLs (bei in vitro-Messung) induzierte, versuchten wir festzustellen, ob dieser Befund mit einer in-vivo-Antitumor-Antwort gegen die parentalen CT26-Zellen korrelierte. Tatsächlich ergab eine Injektion von CT26-IL-2⁺-Zellen einen vollständigen Schutz von Mäusen gegen eine Reizung mit 1 × 10⁵ CT26-Zellen nach 2 Wochen (2). Dieser Schutz war nicht langlebig, da ungefähr 50% der gereizten Mäuse 4 Wochen nach der Immunisierung Tumoren entwickelten (2). Der Schutz war insofern tumorspezifisch, als andere BALB/c-Tumoren (SS-5, RENCA) normal wuchsen, wenn sie 2 Wochen nach der CT26-IL-2⁺-Immunisierung injiziert wurden (Daten nicht aufgeführt).
4. CT26-IL-2⁺-Zellen umgehen die CD4⁺-T-Helferfunktion
Da ein Großteil der T-Zell-Helferfunktion von der CD4⁺8^–-Untergruppe von T-Lymphozyten und ein Großteil der MHC-beschränkten CTL-Funktion von der CD4^–8⁺-Untergruppe ausgeführt wird, untersuchten wir anschließend den Einfluss einer selektiven in-vivo-Verarmung dieser Untergruppen auf die Abstoßung der CT26-IL-2⁺-Zellen. 3 zeigt, dass an CD4⁺8^–-T-Zellen verarmte Mäuse vollkommen zur Abstoßung von CT26-IL-2⁺-Zellen befähigt waren. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass CT26-Zellen durch Transfektion mit einem fremden Gen, wie Influenza-Hämagglutinin (CT26-HA⁺; Fearon et al., 1988) immunogen gemacht werden konnten. Die Hypothese des „Versagens der Helferfunktion" legte es nahe, dass die durch CT26-HA⁺-Zellen verstärkte Immunantwort zumindest teilweise von CD4⁺-Helfer-T-Zellen vermittelt werden könnte, die auf auf MHC-Klasse II-beschränkte Epitope am exogen eingeführten Hämagglutinin-Gen-Produkt reagieren. Zur Stützung dieser Hypothese dient die Beobachtung, dass CT26-HA⁺-Zellen von CD4-verarmten Mäusen nicht abgestoßen werden konnten (3). Zusammengefasst stützen diese Ergebnisse das Konzept, dass eine CT26-IL-2⁺-Immunisierung in wirksamer Weise die T_H-Funktion bei der Erzeugung einer Antitumor-CTL-Antwort umgeht.
5. CD8⁺-Zellen sind in vivo für die Tumorabstoßung erforderlich
An CD4^–8⁺-Zellen verarmte Mäuse waren unfähig zur Abstoßung von CT26-IL-2⁺-Zellen, was zeigt, dass diese T-Zell-Untergruppe an der Antitumor-Antwort in vivo beteiligt ist (3). Es ist jedoch bemerkenswert, dass eine erhebliche Verzögerung in der Tumor-Wachstumskinetik in Bezug zur Kinetik des CT26-Wachstums bei normalen BALB/c-Mäusen vorlag. Diese partielle Antwort könnte zwar auf den Einfluss von restlichen CD4^– 8⁺-Zellen zurückzuführen sein, es wurden jedoch in Lymphknoten durch Durchflusszytometrie-Analyse weder zum Zeitpunkt der anfänglichen Tumorinjektion noch im Verlauf der in-vivo-Antikörper-Behandlung derartige Zellen nachgewiesen. Eine ähnliche Verzögerung des Tumorwachstums ergab sich bei Vorliegen einer Verarmung sowohl von CD4 als auch von CD8. Es ist daher wahrscheinlich, dass eine IL-2-reaktive CD4^–8^–-Effektorzell-Population zusätzlich an der in-vivo-Antitumor-Antwort beteiligt war. Drei IL-2-reaktive Kandidaten sind NK-Zellen, LAK-Zellen und T-Zellen, die den γ-δ-T-Zell-Rezeptor tragen (Übersichtsartikel bei Pardoll et al., 1987; Brenner et al., 1988; Raulet, 1989). Da der Großteil der Zellen in diesen Populationen die Eigenschaft von CD4^–8^–-aufweist, wären sie in CD8-verarmten Mäusen immer noch vorhanden. Weitere mögliche, an der Antitumor-Antwort beteiligte Effektorzellen, basierend auf einer histologischen Analyse von regressiven Tumoren, sind Makrophagen und Mastzellen (Daten nicht aufgeführt).
6. CTL-Bildung und durch IL-2-bildende Melanomzellen induzierte in-vivo-Immunität
Um festzustellen, ob die Induktion einer systemischen Immunität ein allgemeines Merkmal von Tumoren, die gentechnisch zur Sekretion von IL-2 manipuliert waren, darstellt, transfizierten wir einen zweiten, schwach immunogenen Tumor, das B16-Melanom, mit dem BCMG-IL-2-Vektor. Das B16-Melanom ist ein stark aggressiver Melanozytentumor von C57BL/6-Herkunft. Nach Transfektion wurden G418-resistente Klone ausgewählt (B16-IL-2⁺), die Mengen an bioaktivem IL-2 bildeten, die ebenso groß oder größer als bei CTLL-Zellen unter identischen Bedingungen waren. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Klons. Während eine geringe Anzahl an B16-Melanomzellen Tumoren in syngenen C57BL/6-Mäusen hervorriefen, wurden B16-IL-2⁺-Zellen vollständig abgestoßen. Wie beim CT26-Tumor wurde eine höhere CTL-Aktivität gegen den parentalen B16-Tumor bei Mäusen erzeugt, die eine Injektion von B16-IL-2⁺-Zellen erhalten hatten. C57BL/6-Mäuse mit einer Injektion von B16-IL-2⁺-Zellen entwickelten in vivo eine Schutzimmunität gegen eine Reizung durch B16-Zellen in dosisabhängiger Weise. Der Schutz war nicht ebenso groß wie beim CT26-System, da ungefähr die Hälfte der mit 1 × 10⁶ B16-IL-2⁺-Zellen immunisierten Mäuse schließlich Tumoren bei Reizung mit 1 × 10⁵ parentalen B16-Zellen entwickelten (Tabelle 2).
Es ist bemerkenswert, dass die MHC-Klasse I-Expression an B16-Melanomzellen äußerst niedrig ist – etwa 5- bis 10-fach niedriger als bei CT26-Zellen (Daten nicht aufgeführt). Dies kann auf die offensichtlich geringere Schutzwirkung gegen eine Reizung mit parentalem Tumor im B16-System im Vergleich zum CT26-System zurückzuführen sein, obgleich die schnellere Wachstumsgeschwindigkeit von B16-Melanomzellen einen weiteren Beitragsfaktor darstellen kann.
Neben den hier aufgeführten Daten für den Kolontumor und das Melanom wurden kürzlich ähnliche Ergebnisse bei einem IL-2-transfizierten Mäuse-CBA-SP1-Sarkom und beim Ratten-Dunning-Prostata-Karzinom festgestellt (Daten nicht aufgeführt). Die Tatsache, dass ähnliche Effekte bei zwei Tumoren mit stark unterschiedlichen zellulären Ursprüngen auftraten, legte es nahe, dass die hier dargestellten Prinzipien auf eine Reihe von Krebsarten verallgemeinert werden können. Bei weiteren Untersuchungen wurde jedoch ein spontanes Mamma-Adenokarzinom aus CBA-Mäusen mit dem IL-2-Gen transfiziert und zur Immunisierung von CBA-Mäusen gegen das Wachstum des parentalen Tumors verwendet. Bei diesen Untersuchungen induzierte der IL-2⁺-Transfektant keine signifikante Immunität gegen den parentalen Tumor.
Wir stellten auch eine Anzahl von weiteren Transfektanten her, die HA exprimierten und/oder IL-2 oder IFN-γ sezernierten. Es wird angenommen, dass diese doppelt transfizierten Zellen den immunogenen Status des Tumors verbessern.
Beispiel II (Vergleichsbeispiel)
Bildung von Tumorzellen, die mit einem für γ-Interferon kodierenden exogenen Gen transfiziert sind, und Nachweis einer verstärkten nicht-spezifischen Tumorresistenz
Das folgende Beispiel beschreibt einen weiteren Aspekt der Erfindung, nämlich die Transfektion von Tumorzellen mit einem Gen, das für ein Cytokin kodiert, das zur nichtspezifischen Verstärkung der Tumorresistenz befähigt ist, vermutlich über einen Mechanismus, der von anderen Zellen als von T-Lymphozyten abhängt. Im folgenden Beispiel wurde die nicht-spezifische Verstärkung der Tumorresistenz erzeugt, indem man Mäusen eine Tumorzelle injizierte, die mit dem für γ-Interferon kodierenden Gen transfiziert war.
Genauer ausgedrückt, exprimierten SP-1-Mäuse-Ardenokarzinomzellen, die mit Mäuse-IFN-γ-Gen transfiziert waren, IFN-γ (SP1/IFN-γ), konnte nicht in syngenen Wirten wachsen und wuchsen in nackten Mäusen. Die Abstoßung von SP1/IFN-γ-Zellen stand in Zusammenhang mit der Menge an gebildetem IFN-γ und war offensichtlich vorwiegend durch nicht-spezifische zelluläre Mechanismen vermittelt, obgleich auch eine gewisse Rolle für T-Zellen im afferenten Arm dieser Reaktion möglich ist. SP1-Zellen sind H2K^k-negativ, exprimieren aber Klasse I-Antigene, wenn sie IFN-γ bilden. Jedoch war die Klasse I-MHC-Expression (obgleich vermutlich erforderlich) als solche unzureichend, um ein Tumorwachstum zu verhindern, da eine Sekretion > 64 U/ml IFN-γ erforderlich war, um die tumorerzeugende Wirkung zu hemmen, während nur 8 U/ml IFN-γ Klasse I-Antigene induzieren konnten. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Mäuse-Kolonkarzinom CT-26, einem Tumor, der konstitutiv Klasse I-MHC-Antigene exprimiert, erhalten, was zusätzlich die Behauptung stützt, dass die Klasse I-MHC-Expression nicht wesentlich für die durch IFN-γ induzierte Abstoßungsreaktion ist. Das Versagen von SP1/IFN-γ-Zellen zum Schutz gegen eine Reizung durch parentale SP1-Zellen spricht dafür, dass andere Faktoren als die IFN-γ-Bildung oder die Klasse I-MHC-Expression erforderlich sind, um eine schützende Reaktion gegen schwach oder gar nicht immunogene Tumorzellen hervorzurufen.
A. Materialien und Methoden
1. Mäuse
Weibliche CBA- und BALC/c-Mäuse mit einem Alter von 6–8 Wochen wurden von der Frederick Animal Facility vom National Cancer Institute bezogen.
2. Tumoren
Der Ursprung des spontanen SP1-Mamma-Adenokarzinoms wurde früher beschrieben (Frost et al., 1987). SP1 wächst leicht in syngenen Mäusen nach subkutaner Inokulation und ist, wenn überhaupt, schwach immunogen und exprimiert wenig oder gar kein Klasse I-MHC-Antigen. Das CT-26-Kolon-Adenokarzinom wurde von M. Brattain (Brattain et al., 1980) bezogen. MDW1 ist eine immunogene Variante des MDAY-D2-Lymphoms (Kerbel, 1979).
3. Züchtungsbedingungen
Zellen wurden in GIBCO RPMI 1640-Medium gezüchtet, das mit 150 mg L-Glutamin, 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), 375 mg Natriumcarbonat und 10% fötalem Kälberserum (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) supplementiert war. Sämtliche Tumoren wurden periodisch auf die Anwesenheit von Mykoplasma unter Anwendung des Gen Probe RNA-Hybridisierungsverfahrens (Gen Probe, San Diego, CA) getestet. Es wurde nie eine Kontamination mit Mykoplasma beobachtet. Ferner wurden die Zellen auf Mäuse-Antikörperbildung getestet (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Es wurde festgestellt, dass sie frei von 13 pathogenen Mäuse-Viren waren.
4. Antiseren
Folgende monoklonale Antikörper wurden bei diesen Untersuchungen verwendet: Mäuse-anti-D^k/K^d (Klon 15-5-5S) wurde freundlicherweise von Dr. B. E. Elliott (Queen's University Kingston, Ontario, Kanada) zur Verfügung gestellt. Mäuse-anti-K^d (Klon 16-1-11N) wurde von Litton Company (Charles, SC) bezogen. Mäuse-anti-K^k/D^k Ab (Klon H 100-27/55), anti-I-A^k (Klon 14V18) und anti-D^k wurden von der Cedarline Company (Ontario, Kanada) bezogen. Mäuse-anti-I-A^d-Antiseren wurden von Becton Dickinson (San Jose, CA) bezogen.
5. In-vitro-IFN-γ-Behandlung
Rekombinantes Mäuse-IFN-γ wurde von Genentech, Inc. (San Francisco, CA) erhalten. 3 × 10⁵ Tumorzellen wurden in fünf 10 cm-Kunststoffschalen ausgestrichen und 4 Tage mit 1– 100 U/ml IFN-γ inkubiert. Am vierten Tag wurden die mit IFN-γ behandelten Zellen in Aliquotanteile aufgeteilt und weitere 3 Tage mit 1–100 U/ml IFN-γ behandelt. Anschließend wurden die Zellen auf die Expression von Klasse I- oder Klasse II-MHC-Antigenen analysiert.
6. Durchflusszytometrie
Eine quantitative Analyse der MHC-Expression an Zelloberflächen wurde unter Anwendung von FACS durchgeführt. Zellen wurden von Gewebekulturplatten unter Verwendung eines Gummiwischers abgeschabt und 30 Minuten bei 4°C mit Mäuse-anti-D^k, -D^d oder -IA^k oder -IA^d-Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit FITC-konjugierten Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörpern inkubiert, mit 1% Paraformaldehyd fixiert und innerhalb von 1 Woche durch Durchflusszytometrie geprüft.
7. Transfektion von Zellen mit DNA
DNA wurde in SP1- oder CT26-Zellen entweder als Kopräzipitat mit Calciumphosphat (Graham und van der Eb, 1973) oder unter Verwendung des Lipofectin-Reagens (Felgner et al., 1987) eingeführt. Die SP1-neo- und CT26/neo-Zelllinien wurden durch Transfektion mit einem Gemisch von 1 μg des Plasmidvektors pSV2neo mit 1 μg Mäuseleber-DNA erhalten. Die SP1-IFN-γ-Linien wurden durch Transfektion von SP1-Zellen mit 1 μg pSV2neo und 10 μg pGEM3-SVMu-IFN-γ erhalten. Beim letztgenannten Produkt handelt es sich um einen pGEM-Vektor mit einem Gehalt an SV40-Promotor und dem Mäuse-IFN-γ-Gen. Das Produkt wurde freundlicherweise von Dr. R. Suzuki aus dem Department of Immunology beim M. D. Anderson Cancer Center zur Verfügung gestellt. Nach Selektion in Geneticin wurden die Kolonien von den einzelnen Platten vereinigt und auf ihre IFN-γ-Bildung getestet.
8. Antiviraler Test auf Interferon-Aktivität
Das Verfahren von Mory et al. (Mory et al., 1981) wurde zum Test auf IFN-Aktivität herangezogen. Dieser Test beruht auf der Hemmung des Wachstums des vesikulären Stomatitis-Virus in Mäuse-LTK-Zellen. Kontrollvertiefungen wurden mit rekombinantem IFN-γ oder dem Medium allein behandelt. Die Überstände von experimentellen Zellkulturen wurden in Zweifach-Verdünnungen zugesetzt. Ihre Fähigkeit zur Hemmung des VSV-viralen Wachstums wurde durch Bestimmung der Anzahl an in den Vertiefungen enthaltenen lebensfähigen LTK-Zellen ermittelt.
9. Bestimmung der zellvermittelten Zytotoxizität
Die Zytotoxizität wurde unter Anwendung des früher beschriebenen ¹¹¹In-Freisetzungstests gemessen (Wiltrout et al., 1978).
10. Abtrennung von Milzzellen
An Nylonwolle haftende (NWA) und nicht-haftende (NWNA) Zellen wurden gemäß dem Verfahren von Julius et al. (1973) erhalten.
B. Ergebnisse
Vor den Transfektionsversuchen stellten wir fest, ob die SP1-Zellen in Reaktion auf IFN-γ MHC-Klasse I-Antigene exprimieren. Ferner stellten wir fest, ob die Zugabe von exogenem IFN-γ eine zytostatische Wirkung auf die SP1- oder CT26-Zelllinien hatte. 1 bis 1000 U IFN-γ wurden zu halbkonfluenten Kulturen von SP1- oder CT26-Zellen für 4 Tage gegeben. Die Klasse I-MHC-Expression wurde sodann gemessen. Ferner wurden die Lebensfähigkeit und Replikation der Zellen 5 Tage lang täglich gemessen und mit den nicht mit IFN-γ behandelten Zellen verglichen. SP1-Zellen wuchsen normal bei 100 U/ml IFN-γ, jedoch wurde das Wachstum der CT26-Zellen in 1000 U/ml IFN-γ um 17% gehemmt. Die Wachstumsgeschwindigkeiten von SP1-Zellen, die transfiziert waren und 256 U/ml IFN-γ sezernierten (6L), waren die gleichen wie bei den parentalen SP1-Zellen. In ähnlicher Weise zeigten 64 U/ml IFN-γ bildende CT26-Zellen die gleiche Wachstumsgeschwindigkeit wie die parentalen CT26-Zellen.
4 belegt die Expression von H2K^k in SP1-Zellen sowie von H2K^d in CT26-Zellen, bestimmt durch FACS unter Verwendung von spezifischen monoklonalen Mäuse-Antikörpern. Weniger als 6–7% SP1-Zellen exprimierten H2K^k, jedoch exprimierten alle IA^k (Daten nicht aufgeführt). Im Gegensatz dazu exprimierten CT26-Zellen beide Klasse I- und II-MHC-Antigene (die Daten für die Klasse II sind nicht aufgeführt). Nach Behandlung von SP1-Zellen mit exogenem IFN-γ verursachte die Expression von Klasse II-Antigenen keine Veränderung, jedoch war eine drastische Verschiebung der FACS-Kurve nach rechts leicht mit anti-K^k-Antikörpern nachweisbar. Die IFN-γ-Behandlung hatte keinen Einfluss auf die konstitutive exprimierten Klasse I- oder Klasse II-Antigene von CT26-Zellen.
Anschließend bestimmten wir die Dauer der Wirkung von exogenem IFN-γ auf die Klasse I-Expression durch SP1-Zellen. Diese Versuche dienten als Basis für die Anwendung der Transfektion mit dem IFN-γ-Gen als Mittel zur Bereitstellung einer verzögerten Bildung von IFN-γ und Expression von Klasse I-MHC-Antigenen. SP1-Zellen wurden mit 200 μ/ml IFN-γ drei Tage behandelt. Die Zellen wurden gewaschen und entweder auf die H2Kk-Expression getestet oder erneut gezüchtet. Dieser Vorgang wurde 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Entfernung von IFN-γ aus dem Medium wiederholt. 5 zeigt, dass die H2Kk-Expression innerhalb von 48 Stunden nach Entfernung von IFN-γ aus dem Medium auf die Basislinienwerte zurückkehrte. Die Annahme ist gerechtfertigt, dass eine ähnliche Verringerung der H2-Expression bei in-vivo-Injektion von IFN-γ-behandelten Zellen erfolgen würde.
1. Einfluss von IFN-γ-Transfektion auf Klasse I-MHC-Expression
Nach Transfektion wurden SP1- und CT26-Linien auf die Sekretion von IFN-γ getestet. Drei SP1-IFN-γ-Zellpopulationen (1C, 3C und 6L) wurden für die Untersuchung auf der Grundlage der Menge an sezerniertem IFN-γ ausgewählt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Für die CT26/IFN-γ-Zellen wurde in ähnlicher Weise die Bildung von IFN-γ gezeigt, jedoch in einem geringeren Ausmaß als bei den SP1/IFN-γ-Zellen (8 U/ml gegenüber 256 U/ml). Von Interesse ist der Nachweis, dass in sämtlichen drei SP1/IFN-γ-Zellen ein äquivalenter Anstieg der MHC-Klasse I-Expression erfolgte (6, die Ergebnisse für die CT26-Zellen sind nachstehend aufgeführt). Ferner exprimierten sämtliche drei Linien Klasse II-MHC-Antigene (IA^k) in einem Ausmaß, das mit dem von nicht-transfizierten parentalen Zellen vergleichbar war (Daten nicht aufgeführt). Mit dem neo^R-Gen allein transfizierte SP1-Zellen exprimierten keine Klasse I-MHC-Antigene.
2. Einfluss der IFN-γ-Gentransfektion auf das in-vivo-Tumorwachstum
SP1/IFN-γ wurde subkutan CBA-Mäusen injiziert. In Tabelle 3 sind die Daten von verschiedenen derartigen Versuchen zusammengestellt. Diese Zelllinien wurden ausgewählt, da sie alle ein signifikantes Ausmaß der H2K^k-Expression zeigten (6), verglichen mit fünf weiteren Populationen, die durch Screening ausgewählt wurden und bei denen keine H2K^k-Expression festgestellt wurde und somit angenommen wurde, dass sie kein IFN-γ bildeten. 1C und 3C wuchsen bei Reizdosen von 1 × 10⁵. Im Gegensatz dazu zeigten 6L-Zellen in 14 von 15 Tieren bei Injektion mit 1 × 10⁶ Zellen kein Wachstum. Die parentale SP1-Zelllinie wuchs bei subkutaner Injektion von nur 10³ Zellen. Die Immunogenität korrelierte mit dem Grad der IFN-γ-Bildung und nicht mit der H2K^k-Expression (Tabelle 3 und 6), da sämtliche drei Linien äquivalente Mengen an MHC-Antigen exprimierten, jedoch nur die 1C- und 3C-Zelllinien heftig wuchsen. 6L-Zellen wuchsen in nackten Mäusen. SP1-Zellen, die mit dem neo^R-Gen allein transfiziert waren, wuchsen in identischer Weise wie nicht-transfizierte SP1-Zellen (Kerbel et al., 1987).
3. Nicht-spezifische zytotoxische Reaktion auf 6L
Tabelle 4 zeigt, dass lebensfähige 6L-Zellen eine zytotoxische Reaktion induzierten, die mit sich selbst und den parentalen SP1-Tumoren reaktiv war. Diese Reaktion wurde durch an Nylonwolle haftende (NWA) Milzzellen, aber nicht durch an Nylonwolle nicht-haftende (NWNA) Zellen vermittelt. Die Zytotoxizität der NWA-Milzzellen sowohl gegen SP1 als auch gegen 6L war immer größer als die Zytotoxizität, die durch die vollständige Milzzellpopulation hervorgerufen wurde. Ferner waren NWA-Zellen reaktiv (wenn auch in geringerem Ausmaß) gegen die nicht-verwandte MDW1-Tumorzelllinie. Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass ein nicht-spezifischer Mechanismus für die Abstoßung der 6L-Zellen verantwortlich war. Diese Ansicht wurde dadurch gestützt, dass es uns nicht gelang, die zytotoxische Milzreaktion nach Verarmung an immunen Milzzellen mit anti-CD4-, anti-CD8- und anti-CD3-Antikörpern plus Komplement zu verringern (Daten nicht aufgeführt).
Um ferner die nicht-spezifische Natur der Abstoßung von 6L-Zellen zu bestimmen, wurden 1 × 10⁶ 6L-Zellen mit 1 × 10⁵ SP1-Zellen vermischt und zusammen in die linke Flanke von CBA-Mäusen injiziert. Fünf von zehn Mäusen entwickelten nach 5 Wochen Tumoren. Syngene CBA-Mäuse, denen 1 × 10⁴ SP1-Zellen injiziert worden waren, entwickelten innerhalb von 2 Wochen Tumoren. Die fünf gewachsenen Tumoren wurden entfernt und in eine Gewebekultur gebracht, 2 Tage gezüchtet und sodann mit Geneticin behandelt. In sämtlichen Fällen wuchsen Zellkulturen nicht in Gegenwart von Geneticin, was darauf hinweist, dass es sich um parentale SP1-Zellen handelt, die gegenüber 500 μg/ml Geneticin empfindlich waren (6L-Zellen tragen das ursprünglicherweise bei der Kotransfektion mit dem IFN-γ-Gen verwendete neo^R). Die Tatsache, dass das Wachstum von 6L-Zellen im Gemisch mit SP1-Zellen in ausgeprägter Weise behindert war, spricht dafür, dass durch 6L-Zellen induzierte, nicht-spezifische Mechanismen teilweise für das Versagen von deren in-vivo-Wachstum verantwortlich waren.
Dieser Schluss wurde indirekt durch Versuche gestützt, bei denen eine Immunisierung von CBA-Mäusen mit 6L zum Schützen der Tiere gegen eine signifikante Reizung mit parentalen SP1-Zellen versagte (Tabelle 5). Fünfzig Prozent der immunisierten Tiere waren gegen eine Reizung mit 1 × 10⁴-Zellen bei Injektion in die gegenüberliegende Flanke geschützt. Jedoch induzierten nur 5 × 10⁴ SP1-Zellen Tumoren bei 100% der immunisierten Tiere. Ferner hatte bei den Tieren eine gleichzeitige Injektion von 6L in die linke Flanke und von SP1 in die rechte Flanke keinen Einfluss auf das Wachstum der Sp1-Zellen, obgleich 6L-Zellen nicht wachsen konnten.
4. Rolle der Klasse I-MHC-Antigenexpression
Es bleibt festzustellen, ob der Einfluss der IFN-γ-Bildung einwandfrei auf die Verstärkung der Klasse I-MHC-Expression zurückzuführen war, oder ob lokal gebildetes IFN-γ andere Einflüsse auf den Wirt hatte. 6L-Zellen wurden 6 nackten Mäusen injiziert und bildeten Tumoren. Zwei dieser Tumoren wurden entfernt (6L-A und 6L-B) und rekultiviert. Diese Zelllinien wurden sodann auf IFN-γ-Bildung und H2-Expression geprüft. 7 zeigt, dass 6L-A und 6L-B eine äquivalente Expression von H2K^k egaben, selbst wenn 6L-B 64 Mal mehr IFN-γ bildete. Die Reinjektion von 6L-A und 6L-B an Gruppen von 6 CBA-Mäusen zeigte, dass 6L-A-Zellen mit geringer IFN-γ-Bildung in sämtlichen Tieren trotz der Expression von H2K^k wuchsen. Im Gegensatz dazu konnten 6L-B-Zellen mit hoher IFN-γ-Bildung nicht wachsen.
5. Der CT26-Tumor
Wir bestimmten sodann den Einfluss der IFN-γ-Expression auf Mäuse-Tumorzellen, die konstitutiv Klasse I-MHC-Antigene exprimieren. CT26-Mäuse-Adenokarzinomzellen wurden mit pGEM-SVMu-IFN-γ-Plasmid transfiziert. Es wurde festgestellt, dass der ursprüngliche Pool von transfizierten Zellen 8 U/ml IFN-γ sezernierte. Tabelle 6 zeigt, dass bei Dosen von 1 × 10⁵ s. c. oder 5 × 10⁴ i. v. CT26/IFN-γ-Zellen schließlich wuchsen, jedoch erheblich langsamer als die parentalen CT26-Zellen.
Das Versagen von CT26/IFN-γ-Zellen zum in-vivo-Wachstum stand in direktem Zusammenhang mit ihrer IFN-γ-Bildung und konnte nicht durch irgendeinen direkten zytopathischen Einfluss von IFN-γ erklärt werden, da 8 U/ml IFN-γ keine Wirkung auf das in vitro-Wachstum von CT26 hatte. Zusätzlich zum verringerten in-vivo-Wachstum induzierte CT26/IFN-γ eine zytotoxische Reaktion, die in Milzen von immunisierten Mäusen nachweisbar war (Daten nicht aufgeführt). Von parentalen CT26-Zellen wurde nie gezeigt, dass sie irgendeine nachweisbare zytotoxische Reaktion hervorrufen.
Beispiel III
Bildung von immunopotenzierenden Tumorzellen, die mit einem exogenen Gen, das für ein ausgewähltes immunopotenzierendes Polypeptid kodiert, und einem zweiten exogenen Gen, das für ein Polypeptid, das zur Entfernung der Wirtszelle bei spezifischer Induktion befähigt ist, kodiert, kotransfiziert sind
Das folgende Beispiel beschreibt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, nämlich die Bildung einer immunogenen Tumorzelle, die selektiv in Fällen, wenn dies wünschenswert ist, entfernt werden kann. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Zellen mit einem ausgewählten Gen, das für ein gewünschtes Polypeptid, z. B. das immunopotenzierende Polypeptid, und einem zweiten Gen, das für ein Polypeptid, das zur Entfernung (Abtötung) der Wirtszelle befähigt ist, kodiert, transfiziert. Das zweite Gen, das hier als „Beseitigungsgen" oder „letales Gen" bezeichnet wird, steht vorzugsweise unter der Kontrolle eines spezifisch induzierbaren Promotors. Somit kann man dann, wenn die Beseitigung von einigen oder sämtlichen der transfizierten Zellen aus dem Wirt erwünscht ist (beispielsweise etwa 14 Tage nach der Verabreichung der transfizierten Tumorzellen) mit der Beseitigung beginnen, indem man direkt oder indirekt den induzierbaren Promotor unter Stimulation der Synthese des letalen Polypeptids aktiviert, beispielsweise durch Verabreichung des Induktors in einer zur Transkription des Polypeptids ausreichenden Menge an den Wirt. Spezielle Beispiele für Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung sind nachstehend aufgeführt.
A. Selektion und Transfektion von für immunopotenzierende Polypeptide kodierenden Genen
Die Auswahl des vorteilhaftesten, immunopotenzierenden Polypeptids zur Anwendung in einer gegebenen Situation hängt voraussichtlich von einer Anzahl von Parametern ab, wozu beispielsweise der Tumortyp, der Tumorort und der immunologische Status des Patienten gehören. Gene, die für derartige Polypeptide kodieren, sind entweder gegenwärtig erhältlich oder können unter Anwendung von in der Molekularbiologie derzeit verfügbaren Techniken erhalten werden, beispielsweise gemäß den Techniken von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989 (worauf hier durch Verweis Bezug genommen wird). Die Transfektion des Zielzelltyps kann im Allgemeinen im Wesentlichen gemäß der Vorgehensweise im vorstehenden Beispiel I durchgeführt werden. In den nachstehend näher erörterten Beispielen handelt es sich bei den für die Transfektion ausgewählten Genen um solche Gene, die für die immunopotenzierenden Polypeptide IL-2, Interferon-γ und Influenza-Hämagglutinin kodieren.
B. Auswahl und Transfektion mit einem spezifisch induzierbaren letalen Gensystem
1. Auswahl eines geeigneten Promotors
Obgleich die Verwendung einer Anzahl von Promotoren, z. B. Cytomegalovirus, SV40 oder Actin und dergl. erfindungsgemäß möglich ist, haben wir in einer bevorzugten Ausführungsform den durch Interferon induzierbaren 6–16-Promotor ausgewählt. Die Verwendung dieses Promotors hat eine Reihe von Vorteilen, da die IFN-Konzentrationen in normalem Blut sehr gering sind. Somit kann die Injektion von IFN dieses Gen in einer sehr spezifischen Art und Weise auslösen.
Das humane, IFN-regulierte Gen 6–16 wird eng durch IFN-α/β gesteuert. Die 0,9 Kb-cDNA von 6–16 kodiert für ein 13 Kilodalton-Protein, das eine Signalpeptidsequenz am aminoterminalen Ende enthält. Jedoch wurde weder die Funktion noch die subzelluläre Lokalisierung des Proteins (sezerniert oder membrangebunden) definiert (Kelly, 1986). Unbehandelte Zellen weisen keine nachweisbaren Konzentrationen an 6–16-mRNA in ihrem Zytoplasma oder in ihren Kernen auf. Die 6–16-mRNA-Synthese kann bereits nach 5 Minuten im Anschluss an die Behandlung mit Interferon-α nachgewiesen werden. Dessen Synthese im Zellkern erreicht nach 3 Stunden ein Maximum und nimmt innerhalb von 8–12 Stunden auf Grundkonzentrationen ab (Friedman, 1984; Kelly, 1986). Jedoch wird die mRNA von 6–16 posttranskriptional reguliert, und ihre Anwesenheit im Zytoplasma lässt sich auch 12 Stunden nach Beendigung der Synthese im Kern noch nachweisen (Friedman, 1984). Die enge Regulierung des 6–16-Promotors hat sich als wertvolles Werkzeug zur Bildung von IFN-resistenten Mutanten durch Verknüpfung des 6–16-Promotors mit selektierbaren Marker-Genen, die auch eine Rückselektion im Fall einer auf niedrige Konzentration deregulierten Expression ermöglichen, erwiesen (Pellegrini, 1989).
Wir haben die Klonierung und Charakterisierung der Promotorregion von 6–16 (Porter, 1988) durchgeführt, sowie von dessen cis-wirkenden IFN-regulatorischen Sequenzen und trans-wirkenden Faktoren, mit denen sie in Wechselwirkung treten. Dabei führten wir folgende Maßnahmen durch: 5'-Deletionsanalyse, Transfektionsversuche, DNase-Abdrücke (foot prints), Gelverzögerung, in vitro-Transkription und Verknüpfung des Promotors an Reportergene (Dale, 1989, Porter, 1988), (Chernajovsky, 1989).
Der 6–16-Promotor enthält eine direkte Wiederholung (Repeat) von 40 Nukleotiden (von -168 bis -89), die die IFN-regulatorische Sequenz umfasst, die heterologen Promotoren IFN-Induzierbarkeit verleihen kann (Chernajovsky, 1989, Porter, 1988). Diese Region bindet ein (oder mehrere) Kernproteine) mit einem Molekulargewicht von 55 Kilodalton und kann in vitro einen DNA-Proteinkomplex bilden, der IFN-moduliert ist (Chernajovsky, 1990).
Ein weiteres cis-wirkendes Element, das sich bei -450 befindet, bindet konstitutiv an ein Kernprotein von 80 Kilodalton und bewirkt eine Herabregelung der Expression dieses Promotors in Verbindung mit der direkten Wiederholung. Aus sich selbst heraus scheint dieses Element keine transkriptionale Funktion ausüben zu können.
Ferner weist der Promotor 6–16 eine CCAAT-Box im nicht-kodierenden Strang des Promotors und eine TATA-Box auf (Porter, 1988, Chernajovsky, 1989, Chernajovsky, 1990).
2. Selektion von letalen Genen
Zu letalen Genen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören Gene, die für eine Vielzahl von Proteinen kodieren, die den intrazellulären Stoffwechsel hemmen oder zum Stillstand bringen, und insbesondere solche Gene, die zu einer Hemmung von zellulären Schlüsselfunktionen, wie DNA-Synthese, Transkription und Translation, führen, oder solche, die andere notwendige zelluläre Funktionen paralysieren. Beispiele für letale Gene, die sich erfindungsgemäß als wertvoll erweisen können, sind Gene, die für die Ricin-Betakette, für Pertussis-Toxin und dergl. kodieren. Wie nachstehend erörtert, richtet sich die Wahl eines speziellen letalen Gens häufig an den physiologischen Eigenschaften der Zelle aus, in die es einzuführen ist.
Für einige rasch wachsende Tumoren oder Zellen, würde ein Mittel, das spezifisch die DNA-Synthese hemmt, von Vorteil sein. Jedoch kann sich bei anderen Tumoren, z. B. festen Tumoren, die langsam wachsen und sich nicht sehr aktiv vermehren, ein derartiger DNA-Syntheseinhibitor als weniger wertvoll erweisen. In einigen Fällen könnte ein Mittel, das spezifisch eine andere Stoffwechselfunktion der Zelle blockieren kann, z. B. die Proteintranslation, sich als geeigneter erweisen. Beispiele für letale Gensysteme, die zur Adressierung an die einzelnen Zelltypen konstruiert sind, werden nachstehend erörtert.
Ein bevorzugtes Gen für die DNA-Synthesehemmung kodiert für das Enzym Thymidinkinase aus Herpes simplex-Virus. Dieses Enzym ist zur aktiven Phosphorylierung des Thymidin-Analogen Gancyclovir (GANC) (1-(-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-ethyluracyl) fähig, das nach Umwandlung in 5'-Triphosphat durch zelluläre Kinasen die DNA-Polymerase hemmt (Mansour, 1988, Mansuri, 1987). Die Basis für den diskriminierenden Effekt von GANC auf HSV-tk exprimierende Zellen und das zelluläre tk-Enzym liegt in der Tatsache, dass die Substratanforderungen des HSV-tk-Proteins weniger streng als die der zellulären tk sind. Somit sind Zellen, die HSV-tk exprimieren, gegenüber den toxischen Wirkungen von GANC empfindlich, während normale Zellen verschont bleiben.
Ein für die Hemmung der Proteinsynthese bevorzugtes Gen ist das Gen, das für die α-Kette von Diphtherie-Toxin (DT-A) kodiert. DT-A bewirkt eine ADP-Ribosylierung des Erweiterungsfaktors 2 und erzeugt dadurch eine Hemmung der Proteinsynthese und den Zelltod. Dieses Gen wurde mit Erfolg bei transgenen Mäusen zur spezifischen Beseitigung von pankreatischen azinösen Zellen bei Verknüpfung mit dem Verstärker-Promotor des Elastase I-Gens herangezogen (Palmiter, 1987).
3. Konstruktion von selektiv induzierbaren, letalen Genkonstrukten
Die folgenden fiktiven Beispiele beschreiben die Konstruktion von genetischen Konstrukten, die sich erfindungsgemäß zur Transfektion von ausgewählten Tumorzellen eignen.
4. Konstruktion eines Herpes simplex-Virus tk-Gens unter Steuerung durch den 6–16-Promotor
Ein BglII-PvuII (1775 bp)-Fragment aus dem Plasmid pAGO mit sämtlichen Kodierungs- und Polyadenylierungssignalen des tk-Gens (mit 57 Nukleotiden der 5'-untranslatierten Region) wird aus dem XhoI-HpaII (2,3 Kb)-Fragment des 6–16-Promotors, das die gesamte Promotorregion bis zum Nukleotid -4 umspannt, geklont. Die Klonierung wird in 3 Stufen durchgeführt. Zunächst wird das BglII- bis PvuII-Fragment des HSV-tk in die BamHI-SmaI-Stelle von pUC18 subkloniert, um ein Plasmid mit der Bezeichnung TK.pr- zu bilden.
Eine diagnostische Restriktion mit SmaI und EcoRI sollte zwei Fragmente, eines von 360 kb und ein weiteres von 4 kb, ergeben.
Anschließend wird das Fragment XhoI, dem die Polylinker-Stellen HindIII bis SalI von pUC18 vorausgehen) bis HpaII des 6–16-Promotors in die AccI bis HindIII-Stellen von pUC18 subkloniert, um das Plasmid 6–16-XhoI-HpaII zu bilden. Schließlich wird der Promotor 6–16 auf der Frontseite des tk-Gens durch Isolierung des HindIII-XbaI (2,3 kb)-Fragments aus dem Plasmid 6–16.XhoI-HpaII in die XbaI-HindIII-Stelle von TK.pr^– geklont, wodurch man das Plasmid 6–16-TK erhält, das das tk-Gen unter der Kontrolle des 6–16-Promotors enthält.
a. Konstruktion eines Diphtherie-Toxin α-Gens unter Steuerung durch den 6–16-Promotor
Ein ähnlicher Weg wie beim Klonieren von 6–16-.TK wird zur Bildung eines DT-A-Gens unter Steuerung durch den 6–16-Promotor angewandt. Zunächst wird das 795 bp-BglII-Fragment (flankiert von EcoRI- und HindIII-Stellen) aus dem Plasmid pDT-A (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. I. Maxwell, University of Colorado) subkloniert. pDT-A enthält die vollständige Kodierungssequenz des Diphtherie α-Toxin-Gens. Da es sich beim Toxin-Polypeptid um ein Polyprotein mit sowohl der α-Kette (24 Kilodalton) als auch der β-Kette (38 Kilodalton) handelt (Maxwell, 1987, Leong, 1983), wird die DNA folgendermaßen modifiziert, um nur die α-Kette zu exprimieren.
Das Initiator-Methionin-Codon wird von GTG zu ATG substituiert und die ersten beiden Aminosäuren werden zu Asp-Pro verändert. Ferner enthält das DNA-Fragment am Carboxyende ein synthetisches Ser-Leu-Stoppcodon vom kleinen SV40-t-Antigen mit einem Spleißsignal, jedoch ohne das Polyadenylierungssignal (Maxwell, 1986, Palmiter, 1987).
Um das DT-A-Insert zu klonieren, wird das DT-A mit HindIII verdaut und sodann mit einem 940 bp-HindIII-EcoRI-SV40-Fragment mit einem Gehalt an den Polyadenylierungssequenzen des T-Antigens verknüpft, wobei der Rest des Inserts mit EcoRI wieder geschnitten wird. Infolgedessen enthält das Insert an den Enden EcoRI-Stellen, und das DT-A-Fragment weist ein Polyadenylierungssignal auf dessen 3'-Seite auf. Dieses EcoRI-1,7 kb-Fragment wird in die EcoRI-Stelle des 6–16-Promotorplasmids geklont.
Die Orientierung des Inserts wird durch Restriktion mit BglII bestimmt. Es gibt drei BglII-Stellen, eine bei -603 im 6–16-Promotor und zwei an jedem Ende des DT-A-795 bp-Fragments. Wenn sich das Insert in der richtigen Orientierung befindet, sollte die BglII-Verdauung das 600-Fragment des 6–16-Promotors bis zum BglII des DT-A-Inserts, das 795 bp-DT-A-Insert und den Rest des Plasmids freisetzen. Bei entgegengesetzter Orientierung wird es sich bei den Fragmenten um 795 bp (DT-A-Fragment) und 1,5 kp (enthaltend das 940 bp-SV40-3' und Polyadenylierungssequenzen + das 603 bp des 6–16-Promotors) und den Rest des Plasmids handeln.
Einführung der ausgewählten Gene in die Zielzelle
Die ausgewählten immunopotenzierenden und letalen Gene können in die Zelle durch beliebige, dem Fachmann geläufige Verfahren eingeführt werden. Jedoch werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform Zellen durch das Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren (Graham, 1973), durch Lipofektion oder Elektroporation transfiziert. Tumorzellen mit einem Gehalt an den ausgewählten transfizierten immunopotenzierenden Genen, z. B. HA oder Cytokinen, können sodann mit letalen Genen transfiziert werden, oder es werden umgekehrt Zellen zunächst mit dem letalen Genkonstrukt transfiziert. Vorzugsweise enthält das letale Genkonstrukt neben dem letalen Gen geeignete Marker- und Selektionsgene, die den Nachweis und die Selektion von Transfektanten ermöglichen. Darunter werden das Markerplasmid pHC110 (Hall, 1983), der das bakterielle β-Galactosidase-Gen enthält, und der selektierbare Marker pSV2hygro (Blochlinger, 1984) bevorzugt. Zellen werden mit diesen Markern in einem Molverhältnis von 15 : 15 : 1 transfiziert und in 400 μg/ml Hygromycin B selektiert. Ferner sind selektierte Klone gegen Gancyclovir oder IFN empfindlich und werden mit X-gal positiv gefärbt (Price, 1987, Thompson, 1989).
5. Vorklinische Untersuchungen
Da die molekularen Mechanismen der Toxizität von Diphtherie-Toxin und Gancyclovir unterschiedlich sind, kann eine Anzahl von unterschiedlichen Tests durchgeführt werden, um die Konzentrationen an Gancyclovir oder IFN festzustellen, die erforderlich sind, um in unterschiedlichen Zelltypen die zytotoxische Reaktion zu erzielen. Die nachstehend beschriebenen biologischen Tests stehen zur Durchführung an.
a. Bestimmung der Konzentration an Gancyclovir, die zum Abtöten von mit Wildtyp-tk-transfizierten Zellen erforderlich ist
Die Konzentration an Gancyclovir, von der bekannt ist, dass sie den Ausstrichwirkungsgrad von embryonalen Mäuse-Stammzellen, die eine Kopie des HSV-tk-Gens enthalten, beeinträchtigt (um mehr als 90%), liegt im Bereich von 10^–6 bis 5 × 10^–6 M. Die Konzentration an Gancyclovir, die erforderlich ist, um mehr als 90% der HSV-tk-transfizierten Tumorzellen abzutöten, wird durch Ausstrichwirkungsgrad-Tests und durch Tests des [³H]-Thymidin-Einbaus festgelegt. Der Ausstrichwirkungsgrad-Test wird durchgeführt, indem man 10⁴ Zellen auf 10 cm²-Platten mit zunehmenden Gancyclovir-Konzentrationen ausstreicht. Alle 3 Tage werden die Medien ausgetauscht, und frisches Gancyclovir wird zugesetzt. Nach 9 Tagen werden die Zellen mit Giemsa gefärbt. Die Anzahl der Kolonien pro Platte wird bestimmt. Der Test des [³H]-Thymidin-Einbaus wird auf ähnliche Weise wie der nachstehend beschriebene Test für biologische Flüssigkeiten durchgeführt, wobei aber die HSV-tk-Tumor-transfizierten Zellen verwendet werden.
b. Bestimmung der Konzentrationen an Gancyclovir und IFN, die zur Abtötung von mit dem 6–16-tk-Ablationsvektor transfizierten Zellen erforderlich sind
Die Einverleibung von GANC in DNA hängt vermutlich sowohl von der extrazellulären als auch von der intrazellulären Konzentration des HSV-tk-Enzyms ab. Zellen mit erhöhter Bildung von tk, die durch Zugabe von IFN induziert worden ist, können eine verstärkte Empfindlichkeit gegen GANC aufweisen. Dieser Synergismus wird unter Verwendung steigender Konzentrationen beider zytotoxischer Mittel unter Bedingungen untersucht, bei denen die Konzentration von einem der Bestandteile konstant bleibt. Eine erhöhte Toxizität wird sowohl durch [³H]-Thymidin-Einbau-Tests als auch durch Ausstrichwirkungsgrad-Tests bestimmt.
c. Bestimmung der Gancyclovir-Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten
Um rasch die Konzentration von Gancyclovir in biologischen Proben, wie Serum, bestimmen zu können, werden [³H]-Thymidin-Einbau-Tests mit LTK-Zellen, die mit dem HSV-tk-Gen transfiziert und in HAT-Medien selektiert worden sind, bereitgestellt. Der Test wird in Gegenwart von Aminopterin (1,8 ng/ml) und Hypoxanthin (1,36 ng/ml) durchgeführt, um die Synthese von dTMP aus dUMP durch Thymidinsynthetase zu vermeiden, jedoch die Synthese von AMP und GMP über den HGPRT-Purin-Ersatzweg zu ermöglichen. Unter diesen Bedingungen hängt der Einbau von [³H]-Thymidin hauptsächlich vom Ausmaß der Hemmung der DNA-Synthese durch Gancyclovir nach dessen Phosphorylierung und Verarbeitung zu einem Triphosphat-Derivat ab, das die DNA-Polymerase hemmt. Der Einbau von [³H]-Thymidin ist unabhängig von internen UMP/TMP-Pools. Die Tatsache, dass diese Zellen kein endogenes Säugetier-tk-Gen enthalten, ist von großem Vorteil, da die Zellen gegenüber Gancyclovir äußerst empfindlich sind.
Der Test auf DNA-Synthese wird folgendermaßen durchgeführt. Zellen werden in Mengen von 15–25 × 103 Zellen pro Vertiefung auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen überimpft. Die Zellen werden in Dreifachversuchen mit und ohne Gancyclovir in bekannten Konzentrationen in Gegenwart von Hypoxanthin und Aminopterin inkubiert. Nach 24–48 Stunden werden die Zellen 1 Stunde mit [3H]-Thymidin (915 mCi/ml; 25 Ci/mmol; 1 Ci + 37 GBq; Amersham) inkubiert. Sodann werden die Zellen 2 Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, 30 Minuten bei 4°C mit 5% Trichloressigsäure behandelt und 3 Mal mit 5% Trichloressigsäure gewaschen. Der Niederschlag wird in 0,1 ml 0,2 M NaOH 30 Minuten bei 37°C gelöst und mit 0,01 ml 2 M HCl neutralisiert. Die Radioaktivität wird in einem β-Szintillationszähler bestimmt. Die Konzentration an Gancyclovir in tierischen Flüssigkeiten konnte durch Zweifachverdünnungen der Proben und Vergleich des erzielten Hemmgrades mit der Hemmkurve des verwendeten Standards ermittelt werden.
d. Bestimmung der IFN-Konzentration, die zur Hemmung der Proteinsynthese und zur Abtötung der mit dem 6–16-DT-A-Plasmid transfizierten Zellen erforderlich ist
Um die IFN-Dosis und die Behandlungszeit zu ermitteln, die erforderlich sind, um eine Zytotoxizität von mehr als 90% zu erreichen, wird die Hemmung der Proteinsynthese in mit dem Plasmid 6–16-DT-A transfizierten Zellen unter Verwendung eines empfindlichen kolorimetrischen Tests gemessen.
Tumorzellen, die mit dem 6–16-DT-A-Plasmid pSV2neo (zur Selektion in G418) und mit pCH110, das das bakterielle β-Galactosidase-Enzym unter der Steuerung des frühen SV40-Promotors enthält, kotransfiziert sind, werden durch Züchtung in G418 selektiert. Resistente Zellklone werden isoliert und durch Southern Blotting getestet, um nachzuweisen, dass sämtliche Plasmide vorhanden sind. Bei den selektierten Zellklonen handelt es sich um solche, die durch IFN abgetötet werden und nachweisbare Spiegel an β-Galactosidase-Aktivität aufweisen.
Die Hemmung der Proteinsynthese aufgrund der Aktivierung des Diphtherie-Toxins bewirkt eine Abnahme des Anteils an β-Galactosidase, die in einem kolorimetrischen Test unter Verwendung des Substrats pNPG (p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid) nachgewiesen werden kann. Dieses Substrat von β-Galactosidase färbt sich bei Spaltung durch das Enzym gelb. Die Anreicherung des gelben Reaktionsprodukts lässt sich bei einer Wellenlänge von 220 nm in ELISA-Platten messen. Dieses enzymatische System ist auch in vivo geeignet. Die Anwesenheit von Zellen mit einem Gehalt an dem β-Galactosidase-Gen lässt sich in histologischen Proben unter Verwendung des Substrats X-gal sichtbar machen, das bei Spaltung in den Zellen ein blaues Präzipitat liefert. Daher ermöglicht dieser Test die Bestimmung der Anwesenheit von Tumorzellen mit einem Gehalt an letalen Genkonstrukten, wobei die Bestimmung in situ in tierischem Gewebe nach Behandlung mit IFN erfolgt.
6. In-vivo-Versuche
Die folgenden vorhergesagten Beispiele beschreiben die praktische Durchführung der Erfindung in einer Vielzahl von Mäuse-Tumormodellen.
CT26-Zellen mit oder ohne immunopotenzierende und/oder letale Gene werden syngenen BALB/c-Tieren injiziert. Auf ähnliche Weise werden SP1- und RENCA-Zellen (vgl. die nachstehende Beschreibung) ihren syngenen Wirten, nämlich CBA- bzw. BALB/c-Mäusen injiziert. Um das immunogene Potential der die letalen Gene exprimierenden Zellen zu bestimmen, werden 1 × 10³ bis 10⁷ Zellen in die rechte Flanke der Tiere injiziert, während die parentalen, nicht-transfizierten Zellen in die linke Flanke injiziert werden. Die Anzahl der zur Tötung von 50% der Tiere erforderlichen Tumorzellen wird gemäß dem Verfahren von Reed und Muench (Reed, 1938) gemäß früheren Angaben (Fearon, 1988) ermittelt.
7. Modelle
a. H4A
Die H4A-Zelllinie wurde durch Transfektion vom SP1-Mamma-Ardenokarzinom mit dem Influenza-Virus-Hämagglutinin(HA)-Gen abgeleitet. HA exprimierende Zellen wurden 4 Mal unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) gemäß früheren Angaben (Fearon et al., 1989) selektiert. Es wurde die H4A-Zelllinie erhalten. H4A wächst nicht in syngenen Wirten bei einer Reizdosis von 1 × 10⁴, wächst aber bei subkutaner Injektion von 1 × 10⁵ H4A-Zellen. Trotz des Wachstums der Zellen bauen die Tiere eine zytotoxische T-Zellantwort auf, obgleich diese Antwort unzureichend ist oder zu spät erfolgt, um das Tumorwachstum auszugleichen.

CBA-Mäuse erhalten eine Injektion von H4A oder von H4A, das entweder mit HSV-tk oder DTA transfiziert ist. Wenn der gebildete Tumor unterschiedliche Größen erreicht (2–4 mm, 6–8 mm, 1 mm oder 2 mm), werden sämtliche Tiere auf folgende Weise behandelt, um die injizierten Zellen abzutöten.

Injizierte Tumorzelle	Behandlung
H4A	keine
H4A	GANC
H4A	IFN-α
H4A	GANC + IFN-α
H4A – HSV tk	keine
H4A – HSV tk	GANC
H4A – HSV tk	IFN-α
H4A – HSV tk	GANC + IFN-α
H4A – DTA	keine
H4A – DTA	GANC
H4A – DTA	IFN-α
H4A – DTA	GANC + IFN-α

Die anfänglichen Dosen von IFN-α (Hoffman-LaRoche, Nutley, N. J.) betragen 5 × 10⁴ Einheiten/Injektion bei 3-maliger wöchentlicher subkutaner Verabreichung über 2 aufeinander folgende Wochen hinweg. GANC (Syntex, Palo Alto, CA) wird zu Beginn subkutan in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag verabreicht.
Bei den Tieren, bei denen der primäre Tumor abgestoßen worden ist, werden sodann folgende Maßnahmen durchgeführt:
Bestimmung der zytotoxischen Milz-T-Zellantwort; und
Reizung mit 1 × 104, 1 × 105 oder 5 × 105 parentalen Zellen zur Ermittlung der Immunität gegen eine parentale Tumorreizung.
b. CT26/IFN-γ
Das CT26-Mäuse-Kolonkarzinom wird bei Transfektion mit IFN-γ und Expression von IFN-γ teilweise immunogen. Während eine 1 × 10⁵-Reizdosis von parentalen CT26-Zellen für normale Tiere innerhalb von 3 Wochen letal ist, überleben 60% der Tiere mit einer Injektion von CT26-IFN-γ-Zellen länger als 8 Wochen. Diese Zellen sind offensichtlich immunogen, wobei die Antwort, die sie hervorrufen, gelegentlich zur Verhinderung von Tumorwachstum unzureichend ist. Ferner wurden die mit lebensfähigem CT26/IFN-γ immunisierten Tiere nicht gegen einen parentalen CT26-Reiz geschützt. Ferner bewirkten bestrahlte CT26/IFN-γ-Zellen keinen Schutz gegen eine Reizung mit parentalen Zellen.
c. RENCA-Modell
RENCA ist ein renales Zellkarzinom von BALB/c-Mäusen. Die Injektion von 5 × 10⁴ RENCA-Zellen in die subrenale Kapsel von syngenen Mäusen führt innerhalb von 2 Wochen zur Entwicklung eines u-1 cm-Tumors. Wird die den Tumor aufweisende Niere chirurgisch entfernt, entwickeln die Tiere innerhalb von 2 Wochen ausgedehnte Lungenmetastasen.
C. Humanimmunotherapie
Aufgrund der erforderlichen Beschränkungen, die bei der Humantherapie gegeben sind, wurde die vorliegende Erfindung am Menschen noch nicht getestet. Es kommt jedoch in Betracht, dass die Erfindung beim Menschen mit ausgewählten Tumoren, wie Kolontumoren, Brusttumoren, Ovarialtumoren, Melanomen und Sarkomen, eingesetzt werden kann. Im Allgemeinen wird es bevorzugt, zur Behandlung Patienten heranzuziehen, bei denen ein diskreter primärer Tumor entfernt worden ist, bei dem ein hohes Rezidiv-Risiko besteht. In einer üblichen Situation werden Tumorzellen des Patienten isoliert und mit geeigneten immunopotenzierenden und letalen Genen transfiziert. Es ist selbstverständlich, dass dann, wenn es sich beim immunopotenzierenden Gen um ein Cytokin, wie Interleukin-2 handelt, ein für ein humanes Cytokin kodierendes Gen eingesetzt wird. Nach der Transfektion werden die Zellen ausgewählt, um Zelllinien zu erhalten, die in stabiler Weise mit den ausgewählten Genen transfiziert sind.
In einer idealen Situation wird bei dem Patienten zunächst eine von zahlreichen Behandlungsmöglichkeiten zur Verringerung der Tumorbelastung, wie eine chirurgische Resektion, Bestrahlung und dergl., durchgeführt, bevor die Verabreichung des Tumorzellen-Immunogens erfolgt. Sodann führt man die Immunisierung des Wirts für eine ausgewählte Zeitspanne, üblicherweise etwa 14 Tage, durch. Während dieser Zeitspanne können geeignete Tests durchgeführt werden, um den Immunstatus des Patienten in Bezug auf den speziellen, in Frage stehenden Tumor zu ermitteln. Es ist jedoch darauf zu achten, dass dann, wenn die Immunisierung von lokaler Natur ist, nicht in sämtlichen Fällen eine systemische Immunität beobachtet wird. Es kann somit erforderlich sein, für derartige Untersuchungen Lymphozyten von der Tumorstelle zu gewinnen. Auf jeden Fall wird nach einer bestimmten Zeitspanne, innerhalb derer der Wirt in wirksamer Weise gegen die Tumorzellen immunisiert worden ist, das letale Gen dazu veranlasst, die restlichen immunisierenden Tumorzellen zu beseitigen. Wenn als selektierbarer, induzierbarer Promotor der hier beschriebene 6–16-Promotor verwendet wird, wird dem Patienten α-Interferon in einer Dosis verabreicht, die eine Initiierung der Transkription des letalen Gens bewirkt, aber nicht so hoch ist, dass sie für den Patienten akut toxisch ist. Das α-Interferon kann auch lokal an der Stelle der Zufuhr des Impfstoffs verabreicht werden. Wird das Herpes simplex-Thymidin-Kinase-Gen verwendet, ist es erforderlich, Gancyclovir zu verabreichen. Wenn das Thymidin-Kinase-Gen vom 6–16-Promotor gesteuert wird, ist eine Verabreichung sowohl von Gancyclovir als auch von Interferon-α gerechtfertigt. Obgleich bestimmte Parameter für diese einzelnen Verabreichungen und dergl. noch nicht ermittelt worden sind, sollten sie vom Fachmann unter Berücksichtigung der hier gemachten Ausführungen leicht zu ermitteln sein.
Die vorstehende Beschreibung der Erfindung ist auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen unter Berücksichtigung der Anforderungen von patentrechtlichen Bestimmungen abgestellt und dient lediglich Erläuterungszwecken.
Beispielsweise können zahlreiche Verfahren zur Einführung von exogenen Genen in die Tumorzielzellen eingesetzt werden. Ferner können verschiedene ausgewählte Gene erfindungsgemäß transfiziert werden. Beispielsweise können bestimmte Aspekte der Erfindung, wie die Bereitstellung eines selektiv induzierbaren letalen Gens, nicht auf die Anwendung in der Immunotherapie beschränkt sein, sondern sie können in breitem Umfang auf beliebige Situationen anwendbar sein, bei denen es wünschenswert ist, in spezifischer Weise in vivo eine gentechnisch manipulierte Zelle zu beseitigen. Ferner können die erfindungsgemäßen transfizierten Tumorzelllinien zur ex vivo-Immunisierung herangezogen werden, wie bei der Aktivierung von LAK-Zellen zur Verabreichung an einen Patienten durch Infusion gemäß dem im US-Patent 4 690 915 (Rosenberg) beschriebenen Verfahren oder bei der in vitro-Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten oder zur Förderung des Wachstums von Cytokin-abhängigen Zelllinien, wie von IL-2 abhängigen Zelllinien. Die Fähigkeit zur Reinigung von in vitro-Kulturen der transfizierten Tumorzellen durch einfaches Induzieren einer Transkription und Translation des letalen Gens bietet einen zusätzlichen Vorteil. Somit ist es offensichtlich, dass die Erfindung einer beliebigen Anzahl an geeigneten Modifikationen, die innerhalb des Stands der Technik liegen, unterzogen werden kann.
Literatur
Die folgenden Literaturstellen können dazu dienen, das Verständnis und die praktische Ausführung bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung zu erleichtern. Mit der Aufnahme einer Literaturstelle in diese Liste wird nicht automatisch eingeräumt, dass diese Literaturstelle für die vorliegende Erfindung zum Stand der Technik gehört.

Battacharya et al., J Immunol 127: 2488–2495.
Blochlinger and Diggelman, Mol Cell Biol 4: 2929–2931 (1984).
Boon, Immunology Today 6: 307–311 (1985).
Brattain et al., Cancer Res 40: 2142–2146 (1980).
Brenner et al., Adv Immunol 43: 133–192 (1988).
Cantor and Boyse, J Exp Med 141: 1390–1399 (1975).
Chernajovsky et al., Lymphokine Res 9: 199–212 (1990).
Chernajovsky, FEBS Lett 258(2): 323–30 (1989).
Colbere-Garapin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 3755–3759 (1979).
Dale et al., Proc Natl Acad Sci USA 86(4): 1203–7 (1989).
Dialynas et al., J Immunol 131: 2445–2452 (1983).
Fearon et al., Cancer Res 48: 2975–2980 (1988).
Felgner et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413 (1987).
Fidler, Cancer Res 35: 218–234 (1975).
Friedman et al., Cell 38: 745–75 (1984).
Frost and Chernajovsky, Transformation injury and the unicellular phenotype of malignant cells 9: 93–98 (1990).
Frost et al., Cancer Res 47: 2690 (1987).
Graham and van der Eb, Virology 52: 456–467 (1973).
Grimm et al., J Exp Med 155: 1823–1831 (1982).
Hall et al., J Molecular and Applied Genetics 2: 101–109 (1983).
Herberman, NK Cells and Other Natural Effector Cells, New York, Academic Press (1982).
Hewitt et al., Br J Cancer 33: 241–259 (1976).
Hui et al., Nature 311: 750–752 (1984).
Itaya et al., Cancer Immunol Immunother 28: 248–252 (1989).
Janis et al., Science 244: 713–715 (1989).
Jenkins et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 5409–5413 (1987a).
Jenkins et al., Immunol Rev 95: 113–135 (1987b).
Julius et al., Eur J Immunol 3: 645 (1973).
Karasuyama and Melchers, Eur J Immunol 18: 97–104 (1988).
Karasuyama et al, J Exp Med 169: 13–25 (1989).
Keene and Forman, J Exp Med 155: 768–782 (1982).
Kelly et al., Embo J 5(7): 1601–6 (1986).
Kerbel, Amer J Path 97: 609 (1979).
Kerbel et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 1263 (1987).
Kiessling et al., Int J Cancer 15: 933–940 (1975).
Leong et al., Science 220: 515–517 (1983).
Lo et al., Cell 53: 159–168 (1988).
Lurquin et al., Cell 58: 293–303 (1989).
Mansour et al., Nature 336: 348–352 (1988).
Mansuri et al., J Med Chem 30: 867–871 (1987).
Markman et al., Nature 336: 476–479 (1988).
Maryanski et al., Nature 324: 578–579 (1986).
Maxwell et al., Mol Cell Biol 7: 1576–1579 (1987).
Maxwell et al., Cancer Res 46: 4660–4664 (1986).
Mitchell, Proceedings of the Second Conference on Immunity to Cancer, Williamsburg, VA, Nov. 9–11, 1987; 288: 323–336 (1989).
Möller, Immunol Rev 51 (1980).
Moore et al., Cell 54: 777–785 (1988).
Mory et al., Eur J Biochem 120: 197 (1981).
Mulligan and Berg, Science 209: 1422–1427 (1980).
Murphy and Haushesky, J Natl Cancer Inst 50: 1013–1025 (1973).
Ortaldo et al., J Exp Med 164: 1193–1205 (1986).
Ozato et al., J Immunol 125: 2473–2477 (1980).
Ozato et al., Transplantation 34: 113–120 (1982).
Palmiter et al., Cell 50: 435–443 (1987).
Pardoll et al., FASEB J 1: 103–109 (1987).
Pellegrini et al., Mol Cell Biol 9(11): 4605–12 (1989).
Phillips and Lanier, J Exp Med 164: 814–825 (1986).
Porter et al., Embo J 7(1): 85–92 (1988).
Price et al., Proc Nat Acad Sci USA 84: 156–160 (1987).
Raulet, Annu Rev Immunol 7: 175–208 (1989).
Reed and Muench, Am J Hyg 27: 493 (1938).
Sarmiento et al., J Immunol 125: 2665–2672 (1980).
Sella et al., Clin Exp Metastasis 7: 97–105 (1989).
Sitkovsky and Paul, Nature 322: 306 (1988).
Smith et al., J Bacteriol 141: 184–189 (1980).
Tanaka et al., Science 228: 26–30 (1984).
Tepper et al., Cell 57: 503–512 (1989).
Thompson et al., Cell 56: 917–930 (1989).
Townsend et al., Cell 44: 959–968 (1986).
Trenn et al., J Immunol 140: 1101–1106 (1988).
Van Pel and Boon, Proc Natl Acad Sci USA 79: 4718–4722 (1982).
von Boaehmer and Haas, J Exp Med 150: 1134–1142 (1979).
Wallich et al., Nature 315: 301–305 (1985).
Widmer et al., J Exp Med 166: 1447–1455 (1987).
Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 1373–1376 (1979).
Wiltrout et al., J Natl Cancer Instit 61: 183 (1978)
Zinkernagel et al., J Exp Med 147: 897–911 (1978).

Tabelle 1 Wachstum von CT256, CT26-IL-2⁺ und CT26-neo-IL-2^– in BALB/c-Mäusen
Tabelle 2 In-vivo-Wachstum, Schutzimmunität und von IL-2-transfizierten B16-Melanomzellen gebildete CTLs
Tabelle 3 Wachstum von IFN-γ-transfizierten SP1-Tumorzellen
Gruppen von CBA-Mäusen erhielten eine subkutane Injektion mit 10⁵, 5 × 10⁵ oder 10⁶ Zellen aus drei unterschiedlichen Transfektionsplatten (1C, 3C und 6L). Die Tiere wurden sodann 90 Tage lang im Hinblick auf das Tumorwachstum beobachtet.
Tabelle 4 Induktion von zytotoxischen T-Zellen durch IFN-γ-bildende SP1-Zellen
Gruppen von CBA-Mäusen erhielten eine subkutane Injektion von 5 × 10⁵ SP1- oder SP1/IFN-γ(6L)-Zellen. 2 Wochen später wurden die Tiere getötet. Ihre Milzzellen wurden mit bestrahlten SP1- oder 6L-Zellen inkubiert. 5 Tage später wurden die Lymphozyten geerntet und über eine Nylonwolle-Säule gegeben. Haftende und nicht-haftende Milzzellen wurden in den angegebenen Verhältnissen zu den aufgeführten ¹¹¹In-ox-markierten Zielen gegeben.

NWA: an Nylonwolle haftend
NWNA: an Nylonwolle nicht-haftend

Tabelle 5 Immunologischer Schutz durch IFN-γ-transfizierte SP1-Zellen gegen eine Reizung mit parentalen Zellen
CBA-Mäuse wurden mit 10⁶ 6L-Zellen am Tag 0 und erneut am Tag 14 immunisiert. Am Tag 19 wurden die immunisierten Tiere und die Kontrolltiere einer Reizung mit 10⁴ oder 10⁵ parentalen SP1-Zellen unterzogen. Die Tiere wurden sodann im Hinblick auf das Tumorwachstum beobachtet.
Tabelle 6 Wachstum von IFN-γ-bildenden CT26-Tumorzellen
Gruppen von BALB/c-Mäusen erhielten eine subkutane oder intravenöse Injektion von CT26 oder CT26γ- und wurden in Bezug auf Tumorwachstum und Überlebensrate beobachtet.

Claims

Zusammensetzung umfassend eine Tumorzelle, die genetisch verändert wurde indem man in die Zelle zumindest ein exogenes immunpotentiierendes Gen, und ein exogenes letales Gen einschließlich eines Promotors in operativer Verknüpfung, eingebracht hat, zur Verwendung in einem Verfahren zum Stimulieren einer systemischen Immunantwort gegen einen Tumor in einem Subjekt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Tumor ausgewählt ist aus Melanom, Adenokarzinom und Sarkom.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Tumor von einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, stammt.
Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das zumindest eine immunpotentiierende Gen für ein Zytokin ausgewählt aus Interleukin (IL), insbesondere IL-4; und Interferon, insbesondere γ-Interferon, kodiert; oder für ein fremdes Antigen ausgewählt aus einem viralen Protein, insbesondere dem Influenzahämaglutinin (HA); einem bakteriellen Zellantigen, insbesondere von Mycobacterium tuberculosis und ganz besonders dem 65 kD Antigen von M. tuberculosis, und einem allogenen Histokompatibilitätsantigen kodiert.
Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das exogene letale Gen das Gen für die A-Kette des Diphterietoxins ist.
Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, insbesondere der 6–16 Interferon Promotor.
Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das exogene immunpotentiierende Gen und/oder das exogene letale Gen in die Zelle durch Transfektion mit einem Vektor eingebracht wurde.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Transfektion der Zelle mit dem Vektor durch Kalziumphosphat-Kopräzipitation, Liposomen oder Elektroporation vermittelt ist.
Eine Tumorzelle, erhalten durch: a) Einbringen von zumindest einem exogenen immunpotentiierenden Gen, insbesondere wie in Anspruch 4 definiert, welches ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, in eine Tumorzelle; und b) Einbringen eines exogenen letalen Gens wie in einem der Ansprüche 1, 5 oder 6 definiert, in die Tumorzelle; um eine Tumorzelle herzustellen, die die exogenen Gene in der Zelle stabil beibehalten hat; zur Verwendung in einem Verfahren zur Gentherapie von Krebs eines Säugetiersubjektes.
Verfahren zur Herstellung einer Tumorzelle zur Gentherapie von Krebs umfassend: a) Einbringen von zumindest einem exogenen immunpotentiierenden Gen, insbesondere wie in Anspruch 4 definiert, welches ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, in eine Tumorzelle; und b) Einbringen eines exogenen letalen Gens wie in einem der Ansprüche 1, 5 oder 6 definiert, in die Tumorzelle; um eine Tumorzelle herzustellen, die die exogenen Gene in der Zelle stabil beibehalten hat.
Eine Tumorzelle von einem Wirbeltierorganismus umfassend zumindest ein exogenes immunpotentiierendes Gen, insbesondere das immunpotentiierende Gen wie in Anspruch 4 definiert, welches für ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, und ein exogenes letales Gen wie in einem der Ansprüche 1, 5 oder 6 definiert, welche die Gene stabil in der Zelle beibehalten hat.