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Hintergrund der Erfindung
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Zahlreiche
Versuche wurden unternommen, das Immunsystem eines Wirts als ein
Mittel zur Behandlung von Krebs zu verändern. Derartige Versuche umfassen:
aktive Immuntherapie unter Verwendung von Tumor oder Tumor-Antigen
enthaltenden Vaccinen oder immunaktiven Lymphokinen; adoptive Immuntherapie
unter Verwendung von peripherem Blut oder Tumor infiltrierenden
Lymphozyten eines Wirts, die in Kultur expandiert und reinjiziert
wurden; passive Immuntherapie durch Verabreichung von monoklonalen
Antikörpern;
und lokalisierte Immuntherapie unter Verwendung von intraläsionaler
Verabreichung von Mitteln, wie Bazillus Calmette-Guerin (BCG). Der
effektivste dieser Ansätze
war die lokalisierte Therapie mit BCG für Melanommetastasen auf der
Haut und superfizialem Blasenkrebs. Während der Wirkungsmechanismus
von BCG nicht vollständig
verstanden wird, zeigen Studien klar, dass eine erfolgreiche Immuntherapie
dieses Typs mit einer Rekrutierung von T-Zellen am Tumor verbunden
ist.
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Cytokine,
wie die Interleukine, sind wichtige Mediatoren in zellvermittelten
Immunantworten in einem Wirt. Die zellvermittelte Immunantwort ("lokale Immunantwort") wird durch vom
Thymus abgeleiteten Lymphozyten oder T-Zellen erzeugt. T-Zellen stellen
die Gegenwart von eindringenden Pathogenen durch ein Erkennungssystem
fest, das als der T-Zellen-Antigen-Rezeptor
bezeichnet wird. Bei Detektion eines Antigens dirigieren die T-Zellen
die Freisetzung multipler T-Zellen-Lymphokine, einschließlich der
Interleukin-2-Familie (IL-2).
IL-2 ist ein T-Zellen-Wachstumsfaktor, der die Produktion von viel mehr
T-Zellen unterstützt,
die für
das spezielle Antigen empfindlich sind. Diese Produktion bildet
einen Klon der T-Zellen. Die sensibilisierten T-Zellen hängen sich
an die Zellen, die das Antigen enthalten. T-Zellen führen eine
Vielzahl von regulatorischen und defensiven Funktionen aus und spielen
eine zentrale Rolle in immunologischen Antworten. Wenn diese stimuliert
werden, um eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen, reagieren
einige T-Zellen, indem sie als Killerzellen fungieren, die die wirtseigenen Zellen
töten,
wenn diese mit Virus infiziert wurden und wenn diese möglicherweise
cancerogen und daher fremd werden. Einige T-Zellen reagieren durch Stimulieren
von B-Zellen, während
andere T-Zellen reagieren, indem sie die Immunantworten unterdrücken.
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Beispiele
anderer Interleukine, die Mediatoren in zellvermittelten Immunantworten
sind, umfassen Interferon-γ (IFN-γ), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor
(GM-CSF), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und Interleukin-12 (IL-12).
IFN-γ aktiviert
Makrophagen und verstärkt die
Expression von immunreaktiven Antigenen auf Tumorzellen. GM-CSF
aktiviert Makrophagen und stimuliert Makrophagen- und dendritische
Zellen-Rekrutierung und -Differenzierung. IL-4 ist ein T-Zellen-abgeleitetes
Helfer-Lymphokin,
das bei der Regulation von Wachstum und Differentiation von B- und
T-Zellen teilnimmt. IL-5 ist ein T-Zellen-abgeleitetes Lymphokin,
das seine grundlegenden Effekte auf die Expansion von Eosinophilen
aufweist. Es gibt Belege, die nahe legen, dass Eosinophile, wenn
an einer Tumorstelle rekrutiert, direkte Antitumoreffekte aufweisen
können.
IL-12 ist ein heterodimeres Lymphokin, anfänglich gereinigt aus dem konditionierten Medium
einer lymphoblastoiden Human-B-Zelllinie. Mäuse-IL-12 wurde nun kloniert
und exprimiert. Von IL-12-Stimulation wurde gezeigt, dass es die
Antigen-Präsentation
und die cytolytische Aktivität
von natürlichen
Killerzellen verstärkt.
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Der
Wert von Cytokin-basierter Gentherapie wurde in vorklinischen Mäuse-Studien
vorgeschlagen. Inokulation von Mäusen
mit experimentellen Tumoren, transfektiert mit Genen für Tumornekrosefaktor
(Asher AL, et al., J. Immunol. 1991, 146: 3227), Interleukin-2 (Fearon
ER, et al., Cell 1990, 60: 397) und IL-4 (Golumbek PT, et al., Science
1991, 254: 713) resultierten im Wuchs und nachfolgender Abstoßung des
injizierten Tumors. In vielen Fällen
wurde von den Mäusen
gezeigt, dass sie eine systemische Antitumorantwort erzeugen. IL-4-transfektierte
Tumore gingen zurück
und führten
zur Regression von gemischten nicht-transinifizierten Tumoren in
Mäusen (Tepper
PI, et al., Cell 1989, 57: 503). Diese Immuntherapie war ebenfalls
in nu/nu-Mäusen
effektiv, die eine Nicht-T-Zellenkomponente zeigten, die zur lokalisierten
Therapie beitragen kann. Von IL-4-transfektierten RENCA-Zellen wurde gezeigt,
dass diese spezifische T-Zellenimmunität für den Tumor erzeugen und in
der Eliminierung von vorexistierendem nicht-lokalem Tumorwuchs resultieren
(Golumbek PT, et al., Science 1991, 254: 713).
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Gegenwärtige Ansätze für diese
Form von Therapie beziehen das Wachstum und die stabile Genmodifizierung
von Tumorzellen ein, um Cytokine zu erzeugen, deren Expansion in
vitro und die Reinjektion in den Wirt. Während dieser Typ von Therapie in
experimentellen Systemen durchführbar
sein kann, begrenzen das Fehlen der Möglichkeit, den Hauptteil der
Tumoren in vitro wachsen zu lassen, die Erfordernisse für genetische
in vitro-Modifikation
jedes Tumors eines Patienten, und die Reinjektion von lebenden Tumoren
in den Patienten, die klinische Anwendbarkeit dieses Ansatzes.
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Es
wurde nunmehr festgestellt, dass die Expression von immunaktiven
Cytokinen in Tumore in situ durch Verabreichung eines Vaccinia-Virus-Vektors
induziert werden kann. Diese Vaccinia-Virus-Vektoren können an
Tiere, die unter Krebs leiden, als eine Behandlung verabreicht werden.
Die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls zur
Verbesserung der Immunität
gegenüber Parasiten
und anderen eindringenden Pathogenen verwendbar, die allein keine
wirksame Immunantwort des Wirts hervorrufen.
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Die
EP 0 206 920 offenbart ein
Virus, das Interferon-γ exprimiert.
Die WO 92/05262 liefert eine Zubereitung von Tumorzelllinien, enthaltend
ein exogenes Gen, das ein Polypeptid, beispielsweise Interleukin-2,
kodiert, das die Immunantwort für
den Tumor potenziert. Die
EP
0 268 501 offenbart die Verwendung eines Vaccinia-Virus,
das das Cytokin-Interleukin-2
exprimiert. Die
US 5 017 487 offenbart Vaccinia-DNA-transkriptional
regulatorische Sequenzen und rekombinante Vektoren, die zur Insertion
von Fremdgenen in Pockenvirus, z.B. Interleukin-2, verwendbar sind.
Miner JN, et al., Trends Biotechnol. 1990 (8), 1: 20, konzentriert
sich auf virale Expressionsvektoren, insbesondere das Vaccinia-Virus-Expressionssystem,
zum Exprimieren einer Vielzahl von Proteinen. Die
EP 0 514 603 beschreibt die Verwendung
von Viren bei der Behandlung von Krebs. Qin H., et al., Proc. American
Assn Cancer Rsrch 1995, 36: 418, offenbart die Verwendung eines
Vaccinia-Virus für
eine Krebsgentherapie. Lee SS, et al., Proc. American Assn Cancer
Rsrch 1995, 36: 248, offenbart die Verwendung eines rekombinanten
Vaccinia-Virus, enthaltend das Mäuse-GM-CSF-Gen für Cytokin-Gentransfer
in Tumoren. Peplinski GR, et al., Surgical Forum 1995, 46: 515,
offenbart die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, enthaltend das
GM-CSF-Gen in einer
Krebsgentherapie. Coupar BEH, et al., Eur. J. Immunol. 1986, 16:
1479, offenbart rekombinante Vaccinia-Viren, worin Expression von
HA-Genen durch Vaccinia-Viruspromotoren reguliert
wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung
von Tumoren bereitgestellt, umfassend einen rekombinanten Vaccinia-Virus-Vektor, verteilt
in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel
hierfür,
wobei der Vektor ein Gen zur Expression von Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem
Faktor aufweist.
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Bevorzugt
ist der Vektor direkt in den Tumor injizierbar.
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Herkömmlicherweise
wird die Tumormasse ausgewählt
aus Krebs, der als eine zugängliche
Masse wächst.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Tumor gebildet durch Blasenkrebs, Kopfkrebs, Nackenkrebs,
Melanom oder Prostatakrebs.
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Kurze Beschreibung der
Figur
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1 ist
ein Säulendiagramm,
das systemische Immunität,
resultierend aus intravesikaler Instillation, des Vaccinia-Virus-Vektors
(VAC), zeigt. Mäuse
empfingen intravesikale Instillation von VAC bei 10, 100 und 1.000
Pocken-bildenden Einheiten (pfu) (pock forming units). Zwei Wochen
später
wurde die Mäusemilz
entfernt und auf ihre Fähigkeit
VAC-infizierte MB-49-Zellen
zu lysieren, getestet.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Es
wurde in einer Anzahl von Studien deutlich gezeigt, dass die Erzeugung
von effektiver T-Zellen-spezifischer Immunität in der Eliminierung von Tumoren
resultieren kann. In vitro transduziertes Cytokin und durch Tumore
exprimierte virale Gene resultierten in der Eliminierung von transfektierten
Tumoren und verstärkter
T-Zellen-vermittelter Immunität
zu nicht-transduzierten Tumoren. Von der Expression von immunakzessorischen
Molekülen,
wie B7.1 und B7.2, wurde ebenfalls gezeigt, dass diese die Antitumor-Immunität verstärkt. Jedoch
haben in vitro-Manipulationen von Tumoren, um ausgewählte Moleküle zu exprimieren,
ihre Grenzen, insbesondere unter klinischen Bedingungen. Die genetische
Modifikation von Tumoren für
zellulare Vaccine hängt von
der Fähigkeit
ab und ist darauf begrenzt, jeden Patiententumor in vitro zu reserzieren
und wachsen zu lassen und der Reinjektion von lebendem modifizierten
Tumor.
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Nunmehr
wurde ein Verfahren für
in vivo-Gen-Freisetzung eines Gens entwickelt, das ein immunaktives
Cytokin exprimiert, welches den Bedarf nach in vitro-Manipulationen
von Tumorzellen beseitigt und somit die klinische Anwendbarkeit
dieses therapeutischen Ansatzes verbessert. In der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Induzierung der Expression von
immunaktiven Cytokinen in Tumoren in situ bereitgestellt, das die
Erzeugung eines Vaccinia-Virus-Vektors umfasst, der in der Lage ist,
die Expression eines ausgewählten
Cytokins zu induzieren, und Injizieren des Vaccinia-Virus-Vektors in
einen Tumor, so dass Zellen des Tumors das ausgewählte Cytokin
erzeugen. Durch den Begriff "Induzieren" oder "induziert" ist gemeint, dass
das Niveau der Expression des Cytokins durch gut im Stand der Technik
bekannte Verfahren messbar ist, und dass das Niveau der Expression
des Cytokins in einer Immunantwort resultiert. Mit dem Begriff "immunaktives Cytokin" oder "ausgewähltes Cytokin" ist gemeint, dass
es sich auf irgendein Cytokin bezieht, das mit einer Immunantwort
in Zusammenhang steht, die zu einer Tumorzerstörung führt. Das Cytokin ist der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende
Faktor (GM-CSF). Der Vaccinia-Virus-Vektor kann weiterhin ein Gen
für ein
immunakzessorisches Molekül, wie
B7.1 oder B7.2, umfassen. Durch "immunakzessorisches
Molekül" ist ein Molekül gemeint,
das in Zusammenhang mit einem immunaktiven Cytokin den Tumor immunogener
machen kann. Anders als im in vitro-Verfahren des Gentransfers wurde
von einer Infektion und Transfektion unter Verwendung von rekombinanten
Vaccinia festgestellt, dass dieses ein einfaches, schnelles und
hochgradig effizientes Verfahren darstellt. Vaccinia-Rekombinante
können
effizient Antigene an den Klasse I-Präsentationspfad freisetzen und
wurden als brauchbare Vektoren für die
Expression von Schutz-Antigenen für die Vaccin-Freisetzung vorgeschla gen.
Moss B. und Flexner C., "Vaccinia
virus expression vector",
Ann. Rev. Immunol. 1987, 5: 305-324. Die potentielle Verwendbarkeit
von Vaccinia-Rekombinanten für
intravesikale Gentherapie, die auf die Verstärkung der Immunogenizität von Blasentumorzellen
abzielt, wurde von Lee SS, et al., Proc. Am. Assoc, Cancer, März 1993,
34: 337, vorgeschlagen. Es wurde nunmehr festgestellt, dass diese
viralen Vektoren in einem Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems
durch Induzieren der Expression von Cytokinen an einer Tumorstelle verwendet
werden können.
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Der
Vaccinia-Virus, ein doppelstrangiger DNA-Pockenvirus, wurde gut
charakterisiert, da dessen erfolgreiche Verwendung als lebendes
Vaccin Pocken verhindern kann. Als ein vielseitiger eukaryotischer
Expressionsvektor kann das Vaccinia-Virus genetisch so konstruiert
werden, dass er große
Fragmente von Fremd-DNA (bis zu 25 kd) enthält, die keine Wirkung auf die
virale Replikation haben. Die Immunisierung mit rekombinantem Vaccinia
kann Schutzantworten für
das (die) Fremd-Gen(e), das (die) exprimiert wird (werden), induzieren.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Vaccinia-Virus-Vektor (VAC),
der in der Lage ist, die Expression eines ausgewählten Gens zu induzieren, gemäß im Stand
der Technik wohlbekannten Verfahren erzeugt. Das Vaccinia-Virus
kann weiterhin Gene umfassen, die immunakzessorische Moleküle kodieren,
die in Verbindung mit dem immunaktiven Cytokin den Tumor immunogener
machen können.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird zunächst
ein interessierendes Fremd-Gen, bevorzugt ein Gen für das ausgewählte Cytokin,
GM-CSF, hinter einem Promotor, bevorzugt einem VAC-Promotor, in
einem Plasmid platziert, das in das VAC-Genom durch homologe Rekombination
insertiert werden kann. Andere Gene, die in den Vektor einbezogen
werden können,
umfassen Gene, die immunakzessorische Moleküle, wie B7.1 und B7.2, kodieren,
oder Gene, die die IL-10-Produktion inhibieren. Es wurde jüngst festgestellt,
dass sowohl Humanmelanome als auch Blasenkrebs das immunsuppressive
Cytokin IL-10 erzeugen. Somit nimmt man an, dass die Inhibierung
dieses Cytokins die Immunogenität
der Tumoren verstärkt.
Die Inhibierung der Expression des IL-10 wurde durch die Verwendung von
Antisense-Oligonucleotiden, die komplementär zur IL-10-DNA oder -mRNA
in anderen Zellen ist, gezeigt. Die Fähigkeit, ein Antisense-Oligonucleotid, das
komplementär
zur IL-10-DNA oder -mRNA ist, zu exprimieren, kann in die Vaccinia-Virus-Vektoren
der vorliegenden Erfindung einbezogen werden, um die IL-10-Produktion
in Tumorzellen zu inhibieren, und hiermit die Immunogenität dieser
Tumore zu verstärken.
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Die
erfolgreiche Insertion des ausgewählten Gens in das Plasmid wird
durch Auswerten der hohen Transfektionsfähigkeit von bestimmten Zelllinien nach
Vaccinia-Infektion bestätigt.
Nachdem sie Wildtyp-Vaccinia für
30 Minuten bei einer Multiplizität
von 10:1 ausgesetzt wurden, werden Maus-L929-Zellen mit einer Plasmid-DNA-Lipofectin(Gibco/BRL, Bethesda,
MD)-Mischung transfektiert. Innerhalb Stunden der Transfektion können überschüssige Mengen
des Genprodukts beobachtet werden, mit einer Mehrzahl der Zellen,
die das Protein exprimieren. Die Erzeugung des gewünschten
Gens kann unter Verwendung von Standard-Immundetektionstechniken,
wie Immunausfällung
von metabolisch markierten Proteinen oder Western-Blot von Zellextrakten, bestimmt
werden. Weiterhin werden die Überstände aus
den infizierten/transfektierten Zellen auf mit verschiedenen Cytokinen
oder anderen Proteinen verbundene biologische Aktivität getestet.
Nach Bestätigung,
dass das interessierende Gen korrekt insertiert wurde, und ein biologisch
aktives Protein kodiert, wird das Plasmid in das VAC-Genom rekombiniert. Die
Plasmide werden derart erzeugt, dass das interessierende Gen zwischen
der stromabwärtigen
und stromaufwärtigen
Hälfte
des VAC-Thymidinkinase-Gens insertiert wird. Nach Infektion von
CV-1-Affennierenzellen mit nicht-rekombinantem Virus wird das Plasmid
unter Verwendung von Calcium-phosphat-Ausfällung freigesetzt.
In einem Anteil der Zellen rekombiniert das Plasmid in das Vaccinia-Genom und
spaltet das Thymidinkinase-Gen. Die resultierenden Rekombinanten
werden dann vom Wildtyp ausgewählt
durch Wachsenlassen in Thymidinkinase-negativen 143B-Human-Osteosarkomzellen
in Gegenwart von Bromodesoxyuridin. Es ist bevorzugt, dass der Wyeth-Stamm
von Vaccinia, erhältlich
vom Centers for Disease Control in Atlanta, GA (CDC) verwendet wird,
da dieser Stamm für
Pockenimpfungen in den Vereinigten Staaten verwendet wurde. Jedoch
können
ebenfalls abgeschwächte
Stämme
von Vaccinia verwendet werden, wenn die Immunogenisierung nach Abschwächung nicht
beträchtlich
gefährdet
wird.
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Die
Anfälligkeit
der Zellen gegenüber
dem Vaccinia-Virus wurde in in vitro-Versuchen in sowohl Mäuse- als
auch Humantumorzellen gezeigt. Beide Typen von Zellen wurden durch
Vaccinia-Rekombinante infiziert/transfektiert. Signifikante Infektion/Transfektion
von vorliegenden Tumoren in Mäusen
wurde ebenfalls nach intravesikaler Verabreichung beobachtet. Systemische
Immunität
von Vaccinia verhinderte nicht die Tumortransfektion durch intravesikal
instillierte Vaccinia-Rekombinanten.
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Die
Sicherheits- und Aufrecherhaltungsfunktion des viralen Gens gegenüber wiederholter
Verabreichung wurde ebenfalls beim Menschen gezeigt. Fünf Patienten
mit dermalen, subkutanen und/oder Lymphknoten-Metastasen von kutanösen Melanomen
wurden mit Vaccinia-Virus vom Wildtyp geimpft, und vier Tage später begannen
intratumorale Injektionen mit demselben Vaccin. Erhöhte Dosen
von bis zu 107 pfu wurden sicher wiederholt
mit nur lokalen und milden systemischen Reaktionen verabreicht. Vier
der Patienten entwickelten Anti-Vaccinia-Virus-Antikörpertiter ≥ 1/3200. Mit
ansteigenden Antikörpertitern
nahmen die lokalen und systemischen Reaktionen ab. Ein Patient mit
einer großen
exophytischen Läsion
unterlag einer dramatischen Tumorrepression mit multiplen Injektionen
von 107 pfu des Virus. Sequentielle Biopsien
dieser Läsion über eine 2-Monats-Zeitspanne
demonstrierte wiederholte Infektion über erfolgreiche Erzeugung
von viralem Gen-Protein (E3L) trotz antiviraler Antikörpertiter
so hoch wie 1/12.800. Dieses Zeitintervall ist geeignet, um eine
Erzeugung von Antitumorimmunität
zu ermöglichen.
Es wird angenommen, dass ein Vektor, umfassend ein Cytokin-Gen, ähnlich funktionieren würde und
einen immunadjuvanten Effekt vermittelt.
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Die
Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls
verwendet werden, um die Immunität
eines Wirts zu erhöhen.
In der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur Verstärkung der
Immunität
in einem Wirt bereitgestellt, die umfassen: Erzeugen eines Vaccinia-Vektors,
der in der Lage ist, die Expression eines ausgewählten Cytokins zu induzieren,
und Injizieren des Vaccinia-Vektors in einen Wirt, so dass Zellen
des Wirts das ausgewählte
Cytokin exprimieren. Unter "Wirt" wird verstanden,
dass dieser Säuger,
Fisch, Amphibien, Reptilien, Vögel,
Beuteltiere und am meisten bevorzugt Menschen umfasst. Dies ist
ebenfalls verwendbar, um die Immunantwort in einem Wirt gegenüber Parasiten
und anderen eindringenden Pathogenen, die allein keine Immunantwort
auslösen können, zu
verstärken.
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Zusätzlich können die
Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um
den Cytokin-Gen-Transfer in Tumoren mit resultierender Herstellung
löslicher
Produkte zu vermitteln. Beispielsweise wurde ein rekombinanter Vaccinia-Virus,
enthaltend das Mäuse-GM-CSF-Gen
unter der Kontrolle des frühen/späten (early/late)
P7.5-Vaccinia-Promotors
(VV-GM) aufgebaut. Von VV-GM-infizierten Mäusemelanomen (B16.F10) und
Blasen(MB49)-Tumoren wurde gezeigt, dass sie hohe Niveaus an biologisch
aktivem Cytokin erzeugen, wie durch die Ausbreitung von Knochenmarks-CFU-GM und
durch ELISA-Test festgestellt. Signifikante Niveaus von GM-CSF wurden
im Überstand
schon 6 Stunden nach der Infektion gefunden. Diese erhöhte Cytokin-Sekretion
der Tumorzellen kann zu tumor-spezifischer
Immunität
und therapeutischen Antitumor-Effekten führen.
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Demgemäß sind die
Vektoren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung
von Krebs verwendbar. Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs
werden bereitgestellt, die umfassen: Verabreichen an ein Tier, das
unter Krebs leidet, einer Menge eines Vaccinia-Virus-Vektors, der
in der Lage ist, eine Immunantwort gegenüber Krebs im Tier auszulösen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der verwendete Vaccinia-Virus-Vektor mindestens ein Gen
zur Expression des Cytokins GM-CSF. In dieser Behandlung wird der
Vaccinia-Virus-Vektor in Kontakt mit dem Tumor in situ entweder
durch intravesikale Verabreichung oder durch direkte Injektion in
den Tumor gebracht. Daher ist dieses Verfahren insbesondere zur
Behandlung von Krebs, wie Blasenkrebs, Kopfkrebs, Nackenkrebs, Melanom
und anderen Krebsarten, die als zugängliche Massen wachsen und
für diese
Verabreichungswege zugänglich
sind, verwendbar.
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Die
Anfälligkeit
von menschlichen prostatischen Karzinomzellen gegenüber Vaccinia
wurde ebenfalls unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der
das Influenza- Hemagglutinin-Human-Antigen
HA kodiert, untersucht. In vitro-Aussetzen der prostatischen Zelllinien
LNCAP und PC3 gegenüber
dem Virus nach immunhistochemischem Anfärben des kodierten HA-Proteins
zeigte eine hohe Effizienz in der Tumorinfektion/-transfektion.
Somit können
die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung ebenfalls
bei der lokalisierten Therapie von Prostatakrebs verwendet werden.
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Die
Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden in einer
Vaccin-Formulierung verabreicht,
umfassend eine effektive Konzentration des Vaccinia-Virus-Vektors und einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Durch "effektive
Konzentration" ist
eine Menge von Vaccinia-Virus gemeint, die, wenn einem Tumor verabreicht,
in einer messbaren Expression des ausgewählten Cytokins und einer verstärkten Immunantwort
resultiert. Derartige Mengen können
routinemäßig durch
einen Fachmann im Stand der Technik gemäß dieser Offenbarung bestimmt
werden. Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen Salzlösungen und
gepufferte Lösungen. Geeignete
pharmazeutisch akzeptable Träger
sind im Stand der Technik gut bekannt und werden beispielsweise
in Gennaro, Alfonso, Hg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe,
1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, einem Standard-Textbuch auf
diesem Gebiet, beschrieben. Pharmazeutische Träger können gemäß dem beabsichtigten Verabreichungsweg
und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt werden. Die Vaccin-Formulierung
kann weiterhin einen Hilfsstoff bzw. ein Adjuvans aufweisen. Hilfsstoffe
bzw. Adjuvans sind Substanzen, die therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln
zugegeben werden, z.B. Vaccinen oder Antigenen, die zur Immunisierung
verwendet werden, um die Immunantwort zu stimulieren. Die Verwendung von
Hilfsstoffen in Vaccinen, um die Immunantwort zu verstärken, ist
im Stand der Technik gut bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter
veranschaulicht.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Rekombinanter
Vaccinia-Virus
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Rekombinante
Vaccinia-Viren H1-VAC und NP-VAC, die die Hemagglutinin-(H1)- und
Nucleoprotein-(NP)-Gene exprimieren, abgeleitet vom Influenzavirus
A/PR8/34, wurden verwendet. Die Expression beider Influenza-Polypeptide
befindet sich unter der Kontrolle des frühen/späten 7.5 K-Promotors. Virale
Bestände,
quantifiziert in pfu, wurden bis zur Verwendung in BSS/BSA bei –70°C aufbewahrt.
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Beispiel 2: Zelllinien
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Die Übergangszellkarzinom(TCC,
transitional cell carcinoma)-Zelllinien MB-49 vom C57BI-Ursprung,
MBT-2 vom C3H-Ursprung und das Human-T24-Blasenkarzinom und das
H1-Human-Melanom wurden verwendet.
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Beispiel 3: Antikörper, Reagentien
und Färbung
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Die Überstände von
Hybridoma-Zelllinien, die für
die Influenza-A-Hemagglutinin(H28-E23)- und Nucleoprotein-Antigene (HB65)
spezifisch sind, wurden verwendet, um die Zellen und Gewebe anzufärben. Die
Virus-infizierten Blasentumorzellen und Blasen-Urotheliumsektionen wurden mit kaltem
Aceton fixiert und mit 0,1% fötalem
Kalbsserum blockiert. HA und NP wurden mit primärem Maus-Antikörper detektiert
und Biotin-markierte
Anti-Maus-IgG als dem zweiten Antikörper plus Avidin-Meerrettich-Peroxidase
(HRP) und 3,3-DAB-Substrat (Sigma, St. Louis, MO) oder Avidin-Biotin-Komplexverfahren
(ABC-AP) plus alkalische Phosphatase mit Fast-Red-Substrat (Vektor
Laboratories, Inc., Burlingame, CA) detektiert. Gewebeschnitte wurden
mit Hämatoxylin
gegengefärbt.
Zusätzlich
wurden Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbte Schnitte
präpariert.
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Beispiel 4: In vitro-Beurteilung
von viraler Infektion und Transfektion
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Zellen
(2 × 106) von jeder Zelllinie, die in Beispiel 2
beschrieben wurde, wurden in einer flachen Bodenplatte mit 24 Vertiefungen
(Fisher, Pittsburgh, PA) plattiert. Die Platten wurden über Nacht
inkubiert, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit
H1-VAC oder NP-VAC (10 pfu/Zelle) in BSS/BSA durch Inkubieren bei
37°C, 9%
CO2 für
1 Stunde infiziert, wobei alle 15 Minuten geschwenkt wurde. Das
Virus wurde aspiriert, Medium wurde zugegeben und die Platte wurde
für weitere
4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 1:1 Aceton:Methanol für 1 Minute
fixiert und mit PBS vor der immunhistochemischen Färbung gewaschen.
Nicht-inifizierte und rekombinante Virus-infizierte L929-Fibroblasten, die
dafür bekannt
sind, dass sie gegenüber
einer Vaccinia-Virusinfektion empfindlich sind, wurden jeweils als
negative bzw. positive Kontrolle verwendet.
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Die
Mäuse-MBT-2-
und MB-49-TCC-Zellen wurden in vitro mit H1-VAC infiziert. Wenn
mit nicht-infizierten Tumorzellen verglichen wurde, zeigte die immunhistochemische
Färbung
mit spezifischen Antikörpern
positive Expression der kodierten HA- oder NP-Antigene, was durch
cytoplasmische Färbung
von Virus-infizierten TCC-Zellen angegeben wurde. Zusätzlich wurde
die Human-Blasentumor-Zelllinie T24 und eine Human-Melanom-Linie
in ähnlicher
Weise in vitro infiziert.
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Beispiel 5: In vivo-Beurteilung
der Virusinfektion und Transfektion
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Weibliche
Mäuse,
4 bis 6 Wochen alt, wurden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME,
erworben. Die Mäuse
wurden intravesikal mit rekombinantem Vaccinia-Virus instilliert.
Die Mäuse
wurden anästhesiert, über die
Harnröhre
ein Katheter eingeführt
und dann über
einen Ätzdraht
(Birtcher Hyfricator, El Monte, CA) durch Einsetzen eines einzelnen 1-Sekunden-Pulses mit
1 Watt kauterisiert. Nach Entfernung des Ätzdrahts wurden die Blasen
mit 104 MB49-Zellen, um intravesikalen Wuchs
eines Tumors hervorzurufen oder entweder 10, 100 oder 1.000 pfu
Vaccinia-Virus-Rekombinanten in PBS instilliert. Bei 8 und 22 Stunden
nach der Instillation wurden die Mäuse getötet, und die Blasen wurden entfernt
und in OCT-Medium (Fisher) in flüssigem Stickstoff
gefroren. Die Blasenproben wurden bis zur Sektion bei –70°C gelagert.
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Mäusen, die
intraperitoneal mit WR-Vaccinia vom Wild-Typ (107 pfu)
vorimmunisiert waren, wurden intravesikal MB-49-Tumorzellen implantiert.
2 Wochen nach Tumorentwicklung wurde eine einzelne intravesikale
Instillation von NP-VAC (2 × 106 pfu, von der gezeigt wurde, dass sie keine
systemische Toxizität
in vorimmunen Mäusen
hat) vorgenommen. Bei 8 und 22 Stunden nach der Instillation wurden
die Blasen entfernt, eine Sektion durchgeführt und gefärbt. Die in vivo-Expression
von kodiertem NP wurde bei 22 Stunden nach der Instillation gezeigt. Ähnliche Ergebnisse
waren bei dem 8-Stunden-Zeitpunkt zu sehen.
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Beispiel 6: Cytotoxische
T-Lymphozyten-Analyse
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Cytotoxische
T-Lymphozyten(CTL)-Antworten auf intravesikale Infektion durch Vaccinia-Rekombinanten
wurden bei einem 4-Stunden-51Cr-Assay bestimmt.
Die Milz von Virus-infizierten
Mäusen
wurde nach 2 Wochen post-intravesikaler Instillation isoliert, in
vitro mit lebenden Virus-infizierten syngenischen Milz-Stimulatoren
(3:1) restimuliert und für
7 Tage bei 37°C,
5% CO2, kultiviert. Die Responderzellen
wurden auf Cytotoxizität
auf 51Cr-markierten
Vaccinia-Virus-infizierten MB49-Tumortargets auf die angegebenen
Effektor-Target-Verhältnisse
getestet. Prozentspezifische Lysis wurde wie folgt berechnet: (cpm-experimentelle Freisetzung – cpm-spontane Freisetzung)/(Gesamtfreisetzung – spontane
Freisetzung) × 100.
Die Milz von intravesikal infizierten C57BL/6-Mäusen wurde auf Antigen-spezifisches Töten von
Vaccinia-Virus-infizierten MB-49-Blasentumor-Targetzellen in 4 Stunden
Chrom-Freisetzungstests getestet. Keine Virus-induzierte Targetlysis
war im 4-Stunden-Test
zu sehen, und Virus-spezifische CTL lysierte die nicht-infizierten
Targets nicht. Wie in 1 gezeigt, waren Konzentrationen
so niedrig wie 10 pfu intravesikal ausreichend, um eine systemische
Anti-Vaccinia-CTL-Antwort zu induzieren. Wenn die Dosis an intravesikalem
Vaccinia titriert wurde, waren Konzentrationen so groß wie 105 pfu pro Maus für nicht-immunisierte Mäuse tödlich, die
innerhalb 5 bis 6 Tagen nach Instillation starben. Im Gegensatz hierzu
erschienen Mäuse,
die eine einzelne intravesikale Konzentration von weniger als 105 pfu erhielten, normal und überlebten
mehr als 2 Wochen nach der Instillation. Mäuse, die mit einer intraperitonealen
Injektion von WR-Vaccinia-Virus vom Wild-Typ (107 pfu)
vorimmunisiert waren, zeigten keine Morbidität bei intravesikalen Konzentrationen
so hoch wie 2 × 106 pfu von Vaccinia-Rekombinanten pro Maus.
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Weiblichen
C57BL/6-Mäusen
wurde eine einzelne intravesikale Instillation mit Vaccinia-rekombinantem
H1-VAC oder NP-VAC (104 pfu) verabreicht,
um die Infektion des Urothelium zu bestätigen. Die Mäuse wurden
getötet,
post-instilliert und ihre Blasen wurden für die Sektion und Färbung gewonnen.
Die Analyse der Blasenwand durch routinemäßige pathologische Prozeduren
unter Verwendung von H&E-gefärbten Trägern zeigten,
dass urotheliale Zelllinien des Blasenlumens Virus-infiziert waren,
wie durch charakteristische morphologische Änderungen, einschließlich Zellvergrößerung,
Kern- und cyctoplasmische Vakuolisierung genauso wie atypische Chromatinmuster
angezeigt wurde.
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Beispiel 7: Humanstudie
unter Verwendung von intratumoralen Vaccinia-Injektionen als einem Vektor für Gen-Transfer
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Patienten
in dieser Studie hatten jeweils ein histologisch dokumentiertes
chirurgisch unheilbares Melanom mit mindestens einer dermalen, subkutanen
oder Lymphknotenmetastase, die auf lokale Antwort bewertbar und
der Injektion zugänglich
war. Geeignete Patienten waren vollständig ambulant mit oder ohne
geringfügige
tumorbezogene Symptome, hatten eine Lebenserwartung von 6 oder mehr
Monaten und waren mindestens 4 Wochen seit dem chirurgischen Eingriff
(der eine allgemeine Anästhesie
erforderte) und 8 Wochen seit der Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie.
Sämtliche
Patienten waren immunkompetent, wie demonstriert durch ein oder mehrere
positive Hypersensitivitäts-Hautreaktionen vom
verzögerten
Typ, um mikrobielle Antigene zu erinnern oder auf Dinitrofluorbenzol
nach Sensibilisierung.
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Den
Patienten wurde Dryvax (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia,
PA), vertrieben vom Center for Disease Control (Atlanta, GA), in
lyophilisiertem Zustand verabreicht. Wenn entsprechend rekonstituiert,
enthält
das resultierende Produkt 25 Millionen pfu in einem Volumen von
0,25 ml.
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Jeder
Patient wurde unter Verwendung einer Standard-Multipunktionsmethode
mit einer gabelförmigen
Impfnadel auf der Haut des Deltamuskelbereichs geimpft, der in sämtlichen
Fällen
eine tumorfreie Extremität
mit intakten regionalen Lymphknoten war. Die Impfstelle wurde visuell
am Tag 4 beurteilt, um zu bestätigen,
dass eine lokale Hauptreaktion (erythematöse Knötchen mit Vesikulation und
Pustelbildung) fortschritt. Die Tumorbehandlung wurde am Tag 4 fortgesetzt.
Dermale, subkutane und/oder Lymphknotenmetastasen wurden mit Vaccinia-Virus vom
Wild-Typ durch intraläsionale
Injektion unter Verwendung einer 25-iger Nadel infiltriert (das
Volumen der Injektion reichte von 0,05 bis 0,1 ml). Die Behandlung
wurde etwa zweimal pro Woche wiederholt.
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Die
Regression von injizierten und nicht-injizierten Läsionen wurde
durch visuelle Inspektion und/oder Ultrasonographie beurteilt. Die
Ultrasonographie wurde unter Verwendung einer 10,0 MHz-Linearsonde
(Advanced Technology Laboratories, Inc., Bothel, WA) mit Direktkontakt-Scanning
der Oberfläche
der Masse genauso wie Scanning mit einem Abstandskissen (Parker
Laboratories, Inc., Orange, NJ) durchgeführt. Sämtliche Massen wurden in sagittalen und
axialen Ebenen abgebildet. Der Tumorort, die Tiefe der Penetration
und sonographische strukturelle Erscheinung wurden bestimmt. Die
Tumore wurden in Millimetern (mm) mit der sagittalen (S) und anteroposterioren
(AP) Dimensionen, entnommen vom sagittalem Bild mit der größten Dimension,
gemessen. Die Tumorbreite (B) wurde aus der quer verlaufenden Ebene
erhalten. Die läsionale
Antwort wurde als vollständig
(kein klinisch offensichtlicher Resttumor), partiell (≥ 50% Reduktion
im Tumorvolumen) oder nicht (alle anderen) kategorisiert.
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Ausstanz-Biopsien
wurden unter Verwendung herkömmlicher
steriler dermatologischer Techniken durchgeführt. Eine Hälfte des Materials wurde in
Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und Schnitte mit Hämatoxylin
und Eosin für
Routine-Histologie angefärbt.
Das verbliebene Gewebe wurde wieder für Transmissionselektronenmikroskopie
(EM) und immunhistochemische Analyse halbiert. Das Gewebe wurde
entweder in 2% Glutaraldehyd fixiert oder in OCT eingebettet (Fisher
Scientific, Pittsburgh, PA) und unter Verwendung von flüssigem Stickstoff
auf einen Schlag gefroren. Das gefrorene Gewebe wurde daraufhin
mit 5 μm-Dicke
mit einem Kryostat einer Sektion unterzogen, in kaltem Aceton fixiert,
mit PBS mit 5% fötalem
Kalbsserum (FKS) blockiert und mit dem Antikörper TW2.3, der für ein frühes Gen-Produkt
von Vaccinia-Virus-Replikation (E3L) spezifisch ist, gefärbt. Da
E3L ein nicht-strukturelles virales Protein ist, weist die positive
Antikörperfärbung auf
eine aktive Infektion hin.
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Um
Serumtiter für
Anti-Vaccinia-Virus-Antikörper
zu messen, wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit einem 10 μg/ml-Proteinextrakt,
erhalten aus Kulturen von Human-Melanom-Zelllinien,
infiziert für 6
Stunden mit einem Wyeth-Stamm von Vaccinia-Virus, beschichtet. Nach
Blockieren mit PBS plus FKS, wurden Verdünnungsreihen von Patientenseren
vor und nach Immunisierung zu den Vertiefungen zugegeben, für 2 Stunden
inkubiert und die Platten gewaschen. Serum-Anti-Vaccinia-Virus-Antikörper wurden unter
Verwendung eines Peroxidase-markierten Anti-Human-IgG-Zweitreagens
mit schwerer und leichter Kette und Orthophenyldiamin-Substrat sichtbar gemacht.
Titer wurden als die reziproke Serumverdünnung, die 50% maximale Absorption
im Test ergab, abgelesen.
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Beispiel 8: Intraläsionale
Infektion von Human-Melanom-Zellen durch Vaccinia-Virus
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Bei
einem Patienten, einer fünfundsechzig Jahre
alten weißen
Frau, wurde zuerst ein primäres Melanom
(1 mm, Level 4) in der rechten Wade mit Anhängsel-Läsionen im Jahre 1983 diagnostiziert. Die
primäre
Läsion
wurde herausgeschnitten und die dermalen Auswüchse erfolgreich mit intratumoralem BCG
behandelt. Die Patientin fühlte
sich bis 1992 wohl, als zwei dermale/sc-Läsionen an der Wade auftraten
und nicht mehr auf intratumorales BCG, systemisches R24 oder Chemotherapie
reagierten. Vaccinia-Behandlung wurde mit einer Standardimmunisierung
(250.000 pfu topisch, 15 Punktionen) begonnen. Am Tag 4 der Behandlung,
als festgestellt wurde, dass eine Aufnahme deutlich fortschreitet,
wurde intraläsionales
Vaccinia fortgesetzt. Eine einzelne metastatische Läsion wurde
19 Mal über
88 verstreichende Tage mit insgesamt 14 × 107 pfu
(Wyeth) injiziert. Mehrere Biopsien zeigten fortschreitend intensive
Infiltration des Tumors mit Lymphozyten und Tumorregression. EM
und immunhistologische Färbung für Vaccinia-Gen-Produkte
zeigten erfolgreiche virale Infektion von Tumorzellen in Gegenwart
von substantiellen Anti-Vaccinia-Antikörper-Titern.
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Beispiel 9: Klinische
Versuche
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Patienten
wurde PockenVaccin (Dryvax, Wyeth Laboratories) durch Skarifizierung
verabreicht. Die Immunität
gegenüber
dem Vaccin wurde durch eine Hauptreaktion, charakterisiert durch
Pustelbildung am Impfort und die Detektion von zirkulierendem Anti-Vaccinia-Antikörper, demonstriert.
Patienten, die beide Reaktionen zeigten, sind für eine lokalisierte Behandlung
mit dem Cytokin-erzeugenden Vaccinia-Vektor geeignet.
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Die
Patienten wurden mit erhöhten
Dosen von Vaccinia über
eine Zeitspanne von mehreren Wochen durch lokale (intratumorale
oder topisch, wie intravesikale) Verabreichung behandelt. Im Falle
von Melanom, Kopf- und Nacken- und anderen Tumoren, die als zugängliche
feste Massen an den primären und/oder
metastatischen Stellen wachsen, wurde das Vaccinia in den Tumor
unter Verwendung einer Spritze und einer Nadel injiziert. Im Falle
von Blasenkrebs wurde das Vaccinia unter Verwendung eines Katheters
in die Blase instilliert (intravesikal).
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Die
Patienten wurden in häufigen
Intervallen auf Zeichen von Toxizität untersucht, und Tumorreaktion
wurde durch Messen der injizierten und nicht-injizierten Tumormassen
auf Zeichen von Schrumpfen durch direkte Visualisierung oder radiologische
Verfahren (Ultraschall, Röntgenstrahlen,
MRI etc.) bestimmt.
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Ein
Beleg von systemischer Antitumor-Immunität wurde unter Verwendung von
in vitro-Techniken bestimmt, die die direkte Interaktion von Lymphozyten
und Tumorzellen misst. Die Messungen der Antitumor-Immunität können ohne
weiteres von Personen im Stand der Technik in diesem Bereich vervollständigt werden.