DE69535288T2

DE69535288T2 - Verfahren zur induzierung einer immunantwort mittels rekombinanten vaccinia-viren, die das gm-csf-gen exprimieren

Info

Publication number: DE69535288T2
Application number: DE69535288T
Authority: DE
Inventors: J. Michael Jenkintown MASTRANGELO; C. Edmund Princeton LATTIME; David Wyncote BERD; C. Laurence Merion EISENLOHR
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-11
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2015-05-12
Also published as: WO1995031105A1; DE69535288D1; EP0759695B1; CA2190290A1; CA2190290C; EP0759695A1; EP0759695A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Zahlreiche Versuche wurden unternommen, das Immunsystem eines Wirts als ein Mittel zur Behandlung von Krebs zu verändern. Derartige Versuche umfassen: aktive Immuntherapie unter Verwendung von Tumor oder Tumor-Antigen enthaltenden Vaccinen oder immunaktiven Lymphokinen; adoptive Immuntherapie unter Verwendung von peripherem Blut oder Tumor infiltrierenden Lymphozyten eines Wirts, die in Kultur expandiert und reinjiziert wurden; passive Immuntherapie durch Verabreichung von monoklonalen Antikörpern; und lokalisierte Immuntherapie unter Verwendung von intraläsionaler Verabreichung von Mitteln, wie Bazillus Calmette-Guerin (BCG). Der effektivste dieser Ansätze war die lokalisierte Therapie mit BCG für Melanommetastasen auf der Haut und superfizialem Blasenkrebs. Während der Wirkungsmechanismus von BCG nicht vollständig verstanden wird, zeigen Studien klar, dass eine erfolgreiche Immuntherapie dieses Typs mit einer Rekrutierung von T-Zellen am Tumor verbunden ist.
Cytokine, wie die Interleukine, sind wichtige Mediatoren in zellvermittelten Immunantworten in einem Wirt. Die zellvermittelte Immunantwort ("lokale Immunantwort") wird durch vom Thymus abgeleiteten Lymphozyten oder T-Zellen erzeugt. T-Zellen stellen die Gegenwart von eindringenden Pathogenen durch ein Erkennungssystem fest, das als der T-Zellen-Antigen-Rezeptor bezeichnet wird. Bei Detektion eines Antigens dirigieren die T-Zellen die Freisetzung multipler T-Zellen-Lymphokine, einschließlich der Interleukin-2-Familie (IL-2). IL-2 ist ein T-Zellen-Wachstumsfaktor, der die Produktion von viel mehr T-Zellen unterstützt, die für das spezielle Antigen empfindlich sind. Diese Produktion bildet einen Klon der T-Zellen. Die sensibilisierten T-Zellen hängen sich an die Zellen, die das Antigen enthalten. T-Zellen führen eine Vielzahl von regulatorischen und defensiven Funktionen aus und spielen eine zentrale Rolle in immunologischen Antworten. Wenn diese stimuliert werden, um eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen, reagieren einige T-Zellen, indem sie als Killerzellen fungieren, die die wirtseigenen Zellen töten, wenn diese mit Virus infiziert wurden und wenn diese möglicherweise cancerogen und daher fremd werden. Einige T-Zellen reagieren durch Stimulieren von B-Zellen, während andere T-Zellen reagieren, indem sie die Immunantworten unterdrücken.
Beispiele anderer Interleukine, die Mediatoren in zellvermittelten Immunantworten sind, umfassen Interferon-γ (IFN-γ), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und Interleukin-12 (IL-12). IFN-γ aktiviert Makrophagen und verstärkt die Expression von immunreaktiven Antigenen auf Tumorzellen. GM-CSF aktiviert Makrophagen und stimuliert Makrophagen- und dendritische Zellen-Rekrutierung und -Differenzierung. IL-4 ist ein T-Zellen-abgeleitetes Helfer-Lymphokin, das bei der Regulation von Wachstum und Differentiation von B- und T-Zellen teilnimmt. IL-5 ist ein T-Zellen-abgeleitetes Lymphokin, das seine grundlegenden Effekte auf die Expansion von Eosinophilen aufweist. Es gibt Belege, die nahe legen, dass Eosinophile, wenn an einer Tumorstelle rekrutiert, direkte Antitumoreffekte aufweisen können. IL-12 ist ein heterodimeres Lymphokin, anfänglich gereinigt aus dem konditionierten Medium einer lymphoblastoiden Human-B-Zelllinie. Mäuse-IL-12 wurde nun kloniert und exprimiert. Von IL-12-Stimulation wurde gezeigt, dass es die Antigen-Präsentation und die cytolytische Aktivität von natürlichen Killerzellen verstärkt.
Der Wert von Cytokin-basierter Gentherapie wurde in vorklinischen Mäuse-Studien vorgeschlagen. Inokulation von Mäusen mit experimentellen Tumoren, transfektiert mit Genen für Tumornekrosefaktor (Asher AL, et al., J. Immunol. 1991, 146: 3227), Interleukin-2 (Fearon ER, et al., Cell 1990, 60: 397) und IL-4 (Golumbek PT, et al., Science 1991, 254: 713) resultierten im Wuchs und nachfolgender Abstoßung des injizierten Tumors. In vielen Fällen wurde von den Mäusen gezeigt, dass sie eine systemische Antitumorantwort erzeugen. IL-4-transfektierte Tumore gingen zurück und führten zur Regression von gemischten nicht-transinifizierten Tumoren in Mäusen (Tepper PI, et al., Cell 1989, 57: 503). Diese Immuntherapie war ebenfalls in nu/nu-Mäusen effektiv, die eine Nicht-T-Zellenkomponente zeigten, die zur lokalisierten Therapie beitragen kann. Von IL-4-transfektierten RENCA-Zellen wurde gezeigt, dass diese spezifische T-Zellenimmunität für den Tumor erzeugen und in der Eliminierung von vorexistierendem nicht-lokalem Tumorwuchs resultieren (Golumbek PT, et al., Science 1991, 254: 713).
Gegenwärtige Ansätze für diese Form von Therapie beziehen das Wachstum und die stabile Genmodifizierung von Tumorzellen ein, um Cytokine zu erzeugen, deren Expansion in vitro und die Reinjektion in den Wirt. Während dieser Typ von Therapie in experimentellen Systemen durchführbar sein kann, begrenzen das Fehlen der Möglichkeit, den Hauptteil der Tumoren in vitro wachsen zu lassen, die Erfordernisse für genetische in vitro-Modifikation jedes Tumors eines Patienten, und die Reinjektion von lebenden Tumoren in den Patienten, die klinische Anwendbarkeit dieses Ansatzes.
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die Expression von immunaktiven Cytokinen in Tumore in situ durch Verabreichung eines Vaccinia-Virus-Vektors induziert werden kann. Diese Vaccinia-Virus-Vektoren können an Tiere, die unter Krebs leiden, als eine Behandlung verabreicht werden. Die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls zur Verbesserung der Immunität gegenüber Parasiten und anderen eindringenden Pathogenen verwendbar, die allein keine wirksame Immunantwort des Wirts hervorrufen.
Die EP 0 206 920 offenbart ein Virus, das Interferon-γ exprimiert. Die WO 92/05262 liefert eine Zubereitung von Tumorzelllinien, enthaltend ein exogenes Gen, das ein Polypeptid, beispielsweise Interleukin-2, kodiert, das die Immunantwort für den Tumor potenziert. Die EP 0 268 501 offenbart die Verwendung eines Vaccinia-Virus, das das Cytokin-Interleukin-2 exprimiert. Die US 5 017 487 offenbart Vaccinia-DNA-transkriptional regulatorische Sequenzen und rekombinante Vektoren, die zur Insertion von Fremdgenen in Pockenvirus, z.B. Interleukin-2, verwendbar sind. Miner JN, et al., Trends Biotechnol. 1990 (8), 1: 20, konzentriert sich auf virale Expressionsvektoren, insbesondere das Vaccinia-Virus-Expressionssystem, zum Exprimieren einer Vielzahl von Proteinen. Die EP 0 514 603 beschreibt die Verwendung von Viren bei der Behandlung von Krebs. Qin H., et al., Proc. American Assn Cancer Rsrch 1995, 36: 418, offenbart die Verwendung eines Vaccinia-Virus für eine Krebsgentherapie. Lee SS, et al., Proc. American Assn Cancer Rsrch 1995, 36: 248, offenbart die Verwendung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, enthaltend das Mäuse-GM-CSF-Gen für Cytokin-Gentransfer in Tumoren. Peplinski GR, et al., Surgical Forum 1995, 46: 515, offenbart die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, enthaltend das GM-CSF-Gen in einer Krebsgentherapie. Coupar BEH, et al., Eur. J. Immunol. 1986, 16: 1479, offenbart rekombinante Vaccinia-Viren, worin Expression von HA-Genen durch Vaccinia-Viruspromotoren reguliert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren bereitgestellt, umfassend einen rekombinanten Vaccinia-Virus-Vektor, verteilt in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel hierfür, wobei der Vektor ein Gen zur Expression von Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor aufweist.
Bevorzugt ist der Vektor direkt in den Tumor injizierbar.
Herkömmlicherweise wird die Tumormasse ausgewählt aus Krebs, der als eine zugängliche Masse wächst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Tumor gebildet durch Blasenkrebs, Kopfkrebs, Nackenkrebs, Melanom oder Prostatakrebs.
Kurze Beschreibung der Figur
1 ist ein Säulendiagramm, das systemische Immunität, resultierend aus intravesikaler Instillation, des Vaccinia-Virus-Vektors (VAC), zeigt. Mäuse empfingen intravesikale Instillation von VAC bei 10, 100 und 1.000 Pocken-bildenden Einheiten (pfu) (pock forming units). Zwei Wochen später wurde die Mäusemilz entfernt und auf ihre Fähigkeit VAC-infizierte MB-49-Zellen zu lysieren, getestet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es wurde in einer Anzahl von Studien deutlich gezeigt, dass die Erzeugung von effektiver T-Zellen-spezifischer Immunität in der Eliminierung von Tumoren resultieren kann. In vitro transduziertes Cytokin und durch Tumore exprimierte virale Gene resultierten in der Eliminierung von transfektierten Tumoren und verstärkter T-Zellen-vermittelter Immunität zu nicht-transduzierten Tumoren. Von der Expression von immunakzessorischen Molekülen, wie B7.1 und B7.2, wurde ebenfalls gezeigt, dass diese die Antitumor-Immunität verstärkt. Jedoch haben in vitro-Manipulationen von Tumoren, um ausgewählte Moleküle zu exprimieren, ihre Grenzen, insbesondere unter klinischen Bedingungen. Die genetische Modifikation von Tumoren für zellulare Vaccine hängt von der Fähigkeit ab und ist darauf begrenzt, jeden Patiententumor in vitro zu reserzieren und wachsen zu lassen und der Reinjektion von lebendem modifizierten Tumor.
Nunmehr wurde ein Verfahren für in vivo-Gen-Freisetzung eines Gens entwickelt, das ein immunaktives Cytokin exprimiert, welches den Bedarf nach in vitro-Manipulationen von Tumorzellen beseitigt und somit die klinische Anwendbarkeit dieses therapeutischen Ansatzes verbessert. In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Induzierung der Expression von immunaktiven Cytokinen in Tumoren in situ bereitgestellt, das die Erzeugung eines Vaccinia-Virus-Vektors umfasst, der in der Lage ist, die Expression eines ausgewählten Cytokins zu induzieren, und Injizieren des Vaccinia-Virus-Vektors in einen Tumor, so dass Zellen des Tumors das ausgewählte Cytokin erzeugen. Durch den Begriff "Induzieren" oder "induziert" ist gemeint, dass das Niveau der Expression des Cytokins durch gut im Stand der Technik bekannte Verfahren messbar ist, und dass das Niveau der Expression des Cytokins in einer Immunantwort resultiert. Mit dem Begriff "immunaktives Cytokin" oder "ausgewähltes Cytokin" ist gemeint, dass es sich auf irgendein Cytokin bezieht, das mit einer Immunantwort in Zusammenhang steht, die zu einer Tumorzerstörung führt. Das Cytokin ist der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF). Der Vaccinia-Virus-Vektor kann weiterhin ein Gen für ein immunakzessorisches Molekül, wie B7.1 oder B7.2, umfassen. Durch "immunakzessorisches Molekül" ist ein Molekül gemeint, das in Zusammenhang mit einem immunaktiven Cytokin den Tumor immunogener machen kann. Anders als im in vitro-Verfahren des Gentransfers wurde von einer Infektion und Transfektion unter Verwendung von rekombinanten Vaccinia festgestellt, dass dieses ein einfaches, schnelles und hochgradig effizientes Verfahren darstellt. Vaccinia-Rekombinante können effizient Antigene an den Klasse I-Präsentationspfad freisetzen und wurden als brauchbare Vektoren für die Expression von Schutz-Antigenen für die Vaccin-Freisetzung vorgeschla gen. Moss B. und Flexner C., "Vaccinia virus expression vector", Ann. Rev. Immunol. 1987, 5: 305-324. Die potentielle Verwendbarkeit von Vaccinia-Rekombinanten für intravesikale Gentherapie, die auf die Verstärkung der Immunogenizität von Blasentumorzellen abzielt, wurde von Lee SS, et al., Proc. Am. Assoc, Cancer, März 1993, 34: 337, vorgeschlagen. Es wurde nunmehr festgestellt, dass diese viralen Vektoren in einem Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems durch Induzieren der Expression von Cytokinen an einer Tumorstelle verwendet werden können.
Der Vaccinia-Virus, ein doppelstrangiger DNA-Pockenvirus, wurde gut charakterisiert, da dessen erfolgreiche Verwendung als lebendes Vaccin Pocken verhindern kann. Als ein vielseitiger eukaryotischer Expressionsvektor kann das Vaccinia-Virus genetisch so konstruiert werden, dass er große Fragmente von Fremd-DNA (bis zu 25 kd) enthält, die keine Wirkung auf die virale Replikation haben. Die Immunisierung mit rekombinantem Vaccinia kann Schutzantworten für das (die) Fremd-Gen(e), das (die) exprimiert wird (werden), induzieren. In der vorliegenden Erfindung wird ein Vaccinia-Virus-Vektor (VAC), der in der Lage ist, die Expression eines ausgewählten Gens zu induzieren, gemäß im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren erzeugt. Das Vaccinia-Virus kann weiterhin Gene umfassen, die immunakzessorische Moleküle kodieren, die in Verbindung mit dem immunaktiven Cytokin den Tumor immunogener machen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst ein interessierendes Fremd-Gen, bevorzugt ein Gen für das ausgewählte Cytokin, GM-CSF, hinter einem Promotor, bevorzugt einem VAC-Promotor, in einem Plasmid platziert, das in das VAC-Genom durch homologe Rekombination insertiert werden kann. Andere Gene, die in den Vektor einbezogen werden können, umfassen Gene, die immunakzessorische Moleküle, wie B7.1 und B7.2, kodieren, oder Gene, die die IL-10-Produktion inhibieren. Es wurde jüngst festgestellt, dass sowohl Humanmelanome als auch Blasenkrebs das immunsuppressive Cytokin IL-10 erzeugen. Somit nimmt man an, dass die Inhibierung dieses Cytokins die Immunogenität der Tumoren verstärkt. Die Inhibierung der Expression des IL-10 wurde durch die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden, die komplementär zur IL-10-DNA oder -mRNA in anderen Zellen ist, gezeigt. Die Fähigkeit, ein Antisense-Oligonucleotid, das komplementär zur IL-10-DNA oder -mRNA ist, zu exprimieren, kann in die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung einbezogen werden, um die IL-10-Produktion in Tumorzellen zu inhibieren, und hiermit die Immunogenität dieser Tumore zu verstärken.
Die erfolgreiche Insertion des ausgewählten Gens in das Plasmid wird durch Auswerten der hohen Transfektionsfähigkeit von bestimmten Zelllinien nach Vaccinia-Infektion bestätigt. Nachdem sie Wildtyp-Vaccinia für 30 Minuten bei einer Multiplizität von 10:1 ausgesetzt wurden, werden Maus-L929-Zellen mit einer Plasmid-DNA-Lipofectin(Gibco/BRL, Bethesda, MD)-Mischung transfektiert. Innerhalb Stunden der Transfektion können überschüssige Mengen des Genprodukts beobachtet werden, mit einer Mehrzahl der Zellen, die das Protein exprimieren. Die Erzeugung des gewünschten Gens kann unter Verwendung von Standard-Immundetektionstechniken, wie Immunausfällung von metabolisch markierten Proteinen oder Western-Blot von Zellextrakten, bestimmt werden. Weiterhin werden die Überstände aus den infizierten/transfektierten Zellen auf mit verschiedenen Cytokinen oder anderen Proteinen verbundene biologische Aktivität getestet. Nach Bestätigung, dass das interessierende Gen korrekt insertiert wurde, und ein biologisch aktives Protein kodiert, wird das Plasmid in das VAC-Genom rekombiniert. Die Plasmide werden derart erzeugt, dass das interessierende Gen zwischen der stromabwärtigen und stromaufwärtigen Hälfte des VAC-Thymidinkinase-Gens insertiert wird. Nach Infektion von CV-1-Affennierenzellen mit nicht-rekombinantem Virus wird das Plasmid unter Verwendung von Calcium-phosphat-Ausfällung freigesetzt. In einem Anteil der Zellen rekombiniert das Plasmid in das Vaccinia-Genom und spaltet das Thymidinkinase-Gen. Die resultierenden Rekombinanten werden dann vom Wildtyp ausgewählt durch Wachsenlassen in Thymidinkinase-negativen 143B-Human-Osteosarkomzellen in Gegenwart von Bromodesoxyuridin. Es ist bevorzugt, dass der Wyeth-Stamm von Vaccinia, erhältlich vom Centers for Disease Control in Atlanta, GA (CDC) verwendet wird, da dieser Stamm für Pockenimpfungen in den Vereinigten Staaten verwendet wurde. Jedoch können ebenfalls abgeschwächte Stämme von Vaccinia verwendet werden, wenn die Immunogenisierung nach Abschwächung nicht beträchtlich gefährdet wird.
Die Anfälligkeit der Zellen gegenüber dem Vaccinia-Virus wurde in in vitro-Versuchen in sowohl Mäuse- als auch Humantumorzellen gezeigt. Beide Typen von Zellen wurden durch Vaccinia-Rekombinante infiziert/transfektiert. Signifikante Infektion/Transfektion von vorliegenden Tumoren in Mäusen wurde ebenfalls nach intravesikaler Verabreichung beobachtet. Systemische Immunität von Vaccinia verhinderte nicht die Tumortransfektion durch intravesikal instillierte Vaccinia-Rekombinanten.
Die Sicherheits- und Aufrecherhaltungsfunktion des viralen Gens gegenüber wiederholter Verabreichung wurde ebenfalls beim Menschen gezeigt. Fünf Patienten mit dermalen, subkutanen und/oder Lymphknoten-Metastasen von kutanösen Melanomen wurden mit Vaccinia-Virus vom Wildtyp geimpft, und vier Tage später begannen intratumorale Injektionen mit demselben Vaccin. Erhöhte Dosen von bis zu 10⁷ pfu wurden sicher wiederholt mit nur lokalen und milden systemischen Reaktionen verabreicht. Vier der Patienten entwickelten Anti-Vaccinia-Virus-Antikörpertiter ≥ 1/3200. Mit ansteigenden Antikörpertitern nahmen die lokalen und systemischen Reaktionen ab. Ein Patient mit einer großen exophytischen Läsion unterlag einer dramatischen Tumorrepression mit multiplen Injektionen von 10⁷ pfu des Virus. Sequentielle Biopsien dieser Läsion über eine 2-Monats-Zeitspanne demonstrierte wiederholte Infektion über erfolgreiche Erzeugung von viralem Gen-Protein (E3L) trotz antiviraler Antikörpertiter so hoch wie 1/12.800. Dieses Zeitintervall ist geeignet, um eine Erzeugung von Antitumorimmunität zu ermöglichen. Es wird angenommen, dass ein Vektor, umfassend ein Cytokin-Gen, ähnlich funktionieren würde und einen immunadjuvanten Effekt vermittelt.
Die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um die Immunität eines Wirts zu erhöhen. In der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur Verstärkung der Immunität in einem Wirt bereitgestellt, die umfassen: Erzeugen eines Vaccinia-Vektors, der in der Lage ist, die Expression eines ausgewählten Cytokins zu induzieren, und Injizieren des Vaccinia-Vektors in einen Wirt, so dass Zellen des Wirts das ausgewählte Cytokin exprimieren. Unter "Wirt" wird verstanden, dass dieser Säuger, Fisch, Amphibien, Reptilien, Vögel, Beuteltiere und am meisten bevorzugt Menschen umfasst. Dies ist ebenfalls verwendbar, um die Immunantwort in einem Wirt gegenüber Parasiten und anderen eindringenden Pathogenen, die allein keine Immunantwort auslösen können, zu verstärken.
Zusätzlich können die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Cytokin-Gen-Transfer in Tumoren mit resultierender Herstellung löslicher Produkte zu vermitteln. Beispielsweise wurde ein rekombinanter Vaccinia-Virus, enthaltend das Mäuse-GM-CSF-Gen unter der Kontrolle des frühen/späten (early/late) P7.5-Vaccinia-Promotors (VV-GM) aufgebaut. Von VV-GM-infizierten Mäusemelanomen (B16.F10) und Blasen(MB49)-Tumoren wurde gezeigt, dass sie hohe Niveaus an biologisch aktivem Cytokin erzeugen, wie durch die Ausbreitung von Knochenmarks-CFU-GM und durch ELISA-Test festgestellt. Signifikante Niveaus von GM-CSF wurden im Überstand schon 6 Stunden nach der Infektion gefunden. Diese erhöhte Cytokin-Sekretion der Tumorzellen kann zu tumor-spezifischer Immunität und therapeutischen Antitumor-Effekten führen.
Demgemäß sind die Vektoren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Krebs verwendbar. Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs werden bereitgestellt, die umfassen: Verabreichen an ein Tier, das unter Krebs leidet, einer Menge eines Vaccinia-Virus-Vektors, der in der Lage ist, eine Immunantwort gegenüber Krebs im Tier auszulösen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der verwendete Vaccinia-Virus-Vektor mindestens ein Gen zur Expression des Cytokins GM-CSF. In dieser Behandlung wird der Vaccinia-Virus-Vektor in Kontakt mit dem Tumor in situ entweder durch intravesikale Verabreichung oder durch direkte Injektion in den Tumor gebracht. Daher ist dieses Verfahren insbesondere zur Behandlung von Krebs, wie Blasenkrebs, Kopfkrebs, Nackenkrebs, Melanom und anderen Krebsarten, die als zugängliche Massen wachsen und für diese Verabreichungswege zugänglich sind, verwendbar.
Die Anfälligkeit von menschlichen prostatischen Karzinomzellen gegenüber Vaccinia wurde ebenfalls unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der das Influenza- Hemagglutinin-Human-Antigen HA kodiert, untersucht. In vitro-Aussetzen der prostatischen Zelllinien LNCAP und PC3 gegenüber dem Virus nach immunhistochemischem Anfärben des kodierten HA-Proteins zeigte eine hohe Effizienz in der Tumorinfektion/-transfektion. Somit können die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung ebenfalls bei der lokalisierten Therapie von Prostatakrebs verwendet werden.
Die Vaccinia-Virus-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden in einer Vaccin-Formulierung verabreicht, umfassend eine effektive Konzentration des Vaccinia-Virus-Vektors und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Durch "effektive Konzentration" ist eine Menge von Vaccinia-Virus gemeint, die, wenn einem Tumor verabreicht, in einer messbaren Expression des ausgewählten Cytokins und einer verstärkten Immunantwort resultiert. Derartige Mengen können routinemäßig durch einen Fachmann im Stand der Technik gemäß dieser Offenbarung bestimmt werden. Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen Salzlösungen und gepufferte Lösungen. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik gut bekannt und werden beispielsweise in Gennaro, Alfonso, Hg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, einem Standard-Textbuch auf diesem Gebiet, beschrieben. Pharmazeutische Träger können gemäß dem beabsichtigten Verabreichungsweg und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt werden. Die Vaccin-Formulierung kann weiterhin einen Hilfsstoff bzw. ein Adjuvans aufweisen. Hilfsstoffe bzw. Adjuvans sind Substanzen, die therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln zugegeben werden, z.B. Vaccinen oder Antigenen, die zur Immunisierung verwendet werden, um die Immunantwort zu stimulieren. Die Verwendung von Hilfsstoffen in Vaccinen, um die Immunantwort zu verstärken, ist im Stand der Technik gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1: Rekombinanter Vaccinia-Virus
Rekombinante Vaccinia-Viren H1-VAC und NP-VAC, die die Hemagglutinin-(H1)- und Nucleoprotein-(NP)-Gene exprimieren, abgeleitet vom Influenzavirus A/PR8/34, wurden verwendet. Die Expression beider Influenza-Polypeptide befindet sich unter der Kontrolle des frühen/späten 7.5 K-Promotors. Virale Bestände, quantifiziert in pfu, wurden bis zur Verwendung in BSS/BSA bei –70°C aufbewahrt.
Beispiel 2: Zelllinien
Die Übergangszellkarzinom(TCC, transitional cell carcinoma)-Zelllinien MB-49 vom C57BI-Ursprung, MBT-2 vom C3H-Ursprung und das Human-T24-Blasenkarzinom und das H1-Human-Melanom wurden verwendet.
Beispiel 3: Antikörper, Reagentien und Färbung
Die Überstände von Hybridoma-Zelllinien, die für die Influenza-A-Hemagglutinin(H28-E23)- und Nucleoprotein-Antigene (HB65) spezifisch sind, wurden verwendet, um die Zellen und Gewebe anzufärben. Die Virus-infizierten Blasentumorzellen und Blasen-Urotheliumsektionen wurden mit kaltem Aceton fixiert und mit 0,1% fötalem Kalbsserum blockiert. HA und NP wurden mit primärem Maus-Antikörper detektiert und Biotin-markierte Anti-Maus-IgG als dem zweiten Antikörper plus Avidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und 3,3-DAB-Substrat (Sigma, St. Louis, MO) oder Avidin-Biotin-Komplexverfahren (ABC-AP) plus alkalische Phosphatase mit Fast-Red-Substrat (Vektor Laboratories, Inc., Burlingame, CA) detektiert. Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Zusätzlich wurden Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbte Schnitte präpariert.
Beispiel 4: In vitro-Beurteilung von viraler Infektion und Transfektion
Zellen (2 × 10⁶) von jeder Zelllinie, die in Beispiel 2 beschrieben wurde, wurden in einer flachen Bodenplatte mit 24 Vertiefungen (Fisher, Pittsburgh, PA) plattiert. Die Platten wurden über Nacht inkubiert, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit H1-VAC oder NP-VAC (10 pfu/Zelle) in BSS/BSA durch Inkubieren bei 37°C, 9% CO₂ für 1 Stunde infiziert, wobei alle 15 Minuten geschwenkt wurde. Das Virus wurde aspiriert, Medium wurde zugegeben und die Platte wurde für weitere 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 1:1 Aceton:Methanol für 1 Minute fixiert und mit PBS vor der immunhistochemischen Färbung gewaschen. Nicht-inifizierte und rekombinante Virus-infizierte L929-Fibroblasten, die dafür bekannt sind, dass sie gegenüber einer Vaccinia-Virusinfektion empfindlich sind, wurden jeweils als negative bzw. positive Kontrolle verwendet.
Die Mäuse-MBT-2- und MB-49-TCC-Zellen wurden in vitro mit H1-VAC infiziert. Wenn mit nicht-infizierten Tumorzellen verglichen wurde, zeigte die immunhistochemische Färbung mit spezifischen Antikörpern positive Expression der kodierten HA- oder NP-Antigene, was durch cytoplasmische Färbung von Virus-infizierten TCC-Zellen angegeben wurde. Zusätzlich wurde die Human-Blasentumor-Zelllinie T24 und eine Human-Melanom-Linie in ähnlicher Weise in vitro infiziert.
Beispiel 5: In vivo-Beurteilung der Virusinfektion und Transfektion
Weibliche Mäuse, 4 bis 6 Wochen alt, wurden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, erworben. Die Mäuse wurden intravesikal mit rekombinantem Vaccinia-Virus instilliert. Die Mäuse wurden anästhesiert, über die Harnröhre ein Katheter eingeführt und dann über einen Ätzdraht (Birtcher Hyfricator, El Monte, CA) durch Einsetzen eines einzelnen 1-Sekunden-Pulses mit 1 Watt kauterisiert. Nach Entfernung des Ätzdrahts wurden die Blasen mit 10⁴ MB49-Zellen, um intravesikalen Wuchs eines Tumors hervorzurufen oder entweder 10, 100 oder 1.000 pfu Vaccinia-Virus-Rekombinanten in PBS instilliert. Bei 8 und 22 Stunden nach der Instillation wurden die Mäuse getötet, und die Blasen wurden entfernt und in OCT-Medium (Fisher) in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Blasenproben wurden bis zur Sektion bei –70°C gelagert.
Mäusen, die intraperitoneal mit WR-Vaccinia vom Wild-Typ (10⁷ pfu) vorimmunisiert waren, wurden intravesikal MB-49-Tumorzellen implantiert. 2 Wochen nach Tumorentwicklung wurde eine einzelne intravesikale Instillation von NP-VAC (2 × 10⁶ pfu, von der gezeigt wurde, dass sie keine systemische Toxizität in vorimmunen Mäusen hat) vorgenommen. Bei 8 und 22 Stunden nach der Instillation wurden die Blasen entfernt, eine Sektion durchgeführt und gefärbt. Die in vivo-Expression von kodiertem NP wurde bei 22 Stunden nach der Instillation gezeigt. Ähnliche Ergebnisse waren bei dem 8-Stunden-Zeitpunkt zu sehen.
Beispiel 6: Cytotoxische T-Lymphozyten-Analyse
Cytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antworten auf intravesikale Infektion durch Vaccinia-Rekombinanten wurden bei einem 4-Stunden-⁵¹Cr-Assay bestimmt. Die Milz von Virus-infizierten Mäusen wurde nach 2 Wochen post-intravesikaler Instillation isoliert, in vitro mit lebenden Virus-infizierten syngenischen Milz-Stimulatoren (3:1) restimuliert und für 7 Tage bei 37°C, 5% CO₂, kultiviert. Die Responderzellen wurden auf Cytotoxizität auf ⁵¹Cr-markierten Vaccinia-Virus-infizierten MB49-Tumortargets auf die angegebenen Effektor-Target-Verhältnisse getestet. Prozentspezifische Lysis wurde wie folgt berechnet: (cpm-experimentelle Freisetzung – cpm-spontane Freisetzung)/(Gesamtfreisetzung – spontane Freisetzung) × 100. Die Milz von intravesikal infizierten C57BL/6-Mäusen wurde auf Antigen-spezifisches Töten von Vaccinia-Virus-infizierten MB-49-Blasentumor-Targetzellen in 4 Stunden Chrom-Freisetzungstests getestet. Keine Virus-induzierte Targetlysis war im 4-Stunden-Test zu sehen, und Virus-spezifische CTL lysierte die nicht-infizierten Targets nicht. Wie in 1 gezeigt, waren Konzentrationen so niedrig wie 10 pfu intravesikal ausreichend, um eine systemische Anti-Vaccinia-CTL-Antwort zu induzieren. Wenn die Dosis an intravesikalem Vaccinia titriert wurde, waren Konzentrationen so groß wie 10⁵ pfu pro Maus für nicht-immunisierte Mäuse tödlich, die innerhalb 5 bis 6 Tagen nach Instillation starben. Im Gegensatz hierzu erschienen Mäuse, die eine einzelne intravesikale Konzentration von weniger als 10⁵ pfu erhielten, normal und überlebten mehr als 2 Wochen nach der Instillation. Mäuse, die mit einer intraperitonealen Injektion von WR-Vaccinia-Virus vom Wild-Typ (10⁷ pfu) vorimmunisiert waren, zeigten keine Morbidität bei intravesikalen Konzentrationen so hoch wie 2 × 10⁶ pfu von Vaccinia-Rekombinanten pro Maus.
Weiblichen C57BL/6-Mäusen wurde eine einzelne intravesikale Instillation mit Vaccinia-rekombinantem H1-VAC oder NP-VAC (10⁴ pfu) verabreicht, um die Infektion des Urothelium zu bestätigen. Die Mäuse wurden getötet, post-instilliert und ihre Blasen wurden für die Sektion und Färbung gewonnen. Die Analyse der Blasenwand durch routinemäßige pathologische Prozeduren unter Verwendung von H&E-gefärbten Trägern zeigten, dass urotheliale Zelllinien des Blasenlumens Virus-infiziert waren, wie durch charakteristische morphologische Änderungen, einschließlich Zellvergrößerung, Kern- und cyctoplasmische Vakuolisierung genauso wie atypische Chromatinmuster angezeigt wurde.
Beispiel 7: Humanstudie unter Verwendung von intratumoralen Vaccinia-Injektionen als einem Vektor für Gen-Transfer
Patienten in dieser Studie hatten jeweils ein histologisch dokumentiertes chirurgisch unheilbares Melanom mit mindestens einer dermalen, subkutanen oder Lymphknotenmetastase, die auf lokale Antwort bewertbar und der Injektion zugänglich war. Geeignete Patienten waren vollständig ambulant mit oder ohne geringfügige tumorbezogene Symptome, hatten eine Lebenserwartung von 6 oder mehr Monaten und waren mindestens 4 Wochen seit dem chirurgischen Eingriff (der eine allgemeine Anästhesie erforderte) und 8 Wochen seit der Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie. Sämtliche Patienten waren immunkompetent, wie demonstriert durch ein oder mehrere positive Hypersensitivitäts-Hautreaktionen vom verzögerten Typ, um mikrobielle Antigene zu erinnern oder auf Dinitrofluorbenzol nach Sensibilisierung.
Den Patienten wurde Dryvax (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA), vertrieben vom Center for Disease Control (Atlanta, GA), in lyophilisiertem Zustand verabreicht. Wenn entsprechend rekonstituiert, enthält das resultierende Produkt 25 Millionen pfu in einem Volumen von 0,25 ml.
Jeder Patient wurde unter Verwendung einer Standard-Multipunktionsmethode mit einer gabelförmigen Impfnadel auf der Haut des Deltamuskelbereichs geimpft, der in sämtlichen Fällen eine tumorfreie Extremität mit intakten regionalen Lymphknoten war. Die Impfstelle wurde visuell am Tag 4 beurteilt, um zu bestätigen, dass eine lokale Hauptreaktion (erythematöse Knötchen mit Vesikulation und Pustelbildung) fortschritt. Die Tumorbehandlung wurde am Tag 4 fortgesetzt. Dermale, subkutane und/oder Lymphknotenmetastasen wurden mit Vaccinia-Virus vom Wild-Typ durch intraläsionale Injektion unter Verwendung einer 25-iger Nadel infiltriert (das Volumen der Injektion reichte von 0,05 bis 0,1 ml). Die Behandlung wurde etwa zweimal pro Woche wiederholt.
Die Regression von injizierten und nicht-injizierten Läsionen wurde durch visuelle Inspektion und/oder Ultrasonographie beurteilt. Die Ultrasonographie wurde unter Verwendung einer 10,0 MHz-Linearsonde (Advanced Technology Laboratories, Inc., Bothel, WA) mit Direktkontakt-Scanning der Oberfläche der Masse genauso wie Scanning mit einem Abstandskissen (Parker Laboratories, Inc., Orange, NJ) durchgeführt. Sämtliche Massen wurden in sagittalen und axialen Ebenen abgebildet. Der Tumorort, die Tiefe der Penetration und sonographische strukturelle Erscheinung wurden bestimmt. Die Tumore wurden in Millimetern (mm) mit der sagittalen (S) und anteroposterioren (AP) Dimensionen, entnommen vom sagittalem Bild mit der größten Dimension, gemessen. Die Tumorbreite (B) wurde aus der quer verlaufenden Ebene erhalten. Die läsionale Antwort wurde als vollständig (kein klinisch offensichtlicher Resttumor), partiell (≥ 50% Reduktion im Tumorvolumen) oder nicht (alle anderen) kategorisiert.
Ausstanz-Biopsien wurden unter Verwendung herkömmlicher steriler dermatologischer Techniken durchgeführt. Eine Hälfte des Materials wurde in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin für Routine-Histologie angefärbt. Das verbliebene Gewebe wurde wieder für Transmissionselektronenmikroskopie (EM) und immunhistochemische Analyse halbiert. Das Gewebe wurde entweder in 2% Glutaraldehyd fixiert oder in OCT eingebettet (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) und unter Verwendung von flüssigem Stickstoff auf einen Schlag gefroren. Das gefrorene Gewebe wurde daraufhin mit 5 μm-Dicke mit einem Kryostat einer Sektion unterzogen, in kaltem Aceton fixiert, mit PBS mit 5% fötalem Kalbsserum (FKS) blockiert und mit dem Antikörper TW2.3, der für ein frühes Gen-Produkt von Vaccinia-Virus-Replikation (E3L) spezifisch ist, gefärbt. Da E3L ein nicht-strukturelles virales Protein ist, weist die positive Antikörperfärbung auf eine aktive Infektion hin.
Um Serumtiter für Anti-Vaccinia-Virus-Antikörper zu messen, wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit einem 10 μg/ml-Proteinextrakt, erhalten aus Kulturen von Human-Melanom-Zelllinien, infiziert für 6 Stunden mit einem Wyeth-Stamm von Vaccinia-Virus, beschichtet. Nach Blockieren mit PBS plus FKS, wurden Verdünnungsreihen von Patientenseren vor und nach Immunisierung zu den Vertiefungen zugegeben, für 2 Stunden inkubiert und die Platten gewaschen. Serum-Anti-Vaccinia-Virus-Antikörper wurden unter Verwendung eines Peroxidase-markierten Anti-Human-IgG-Zweitreagens mit schwerer und leichter Kette und Orthophenyldiamin-Substrat sichtbar gemacht. Titer wurden als die reziproke Serumverdünnung, die 50% maximale Absorption im Test ergab, abgelesen.
Beispiel 8: Intraläsionale Infektion von Human-Melanom-Zellen durch Vaccinia-Virus
Bei einem Patienten, einer fünfundsechzig Jahre alten weißen Frau, wurde zuerst ein primäres Melanom (1 mm, Level 4) in der rechten Wade mit Anhängsel-Läsionen im Jahre 1983 diagnostiziert. Die primäre Läsion wurde herausgeschnitten und die dermalen Auswüchse erfolgreich mit intratumoralem BCG behandelt. Die Patientin fühlte sich bis 1992 wohl, als zwei dermale/sc-Läsionen an der Wade auftraten und nicht mehr auf intratumorales BCG, systemisches R24 oder Chemotherapie reagierten. Vaccinia-Behandlung wurde mit einer Standardimmunisierung (250.000 pfu topisch, 15 Punktionen) begonnen. Am Tag 4 der Behandlung, als festgestellt wurde, dass eine Aufnahme deutlich fortschreitet, wurde intraläsionales Vaccinia fortgesetzt. Eine einzelne metastatische Läsion wurde 19 Mal über 88 verstreichende Tage mit insgesamt 14 × 10⁷ pfu (Wyeth) injiziert. Mehrere Biopsien zeigten fortschreitend intensive Infiltration des Tumors mit Lymphozyten und Tumorregression. EM und immunhistologische Färbung für Vaccinia-Gen-Produkte zeigten erfolgreiche virale Infektion von Tumorzellen in Gegenwart von substantiellen Anti-Vaccinia-Antikörper-Titern.
Beispiel 9: Klinische Versuche
Patienten wurde PockenVaccin (Dryvax, Wyeth Laboratories) durch Skarifizierung verabreicht. Die Immunität gegenüber dem Vaccin wurde durch eine Hauptreaktion, charakterisiert durch Pustelbildung am Impfort und die Detektion von zirkulierendem Anti-Vaccinia-Antikörper, demonstriert. Patienten, die beide Reaktionen zeigten, sind für eine lokalisierte Behandlung mit dem Cytokin-erzeugenden Vaccinia-Vektor geeignet.
Die Patienten wurden mit erhöhten Dosen von Vaccinia über eine Zeitspanne von mehreren Wochen durch lokale (intratumorale oder topisch, wie intravesikale) Verabreichung behandelt. Im Falle von Melanom, Kopf- und Nacken- und anderen Tumoren, die als zugängliche feste Massen an den primären und/oder metastatischen Stellen wachsen, wurde das Vaccinia in den Tumor unter Verwendung einer Spritze und einer Nadel injiziert. Im Falle von Blasenkrebs wurde das Vaccinia unter Verwendung eines Katheters in die Blase instilliert (intravesikal).
Die Patienten wurden in häufigen Intervallen auf Zeichen von Toxizität untersucht, und Tumorreaktion wurde durch Messen der injizierten und nicht-injizierten Tumormassen auf Zeichen von Schrumpfen durch direkte Visualisierung oder radiologische Verfahren (Ultraschall, Röntgenstrahlen, MRI etc.) bestimmt.
Ein Beleg von systemischer Antitumor-Immunität wurde unter Verwendung von in vitro-Techniken bestimmt, die die direkte Interaktion von Lymphozyten und Tumorzellen misst. Die Messungen der Antitumor-Immunität können ohne weiteres von Personen im Stand der Technik in diesem Bereich vervollständigt werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, umfassend einen rekombinanten Vaccinia-Virus-Vektor, verteilt in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel hierfür, wobei der Vektor ein Gen zur Expression von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Vektor direkt in den Tumor injizierbar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Tumormasse ausgewählt ist aus einem Krebs, der als eine zugängliche Masse wächst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Tumor gebildet wird durch Blasenkrebs, Kopfkrebs, Nackenkrebs, Melanom oder Prostatakrebs.