DE69637480T2

DE69637480T2 - Bioaktive il-12 fusionsproteine

Info

Publication number: DE69637480T2
Application number: DE69637480T
Authority: DE
Inventors: Graham J. Cambridge LIESCHKE; Richard C. Lincoln MULLIGAN
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1995-02-08
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: ES2302565T3; WO1996024676A1; JP2006314332A; EP0815245A1; ATE391181T1; DK0815245T3; MX9706050A; AU701918B2; EP0815245B1; JP3919220B2; PT815245E; DE69637480D1; AU4919896A; JPH10513362A; US5891680A

Description

BIOAKTIVE FUSIONSPROTEINE UND IHRE VERWENDUNG IN DER TUMORTHERAPIE
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft bioaktive Fusionsproteine und ihren Nutzen in der Tumortherapie.
Die Erzeugung therapeutischer Proteine, wie z. B. derjenigen, die dimer sind, ist oft schwierig, ineffizient und teuer. Die Erzeugung eines Dimers kann eine getrennte Expression der beiden Komponenten mit anschließender Verbindung dieser Komponenten zu einem funktionellen Dimer erfordern. Alternative Verfahren zur Erzeugung funktioneller dimerer Proteine wären nützlich.
Eur. J. Immunol. (1995) 25: 137–146 beschreibt die Expression der zwei Untereinheiten von Interleukin-12-Genen (p35 und p40) aus einem Plasmid, wobei p35 und p40 durch eine interne ribosomale Eintrittsstelle so gebunden werden, daß p35 und p40 nach der Expression nicht durch Aminosäuren verbunden sind.
J. Bio. Chem., Bd. 268, 31, 23455–23459, 1933, offenbart die Konstruktion einer cDNA, die eine Na-Pumpe mit "Einzel-Untereinheit" codiert, in der die α- und β-Untereinheiten der Pumpe durch einen Linker von 17 Aminosäuren verbunden wurden.
Hierin werden Fusionsproteine, die mindestens zwei Polypeptidmonomere (Aminosäureketten) aufweisen, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden und bioaktiv sind, sowie ihre Herstellung offenbart. In einigen Teilen der Offenbarung weisen die bioaktiven Fusionsproteine zwei oder mehrere Polypeptide auf, die als Untereinheiten oder Monomere in einem entsprechenden bioaktiven nativen dimeren Protein auftreten und durch heterologe Aminosäurereste (Aminosäurereste, die nicht zwischen zwei Untereinheiten in dem nativen Protein anwesend sind) verbunden sind. Das Cytokin IL-12, wie es in der Natur auftritt, ist ein Heterodimer, das aus einer 40 kDa-Untereinheit (p40) aufgebaut ist, die durch eine Disulfidbindung an eine 35 kDa-Untereinheit (p35) gebunden ist. Gillessen, S. et al., Eur. J. Immunology, 25: 200–206 (1995); Ozmen et al., J. Exp. Med., 180: 907–915 (1995); Heinsel et al., Inf. & Immun., 62(10): 4244–4249 (1994). Zum Beispiel ist das Fusionsprotein ein bioaktives Interleukin-12-(IL-12-)Fusionsprotein, das zwei als p35 und p40 bezeichnete Untereinheiten aufweist, die durch einen Polypeptid-Linker miteinander verbunden sind. Gleichfalls offenbart wird ein Fusionsprotein, das die Untereinheiten anderer dimerer, durch einen Polypeptid-Linker verbundener hämatopoetischer bzw. blutbildender Wachstumsfaktoren oder die Untereinheiten anderer dimerer Cytokin-Proteine aufweist, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden sind. Gleichfalls offenbart wird ein bioaktives Fusionsprotein, das zwei Untereinheiten aufweist, die bioaktive Monomere (z. B. Interleukin-2, GMCSF) in ihrer nativen Form sind und über einen Polypeptid-Linker verbunden sind, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, das seiner Natur nach insofern chimär oder hybrid ist, als es mindestens zwei Komponenten oder Untereinheiten aufweist, die nicht zusammen in einem nativen Protein auftreten (z. B. einem Interleukin-2/GMCSF-Fusionsprotein).
Außerdem werden Verfahren zur Herstellung derartiger Fusionsproteine, Konstrukte, die bei ihrer Herstellung nützlich sind, und Wirtszellen offenbart, welche die Konstrukte enthalten, aus denen die codierten Fusionsproteine exprimiert werden. Die Fusionsproteine werden in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert, wie z. B. durch einen Retrovirusvektor, der DNA enthält und exprimiert, welche die Untereinheiten oder Monomere codiert, und den Polypeptid-Linker des gewünschten Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtszelle, wie z. B. in Säugetierzellen. Ferner werden Zellen offenbart, die transduziert worden sind, um erfindungsgemäße IL-12-Fusionsproteine abzusondern bzw. zu sekretieren, und insbesondere Tumorzellen, die transduziert worden sind, um IL-12-Fusionsprotein zu sekretieren. Außerdem wird die Verwendung der transduzierten Tumorzellen besonders bei der Behandlung von Tumoren offenbart.
Unsere Fusionsproteine sind für die gleichen Zwecke (z. B. therapeutische oder diagnostische Zwecke) wie das entsprechende native Protein anwendbar. Zum Beispiel können IL-12-Fusionsproteine eingesetzt werden, um die lytische Aktivität von NK/Lymphokin-aktivierten Killerzellen zu erhöhen, wirken als Wachstumsfaktor für aktivierte humane T- und NK-Zellen und stimulieren die Produktion von IFN-γ durch ruhende periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC). IL-12 ist auch bei der Behandlung verschiedener Karzinome einsetzbar. Zum Beispiel ist IL-12 für die Verstärkung der Antitumorimmunität verwendbar, und wie hierin beschrieben, können Tumorzellen, die entweder natives IL-12 oder ein IL-12-Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung sekretieren, zur Behandlung etablierter Tumoren verwendet werden, beispielsweise um die weitere Entwicklung eines Tumors zu verhindern, die Rückbildung etablierter Tumoren zu bewirken, die Überlebenszeit zu verlängern, oder eine Kombination davon. Die Fusionsproteine haben gegenüber den entsprechenden nativen Proteinen insofern gewisse Vorteile, als sie durch die hierin beschriebenen Verfahren effizient und reproduzierbar hergestellt werden können. Ferner können unsere Fusionsproteine auch im Sinne modifizierter oder verstärkter Aktivität, günstigerer Bioverfügbarkeit und verbesserter pharmakokinetischer Eigenschaften Vorteile gegenüber den entsprechenden nativen Proteinen aufweisen.
Nach einem ersten Aspekt bietet die Erfindung DNA, die aufweist: eine DNA, die eine IL-12 p35-Untereinheit codiert, vorzugsweise von menschlichem (humanem) oder Maus-(murinem)Ursprung, eine DNA, die einen Polypeptid-Linker codiert, und eine DNA die eine IL-12 p40-Untereinheit codiert, vorzugsweise von humanem oder murinem Ursprung, wobei die den Polypeptid-Linker codierende DNA zwischen der die IL-12 p35-Untereinheit codierenden DNA und der die IL-12 p40-Untereinheit codierenden DNA positioniert ist, und wobei die Expression der DNA zur Erzeugung eines bioaktiven IL-12-Fusionsproteins führt, das die IL-12 p35-Untereinheit und die IL-12 p40-Untereinheit aufweist, die durch den codierten Polpeptid-Linker miteinander verbunden sind.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung stellen wir ein bioaktives IL-12-Protein bereit, das eine IL-12 p35-Untereinheit, vorzugsweise von humanem oder murinem Ursprung, und eine IL-12 p40-Untereinheit aufweist, vorzugsweise von humanem oder murinem Ursprung, die durch einen Polpeptid-Linker miteinander verbunden sind, der vorzugsweise 7 bis 16 Aminosäurereste aufweist.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven IL-12-Proteins bereitgestellt, das die folgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen eines Expressionsvektors mit einer DNA, die eine IL-12 p35-Untereinheit codiert, vorzugsweise von humanem oder murinem Ursprung, einer DNA, die einen Polpeptid-Linker codiert, vorzugsweise mit 7 bis 16 Aminosäureresten, und einer DNA, die eine IL-12 p40-Untereinheit codiert, vorzugsweise von humanem oder murinem Ursprung, wobei die den Polpeptid-Linker codierende DNA zwischen der die IL-12 p35-Untereinheit codierenden DNA und der die IL-12 p40-Untereinheit codierenden DNA positioniert ist;
b) Einbringen des Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle; und
c) Halten der aus Schritt (b) entstehenden Wirtszelle unter Bedingungen, die sich für eine Expression der in dem Expressionsvektor vorhandenen DNA eignen, wodurch ein bioaktives IL-12-Protein erzeugt wird, in dem die zwei Untereinheiten durch den Polpeptid-Linker verbunden sind.

Hierin werden IL-12 sekretierende Tumorzellen, die vorzugsweise unter CMS-5-Tumorzellen und B16-Tumorzellen ausgewählt sind, zur Verwendung bei der Therapie zur Behandlung einer Person mit einer Erkrankung offenbart, die durch einen etablierten Tumor charakterisiert ist, vorzugsweise durch Verkleinerung des Tumors, stärker bevorzugt durch Verkleinerung um mindestens 50%, Verlängern der Überlebenszeit der Person im Vergleich zu einer unbehandelten Person, oder beides.
Außerdem werden Tumorzellen offenbart, die ein bioaktives IL-12-Protein sekretieren, das eine IL-12 p35-Untereinheit und eine IL-12 p40-Untereinheit aufweist, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden sind, zur Verwendung bei der Therapie zur Behandlung einer Person mit einer Erkrankung, die durch einen etablierten Tumor charakterisiert ist, oder um die Etablierung eines Tumors in einer Person durch Verabreichung an die Person nach der Initiierung des Tumors und vor der Etablierung des Tumors zu verhindern.
Ferner wird die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines etablierten Tumors, eines Fibrosarkoms, eines Melanoms oder eines Hypernephroms aus IL-12 sekretierenden Tumorzellen, vorzugsweise CMS-5-Zellen, B16-Zellen oder Hypernephromzellen offenbart.
In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
1 die Strukturen von retroviralen Konstrukten auf SFG-Basis für die Interleukin-12-Produktion (SD = Spleiß-Donor, IRES = interne ribosomale Eintrittsstelle; SA = Spleiß-Akzeptor; LTR = lange terminale Wiederholung);
2 die Nucleinsäuresequenzen, welche die Linkersequenzen in erfindungsgemäßen Interleukin-12-Fusionsproteinen codieren, und flankierende IL-12 p35- und IL-12 p40-Sequenzen (SEQ ID Nr.: 1 bis 4 und 35), sowie die codierten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr.: 5 bis 7 und 36);
die 3A–3U die vollständige Restriktionskarte und die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 8 und 9) von pUC19-SFG;
die 4A–4C die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 10 und 11), welche die murine IL-12-Untereinheit codiert, und die Aminosäuresequenz der murinen IL-12 p35-Untereinheit (SEQ ID Nr.: 12);
die 5A–5D die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 13 und 14), welche die murine IL-12 p40-Untereinheit codiert, und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 15) der murinen IL-12 p40-Untereinheit;
6 eine Standardkurve, die unter Verwendung von rekombinantem muriner IL-12 erzeugt wurde;
die 7A–7D graphische Darstellungen der Wirkung der Immuntherapie von CMS-5-tumortragenden Mäusen mit Wildtyp-, GM-CSF- und IL-12-sekretierenden CMS-5-Zellen.
Die Behandlung wurde entweder am Tag 7 (7A und /B) oder am Tag 14 (7C und 7D) nach dem Tumorangriff begonnen. Endpunkte sind entweder Überleben (7A und 7C) oder tumorfreies Überleben (7B und 7D). Tumoren wurden entweder nicht behandelt (a) oder mit GM-CSF sekretierenden CMS-5-Zellen (b), IL-12 sekretierenden Zellen (c) oder Wildtyp-CMS-5-Zellen (d) behandelt.
8 ist eine graphische Darstellung der Inzidenz von Regression etablierter CMS-5-Tumoren nach Art der Immuntherapie. Tumoren wurden wie folgt behandelt: Spalte 1 erhielt keine Immuntherapie; Spalte 2 wurde mit Wildtyp-Tumorzellen behandelt; Spalte 3 wurde mit GM-CSF sekretierenden Tumorzellen behandelt; und Spalte 4 wurde mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen behandelt.
9 ist eine graphische Darstellung der Tumor-Regression bei Mäusen, die mit systemischem IL-12 behandelt wurden. Leeres und ausgefülltes Quadrat, Dreieck, Kreis und Rhombus repräsentieren 5 individuelle Mäuse, die mit systemischem IL-12 mit 0,1 μg/Tag behandelt wurden, das 4 Wochen lang an 5 Tagen pro Woche verabreicht wurde.
Die 10A–10B zeigen graphische Darstellungen der höheren Überlebensrate, die aus der Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden CMS-5-Zellen im Vergleich zu Verabreichung von systemischem IL-12 oder keiner Behandlung (nil) resultierte. 10a stellt Ergebnisse mit Verwendung eines Tumorimpfmaterials von 2 × 10⁵ Zellen dar. 10B stellt Ergebnisse mit Verwendung eines Tumorimpfmaterials von 4 × 10⁵ Zellen dar.
Die 11A–11B zeigen graphische Darstellungen des Wirksamkeitsvergleichs (Anteil überlebender Mäuse) von CMS-5-Zellen, die unterschiedliche Formen von IL-12 sekretieren, als Immuntherapie für etablierte CMS-5-Tumoren. 11A zeigt Ergebnisse mit Verwendung von Tumoren, die durch 2 × 10⁵ CMS-5-Zellen initiiert wurden, mit einer am Tag 14 beginnenden Behandlung (20 Mäuse pro Gruppe, gepoolt von zwei Experimenten). 11B zeigt Ergebnisse mit Verwendung von Tumoren, die durch 4 × 10⁵ CMS-5-Zellen initiiert wurden, mit einer am Tag 14 beginnenden Behandlung (1 Gruppe von 10 Mäusen). Die Tumoren wurden entweder nicht behandelt (a) oder mit Wildtyp-CMS-5-Zellen (b), GM-CSF sekretierenden CMS-5-Zellen (c), natives IL-12 sekretierenden Zellen (d) oder IL-12-Fusionsprotein sekretierenden CMS-5-Zellen (e) behandelt.
Die 12A–12C sind graphische Darstellungen der Ergebnisse einer Immuntherapie von B16-(Melanom-)Tumoren mit Cytokin sekretierenden Tumorzellen. Für das vorbestehende Tumormodell wurden Tumoren mit 4 × 10⁵ B16-Zellen initiiert, und die Therapie begann am Tag 7 (12A) oder am Tag 14 (12B). Für das Angriffsmodell (12C) wurden 5 × 10⁵ bestrahlte Zellen als Impfstoff 14 Tage vor dem Tumorangriff mit 1 × 10⁶ B16-Zellen verabreicht. Tumoren wurden entweder nicht behandelt (a) oder mit Wildtyp-B16-Zellen (b), GM-CSF sekretierenden B16-Zellen (c), natives IL-12 sekretierenden B16-Zellen (d) oder IL-12-Fusionsprotein sekretierenden B16-Zellen (e) behandelt.
Die 13A–13B sind graphische Darstellungen der Auswirkungen einer IL-12-Abgabe durch unterschiedliche Zelltypen auf die Immuntherapie bei Mäusen mit vorbestehenden Hypernephrom(RENCA-)Tumoren. 13A zeigt Ergebnisse bei Behandlung von RENCA-Tumoren entweder mit bestrahlten Wildtyp-CMS-5-Tumorzellen (C-wt) oder mit CMS-5-Tumorzellen, die transduziert wurden, um entweder natives IL-12 (C-nIL-12) oder das IL-12-Fusionsprotein (C-scIL-12) zu sekretieren. 13B zeigt Ergebnisse bei Behandlung von RENCA-Tumoren entweder mit einer Kombination von Wildtyp-CMS-5- und -RENCA-Zellen (C-wt + R-wt), einer Kombination von IL-12-Fusionsprotein sekretierenden RENCA-Zellen und Wildtyp-CMS-5-Zellen (C-wt + R-IL-12) oder einer Kombination von IL-12-Fusionsprotein sekretierenden CMS-5-Zellen und Wildtyp-RENCA-Zellen (C-IL-12 + R-wt).
Die 14A–14B sind eine graphische Darstellung der Auswirkungen auf die Immuntherapie von vorbestehenden CMS-5-Tumoren mit IL-12-Fusionsprotein sekretierenden RENCA-Tumorzellen. 14A zeigt die Ergebnisse bei Behandlung von CMS-5-Tumoren entweder mit Wildtyp-RENCA-Zellen oder mit RENCA-Zellen, die zur Sekretion des IL-12-Fusionsproteins transduziert wurden. 14B zeigt die Ergebnisse bei Behandlung von CMS-5-Tumoren entweder mit einer Kombination von Wildtyp-RENCA- und Wildtyp-CMS-5-Zellen (C-wt + R-wt), einer Kombination von IL-12-Fusionsprotein sekretierenden RENCA-Zellen und Wildtyp-CMS-5-Zellen (C-wt + R-IL-12) oder einer Kombination von IL-12-Fusionsprotein sekretierenden CMS-5-Zellen und Wildtyp-RENCA-Zellen (C-IL-12 + R-wt).
Hierin beschrieben werden bioaktive Fusionsproteine, die mindestens zwei Untereinheiten aufweisen, die durch einen intervenierenden Aminosäure-Linker gekoppelt oder verbunden sind, ein Verfahren zur Herstellung der bioaktiven Fusionsproteine, für die Herstellung der Fusionsproteine verwendbare Konstrukte, die in Wirtszellen exprimiert werden können und Wirtszellen, welche die Konstrukte enthalten.
In einer Offenbarung weisen die bioaktiven Fusionsproteine auf: 1) mindestens zwei Polypeptid-Untereinheiten oder Monomere, die Polypeptid-Untereinheiten entsprechen, die in einem nativen dimeren Protein anwesend sind, das eine spezifizierte Bioaktivität aufweist, und 2) mindestens einen Polypeptid-Linker, der die Untereinheiten so miteinander verbindet, daß das entstehende Fusionsprotein bioaktiv ist. Wenn das entstehende Fusionsprotein dimer ist (zwei Untereinheiten oder Monomere enthält), können die zwei Komponenten Untereinheiten, die in dem gleichen nativen dimeren Protein auftreten (z. B. zwei IL-12-Untereinheiten); Untereinheiten, die in zwei verschiedenen nativen dimeren Proteinen auftreten (z. B. eine Untereinheit von IL-12 und eine Untereinheit von IL-3), oder Monomere sein, die individuell bioaktiv sind (z. B. IL-12, GMCSF). Multimere Fusionsproteine, die drei oder mehr Untereinheiten aufweisen, die durch Polypeptid-Linker miteinander verbunden sind, können beispielsweise drei oder mehr von den Untereinheiten, die im gleichen nativen dimeren Protein auftreten (z. B. drei oder mehr IL-12-Untereinheiten), drei oder mehr Untereinheiten, die in verschiedenen nativen dimeren Proteinen auftreten (z. B. zwei IL-12-Untereinheiten und eine IL-3-Untereinheit), drei oder mehr bioaktive Monomere (z. B. drei IL-12-Monomere, zwei IL-2-Monomere und ein GMCSF-Monomer) oder eine Kombination von Untereinheiten von nativen dimeren Proteinen und bioaktiven Monomeren (z. B. zwei IL-12-Untereinheiten und ein GMCSFG-Monomer) aufweisen. In jedem Fall ist ein Polypeptid-Linker zwischen zwei Untereinheiten vorhanden (die Reihenfolge ist zum Beispiel Untereinheit-Linker-Untereinheit-Linker-Untereinheit). Die Begriffe "Untereinheit" und "Monomer", wie sie hier gebraucht werden, werden austauschbar benutzt, um auf die Komponenten eines dimeren oder multimeren Proteins und die einzelne Komponente eines monomeren Proteins Bezug zu nehmen. Die Reihenfolge von Untereinheiten in dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein kann p35-Linker-p40 oder p40-Linker-p35 sein. Im einen wie im anderen Fall ist der Polypeptid-Linker zwischen den zwei Untereinheiten positioniert. Ein bioaktives Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung, das Untereinheiten enthält, die in dem gleichen nativen dimeren Protein auftreten, "imitiert" oder ist ähnlich dem, was hierin als entsprechendes natives dimeres Protein im Sinne seiner Bioaktivität bezeichnet wird, unterscheidet sich aber insofern von dem entsprechenden nativen dinieren Protein, als das Fusionsprotein zwischen jedem Paar von Polypeptid-Untereinheiten Linker-Aminosäurereste enthält, die nicht in dem entsprechenden nativen Protein auftreten (heterologe Aminosäurereste). Ein entsprechendes natives Protein ist ein Protein, das die in dem Fusionsprotein anwesenden Untereinheiten enthält und Bioaktivität aufweist, die auch von dem Fusionsprotein aufgewiesen wird.
In dem bioaktiven IL-12-Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung sind die zwei mit p35 und p40 bezeichneten Untereinheiten eines nativen Säugetier-IL-12-Proteins (z. B. Human-, Maus-, Ratten, Hunde-, Katzen-, Affen-, Schimpansen- oder Schweine-IL-12-Proteins) über einen Polypeptid-Linker miteinander verbunden. Hier ist das entsprechende native Protein das native Säugetier-IL-12-Protein. Entsprechend ist im Fall eines anderen bioaktiven IL-12-Fusionsproteins, wie z. B. IL-3, das entsprechende native Protein IL-3. Die Aminosäurereste der Untereinheiten des bioaktiven Fusionsproteins können die gleichen sein wie die der Untereinheiten des entsprechenden nativen Proteins oder können unterschiedlich sein, vorausgesetzt, daß das resultierende Fusionsprotein die gewünschte Bioaktivität aufweist. Zum Beispiel kann (können) die Untereinheit(en) eine andere Aminosäuresequenz als die der entsprechenden Untereinheit eines nativen Proteins aufweisen (d. h. die Sequenz der nativen Untereinheit kann sich darin unterscheiden, daß eine oder mehrere Aminosäurereste deletiert oder durch einen natürlich auftretenden oder nicht natürlich auftretenden Aminosäurerest ausgetauscht worden sind, zusätzliche Aminosäurereste eingebaut worden sind oder ein Aminosäurerest modifiziert worden ist). Die gewünschte Bioaktivität ist Aktivität wie die des entsprechenden nativen Proteins (z. B. ruft sie eine physiologische Antwort hervor, die auch aus der Aktivität des entsprechenden nativen Proteins resultiert). Die Bioaktivität eines Fusionsproteins (z. B. die Dauer seiner Wirkung, das Ausmaß der resultierenden Antwort) kann stärker oder schwächer als die des entsprechenden nativen Proteins sein.
Der in dem Fusionsprotein vorhandene Polypeptid-Linker kann von irgendeiner Länge und Zusammensetzung sein, die geeignet sind, zwei Untereinheiten so miteinander zu verbinden, daß das entstehende Fusionsprotein die gewünschte biologische Aktivität aufweist und seine Integrität als Dimer oder Multimer bewahrt. Die geeignete Länge und Zusammensetzung eines Linkers können für das zu erzeugende konkrete Fusionsprotein empirisch ermittelt werden. Im allgemeinen besteht der Polypeptid-Linker aus mindestens 7 Aminosäureresten, kann allerdings auch kürzer sein (z. B. 2 bis 6 Aminosäurereste). Typischerweise betragt die Länge des Linkers weniger als 30 Aminosäurereste, wie z. B. 7 bis 25 Aminosäurereste oder 7 bis 20 Aminosäurereste. In einer Ausführungsform weist der Polypeptid-Linker 7 bis 16 Aminosäurereste auf, und in spezifischen Ausführungsformen 7, 11, 15 oder 16 Aminosäurereste. Spezifische Linker, die bei der Erzeugung von bioaktiven IL-12-Fusionsproteinen verwendet werden, sind in 2 dargestellt und werden in Beispiel 4 beschrieben. In konkreten Ausführungsformen werden die Polypeptid-Linker durch die Sequenzen (Gly₄Ser)₃, (Gly₄Ser)₃Ser; (Gly₄Ser)₂Ser und Gly₆Ser veranschaulicht, und diese Linker können verwendet werden, um Untereinheiten von erfindungsgemäßen IL-12-Fusionsproteinen zu verbinden. Alternativ können andere Polypeptid-Linker verwendet werden, um zwei IL-12-Untereinheiten zu verbinden und ein bioaktives IL-12-Fusionsprotein zu erzeugen.
Die DNA, die das bioaktive Fusionsprotein codiert, kann cDNA oder genomische DNA sein und kann von verschiedenen Tieren stammen, insbesondere von Säuretieren. Zum Beispiel kann die DNA Human-, Maus-, Ratten-, Hunde-, Katzen-, Affen-, Schimpansen-, Schweine- oder Frettchen-DNA sein. Die DNA kann eine vollständige oder ganze Untereinheit (z. B. eine komplette IL-12 p35-Untereinheit und eine komplette IL-12 p40-Untereinheit) oder ein Fragment oder einen Abschnitt einer oder mehrerer Untereinheiten codieren, vorausgesetzt, daß das codierte Fusionsprotein, wenn es exprimiert wird, die gewünschte biologische Aktivität aufweist. Die Nucleinsäuresequenzen von DNA, die murine IL-12 p35- und -p40-Untereinheiten codieren, sind in den 4 bzw. 5 dargestellt. Die Nucleinsäuresequenzen von DNA, die humane IL-12 p35- und -p40-Untereinheiten codieren, sind veröffentlicht worden (Gubler et al., in Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88: 4134 (1991); 4A–4C und 5A–5D). Die gesamte oder ein Abschnitt der IL-12-DNA kann verwendet werden, um das betreffende IL-12-Fusionsprotein herzustellen, vorausgesetzt, daß das codierte Fusionsprotein bioaktiv ist (IL-12-Aktivität aufweist).
Jedes Expressionssystem, das sich zum Exprimieren eines Proteins eignet, wie z. B. ein Säugetier-, Bakterien-, Hefe- oder Insekten-Expressionssystem, kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Fusionsproteine zu exprimieren. Zum Beispiel ist, wie hierin beschrieben, ein viraler (z. B. ein retroviraler) Vektor verwendet worden, der DNA (z. B. cDNA) exprimiert, die das gewünschte Fusionsprotein in einer Säugetier-Wirtszelle codiert. Wie gleichfalls hierin beschrieben, sind Retroviren, die cDNA enthalten, welche die p35- und p40-Untereinheiten von IL-12 codiert, und ein intervenierender Polypeptid-Linker (ein IL-12-Fusionsprotein) konstruiert und in Verpackungszellen transfiziert worden (z. B. in BOSC23-Verpackungszellen). Empfängerzellen (z. B. die CMS-5-Fibrosarkom-Zellinie) wurden mit virushaltigen überstehenden Kulturflüssigkeiten infiziert und kultiviert; ein durch infizierte Zellen konditioniertes Medium wurde unter Verwendung eines Splenozytenproliferations-Bioassays mit Interleukin-2 und Concanavalin-A als Primer auf IL-12-Aktivität getestet. Zur Produktion von infektiösen Retroviren, welche die das Fusionsprotein codierende DNA enthalten, können andere Verpackungs- oder produzierende Zellinien als BOSC23-Zellen verwendet werden. Außerdem können zur Produktion des Fusionsproteins andere Empfängerzellen als eine Fibrosarkom-Zellinie verwendet werden, wie z. B. B16-Melanom- oder Hypernephrom-Zellinien. IL-12-Bioaktivität war in Zellen demonstrierbar, die mit den Retroviren infiziert wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Für die Expression eines IL-12-Fusionsproteins sind spezifische Retroviren konstruiert worden (Beispiel 1 und 1), und es ist gezeigt worden, daß Zellen, die mit den Retroviren infiziert wurden, bioaktive IL-12-Fusionsproteine produzieren (siehe Beispiel 4). Die verwendeten Retroviren enthielten alle das SFG-retrovirale Grundgerüst, dessen Sequenz in 3 dargestellt ist. Die mit pSFG.IL-12.p35 bzw. pSFG.IL-12.p40 bezeichneten Vektoren enthalten die cDNA für die IL-12 p35-Untereinheit bzw. die cDNA für die IL-12 p40-Untereinheit. Der mit pSFG.IL-12.p35-IRES-p40 bezeichnete Vektor enthält cDNA, welche die IL-12 p35-Untereinheit codiert, und cDNA, welche die IL-12 p40-Untereinheit codiert, getrennt durch eine IRES-Sequenz. Der mit pSFG.IL-12.p40-IRES-p35 bezeichnete Vektor enthält die gleichen Komponenten wie das Plasmid pSFG.IL-12.p35-IRES-p40, aber die Diniere sind in der umgekehrten Reihenfolge angeordnet, wie angedeutet. Die mit pSFG.IL-12.p35-linker-p40 bzw. pSFG.IL-12.p40-linker-p35 bezeichneten Vektoren enthalten cDNA, die jede IL-12-Untereinheit codieren, die durch die Linker (Gly₄Ser)₃Ser bzw. (Gly₄Ser)₂Ser gekoppelt wird. Die mit pSFG.IL-12.p35-linker-Δp40 bzw. pSFG.IL-12.p40-linker-Δp35 bezeichneten Vektoren enthalten cDNA, in denen Sequenzen, die eine mutmaßliche 22-Aminosäuren-Leader-Sequenz codieren, aus der zweiten cDNA deletiert wurden. Der mit pSFG.hIL-12.p40-linker-Δp35 bezeichnete Vektor ist eine humane Form des IL-12-Fusionsproteins und ist analog zu der murinen Form pSFG.hIL-12.p40-linker-Δp35, außer daß wegen einer beim Klonen aufgetretenen Deletion (siehe 2, Konstrukt E) der Linker kürzer ist. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde IL-12-Bioaktivität in einem konditionierten Medium von Zellen aufgewiesen, die mit den Retroviren infiziert waren.
Prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen, die durch die beschriebenen Vektoren transfiziert werden, werden gleichfalls offenbart. Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transfiziert werden können, schließen z. B. ein, sind aber nicht beschränkt auf Bakterienzellen, wie z. B. E. coli, Insektenzellen (Baculovirus), Hefe- oder Säugetierzellen, wie z. B. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Besonders nützlich sind Tumorzellen, die transduziert werden, um die erfindungsgemäßen IL-12-Fusionsproteine zu sekretieren.
Daher können hierin beschriebene Expressionsvektoren verwendet werden, um Wirtszellen, entweder eukaryotische (Hefe-, Vogel-, Insekten- oder Säugetierzellen) oder prokaryotische (Bakterienzellen), unter Anwendung von Standardverfahren, die bei der Erzeugung anderer, bekannter Proteine eingesetzt werden, zu transformieren, zu transfizieren oder zu transduzieren. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen davon können angewandt werden, um durch mikrobielle Mittel oder Gewebekulturtechnologie erfindungsgemäße rekombinante Proteine herzustellen. Zum Beispiel können von Fibroblasten abgeleitete 3T3-Zellen mit den erfindungsgemäßen Vektoren transduziert werden, um erfindungsgemäße IL-12-Fusionsproteine zu exprimieren und zu sekretieren. Tumorzellen und 3T3-Zellen sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich, da Zellen, die transduziert werden, um IL-12 oder IL-12-Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung zu sekretieren, eine nützliche Quelle des Proteins oder Fusionsproteins (z. B. zur Reinigung) sind. Tumorzellen, die transduziert werden, um IL-12 oder IL-12-Fusionsproteine zu sekretieren, sind gleichfalls von besonderem Nutzen als Cytostatika, wie hierin beschrieben wird.
Die zu transduzierenden Tumorzellen können von der zu behandelnden Person oder von einer anderen Person ausgewählt werden; ferner können die zu transduzierenden Tumorzellen vom gleichen Typ wie die Tumorzellen des zu behandelnden Tumors sein, oder die Tumorzellen können von einem anderen Typ als dem des zu behandelnden Tumors sein. Zum Beispiel kann ein CMS-5-Tumor mit CMS-5-Tumorzellen, Hypernephrom-(RENCA-)Tumorzellen oder B16-Tumorzellen behandelt werden, die IL-12 oder ein erfindungsgemäßes IL-12-Fusionsprotein sekretieren. Alternativ kann der Tumor mit einer Kombination von IL-12 sekretierenden, IL-12-Fusionsprotein sekretierenden und Wildtyp-Zellen vom gleichen oder einem anderen Zelltyp behandelt werden. Zum Beispiel kann ein RENCA-Tumor mit einer Kombination von Wildtyp-RENCA-Zellen und IL-12-Fusionsprotein sekretierenden CMS-5-Zellen oder mit einer Kombination von natives IL-12 sekretierenden CMS-5-Zellen und IL-12-Fusionsprotein sekretierenden RENCA-Tumorzellen behandelt werden.
Hierin werden transduzierte Tumorzellen, die natives IL-12 oder erfindungsgemäße IL-12-Fusionsproteine exprimieren, und ihre Anwendung bei der Behandlung von Tumoren offenbart. Das heißt, transduzierte Tumorzellen, die IL-12 oder IL-12-Fusionsproteine exprimieren und sekretieren, sind als Therapeutika für die Behandlung von Krebs oder zur Behandlung von etablierten Tumoren verwendbar und bieten ein Mittel für die Reversion von Tumoren (indem sie ihre Größe reduzieren oder ihre vollständige Rückbildung bewirken) oder zur Verhinderung des weiteren Wachstums eines etablierten Tumors. Wie hierin beschrieben, bewirken transduzierte Tumorzellen, die IL-12 oder erfindungsgemäße IL-12- Fusionsproteine exprimieren, die Rückbildung von etablierten Tumoren, verhindern die Etablierung von Tumoren, verlängern die Überlebenszeit oder kombinieren diese Wirkungen bei Tieren, denen sie in einer therapeutisch geeigneten Dosis verabreicht werden.
Zum Beispiel können die Tumorzellen, die IL-12 oder das erfindungsgemäße IL-12-Fusionsprotein sekretieren, mit einem physiologisch akzeptierbaren Medium formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Das spezielle physiologische Medium kann einschließen, ist aber nicht beschränkt auf Wasser, gepufferte physiologische Kochsalzlösung, Polyole (z. B. Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol) und Dextroselösungen. Die optimale Konzentration des einen oder der mehreren Wirkstoffe in dem gewählten Medium kann nach Verfahren, die Pharmakochemikern bekannt sind, empirisch ermittelt werden und wird von der gewünschten endgültigen pharmazeutischen Formulierung abhängen. Verfahren zum Einbringen der IL-12 sekretierenden oder IL-12-Fusionsprotein sekretierenden Tumorzellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale oder intranasale Verfahren. Die Tumorzellen, die natives IL-12 oder ein IL-12-Fusionsprotein sekretieren, können an der Stelle eines m behandelnden Tumors oder in der Nähe der Stelle oder an irgendeiner anderen Stelle des Körpers verabreicht werden, vorausgesetzt, daß das IL-12 oder IL-12-Fusionsprotein die gewünschte therapeutische Wirkung hervorruft (Rückbildung von etablierten Tumoren, Verhinderung der Etablierung von Tumoren oder verlängerte Überlebenszeit). Wie hierin beschrieben, ist die Nähe von Tumorstelle und Verabreichungsstelle für die Wirksamkeit der Behandlung nicht notwendig. Andere geeignete Verabreichungsverfahren können auch nachfüllbare oder biologisch abbaubare Elemente und Polymerelemente mit verzögerter Freisetzung einschließen. Die hierin beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch als Teil einer Kombinationstheorie mit anderen Mitteln verabreicht werden. Behandlungsregime werden von der Dosis, dem Abgabeweg, der Verabreichungshäufigkeit der Zusammensetzung, dem Typ, der Größe und dem Stadium des zu behandelnden Tumors und vom Alter, der Gesundheit und anderen körperlichen Eigenschaften der zu behandelnden Person abhängen.
Zum Beispiel wird eine therapeutisch wirksame Menge (Dosis) der transduzierten Tumorzellen (wahlweise mit einem physiologisch geeigneten Medium formuliert) einer Person mit einem Tumor verabreicht, der behandelt werden soll (dessen Größe z. B. vermindert oder dessen Größenzunahme verhindert werden soll). Die transduzierten Tumorzellen können auch in einer therapeutisch geeigneten Dosis einer Person verabreicht werden, um die Ansiedlung eines Tumors zu verhindern. Zum Beispiel können die transduzierten Tumorzellen einer Person verabreicht werden, die eine Antikrebstherapie benötigt (z. B. einer Person mit einem etablierten Tumor oder einer Person, bei der die Ansiedlung eines Tumors zu verhindern ist). Alternativ kann das erfindungsgemäße IL-12-Fusionsprotein der Person direkt in einer therapeutisch wirksamen Dosis verabreicht werden; das IL-12-Fusionsprotein kann wahlweise mit einem physiologisch akzeptierbaren Medium kombiniert werden, wie oben beschrieben.
Wie hierin beschrieben, wurde die Wirksamkeit von IL-12 sekretierenden Tumorzellen als Antitumor-Immuntherapie bei Mäusen mit Belastungen durch etablierte Tumoren beurteilt. Es wurden die immunogenen CMS-5-(Fibrosarkom-) und nichtimmunogene B16-(Melanom-)Tumorzellen verwendet; RENCA-Tumoren wurden gleichfalls genutzt, wie hierin beschrieben.
Wie in den Beispielen 6–8 dargestellt, demonstriert die hierin beschriebene Arbeit, daß für die immuntherapeutische Behandlung von 14 Tage alten etablierten tastbaren CMS-5-Tumoren die Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden und IL-12-Fusionsprotein sekretierenden Tumorzellen die Überlebenszeit verlängert, indem sie die Rückbildung von Tumoren einleitet. Ferner bewirkte die Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen eine Tumorrückbildung auch dann, wenn die tastbare Tumorbelastung im Mittel mehr als 5% der Körpermasse betrug. Obwohl IL-12 bei systemischer Verabreichung Antitumoraktivität gegen CMS-5-Tumoren aufweist, ergab sich für Mäuse mit größeren Tumorbelastungen bei Beginn der Therapie ein signifikanter Überlebensvorteil der Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen gegenüber der systemischen IL-12-Therapie. Dies zeigt, daß in der Abgabe des IL-12 durch transduzierte Tumorzellen statt lediglich als systemische Cytokin-Therapie ein Vorteil liegt. Daten von Tumorzellen, die transduziert wurden, um ein IL-12-Fusionsprotein (SFG. IL-12.p40.linker.Δp35) zu exprimieren, zeigen, daß die murinen und humanen Formen des Fusionsproteins eine spezifische Aktivität aufweisen, die in einem In-vitro-Bioassay mindestens gleich derjenigen des nativen Moleküls ist.
Hierin beschriebene Ergebnisse zeigen, daß eine Impfung mit IL-12 sekretierenden B16-Zellen die Naturgeschichte des Wachstums von späteren etablierten B16-Tumoren veränderte, und sie scheinen außerdem in der Lage zu sein, immunologische Mechanismen zu verstärken, die das Tumorwachstum modulieren können. IL-12 sekretierende B16-Zellen sind als Immuntherapie für etablierte B16-Tumoren verwendbar, da sie die Überlebensdauer wirksam verlängern. Diese Ergebnisse zeigen, daß es auslösbare angeborene Mechanismen gibt, welche die Naturgeschichte von etablierten Tumoren bei der Maus verändern können, und daß IL-12 sekretierende Zellen bei ihrer Auslösung wirksamer sind als GM-CSF sekretierende Zellen. Diese Ergebnisse, die in den nachstehenden Beispielen ausführlicher beschrieben werden, zeigen, daß IL-12 sekretierende Tumorzellen Wirksamkeit als Immuntherapie für etablierte Tumoren aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, welche die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
BEISPIEL 1. KONSTRUKTION VON PLASMIDEN
Die allgemeine Struktur der in diesen Untersuchungen verwendeten Plasmide ist schematisch in 1 dargestellt. Die bestätigten Sequenzen der Linker in jedem der Fusionsproteine sind in 2 angegeben.
QUELLE VON PLASMIDEN
Die Plasmide, die cDNA für die murinen IL-12 p35- und -p40-Untereinheiten enthalten (pBS. IL-12.p35 und pBS. IL-12.p40), wurden von Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) bereitgestellt. Die Numerierung der Basenpaare in diesem Dokument entspricht den Karten der Inserts dieser beiden Plasmide (4 und 5). Das Plasmid, welches das retrovirale SFG-Grundgerüst enthält, wurde von Dr. Dan Ory (Whitehead Institute, Cambridge, MA) als pSFG-TPA bereitgestellt, ein pUC-Plasmid, welches das retrovirale SFG-Grundgerüst zwischen den HindIII- und EcoR1-Stellen mit einer Gewebe-Plasminogenaktivator-cDNA zwischen den einmalig vorhandenen Nco1- und BamH1-Stellen in dem SFG-Retrovirus enthält. Eine Nucleotid-Sequenzkarte des retroviralen SFG-Grundgerüsts ist in 3 dargestellt.
PLASMID PSFG.IL-12.P35
Die IL-12p35-cDNA wurde in pBluescript bereitgestellt, wobei die das Translationsinitiations-ATG umgebenden Sequenzen gemäß den Regeln von Kozak zu ACCATGG optimiert wurden. Das IL-12p35 cDNA-Fragment wurde als Nco1-EcoR1-Fragment ausgeschnitten, wobei der EcoR1-Überstand mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase 1 gefüllt worden war. Dieses Fragment wurde mit T4 DNA-Ligase in die Nco1-BamH1-Schnittstellen von pSFG ligiert, wobei der BamH1-Überstand mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase 1 gefüllt worden war. Das resultierende Plasmid wird als pSFG.IL-12.p35 bezeichnet.
PLASMID PSFG.IL-12.P40
Die IL-12 p40-cDNA wurde in pBluescript bereitgestellt. Das Nco1-BamH1-Fragment, das die IL-12p40-cDNA enthielt, wurde ausgeschnitten und in die Nco1-BamH1-Stellen von pSFG ligiert, um pSFG.IL-12.p40 herzustellen.
ALLGEMEINE STRATEGIE FÜR DIE KONSTRUKTION VON VEKTOREN AUF SFG-BASIS
Die allgemeine Strategie für die Konstruktion der retroviralen Vektoren auf SFG-Basis für die Expression von IL-12-Fusionsprotein ist wie folgt: Zwei Oligonucleotide, die den Sense- und den Antisense-Strang eines (Gly₄Ser)₃-Linkerfragments und angrenzende IL-12 cDNA-Sequenzen codieren, die (mit endständigen Sequenzen für die Erzeugung von kohäsiven ligierbaren Überständen) zu verbinden waren, wurden unter Verwendung eines "PCR-mate" 391 DNA-Synthetisierers (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Die Sequenz des (Gly₄Ser)₃-Linkers war die von Huston et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 85: 5879–5883 (1988)).
Für die zwei Fusionsproteine mit vollständigen IL-12 cDNA wurden die Oligonucleotide so konstruiert, daß sie in eine nur einmal vorhandene Restriktionsenzym-Bindungsstelle am 3'-Ende der ersten cDNA geklont wurden, das 3'-Ende der ersten cDNA wiederhergestellt und ermöglicht wurde, daß das Nco1-Nco1-Fragment, das die vollständige cDNA und die Linkersequenz umfaßt, in die Nco1-Bindungsstelle des SFG-Plasmids geklont wurde, das die andere cDNA enthält.
Die Klonierungsstrategie war für die zwei Fusionsproteine ähnlich, mit einer Deletion der 66 bp-Codierung der ersten 22 Aminosäuren der zweiten cDNA. Linker-Oligonucleotide wurden so gestaltet, daß sie in nur einmal vorhandene Restriktionsenzym-Bindungsstellen geklont wurden, die auf der 3'-Seite von bp66 der translatierten Basen der zweiten cDNA in dem Fusionsprotein-Konstrukt lagen. Dadurch konnte ein Fragment zum Klonieren ausgeschnitten werden, welches das mit dem Linker verbundene 3'-Ende der ersten cDNA wiederherstellte und den Linker enthielt, der mit dem Codon 23 der zweiten cDNA verbunden war.
Die Sequenz des Linkers und angrenzender cDNA-Bereiche in Plasmiden wurde unter Verwendung eines "Sequenase"-Kits (Amersham, Cleveland, OH) ermittelt.
PLASMID PSFG.IL-12.P35-LINKER-P40
Die Oligonucleotide waren: Sense,
Diese zwei Oligonucleotide wurden durch Hybridisierung gebunden (Annealing), mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in die Sac1-Schnittstelle von pBS.IL-12.p35 ligiert, das mit Kalbsdarmphosphatase dephosporyliert worden war. Das Nco1-Nco1-Fragment des resultierenden Plasmids, das die IL-12p35-cDNA und den richtig orientierten Linker enthielt, wurde ausgeschnitten und in die dephosporylierte NcoI-Schnittstelle von pSFG.IL-12p40 ligiert, um pSFG.IL-12.p35-linker.p40 zu erzeugen (die richtige Orientierung dieses ligierten Fragments wurde durch Sac1-Aufschluß nachgewiesen).
Dieses Plasmid wurde unter Verwendung der folgenden zwei Primer sequenziert: 5'-CAGAGTGAAAATGAAGCT-3' (SEQ ID Nr: 18) und 5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3' (SEQ ID Nr: 19), die bp 601-618 und 613-630 der IL-12p35-cDNA entsprechen. Die Sequenzierung zeigte daß beim Klonieren eine Deletion aufgetreten war, die zu einem Verlust von 15 bp aus den Linkersequenzen führte, aber ein intaktes Leseraster bewahrte. Die Sequenz des Linkers in diesem Plasmid ist in 2 angegeben.
PLASMID PSFG.IL-12.P40.LINKER.P35
Die Oligonucleotide waren: Sense,
Diese zwei Oligonucleotide wurden durch Hybridisierung gebunden (Annealing) und in die Sse83871- und BamH1-Schnittstellen von pBS.IL-12.p40 ligiert. Das Nco1-Nco1-Fragment des resultierenden Fragments, das die IL-12p40-cDNA und den richtig orientierten Linker enthielt, wurde ausgeschnitten und in die dephosporylierte Nco1-Schnittstelle von pSFG.IL-12p35 ligiert, um pSFG.IL-12.p40.linker.p35 zu erzeugen (die richtige Orientierung dieses ligierten Fragments wurde durch Xcm1-Aufschluß nachgewiesen).
Dieses Plasmid wurde unter Verwendung der folgenden zwei Primer sequenziert: 5'-CTATTACAATTCCTCATG-3' (SEQ ID Nr: 22) und 5'-GAGGGCAAGGGTGGCCAA-3' (SEQ ID Nr: 23), entsprechend den Basenpaaren 997-1014 der IL-12p40-cDNA und den Basenpaaren 91-74 der IL-12p35-cDNA (einem Antisense-Primer). Die Sequenzierung bestätigte, daß die Sequenz des Linkers und angrenzende IL-12-cDNA-Sequenzen der Erwartung entsprachen.
Eine anschließende Restriktionsenzymkartierung von pSFG.IL-12.p40.linker.35 nach Abschluß der Transfektions- und Expressionsuntersuchungen zeigte, daß es wahrscheinlich ein Concatamer von Nco1-Nco1-Fragmenten aus dem letzten Klonierungsschritt enthielt.
PLASMID PSFG.IL-12.P35.LINKER.ΔP40
Die Oligonucleotide waren: Sense,
Diese zwei Oligonucleotide wurden durch Hybridisierung gebunden (Annealing), mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in pBS.IL-12.p40 ligiert, aus dem das Fragment 5'-Xcm1-Xcm1 mit 30 Basenpaaren ausgeschnitten worden war. Das Sac1-Sac1-Fragment aus dem resultierenden Plasmid wurde ausgeschnitten und in die Sac1-Schnittstelle von pBS.IL-12.p35 ligiert, die mit Kalbsdarmphosphatase dephosporyliert worden war (die richtige Orientierung des ligierten Fragments wurde durch einen Nco1-EcoR1-Aufschluß nachgewiesen). Das Nco1-EcoR1-Fragment des resultierenden Vektors wurde ausgeschnitten, wobei der EcoR1-Überstand mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1 gefüllt worden war, und in die Nco1- und Klenow-gefüllten BamH1-Scchnittstellen von pSFG ligiert, um pSFG.IL-12.p35.linker.Δp40 zu erzeugen.
Dieses Plasmid wurde unter Verwendung der folgenden Primer sequenziert: 5'-CAGAGTGAAAATGAAGCT-3' (SEQ ID Nr: 18) und 5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3' (SEQ ID Nr: 19), die den Basenpaaren 601-618 und 613-630 der IL-12p35-cDNA entsprechen; und 5'-GTCATCTTCTTCAGGCGT-3' (SEQ ID Nr: 34), ein Antisense-Primer, der den Basenpaaren 217-200 der IL-12 p40 cDNA entspricht. Die Sequenzierung bestätigte, daß die Sequenz des Linkers und angrenzende IL-l2-cDNA-Sequenzen der Erwartung entsprachen.
PLASMID PSFG.IL-12.P40.LINKER.ΔP35
Die Oligonucleotide waren: Sense,
Diese zwei Oligonucleotide wurden durch Hybridisierung gebunden (Annealing), mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in die Pf1M1-Schnittstelle in pBS.IL-12.p35 ligiert, die mit Kalbsdarmphosphatase dephosporyliert worden war. Die Orientierung dieses ligierten Fragments wurde durch einen Sse83871/EcoR1-Aufschluß bestätigt. Das Sse83871-EcoR1-Fragment aus dem resultierenden Plasmid wurde ausgeschnitten, wobei der EcoR1-Überstand mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1 gefüllt worden war, und in die Sse83871- und Klenow-gefüllten BamH1-Schnittstellen von pSFG.IL-12.p40 ligiert, um pSFG.IL-12.p40.linker.Δp35 zu erzeugen.
Dieses Plasmid wurde unter Verwendung des Primers 5'-GCAAAGGCGGGAATGTCT-3' (SEQ ID Nr: 28) sequenziert, der den Basenpaaren 960-977 der IL-12.p40-cDNA entspricht. Die Sequenz des zweiten Linkercodons war schwer lesbar, aber seine Sequenz wurde durch Sequenzierung des geklonten Linkers in dem Zwischenplasmid unter Verwendung der Antisense-Primer 5'-AGGAATAATGTTTCAGTT-3' (SEQ ID Nr: 29) und 5'-CAGCAGTGCAGGAATAAT-3' (SEQ ID Nr: 30) ermittelt, die den Basenpaaren 224-207 bzw. 233-216 der IL-12 p35-cDNA entsprechen. Die Sequenzierung bestätigte, daß die Sequenz des Linkers und angrenzende IL-12-cDNA-Sequenzen der Erwartung entsprachen.
PLASMIDE PSFG.IL-12.P35. IRES.P40 UND PSFG.IL-12.P40.IRES.P35
Das interne ribosomale Eintrittsstellen-(IRES-)Fragment des Enzephalomyocarditis-Virus (ECMV) wurde von Dr. Michael Sadelain (Whitehead Institute, Cambridge, MA) zur Verfügung gestellt und entsprach der früher gegebenen Beschreibung (Ghattas et al., Mol. Cell. Biol., 11: 5848–5859 (1991)).
BEISPIEL 2. ZELLEN UND GEWEBEKULTUR
BOSC23-Verpackungszellen (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8382–8396 (1993)) wurden von Dr. Dirk Lindemann (Whitehead Institute, Cambridge, MA) bezogen. Sie wurden in Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) überimpft, das mit 10% Kälberserum, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt war.
CMS-5-Tumorzellen (DeLeo et. al., J. Exp. Med. 146: 720–734 (1977)) wurden von Jason Salter (Whitehead Institute, Cambridge, MA) bezogen. Sie wurden in DMEM überimpft, das mit 10% Kälberserum, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt war. Das gleiche Medium wurde zum Sammeln von konditioniertem CMS-5-Medium verwendet.
C57BL/6-Splenozyten für IL-12-Assays wurden gewonnen, indem eine Milz durch ein Sieb (Falcon 2350, Betton Dickinson, Franldin Lakes, NJ) passiert wurde und die Zellen in IL-12-Medium (wie ausführlich in Schoenhaut et. al. (J. Immunol., 148: 3433–3440 (1992) beschrieben), das mit 2% fötalem Kälberserum ergänzt war, aufgefangen wurden.
BEISPIEL 3. ERZEUGUNG VON BOSC23-ABGELEITETEN PRODUZENTENZELLEN UND SAMMELN VON KONDITIONIERTEM MEDIUM
BOSC23-Zellen wurden mit 2 × 10⁶ Zellen pro 6 cm-Gewebekulturschale ausgestrichen und durch CaPO₄-Transfektion mit den verschiedenen, früher beschriebenen Konstrukten transfiziert (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8382–8396 (1993)). Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch 5 ml frisches Medium ausgetauscht. Virushaltige überstehende Flüssigkeiten wurden 24 h später gesammelt, durch ein 0,45 μm-Filter passiert, und Polybren wurde bis zu einer Endkonzentration von 8 μg/ml zugesetzt. 2,5 ml des virushaltigen Überstands wurden verwendet, um CMS-5-Zellen unmittelbar 4 Stunden lang zu infizieren (vorbereitend für diese Infektion waren am Vortag CMS-5-Zellen mit 5 × 10⁴ Zellen/6 cm-Gewebekulturschale ausgestrichen worden), und die übrigen 2,5 ml wurden bei –70°C eingefroren. Am folgenden Tag wurden die gefrorenen 2,5 ml virushaltiger Überstand aufgetaut und für eine zweite 4-Stunden-Infektion der CMS-5-Zellen benutzt. Zum Sammeln von IL-12-haltigem konditioniertem Medium wurde das Medium am folgenden Tag durch 5 ml frisches Medium ausgetauscht, das 24 Stunden später geerntet wurde. Dieses konditionierte Medium wurde durch ein 0,2 μm-Filter passiert und bei –70°C für einen späteren Assay auf IL-12-Bioaktivität eingefroren. 5 ml des frischem Mediums wurden den CMS-5-Zellen zugesetzt, und ein zweiter Ansatz von konditioniertem Medium wurde 24 Stunden später gesammelt, der gleichfalls gefiltert und für einen späteren Assay eingefroren wurde. Die infizierten CMS-5-Zellen wurden dann lysiert, und genomische DNA wurde zur späteren Analyse präpariert.
BEISPIEL 4. BIOASSAY AUF MURINES INTERLEUKIN-12
Gehalte an bioaktivem Interleukin-12 wurden unter Verwendung eines Splenozytenproliferationsassays mit Interleukin-2 und Concanavalin-A als Primer bestimmt, wie in Schoenhaut et al. (J. Immunol. 148: 3433–3440 (1992)) beschrieben. Das Concanavalin-A wurde kommerziell von Boehringer (Mannheim, Deutschland) bezogen, und das rekombinante humane Interleukin-12 wurde kommerziell von Chiron Therapeutics (Emeryville, CA) bezogen. Um Zellen für die Messung des [³H]-Thymidineinbaus in zelluläre DNA zu ernten, wurden eine Skatron (Sterling, VA) Zellernteeinrichtung und Filtermatten (#7031) benutzt. Zur Untersuchung auf inhibitorische Aktivität in konditionierten Medien wies das 50 μl-Probenvolumen 25 μl rekombinantes murines IL-12 mit 1000 pg/ml und 25 μl der Testprobe auf. Proben von konditionierten Medien wurden in mehreren Verdünnungen im Bereich von 1:1 bis 1:1000 doppelt analysiert. Für jeden Bioassay wurde unter Verwendung von rekombinantem murinem IL-12 im Bereich von 20–10000 pg/l eine Standardkurve konstruiert. Das rekombinante murine IL-12 wurde von Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) bezogen. Um die Konzentration von bioaktivem IL-12 in Testproben in pg/ml zu berechnen, wurde der lineare Teil der Standardkurve mit der Kurvenanpassungsfunktion der "KaleidaGraph 2.1.1"-Software approximiert, und die resultierende Formel wurde für Berechnungen verwendet. Konditionierte Medien wurden durch einen hIL-12 ELISA-Assay (handelsüblicher Satz, R & D Systems) auf hIL-12-Immunoreaktivität überprüft.
Die folgenden Konstrukte (1) wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Expression eines bioaktiven IL-12-Fusionsproteins beurteilt;

A. pSFG.IL-12.p35.linker.p40
B. pSFG.IL-12.p40.linker.p35
C. pSFG.IL12-p35.linker.Δp40
D. pSFG.IL12-p40.linker.Δp35; und
E. pSFG.hIL-12.p40.linker.Δp35.

Die Sequenzen für die Linker in jedem Konstrukt waren die folgenden, wie durch Sequenzieren bestätigt wurde (zur Orientierung werden einige benachbarte bestätigte IL-12-Sequenzen angegeben):
Keine IL-12-Bioaktivität war in Medien nachweisbar, die durch mock-transfizierte CMS-5-Zellen und durch mit dem SFG-Retrovirus allein oder durch ein verwandtes Retrovirus (MFG) konditioniert wurden, welches das lac-z-Gen trug. Durch diese Zellen konditionierte Medien enthielten jedoch eine signifikante inhibitorische Aktivität in Verdünnungen von 1:2 bis 1:10 und hemmten so viel wie 95% der Bioaktivität von 500 pg/ml rmIL-12 (Tabelle 1 und andere, nicht dargestellte Daten). Trotz dieses Hintergrunds von inhibitorischer Aktivität in den konditionierten Medien erwies sich, daß die Produktion von bioaktivem IL-12 noch nachweisbar war.
Konstrukte für die Expression einzelner Untereinheiten des IL-12-Proteins (pSFG.11-12.p35 und pSFG.IL-12.p40) ergaben von sich aus keine nachweisbare Bioaktivität. Cotransfektion von BOSC23-Zellen mit diesen Konstrukten führte jedoch zur Sekretion von bioaktivem IL-12 durch infizierte CMS-5-Zellen. Entsprechend produzierten CMS-5-Zellen, die mit dem SFG. IL-12.p35-Retrovirus und 24 Stunden später mit dem SFG. IL-12.p40-Retrovirus infiziert wurden, gleichfalls bioaktives IL-12 (Tabelle 1).
Die Dicistron-Konstrukte, die unter Verwendung der IRES-Sequenz zur Expression beider IL-12-Untereinheiten gestaltet wurden, ergaben ähnliche Produktionswerte an bioaktivem IL-12 (trotz eines nicht nachweisbaren viralen Infektionsgrades, bestimmt durch Southern-Hybridisierungsanalyse (siehe unten)) (Tabelle 1). Die Fähigkeit der IRES-haltigen Retroviren, die Produktion von bioaktivem IL-12 zu bewirken, ist durch Erzeugung stabiler klonaler retrovirusproduzierender Zellinien unter Verwendung dieser beiden Konstrukte bestätigt worden.

Alle IL-12-Fusionsproteinkonstrukte führten zu signifikanter Produktion von bioaktivem IL-12 durch infizierte CMS-5-Zellen. Von besonderer Bedeutung war das SFG.IL-12.p40.linker.Δp35-Konstrukt, für das IL-12-Bioaktivität in unverdünntem konditioniertem Medium nachweisbar war (trotz des Hintergrunds erheblicher inhibitorischer Aktivität), und für das eine Verdünnung von 1:1000 von konditioniertem Medium eine Bioaktivität enthielt, die 301 pg/ml rmIL-12 äquivalent war (Tabelle 1). Alle Konstrukte führten ebenso zu titrierbarer IL-12-Bioaktivität trotz signifikanter unspezifischer inhibitorischer Aktivität in dem konditionierten Medium. Bioaktivität von hIL-12 wurde bei Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ, Labor von Dr. Gatley) bestätigt, und die spezifische Aktivität des hIL-12-Fusionsproteins wurde als annähernd äquivalent der spezifischen Aktivität von rekombinantem nativem Human-IL-12 bestimmt. TABELLE 1

Konstrukt	Agonisten-Assay (IL-12-Bioaktivität, pg/ml)			Antagonisten-Assay (% Inhibition von 500 pg/ml IL-12 im Assay)
	Verdünnung von CM im Assay			Verdünnung von CM im Assay
	1:1	1:100	1:1000	1:2	1:10	1:1000
Keine DNA	< 50	< 50	< 50	56	62	8,6
SFG-frei	< 50	< 50	< 50	12	47	–91
MFG-lac-z	< 50	< 50	< 50	66	56	64
SFG.IL-12p35	< 50	< 50	< 50	65	76	45
SFG.IL-12p40	< 50	< 50	< 50	94	84	38
2 × Infektion^a	199,7	234,2	137,2	1	1	–84
2 × Transfektion^b	244,7	118,8	< 50	12	–3	–2
A	86,5	< 50	< 50	44	60	46
B	253,8	< 50	< 50	41	12	–14
C	189,2	57,0	< 50	43	42	47
D	297,8	600,1	301,2	–48	–143	–93

Diese Daten stammen von einem von drei Assays.

^a. Zielzellen, die nacheinander mit pSFG.IL-12.p35- und dann mit pSFG.IL-12.p40-Viren infiziert wurden (die jeweils nur die entsprechende cDNA zwischen den Nco1- und BamH1-Bindungsstellen enthielten)
^b. BOSC23-Zellen wurden mit einem Gemisch von pSFG. IL-12p35- und pSFG.IL-I2.p40-Konstrukten transfiziert.

Diese Daten lassen die Anwesenheit von IL-12-Agonistenaktivität in Medien erkennen, die durch Zellen konditioniert wurden, die mit den retroviralen Fusionsprotein-Konstrukten infiziert waren. Es wird angenommen, daß dies aus der Bioaktivität von entsprechenden sekretierten Fusionsproteinen resultiert.
Die Anwesenheit der Fusionsproteine wurde mit Western-Blotting nachgewiesen. Serumfreies CM von Wildtyp-CMS-5-Zellen oder CMS-5-Zellen, die natives IL-12 oder das IL-12-Fusionsprotein (SFG.IL-12.p35.IRES.p40 oder SFG.IL-12.p40. linker.Δp35) exprimieren, wurden gesammelt, gefiltert (0,2 μm) und bei –70°C gelagert. Diese CMs wurden 20- bis 30-fach konzentriert, und eine 20 μg-Gesamtproteinprobe wurde auf 10% Polyacrylamid-Gelen mit oder ohne 10% β-Mercapotethanol durchgeführt. Der primäre Antikörper war ein polyklonaler Ziege-Anti-rmIL-12-Antikörper (Geschenk von D. Presky, Hoffmann-La Roche, NJ). Das "Renaissance"-Detektionssystem (NEN Dupont) wurde benutzt. Eine vorläufige Analyse ließ ein 4-fach größeres Signal erkennen, das von CM resultierte, welches das einkettige IL-12-Fusionsprotein (SFG.IL-12.p40.linker.Δp35) enthielt, und daher wurde eine 5 μg-Gesamtproteinprobe von diesem CM geladen. Die Kontrollspuren waren CM von Wildtyp-Zellen ohne oder mit Beimischung von rmIL-12.
BEISPIEL 5. SOUTHERN-HYBRIDISIERUNGSANALYSE VON GENOMISCHER DNA VON INFIZIERTEN CMS-5-ZELLEN
Eine Southern-Hybridisierungsanalyse von genomischer DNA aus den Populationen von infizierten CMS-5-Zellen wurde durchgeführt, um die Anwesenheit eine Hybridisierungsbande nachzuweisen, die mit der Infektion dieser Zellen durch Retroviren der erwarteten Struktur vereinbar war, und um die Effizienz der viralen Infektion zu ermitteln (durch genomweise Bestimmung der Retrovirus-Kopienzahl).
Aus diesen Nhe1-Verdauen von genomischer DNA wurde eine hybridisierende, von Retroviren abgeleitete Bande von 985 bp plus der Größe des in die Nco1-BamH1-Bindungsstellen von SFG geklonten Inserts vorausgesagt (siehe 1). Die Größen der verschiedenen geklonten Fragmente waren: IL-12.p35 cDNA, 0.6 kb; IL-12.p40 cDNA, 1.0 kb; IRES, 0.7 kb; Linker, 0.05 kb; die in zwei Konstrukten deletierte mutmaßliche Leitsequenz war 0,066 bp.
Die BOSC23-Zellen-Überstände führten zu viralen Kopienzahlen zwischen 0,1 und 1,4 Kopien/Genom (meist 0,1–0,3 Kopien/Genom) für alle Konstrukte außer den IRES-haltigen Konstrukten, wo keine hybridisierende Bande der erwarteten Größe (3,2 kb) beobachtet wurde (Tabelle 2).

Von besonderer Bedeutung sind die Vergleichsergebnisse für die IL-12-Fusionsprotein-Retroviruskonstrukte in diesen Populationen infizierter Zellen. Obwohl das pSFG.IL-12.p35.linker.p40-Retrovirus in 1,4 Kopien/Genom anwesend war, entsprach dies einem relativ niedrigen Produktionsniveau von bioaktivem IL-12 (Tabelle 2). Das SFG.IL-12.p40 linker.Δp35-Retrovirus führte jedoch zu einem relativ hohen IL-12-Bioaktivitätsniveau, obwohl es mit 0,2 Kopien/Genom anwesend war. TABELLE 2: RETROVIRUS-KOPIENZAHL IN CMS-5-ZELLEN, DIE MIT SFG.IL-12-RETROVIREN INFIZIERT WAREN

SFG.IL-12-Konstrukt, enthaltend:	Retrovirus-Kopienzahl^a
nichts	0
IL-12.p35	0,1
IL-12.p40	0,3
sequentielle Infektion (p35/p40)	0,3/0,3
Cotransfektion (p35/p40)	0,1/0,1
IL-12.p35-IRES.p40	<< 0,1^b
IL-12.p40-IRES.p35	<< 0,1^b
IL-12.p35.linker.p40	1,4^b
IL-12.p40.linker.p35	0,1^b
IL-12.p35.linker. Δp40	0,4^b
IL-12.p40.linker. Δp35	0,2^b
1 Kopie-Kontrolle	1,0^b
0,1 Kopie-Kontrolle	0,1^b

^a Bezüglich einer Plasmid-Kopienzahl-Kontrolle von 13,5 pg pSFG.IL-12.p35.linker.p40, berechnet äquimolar zu 1 Kopie/Genom für 10 μg genomische DNA.
^b Mittelwert der Ergebnisse von einem Southern-Blot, der zunächst mit einer radioaktiv markierten p35- und dann mit einer radioaktiv markierten p40-Sonde sondiert wurde. Die relative Intensität von Signalen wurde mit einem Fuji BAS-II-Phosphoimager quantitativ bestimmt.

BEISPIEL 6. VERGLEICH DER IMMUNTHERAPIE ETABLIERTER IMMUNOGENER CMS-5-TUMOREN MIT GM-CSF SEKRETIERENDEN UND IL-12 SEKRETIERENDEN TUMORZELLEN CYTOKIN SEKRETIERENDE TUMORZELLEN
Durch CRE- oder CRIP-Verpackungszellinien erzeugte SFG-Retroviren wurden für die Transduktion von Tumorzellen verwendet. Die durch die in diesen Untersuchungen verwendeten Tumorzellen in vitro sekretierte Cytokinmenge betrug (in ng/ml/48h/10⁶ bestrahlte Zellen [alle in 10 ml gesammelt]): mit CRIP-verpacktem SFG.GM-CSF infizierte Zellen, B16 > 250, CMS-5 > 250; mit CRE-verpacktem SFG.p35.IRES.p40.IL-12 infizierte Zellen, B16 1-3, CMS-5 60–400; mit CRE-verpacktem SFG.IL-12.p40.linker. Δp35 infizierte Zellen, CMS-5 490–950; mit CRIP-verpacktem SFG.IL-12.p35.IRES.p40 infizierte Zellen, B16 90; und mit CRIP-verpacktem SFG.IL-12.p40.linker. Δp35 infizierte Zellen, B16 170 und RENCA 45. Die Tumorzellen wurden bestrahlt, um die Bildung weiterer Tumoren nach Injektion in Mäuse zu verhindern, und die Cytokinsekretion wurde für die gleichen bestrahlten Zellen charakterisiert. GM-CSF-Konzentrationen von konditionierten Medien (CM) wurden durch ELISA (Endogen, Cambridge) und IL-12-Gehalte durch einen Bioassay auf der Basis der Proliferation von Splenozyten mit Concanavalin-A- und Interleukin-2-Primern bestimmt (Schoenhaut et al., J. Immunol. 148: 3433 (1992)).
In einem Anfangsverfahren wurden Fibrosarkom-Tumoren mit 2 × 10⁵ Tumorzellen initiiert, die am Rücken syngener BALG/C-Mäuse subkutan injiziert wurden, und die Immuntherapie (bestrahlte Wildtyp-, GM-CFS sekretierende oder IL-12 sekretierende Tumorzellen) begann entweder 7 oder 14 Tage später. In diesem Experiment wurden Mäuse in mehrere Gruppen von 5 bis 10 Mäusen gegliedert, die 1, 2 oder 3 wöchentliche Immuntherapiedosen mit entweder 1 × 10⁶ oder 5 × 10⁶ Zellen/Dosis erhielten. Die Primäranalyse wurde jedoch nur nach dem Typ der als Immuntherapie verwendeten Zellen und dem Tag des Behandlungsbeginns gegliedert, ungeachtet anderer Terminierungsvariabler.
Mäuse, die mit bestrahlten IL-12 sekretierenden Tumorzellen behandelt wurden, wiesen für Therapiepläne, die entweder 7 oder 14 Tage nach dem Tumorangriff begannen, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen oder zu Mäusen, die mit Wildtyp- oder GM-CSF sekretierenden Tumorzellen behandelt wurden, eine signifikant bessere tumorfreie Langzeitüberlebensrate auf (7A und 7B, p < 0,05 für alle Vergleiche der Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen). Wenn die Immuntherapie 7 Tage nach der Tumortransplantation begonnen wurde, war der Überlebensvorteil von Mäusen, die mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen behandelt wurden, zum großen Teil auf die Verhütung der Entwicklung von Spättumoren zurückzuführen (7C, p < 0,05 für alle Vergleiche nach dem Log-Rangtest). Wenn die Immuntherapie 14 Tage nach der Tumortransplantation begann, war der Überlebensvorteil zum großen Teil auf die Regression etablierter Tumoren zurückzuführen (7C, 7D und 8, p < 0,005 im Vergleich zu Mäusen, die eine Immuntherapie mit Wildtyp- oder GM-CSF sekretierenden Tumorzellen erhielten). Die tastbaren Tumoren, die in Mäusen regredierten, die eine Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen erhielten, hatten einen mittleren Durchmesser im Bereich von 1 bis 8,5 mm und wurden 20–43 Tage (Medianwert 30 Tage) nach der Tumortransplantation nicht tastbar. Die Anzahl der Tiere pro Gruppe betrug jeweils: 7A und 7B, 137, 40, 40, 38: und 7C und 7D, 18, 39, 40, 40. Angegebene p-Werte gelten für die niedrigstwertige Differenz zwischen Behandlung mit IL-12 sekretierenden Zellen und anderen Gruppen. Um die Gesamtwirkung zu ermitteln, wurden Daten von Gruppen gepoolt, die ähnliche Immuntherapiezellen nach verschiedenen Zeitplänen erhielten.
Untergruppen-Analysen von Therapien, die am Tag 14 begannen, ließen darauf schließen, daß bessere Überlebensraten nach Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen aus Therapieplänen mit mehr als einer wöchentlichen Immuntherapiedosis (p = 0,1) und Dosen von 5 × 10⁶ statt 1 × 10⁶ IL-12 sekretierenden Zellen (p < 0,02) resultierten. Daher beinhalteten in allen nachfolgenden Experimenten mit Einsatz von transduzierten Tumorzellen die Immuntherapieregime die höhere Zelldosis, die 4 Wochen lang wöchentlich verabreicht wurde.
STATISTISCHE ANALYSEN
Alle Analysen wurden mit der Absicht durchgeführt, zum Zeitpunkt der zufälligen Verteilung von Mäusen in Gruppen zu behandeln. Deskriptive Statistiken wurden für die Hauptendpunkte berechnet. Wo nicht anders angegeben, wurden Differenzen im Überlebensendpunkt nach dem Wilcoxon-Rangsummentest beurteilt. Für Überlebensanalysen wurden gelegentliche Todesfälle nach Anästhesie und Behandlung als zensierte Ereignisse behandelt. Der Chi-Quadrat-Test wurde zur Messung der Assoziation kategorischer Variabler benutzt. Wo p-Werte die Vergleiche zwischen mehreren Gruppen zusammenfassen, ist nur der größte p-Wert angegeben. Analysen wurden mit JMP-Sofware auf einem Power Macintosh 6100/60-Computer durchgeführt.
BEISPIEL 7. UNTERSUCHUNG VON MECHANISMEN DER IL-12-TUMORREGRESSION UND VERBESSERTER ÜBERLEBENSRATE
Um zu ermitteln, ob die Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen gegen größere Tumorbelastungen wirksam war, wurden Tumoren mit 4 × 10⁵ Tumorzellen etabliert, die im Vergleich zu 2 × 10⁵ Zellen zu höherem Tumorbefall (Tastbarkeitsraten am Tag 14 von 98/100 bzw. 83/100), größerer mittlerer Tumorgröße (Durchmesser 6,7 ± 3,0 bzw. 3,7 ± 2,4 am Tag 14) und kürzerer mittlerer Überlebenszeit ohne Behandlung (31 gegenüber 37 Tage) führten. Nach Etablierung dieser größeren Tumoren überlebten 70% (7/10) der tumortragenden Mäuse mit Immuntherapie durch IL-12 sekretierende Tumorzellen vom Tag 14 an mit vollständiger Tumorregression, verglichen mit 0/10 Mäusen, die mit Wildtyp-Tumorzellen behandelt wurden (p ≤ 0,001).
Die systemische (intraperitoneale) Verabreichung von IL-12 an Mäuse mit Tumoren, die durch 2 × 10⁵ CMS-5-Zellen initiiert wurden, führte auch zur Regression von etablierten Tumoren (9) und verbesserte die Überlebensrate (4/5 nach 90 Tagen für Mäuse, die mit 0,1 μg/Tag behandelt wurden, verglichen mit 0/5 für placebobehandelte Mäuse). Für Mäuse mit Tumoren, die sich aus 2 × 10⁵ CMS-5-Zellen etablierten, war eine IL-12-Dosis von 0,1 μg/Tag (Überlebensrate 4/5) besser als 1 μg/Tag (Überlebensrate 3/5), 0,01 μg/Tag (Überlebensrate 1/5) und 0,001 μg/Tag für Regime, die entweder 7 oder 14 Tage nach der Tumortransplantation begannen.
Es war daher möglich, daß die Regression von Tumoren in Mäusen, die eine Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Zellen erhielten, nicht von der lokalen Freisetzung von IL-12 am Ort der bestrahlten, als Immuntherapie verabreichten Tumorzellen abhängig war, sondern vielmehr von einer systemischen Wirkung von IL-12. Dies wurde durch Vergleich unterschiedlicher Zeitpläne beurteilt, die am Tag 14 begannen und Immuntherapie mit entweder Wildtyp- oder IL-12 sekretierenden Zellen und systemische Therapie mit entweder IL-12, Placebo oder nichts kombinierten. Bei Mäusen mit Tumoren, die durch 2 × 10⁵ CMS-5-Zellen initiiert wurden, gab es eine Tendenz zu besseren mittleren und Gesamtüberlebensraten für Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Zellen als für systemische IL-12-Therapie (10A). Diese Tendenz war statistisch signifikant für Mäuse mit Tumoren, die durch 4 × 10⁵ Zellen initiiert wurden (10B, p = 0,006 im Vergleich von Gruppen, die eine systemische IL-12-Therapie (entweder allein oder in Kombination mit Wildtyp-Zellen) erhielten, mit Mäusen, die eine Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Zellen erhielten (entweder allein oder zusammen mit systemischer Therapie mit Verdünnungsmittel)). Vergleiche von kleineren, einheitlich behandelten Gruppen (n = 10/Gruppe, Tumoren initiiert durch 4 × 10⁵ Zellen) zeigten, daß eine Kombination der Verabreichung von Wildtyp-Zellen mit systemischem IL-12 sich nicht von systemischer IL-12-Therapie allein (p = 0,85) unterschied und anscheinend schlechter war als die Impfung mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen allein (p = 0,04) oder zusammen mit systemischer Placebo-Therapie (p = 0,19).
BEISPIEL 8. ANTITUMORWIRKUNG VON IL-12-FUSIONSPROTEIN
In dem bereits vorhandenen CMS-5-Tumormodell war die Immuntherapie mit CMS-5-Tumorzellen, die das IL-12-Fusionsprotein SFG.IL-12.p40.linker. Δp35 exprimieren, ebenso wirksam wie die Therapie mit Tumorzellen, die natives IL-12 erzeugen (11A und 11B). Für Mäuse mit Tumoren, die entweder durch 2 × 10⁵ oder durch 4 × 10⁵ CMS-5-Zellen initiiert wurden, war die Überlebensrate größer als 90% für Gruppen von Mäusen, die mit CMS-5-Zellen behandelt wurden, welche die eine oder die andere Form von IL-12 sekretieren, im Vergleich zu weniger als 40% für Mäuse, die keine Behandlung oder Behandlung mit Wildtyp- oder GM-CSF sekretierenden Zellen erhielten (p ≤ 0,02).
BEISPIEL 9. VERGLEICH DER IMMUNTHERAPIE VON ETABLIERTEN NICHTIMMUNOGENEN B16-TUMOREN MIT GM-CSF SEKRETIERENDEN UND IL-12 SEKRETIERENDEN TUMORZELLEN
Um die Wirksamkeit einer Immuntherapie mit IL-12 sekretierenden Tumorzellen in einem anderen Tumormodell einzuschätzen, wurde das nichtimmunogene B16-Melanom untersucht. B16-Tumorzellen wurden transduziert, um natives IL-12 mit 90 ng/ml/48 h/10⁶ bestrahlte Zellen oder das einkettige IL-12 (SFG.IL-l2.p40.linker. Δp35) mit 170 ng/ml/48 h/10⁶ bestrahlte Zellen herzustellen. B16-Tumoren wurden mit 4 × 10⁵ Zellen initiiert, und die Immuntherapie von etablierten Tumoren begann entweder am Tag 7 (25% Tumortastbarkeit) oder am Tag 14 (93% Tumortastbarkeit, mittlerer Tumordurchmesser 5,74 ± 3,23, n = 56). Dieses Verfahren wurde nach 31 Tagen Nachsorge analysiert, als nur 1/60 (2%) der mit Wildtyp-Zellen, GM-CSF sekretierenden Zellen oder mit nichts als Immuntherapie behandelten Mäuse überlebten. Obwohl mit IL-12 sekretierenden Zellen behandelte Mäuse eine vergleichsweise schlechte Gesamtüberlebenszeit aufwiesen, war ihre mittlere Überlebenszeit im Vergleich zu derjenigen der mit Wildtyp-Zellen behandelten Kontrollmäuse signifikant länger bei Beginn der Behandlung am Tag 7 ( 12A, 24 gegenüber 18 Tagen, p = 0,01) und am Tag 14 (12B, 28 gegenüber 18 Tagen, p = 0,0005). Entsprechend verlängerte sich die mittlere Überlebenszeit bei einer Therapie mit IL-12-Fusionsprotein sekretierenden Tumorzellen bei Beginn der Behandlung am Tag 7 (21 gegenüber 18 Tage, p = 0,08) und am Tag 14 (24 gegenüber 18 Tage, p = 0,006). In 3/4 Szenarien waren IL-12 sekretierende Tumorzellen GM-CSF sekretierenden Zellen überlegen (p-Werte von 0,01, 0,14, 0,003 bzw. 0,02).
In Anbetracht der starken Wirkung von GM-CSF sekretierenden B16-Zellen bei der Auslösung von Antitumor-Immunität, wenn sie als Impfstoff vor dem Tumorangriff eingesetzt wurden, aber ihrer mangelnden Wirkung auf das Tumorwachstum bei Verabreichung nach der Tumoretablierung, wurden die Wirkungen von IL-12 sekretierenden und GM-CSF sekretierenden B16-Zellen als Impfstoffe in einem B16-Tumorangriffsmodell verglichen. Die in einleitenden Untersuchungen verwendeten IL-12 sekretierenden B16-Zellen sekretierten natives IL-12 mit 1–3 ng/ml/48 h/10⁶ bestrahlte Zellen. GM-CSF sekretierende B16-Zellen lösten Antitumor-Immunität aus, wenn sie als Impfstoffe vor der Tumortransplantation verwendet wurden (12C, Überlebensrate 80% nach 100 Tagen).
BEISPIEL 10. IMMUNTHERAPEUTISCHE WIRKUNG VON IL-12-ABGABE DURCH TUMORZELLEN UNTERSCHIEDLICHEN URSPRUNGS VON EINEM ZU BEHANDELNDEN TUMOR
Die Wirkung der Abgabe von IL-12 durch Tumorzellen unterschiedlichen Ursprungs von dem zu behandelnden Tumor auf die Überlebensrate wurde bei Hypernephrom-(RENCA-)Tumoren eingeschätzt. RENCA-Tumoren wurden mit 4 × 10⁵ Zellen initiiert, und die Immuntherapie von etablierten Tumoren begann am Tag 14. In einem Verfahren wurden Gruppen von Mäusen entweder mit bestrahlten Wildtyp-CMS-5-Zellen oder mit CMS-5-Tumorzellen behandelt, die für die Sekretion entweder von nativem IL-12 oder des Fusionsproteins SFG.IL-I2.p40.linker. Δp35 transduziert wurden (13A). In einem anderen Verfahren wurden zusätzliche Gruppen von Mäusen mit einer Kombination von bestrahlten CMS-5- und RENCA-Wildtyp-Zellen, einer Kombination von bestrahlten Wildtyp-CMS-5-Zellen und IL-12 sekretierenden RENCA-Tumorzellen oder einer Kombination von bestrahlten Wildtyp-RENCA-Tumorzellen und IL-12 sekretierenden CMS-5-Tumorzellen behandelt (13B).
In dem ersten Verfahren verlängerte die Immuntherapie sowohl mit CMS-5-Tumorzellen, die natives IL-12 sekretierten, als auch mit dem IL-12-Fusionsprotein die mittlere Überlebenszeit (p-Werte von p = 0,02 bzw. p = 0,06). In dem zweiten Verfahren wiesen Mäuse, die mit einer Kombination von bestrahlten RENCA-Tumorzellen und IL-12 sekretierenden CMS-5-Tumorzellen behandelt wurden, eine Tendenz zu erhöhter Überlebensrate auf.
Außerdem wurden CMS-5-Tumoren mit 4 × 10⁵ Zellen initiiert, und die Immuntherapie etablierter Tumoren begann am Tag 14. In einem Verfahren wurden die etablierten CMS-5-Tumoren entweder mit bestrahlten Wildtyp-RENCA-Tumorzellen oder mit RENCA-Tumorzellen behandelt, die für die Sekretion von nativem IL-12 oder des IL-12-Fusionsproteins SFG.IL-12.p40.linker. Δp35 transduziert wurden (14A). In einem weiteren Verfahren wurden zusätzliche Mäusegruppen mit einer Kombination von bestrahlten CMS-5- und RENCA-Wildtyp-Zellen, einer Kombination von bestrahlten Wildtyp-CMS-5- und IL-12 sekretierenden RENCA-Tumorzellen oder einer Kombination von bestrahlten Wildtyp-RENCA-Tumorzellen und IL-12 sekretierenden CMS-5-Tumorzellen behandelt (14B).
In dem ersten Verfahren bewⁱrkte die Immuntherapie mit RENCA-Zellen, die das IL-12-Fusionsprotein sekretieren, eine mäßige Verlängerung der Überlebenszeit der Mäuse im Vergleich zu Mäusen, die mit Wildtyp-RENCA-Zellen behandelt wurden; die Wirkung stand im Einklang mit der niedrigeren IL-12-Dosis, die durch die transduzierten RENCA-Zellen abgegeben wurde. In dem zweiten Verfahren zeigten sowohl Mäuse, die mit einer Kombination von IL-12 sekretierenden CMS-5-Zellen und Wildtyp-RENCA-Zellen behandelt wurden, als auch Mäuse, die mit einer Kombination von IL-12 sekretierenden CMS-5-Zellen und Wildtyp-RENCA-Zellen behandelt wurden, eine signifikant verlängerte Überlebenszeit (p-Werte von p = 0,004 und p = 0,04) im Vergleich zu Mäusen, die mit Wildtyp-RENCA- und Wildtyp-CMS-5-Zellen behandelt wurden.
ÄQUIVALENTE
Der Fachmann wird viele Äquivalente zu den konkreten Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung erkennen oder mit nicht mehr als Routineversuchen ermitteln können. Derartige Äquivalente sollen im Umfang der nachstehenden Patentansprüche enthalten sein. SEQUENZLISTE

Claims

DNA, die aufweist: eine DNA, die eine IL-12 p35-Untereinheit codiert, eine DNA, die einen Polypeptidlinker codiert, und eine DNA die eine IL-12 p40-Untereinheit codiert, wobei die den Polypeptidlinker codierende DNA zwischen der die IL-12 p35-Untereinheit codierenden DNA und der die IL-12 p40-Untereinheit codierenden DNA positioniert ist, und wobei die Expression der DNA zur Erzeugung eines bioaktiven IL-12-Fusionsproteins führt, das die IL-12 p35-Untereinheit und die IL-12 p40-Untereinheit aufweist, die durch den codierten Polypeptidlinker miteinander verbunden sind.
DNA nach Anspruch 1, wobei die IL-12 p35-Untereinheit und die IL-12 p40-Untereinheit ihren Ursprung im Menschen oder der Maus haben und der Polypeptidlinker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID-Nummern 5–7 besteht.
DNA nach Anspruch 1, die ein bioaktives IL-12-Protein codiert, wobei das bioaktive IL-12-Protein eine native IL-12 p35-Untereinheit und eine native IL-12 p40-Untereinheit aufweist, die durch einen Polypeptidlinker miteinander verbunden sind.
DNA nach Anspruch 3, wobei der Polypeptidlinker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID-Nummern 5–7 besteht.
Bioaktives IL-12-Protein, das eine IL-12 p35-Untereinheit und eine IL-12 p40-Untereinheit aufweist, die durch einen Polypeptidlinker miteinander verbunden sind.
Bioaktives IL-12-Fusionsprotein nach Anspruch 5, das durch die DNA nach Anspruch 1, 2 oder 3 codiert wird.
Bioaktives IL-12-Protein nach Anspruch 5, wobei die IL-12 p35-Untereinheit und die IL-12 p40-Untereinheit ihren Ursprung im Menschen oder der Maus haben und der Polypeptidlinker aus 7 bis 16 Aminosäureresten besteht.
Bioaktives IL-12-Protein nach Anspruch 7, wobei der Polypeptidlinker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID-Nummern 5–7 besteht.
Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 1 aufweist.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, der ein retroviraler Vektor ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, der die retrovirale pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, wie in 3 dargestellt.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, der ein Insert zwischen den Nco1- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p35-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₂-Ser-Linker und die IL-12 p40-Untereinheit.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, der ein Insert zwischen den Nco1- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p40-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker und die IL-12 p35-Untereinheit.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, der ein Insert zwischen den Nco1- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p35-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker und die IL-12 p40-Untereinheit, in der die ersten 22 Aminosäuren gestrichen sind.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, der ein Insert zwischen den Nco1- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Peptide codiert: die IL-12 p40-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker und die IL-12 p35-Untereinheit, in der die ersten 22 Aminosäuren gestrichen sind.
Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven IL-12-Proteins, das die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen eines Expressionsvektors mit einer DNA, die eine IL-12 p35-Untereinheit codiert, einer DNA, die einen Polypeptidlinker codiert, und einer DNA, die eine IL-12 p40-Untereinheit codiert, wobei die den Polypeptidlinker codierende DNA zwischen der die native IL-12 p35-Untereinheit codierenden DNA und der die native IL-12 p40-Untereinheit codierenden DNA positioniert ist; b) Einbringen des Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle; und c) Halten der aus Schritt (b) entstehenden Wirtszelle unter Bedingungen, die sich für eine Expression der in dem Expressionsvektor vorhandenen DNA eignen, wodurch ein bioaktives IL-12-Protein erzeugt wird, in dem die zwei Untereinheiten durch den Polypeptidlinker verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die IL-12 p35-Untereinheit und die IL-12 p40-Untereinheit ihren Ursprung im Menschen oder der Maus haben und der Polypeptidlinker aus 7 bis 16 Aminosäureresten besteht.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Polypeptidlinker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID-Nummern 5–7 besteht.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Expressionsvektor ein retroviraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Expressionsvektor die retrovirale pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, wie in 3 dargestellt.
Verfahren nach Anspruch 20, das ein Insert zwischen den NcoI- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p35-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₂-Ser-Linker; und die IL-12 p40-Untereinheit.
Verfahren nach Anspruch 20, das ein Insert zwischen den NcoI- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p40-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker; und die IL-12 p35-Untereinheit.
Verfahren nach Anspruch 20, das ein Insert zwischen den NcoI- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Polypeptide codiert: die IL-12 p35-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker; und die IL-12 p40-Untereinheit, in der die ersten 22 Aminosäuren gestrichen sind.
Verfahren nach Anspruch 20, das ein Insert zwischen den NcoI- und BamH1-Restriktionsenzymschnittstellen der retroviralen pUC19-SFG-Hauptkette aufweist, das die folgenden Peptide codiert: die IL-12 p40-Untereinheit; einen (Gly₄Ser)₃-Linker; und die IL-12 p35-Untereinheit, in der die ersten 22 Aminosäuren gestrichen sind.