DE60025832T2

DE60025832T2 - Mehrere zytokin-antikörper komplexen

Info

Publication number: DE60025832T2
Application number: DE60025832T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen Carlisle GILLIES; Ming Kin Lexington LO
Original assignee: EMD Serono Research Center Inc
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2020-08-10
Also published as: CA2380331A1; MXPA02001417A; SK1842002A3; AU778611B2; KR100827757B1; US7582288B2; NO20020641L; NO20020641D0; CN1235911C; AU6626800A; ATE316982T1; US20070258944A1; BR0013231A; HUP0202442A2; PL353348A1; ZA200200789B; CA2380331C; ES2256027T3; JP4793971B2; DE60025832D1

Description

Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht den Nutzen der U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 60/147,924, eingereicht am 9. August 1999, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Konstruktion und Expression von Mehrfach-Cytokin-Proteinkomplexen und ihre Zusammensetzungen. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Fusionsproteine, die aus mehreren Cytokinen und einer Zielsteuerungskomponenten bestehen, und deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen, wie Krebs und Virusinfektion.
Hintergrund der Erfindung
Die regulatorischen Netzwerke, die das Immunsystem steuern, beruhen auf sekretierten Protein-Signalmolekülen, die als Cytokine bezeichnet werden, zum An- und Abschalten der Funktionen von Immunzellen sowie zur Regulation ihrer Proliferation. An diesen Reaktionen sind gewöhnlich mehrere Cytokine beteiligt, die zusammenwirken, um die gewünschte biologische Wirkung zu erzielen. Bestimmte Cytokine, wie Interleukin-2 (IL-2), können selbst die Immunzellproliferation induzieren und andere Funktionen aktivieren, einschließlich der Sekretion sekundärer Cytokine. Ein anderes Cytokin, Interleukin-12 (IL-12) [Übersicht von Trinchieri, 1994, Blood 84:4008–4027], können die Proliferation bestimmter Immunzellen sowie einen weiteren wichtigen Immunmodulator, Interferon-γ (IFN-γ), induzieren. Diese Induktion von IFN-γ ist eine Schlüsselaktivität von IL-12, obwohl IL-12 andere wichtige Aktivitäten aufweist, die IFN-γ-unabhängig sind. Weil IL-12 selbst bei Infektionserkrankungssituationen auf einem frühen Stadium induziert wird, wird angenommen, dass es das angeborene und das erworbene Immunsystem miteinander verbindet.
Viele In-vitro-Studien sowohl an Mäuse- als auch an humanen Immunzellen haben die Bedeutung von Cytokinkombinationen bei der Entwicklung optimaler Immunantworten gezeigt. Zum Beispiel exprimieren die meisten T-Zellen keine IL-12-Rezeptoren (IL-12R), bis sie mit Mitogenen aktiviert oder in hohen Konzentrationen von IL-2 gezüchtet worden sind [Desai et al. (1992), J. Immunol. 148: 3125–3132]. Wenn die Rezeptoren exprimiert werden, werden die Zellen viel reaktiver gegenüber IL-12. Ferner induziert IL-12 die IFN-γ-Transkription, aber die IFN-γ-mRNA wird kurz darauf abgebaut. In Gegenwart von IL-2 wird die mRNA stabilisiert, was zu einer drastischen Zunahme in der produzierten IFN-γ-Menge führt [Chan et al. (1992) J. Immunol. 148:92–98]. In anderen Studien wurde gefunden, dass die Cytokinkombinationen IL-3 plus IL-11 oder IL-3 plus Steel-Faktor eine synergistische Wirkung mit IL-12 auf die Proliferation früher hämatopoetischer Vorläuferzellen haben [Trinchieri, 1994; s.o.]. Die Kombination von Interleukin-4 und GM-CSF ist besonders geeignet zur Stimulation dendritischer Zellen (Palucka et al. [1998] J. Immunology 160:4587–4595). Zur Stimulation der zellvermittelten Immunantwort ist es ebenfalls nützlich, IL-12 mit IL-18, einem vor kurzem entdeckten Th1-fördernden Cytokin mit gewissen Aktivitäten, die komplementär zu IL-12 sind (Hashimoto et al. [1999] J. Immunology 163:583–589; Barbulescu et al. [1998] J. Immunology 160:3642–3647), zu kombinieren. Ferner sind IL-2 und Interferon-γ unter bestimmten Umständen synergistisch [Palladino, M. A., U.S.-Patent Nr. 5,082,658].
In vielen dieser Synergiestudien wurde gefunden, dass der relative Spiegel jedes Cytokins sehr wichtig war. Während die Zugabe von IL-12 in Gegenwart subptimaler Mengen an IL-2 zu einer Synergie bei der Induktion von Proliferation, cytolytischer Aktivität und IFN-γ-Induktion führte, wurde gefunden, dass Kombinationen von IL-2 und IL-12 unter Verwendung einer hohen Dosis eines Cytokins antagonistisch waren [Perussia et al., J. Immunol. 149:3495–3502 (1992); Mehrotra et al., J. Immunol. 151:2444–2452 (1993)]. Eine ähnliche Situation besteht auch bei Kombinationen von IL-12 und IL-7.
Synergiestudien zwischen IL-12 und anderen Cytokinen zur Erzeugung von Anti-Tumor-Antworten bei Mäusen haben ebenfalls gemischte Ergebnisse geliefert. In einigen Modellen wurde eine Synergie bei suboptimalen Dosen von jedem Cytokin beobachtet, und höhere Dosen führten zu verstärkter Toxizität, während in anderen Modellen Kombinationen von IL-12 und IL-2 wenig oder keine Synergie zeigten [siehe beispielsweise Nastala et al., J. Immunol. 153:1697–1706 (1994)]. Diese Ergebnisse können die inhärente Schwierigkeit, zwei potenziell synergistische Substanzen in vivo zu kombinieren, widerspiegeln, insbesondere wenn es notwendig ist, ein festes Verhältnis von Aktivitäten von zwei Mitteln mit unterschiedlichen pharmakologischen Eigenschaften, wie unterschiedlicher Zirkulationshalbwertszeit und biologischer Verteilung, aufrechtzuerhalten.
Bei In-vitro-Zellkulturexperimenten ist es einfach, die Cytokinspiegel zu kontrollieren, aber viele Faktoren können die relative biologische Verteilung und Lokalisierung von Cytokinen in vivo beeinflussen und somit ihre immunstimulatorische Fähigkeit beeinflussen. Der wichtigste dieser Faktoren ist die Halbwertszeit. Die Halbwertszeit von IL-2 im Kreislauf nach einer Bolusinjektion beträgt etwa 10 Minuten. In auffälligem Kontrast zu diesen pharmakokinetischen Eigenschaften wurde die Zirkulationshalbwertszeit von IL-12 als > 3 Std. in Mäusen [Wysocka et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:672] und als 5–10 Std. in Menschen beschrieben [Lotze et al. (1996) Ann NY Acad Sci 795:440–454].
Es wird angenommen, dass dieser Unterschied auf die relativ geringen Größen von sowohl IL-2 als auch GM-CSF (15–25 kD gegenüber 75 kD für IL-12) zurückzuführen ist, wodurch IL-2 und GM-CSF mittels Nierenfiltration ausgeschieden werden können. Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 50 kD werden mittels Nierenfiltration ausgeschieden. Fast alle Cytokine sind kleiner als 50 kD und unterliegen einer ähnlichen, schnellen Ausscheidung mittels Nierenfiltration. Wenn eine Behandlung mit zwei dieser kleinen, schnell ausgeschiedenen Cytokine gewünscht ist, ist es ausreichend, die Cytokine einfach gemeinsam zu verabreichen. Eine gemeinsame Verabreichung ist jedoch nicht optimal bei Cytokinen mit signifikant unterschiedlichen Halbwertszeiten.
Die systemische Verabreichung von Cytokinen ist aufgrund ihrer schädlichen Nebenwirkungen schwierig. Zum Beispiel führen hohe Spiegel an Inerferon-alpha zu signifikanten Nebenwirkungen, einschließlich Haut-, neurologischen, Immun- und endokrinen Toxizitäten. Es wird erwartet, dass Mehrfach-Cytokin-Fusionen besonders schwere Nebenwirkungen zeigen könnten.
Um die Nebenwirkungen der systemischen Verabreichung von Cytokinen zu verringern, ist eine Strategie die Fusion eines Cytokins mit einem zweiten Molekül mit Zielsteuerungsfähigkeit. Fusionen, in denen eine Fc-Region an den N-Terminus eines anderen Proteins platziert wird, (als "Immunfusionen" oder "Fc-X"-Fusionen bezeichnet, wobei X ein Ligand, wie Interferon-alpha, ist) haben eine Reihe einzigartiger, vorteilhafter biologischer Eigenschaften [Lo et al., U.S.-Patente Nr. 5,726,044 und 5,541,087; Lo et al., Protein Engineering 11:495]. Insbesondere können solche Fusionsproteine immer noch an die relevanten Fc-Rezeptoren auf Zelloberflächen binden. Wenn jedoch der Ligand an seinen Rezeptor auf einer Zelloberfläche bindet, wird die Orientierung der Fc-Region verändert, und die Sequenzen, die eine antikörperabhängige zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC) und eine Komplementfixierung vermitteln, scheinen verborgen zu sein. Dadurch vermittelt die Fc-Region in einem Fc-X-Molekül nicht effizient eine ADCC oder eine Komplementfixierung. Die cytotoxische Wirkung aufgrund der Fusion eines N-terminalen Cytokins und einer C-terminalen Fc-Region ist bekannt. Zum Beispiel erzeugt eine Fusion von IL-2 an den N-Terminus einer Fc-Region ein Molekül, das in der Lage ist, an Zellen zu binden, die den IL-2-Rezeptor tragen, Komplement zu fixieren und als Folge dessen die Zellen zu lysieren [Landolfi, N. F. (1993) U.S.-Patent Nr. 5,349,053]. Dagegen haben Fc-IL-2-Fusionsproteine diese Eigenschaft nicht. Somit wird erwartet, dass Fc-X-Fusionen die Vorteile einer erhöhten Serum-Halbwertszeit und einer relativen Konzentration in der Leber ohne die schädlichen Wirkungen von ADCC und Komplementfixierung haben.
Es wurde gezeigt, dass viele verschiedene Proteine mit kurzen Serum-Halbwertszeiten an eine Fc-Region in einer Fc-X-Konfiguration fusioniert werden können und die so erhaltenen Fusionen viel längere Serum-Halbwertszeiten haben. Die Serum-Halbwertszeiten von zwei verschiedenen Fc-Fusionen sind jedoch gewöhnlich nicht identisch. Wenn eine Zufuhr von zwei verschiedenen X-Einheiten gewünscht ist, ist somit eine gemeinsame Verabreichung von zwei verschiedenen Fc-X-Proteinen gewöhnlich nicht optimal.
Unter gewissen Umständen ist es ein besserer Ansatz, die Wirkung des Cytokins an ein Zelloberflächenantigen zu steuern, indem es mit einem Antikörper (oder einem davon stammenden Fragment) mit Spezifität und Affinität für das Antigen fusioniert wird (Gillies, U.S.-Patent Nr. 5,650,150; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428) oder indem ein Proteinantigen und ein stimulatorisches Cytokin über eine Peptidverknüpfung in Form eines Fusionsproteins verbunden werden (Hazama et al., Vaccine 11: 629). Ein Antikörper-IL-12-Fusionsprotein ist aus Gillies et al. (J. Immunol., 1998, 160, 6195) bekannt. Während Antikörper selbst die Halbwertszeit eines fusionierten Cytokins erhöhen können, gibt es dennoch Unterschiede zwischen verschiedenen Cytokinfusionen mit dem gleichen Antikörper [siehe beispielsweise Gillies et al., Bioconjugate Chem. 4:230–235 (1993); Gillies et al., J. Immunol. 160:6195–6203], die eine Colokalisierung an einer Zielstelle schwierig machen. Wie oben erläutert, könnte dies zu einem Ungleichgewicht in den Cytokinaktivitäten führen und die gewünschten synergistischen Wirkungen verringern. Zusätzlich erfordert die Verwendung von zwei verschiedenen Fusionsproteinen das Testen jeder Fusion getrennt hinsichtlich ihres Sicherheits- und Wirksamkeitsprofil und dann das weitere Testen als Gemische.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Komplexe oder Fusionen zwischen zwei oder mehreren verschiedenen Cytokinen bereit, die sich für die allgemeine als auch die zielgerichtete Immuntherapie eignen. Diese Komplexe oder Fusionen beinhalten gegebenenfalls andere Proteineinheiten. Ein Merkmal solcher Komplexe oder Fusionen ist, dass sie die Aktivitäten der Komponenten-Cytokine in einem festen Verhältnis bereitstellen.
Allgemein betrifft die Erfindung einen Proteinkomplex, der mindestens zwei verschiedene Cytokine enthält. Die Cytokine können in der gleichen Polypeptidkette sein oder durch eine kovalente Bindung, wie eine Disulfidbindungen oder eine durch chemische Vernetzung hergestellte Bindung, verbunden sein. Alternativ können sich die Cytokine in einer stabilen, nicht-kovalenten Verbindung befinden. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Proteinkomplex eine Zielsteuerungseinheit, wie einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, die der Komplex an einen Locus in einem Säuger steuert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Proteinkomplex bereit, der die biologische Aktivität eines zweikettigen Cytokins, wie IL-12, mit derjenigen eines zweiten Cytokins kombiniert. Die Cytokine können kovalent aneinander gebunden (z.B. fusioniert) sein. Die Cytokine können aus über andere Einheiten assoziiert sein. Zum Beispiel kann die Polypeptidkette, die das zweite Cytokin enthält, eine Bindungseinheit enthalten, die spezifisch IL-12 bindet, wie einen Antikörper gegen IL-12 oder einen Rezeptor für IL-12. Alternativ kann die Bindungseinheit mit einer zweiten Einheit wechselwirken, die mit IL-12 assoziiert ist. Wenn zum Beispiel eine Polypeptidkette, die eine Untereinheit von IL-12 kodiert, auch Avidin enthält, kann das Polypeptid, das das zweite Cytokin enthält, auch Biotin als Zielsteuerungseinheit umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Cytokin IL-2.
Die Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen von IL-12 bereit, die sowohl IL-12-Aktivität als auch diejenige des zweiten Cytokins beibehalten, während sie ein länger andauerndes, einzelnes pharmakokinetisches Verhalten ähnlich demjenigen von IL-12 selbst bereitstellen, was die Dauer der Aktivität des zweiten Cytokins erhöht und das Gleichgewicht der Aktivitäten der zwei Cytokine nach Injektion in ein Tier aufrechterhält.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die Fusionsproteine eine heterodimere Form von IL-12, in der die p35- und p40-Untereinheiten von IL-12 durch eine Disulfidbindung verbunden und entweder am Amino- oder Carboxyterminus der p35- oder p40-Untereinheit von IL-12 kovalent an ein zweites Cytokin gebunden sind, mit der allgemeinen Formel IL-12-X oder X-IL-12, wobei. X ein zweites Cytokin ist.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die Fusionsproteine ein zweites Cytokin, das entweder am Amino- oder am Carboxyterminus an eine einkettige (sc-) Form von IL-12, die die beiden Polypeptiduntereinheiten über einen flexiblen Peptidlinker verknüpft umfasst, gebunden ist, mit der allgemeinen Formel scIL-12-X oder X-scIL-12.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind ferner zwei Cytokine mit einem Protein, das eine dimere oder multimere Struktur bilden kann, entweder am Amino- oder am Carboxyterminus dieser Proteinkette fusioniert. Bei einer bevorzugten Form dieser Ausführungsform ist eine der Fusionsproteinformen von IL-12 mit einem zweiten Cytokin weiter an einen Teil einer Immunglobulin- (Ig-) Kette, wie beispielsweise die Fc-Region, fusioniert, die zur Dimerisierung in der Lage ist. Weitere Ausführungsformen umfassen eine Fusion mindestens einer Polypeptidkette von IL-12 an einen Terminus eines Teils einer Ig-Kette und eines zweiten Cytokins, das an den anderen Terminus fusioniert ist.
Bei einer anderen Ausführungsform sind zwei oder mehrere Cytokine an ein Protein mit Zielsteuerungsfähigkeit aufgrund der Bindung an einen spezifischen Rezeptor fusioniert. Zum Beispiel ist eine Fc-Region in der Lage, an Fc-Rezeptoren zu binden, die in der Leber häufig vorkommen. Fusionen einer Fc-Region mit mehreren Cytokinen veranschaulichen die Vorteile von sowohl Dimerisierung als auch Zielsteuerung, aber unter gewissen Umständen ist es geeignet, Fusionen von mehreren Cytokinen zu konstruieren, die nur Multimerisierungs- oder Zielsteuerungsfähigkeit, aber nicht beide Fähigkeiten haben.
Bei noch einer anderen Ausführungsform wird ein Fusionsprotein, das mehrere Cytokine umfasst, weiter an entweder den Amino- oder den Carboxyterminus eines Mitglieds einer Klasse von Molekülen mit verschiedenartiger Zielsteuerungsfähigkeit, wie eines Antikörpers oder eines Peptid-Aptamers mit oder ohne ein Grundgerüst (Colas et al. [1998] Proc Natl Acad Sci USA 95:14272–7), fusioniert. Eine besondere Ausführungsform ist die Fusion mehrerer Cytokine an mindestens einen Teil eines Antikörpers, der ein Antigen binden kann, wie einen intakten Antikörper, einen einkettigen Antikörper oder eine einkettige Fv-Region. Weitere Ausführungsformen beinhalten Fusionen mindestens einer Polypeptidkette von IL-12 an einen Terminus mindestens eines Teils einer Antikörperkette, der ein Antigen binden kann, und eines zweiten Cytokins, das an den anderen Terminus fusioniert ist.
Den vorstehenden Beschreibungen zufolge ist es gewöhnlich bevorzugt, Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen und Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsproteine mittels Gentechnologie zu konstruieren, so dass die Komponentenproteine durch kovalente Bindungen, wie Amidbindungen oder Disulfidbindungen, verknüpft sind. Es ist jedoch ebenfalls geeignet, chemische Vernetzer für die Konstruktion solcher Proteinkomplexe zu verwenden. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet der Proteinchemie gut etabliert. Alternativ ist es manchmal ausreichend, Proteinkomplexe durch Fusionieren verschiedener Cytokine mit Partnerproteinen, die stabile nicht-kovalente Komplexe bilden, zu erzeugen. Zum Beispiel wird ein nicht-kovalentes Heterodimer-Trägerprotein verwendet: Ein erstes Cytokin wird an eine Untereinheit des Heterodimers fusioniert, ein zweites Cytokin wird an eine zweite Untereinheit des Heterodimers fusioniert, und die beiden Fusionsproteine werden unter geeigneten Bedingungen gemischt. Zum Beispiel werden Nucleinsäuren, die die Zwei-Untereinheiten-Cytokin-Fusionsproteine kodieren, in der gleichen Zelle exprimiert. Auf diese Weise kann ein Proteinkomplex mit mehreren Cytokinen konstruiert werden, in dem die Komponenten-Cytokine direkt oder indirekt nicht-kovalent verknüpft sind. Um das Ziel der Erfindung zu erreichen, ist es notwendig, dass ein solcher Komplex stabil genug ist, dass er nach Verabreichung an ein Tier aufrechterhalten wird und eine biologische Wirkung erzielt.
Die Erfindung stellt auch Nucleinsäuren bereit, die Fusionsproteine kodieren, die zwei oder mehrere Cytokine umfassen, wobei eines der Cytokine vorzugsweise IL-12 ist und das von der Nucleinsäure kodierte Fusionsprotein gegebenenfalls andere Proteineinheiten beinhaltet. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen Nucleinsäuren, die Fusionen von zwei oder mehreren Cytokinen an ein dimerisierendes Protein, wie einen Fc-Teil einer Antikörperkette, kodieren. Ein weiterer Satz bevorzugter Ausführungsformen sind Nucleinsäuren, die Fusionen von zwei oder mehreren Cytokinen an ein Protein mit Zielsteuerungsfähigkeit, wie einen Antikörper, kodieren.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Konstruktion von Fusionen von zwei oder mehreren Cytokinen sowie Verfahren zur Expression solcher Fusionsproteine bereit.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung multifunktioneller Cytokin-Antikörper-Fusionsproteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen und anderen medizinischen Zuständen bereit, wobei die Behandlung die geeignete Kombination der Aktivität von zwei oder mehreren Proteine beinhaltet. Bei einer Ausführungsform hat mindestens eines der Proteine eine kurze (z.B. weniger als 20 Minuten) oder nur mäßig lange (z.B. weniger als 40 Minuten) Serum-Halbwertszeit. Die Proteine werden mittels Gentechnologie oder anderen Techniken fusioniert und einem Menschen oder Tier verabreicht. Auf diese Weise liegen die Aktivitäten der zwei Proteine in einem festen Verhältnis vor, und getrennte Verabreichungen mit unterschiedlichen Dosierungsschemata der zwei Proteine sind nicht erforderlich. Zusätzlich ist die Serum-Halbwertszeit des Fusionsproteins gewöhnlich ähnlicher derjenigen der Proteinkomponente mit der längeren Serum-Halbwertszeit, wodurch sich die wirksame Halbwertszeit des Proteins oder der Proteine mit der kürzeren Serum-Halbwertszeit verlängert.
Genauer gesagt, stellt die Erfindung multifunktionelle Cytokin-Antikörper-Fusionsproteine für die Verwendung bei der immuntherapeutischen Behandlung von Erkrankungen, wie Krebs oder Infektionen oder anderen Erkrankungen, die geeigneterweise mit einem zweikettigen Cytokin, wie IL-12, in Kombination mit einem zweiten Cytokin behandelt werden können, bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird IL-12 mit IL-2 oder GM-CSF fusioniert und einem Tier oder Menschen verabreicht. Solche Behandlungen können in Kombination mit anderen Krankheitsbehandlungen verwendet werden. Außerdem stellt die Erfindung Verwendungen zur Impfung gegen verschiedenartige Antigene bereit, die zur Verhinderung oder Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden kann.
Bei anderen Ausführungsformen dieser Verfahren werden zwei verschiedene Cytokine mit einer dimeren Proteineinheit, wie der Fc-Region eines Antikörpers, fusioniert und einem Tier oder Menschen verabreicht. Bei einer bevorzugten Form dieser Verfahren wird das Cytokin IL-12 zusammen mit einem zweiten Cytokin, das stärker bevorzugt IL-2 oder GM-CSF ist, an die Fc-Region fusioniert.
Bei noch anderen Ausführungsformen dieser Verfahren werden zwei verschiedene Cytokine an einen intakten Antikörper fusioniert und einem Tier oder Menschen verabreicht. Bei einer bevorzugten Form dieser Verfahren wird das Cytokin IL-12 an die Antikörpereinheit zusammen mit einem zweiten Cytokin fusioniert, das stärker bevorzugt IL-2 oder GM-CSF ist. Die Erfindung offenbart auch Gemische von Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen, die sich zur Behandlung von Erkrankungen eignen. Bei einer Ausführungsform wird ein Gemisch von einem Antikörper-IL-2-Fusionsprotein und einem Antikörper-IL-12-Fusionsprotein zur Behandlung einer Erkrankung verwendet. Es werden zum Beispiel Krebs, Virusinfektion oder bakterielle Infektion behandelt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorstehenden und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung und ihre verschiedenen Merkmale können aus den folgenden Beschreibungen, wenn sie zusammen mit den beigefügten Zeichnungen gelesen werden, besser verstanden werden. In allen Zeichnungen bezeichnen gleiche Zahlen gleiche Strukturen.
1A veranschaulicht schematisch die Fusion von zwei Cytokinen in ihrer einfachsten Form: Ein Cytokin ist, gegebenenfalls über einen Linker, an ein zweites Cytokin fusioniert. Die 1B–1I zeigen verschiedene Weisen, auf die ein zweites Cytokin (mit "cyt" bezeichnet) an das heterodimere Cytokin IL-12 gebunden werden kann. Genauer gesagt, kann das zweite Cytokin an den C-Terminus von p40 (1B), den N-Terminus von p40 (1C), den C-Terminus von p35 (1D) oder den N-Terminus von p35 (1E) fusioniert werden. Ferner zeigt 1, wie ein zweites Cytokin an eine einkettige Version von IL-12 fusioniert werden kann. Genauer gesagt, können einkettige IL-12-Moleküle p35 N-terminal von p40 aufweisen, wobei sich das zweite Cytokin am C-Terminus (1F) oder am N-Terminus (1G) befindet. Alternativ können einkettige IL-12-Moleküle p40 N-terminal von p35 aufweisen, wobei sich das zweite Cytokin am C-Terminus (1H)-oder am N-Terminus (1I) befindet.
Die 2A–2C zeigen schematisch, wie die in 1 dargestellten Mehrfach-Cytokin-Fusionen (im Kasten) weiter an eine Fc-Region eines Antikörpers, hier als Hinge (H), eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne (Ovale) dargestellt, fusioniert werden können. Genauer gesagt, kann jedes der acht Moleküle der 1 entweder an den C-Terminus (2A) oder den N-Terminus (2B) der Fc-Region fusioniert werden. Außerdem müssen das erste Cytokin und das zweite Cytokin (jeweils im Kasten) nicht direkt aneinander gebunden sein, sondern können durch die Fc-Einheit verbunden werden (2C).
Die 3A–3G zeigen schematisch eine Untergruppe der Weisen, auf die ein Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein weiter an ein intaktes Immunglobulin, wie ein IgG, fusioniert werden kann. Die V-Region der schweren Kette ist als ein mit V_H bezeichnetes Oval dargestellt, die V-Region der leichten Kette ist als ein mit V_L bezeichnetes Oval gezeigt, und die konstanten Regionen sind leere Ovale. Eine Mehrfach-Cytokin-Fusion, wie in 1 dargestellt, kann an den C-Terminus der schweren Kette (2A), den N-Terminus der schweren Kette (2B), den N-Terminus der leichten Kette (2C) oder den C-Terminus der leichten Kette gestellt werden (2D). Zusätzlich gibt es viele Weisen, auf die ein erstes und ein zweites Cytokin getrennt an die N- und C-Termini der schweren und leichten Ketten gebunden werden könnten; drei von diesen sind in den 3E–3G gezeigt.
Die 4A–4C zeigen schematisch, wie ein erstes Cytokin und ein zweites Cytokin an einen "einkettigen" Antikörper fusioniert werden können, in dem die variable leichte und die variable schwere Kette fusioniert sind, und das Protein als ein einziges Polypeptid exprimiert wird, das dann homodimerisiert. Genauer gesagt, kann eine Mehrfach-Cytokin-Fusion an den C-Terminus (4A) oder den N-Terminus (4B) platziert werden. Außerdem müssen das erste Cytokin und das zweite Cytokin nicht direkt gebunden sein, sondern können durch die einkettige Antikörpereinheit verbunden sein (4C).
Die 5A–5C zeigen schematisch, wie ein erstes Cytokin und ein zweites Cytokin an eine einkettige Fv-Region fusioniert werden können, die aus den fusionierten variablen Regionen aus einer schweren Kette und einer leichten Kette bestehen. Genauer gesagt, kann eine erste Cytokin-Cytokin-Fusion an den C-Terminus (5A) oder den N-Terminus (5B) gestellt werden. Außerdem müssen das erste Cytokin und das zweite Cytokin nicht direkt gebunden sein, sondern können durch die einkettige Fv-Einheit verbunden sein (5C).
Die 6A and 6B zeigen die Synergie zwischen IL-12 und IL-2 bei der Indution von IFN-γ durch menschliche mononucleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) als Antwort auf die getrennten Cytokine oder Fusionsproteine. In 6A wurden die Zellen mit Human-IL-12 vor (Quadrate) oder nach der Phytohämagglutinin-Aktivierung (X) oder mit IL-12-IL-2-Fusionsprotein vor (Rauten) oder nach der Phytohämagglutinin-Aktivierung (Dreiecke) behandelt. 6B zeigt ein Experiment, bei dem Zellen mit einem Gemisch von IL-12 plus IL-2, das in einem Molverhältnis von 1:1 zugegeben wurde, (schwarze Rauten), Human-Fc-IL-12-IL-2-Fusionsprotein (graue Quadrate) und Humanantikörper-IL-12-IL-2-Fusionprotein (hellgraue Dreiecke) behandelt wurden. Die X-Achse zeigt die Konzentrtion von IL-12 in pg/ml, gleich, ob es als intaktes Protein oder als Fusionsprotein vorliegt. Die Y-Achse gibt die IFN-γ-Konzentration (in ng/ml) an, die mit einem ELISA-Assay bestimmt wurde.
7 zeigt einen üblichen IL-12-Bioassay, der die Aktivität eines Fusionproteins getrennt misst und sie mit derjenigen eines unfusionierten IL-12-Moleküls vegleicht. Dargestellt ist die Stimulation der ³H-Thymidin-Aufnahme in humane PBMCs als Antwort auf murines IL-12 (weiße Kreise), auf eine Mischung von murinem IL-12 plus IL-2, die in einem Molverhältnis von 1:1 zugegeben wurden, (schwarze Quadrate), auf murines IL-2 (weiße Dreiecke) und ein Antikörpermurines-IL-12-IL-2-Fusionsprotein (schwarze Rauten). Die X-Achse zeigt die Konzentration (pM) von monomere(m/n) Cytokin(en), gleich, ob sie als intaktes Protein oder als Fusionsprotein vorliegen. Die Y-Achse gibt die cpm des Einbaus von tritiiertem Thymidin an.
8 zeigt einen Standard-Assay der biologischen Aktivität von IL-2. Der Graph zeigt die Stimulation der Proliferation von Maus-CTLL-Zellen als Antwort auf murines IL-2 (Kreise), ein Antikörper-murines-IL12-IL-2-Fusionsprotein (Rauten) und murines IL-12 (Quadrate). Die X-Achse zeigt die Konzentration (pM) von monomere(m/n) Cytokin(en), gleich, ob sie als intaktes Protein oder Fusionprotein vorliegen. Die Zellen wurden für 48 Stunden in Medium inkubiert, das verschidene Mengen an Cytokin oder Fusionsprotein enthielt, und dann unter Verwendung des MTT/MTS-Assays hinsichtlich der Anzahl lebensfähiger Zellen getestet. Die Y-Achse zeigt die Absorption bei 490 Nanometern in optischen Dichteeinheiten (OD).
9 zeigt die Stimulation der ³H-Thymidin-Aufnahme durch humane PBMCs als Antwort auf murines IL-12 (weiße Kreise), eine Mischung von murinem IL-12 plus IL-2, die in einem Molverhältnis von 1:1 zugegeben wurden, (schwarze Kreise), auf ein muriner-Fc-einkettiges-IL-12-IL-2-Fusionsprotein (schwarze Dreiecke) und ein murines einkettiges IL-12, fusioniert an murines IL-2, (schwarze Rauten). Die X-Achse zeigt die Konzentration (pM) von monomere(m/n) Cytokin(en), gleich, ob sie als intaktes Protein oder Fusionsprotein vorliegen; die Y-Achse gibt die cpm des Einbaus von tritiiertem Thymidin an.
10 zeigt die Stimulation der ³H-Thymidin-Aufnahme durch humane PBMCs als Antwort auf murines IL-12 (weiße Kreise), auf eine Mischung von murinem IL-12 plus GM-CSF, die in einem Molverhältnis von 1:1 zugegeben wurden, (schwarze Kreise), auf murinen GM-CSF (schwarze Dreiecke) und ein muriner-Fc-murines-IL-12-GM-CSF-Fusionsprotein (X). Die X-Achse zeigt die Konzentration (pM) von monomere(m/n) Cytokin(en), gleich, ob sie als intaktes Protein oder Fusionsprotein vorliegen; die Y-Achse gibt die cpm des Einbaus von tritiiertem Thyrnidin an.
11 zeigt die Wirkung einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von Balb/C-Mäusen, die subkutane Tumoren aufweisen, die von CT26-Colonkarzinomzellen stammen, die gentechnisch verändert waren, so dass sie humanes EpCAM, das Antigen für KS-1/4, exprimierten. Schwarze Rauten geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen als Kontrollen PBS an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 injiziert wurde. Dreiecke geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 6 Mikrogramm KS-IL-12-IL-2 behandelt wurden. Quadrate geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 3,4 Mikrogramm KS-IL2 und 5,3 Mikrogramm KS-IL12 behandelt wurden. Es wurden intratumorale Injektionen durchgeführt. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der ersten Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
12 zeigt die Wirkung einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von SCID-Mäusen, die subkutane Tumoren aufweisen, die von CT26-Colonkarzinomzellen stammen, die gentechnisch verändert waren, so dass sie humanes EpCAM exprimierten. Rauten geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen als Kontrollen PBS an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 injiziert wurde. Dreiecke geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 6 Mikrogramm KS-IL-12-IL-2 behandelt wurden. Quadrate geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 3,4 Mikrogramm KS-IL2 und 5,3 Mikrogramm KS-IL12 behandelt wurden. Es wurden intratumorale Injektionen durchgeführt. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der ersten Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
13 vergleicht die Wirkung einer Antikörper-Cytokin- und einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von Mäusen mit subkutanen Tumoren von Lewis-Lungenkarzinom- (LLC-) Zellen, die gentechnisch verändert waren, so dass sie humanes EpCAM exprimierten. Rauten geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen als Kontrollen PBS an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 injiziert wurde. Quadrate geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen 20 Mikrogramm KS-IL-2 an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 intratumoral injiziert wurden. Dreiecke geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen 20 Mikrogramm KS-IL12 an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 intratumoral injiziert wurden. X geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen 20 Mikrogramm KS-IL12-IL2 an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 intratumoral injiziert wurden. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der ersten Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
14 zeigt die Wirkung einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von Mäusen mit subkutanen Tumoren, die von Lewis-Lungenkarzinom- (LLC-) Zellen stammten, die gentechnisch verändert waren, so dass sie humanes EpCAM exprimierten. Rauten geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, denen als Kontrollen PBS an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 injiziert wurde. Dreiecke geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 20 Mikrogramm KS-IL-12-IL-2 behandelt wurden. Quadrate geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die mit 11,5 Mikrogramm KS-IL2 und 18 Mikrogramm KS-IL12 behandelt wurden. Es wurden intratumorale Injektionen durchgeführt. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der ersten Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern. 15 zeigt die Wirkung einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von Mäusen mit subkutanen Tumoren, die von Lewis-Lungenkarzinom- (LLC-) Zellen stammen, die humanes EpCAM entweder exprimieren oder nicht exprimieren. Schwarze Quadrate geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die von LLC/KSA stammende Tumoren aufweisen. Schwarze Rauten geben die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen an, die von LLC stammende Tumoren aufweisen. Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 mit 20 Mikrogramm KS-IL12-IL2 behandelt. Es wurden intratumorale Injektionen durchgeführt. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der ersten Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
16 zeigt die Wirkung einer Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionsprotein-Behandlung von Mäusen, die subkutane Tumoren tragen, die von Lewis-Lungenkarzinomzellen stammen. Etwa 10⁶ Zellen wurden am Tag 0 subkutan injiziert. Rauten zeigen die durchschnittlichen Tumorvolumina bei nativen Mäusen. Quadrate zeigen die durchschnittlichen Tumorvolumina bei Mäusen, die zuvor subkutane Tumoren gehabt hatten, die von Lewis-Lungenkarzinomzellen stammten, die gentechnisch verändert waren, so dass sie humanes EpCAM exprimierten, und die durch Behandlung mit KS-IL12-IL2 von diesen Tumoren geheilt worden waren. Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der Injektion; die Y-Achse zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
Die 17A und 17B zeigen die Wirkung der Sekretion von Einzel- oder Mehrfach-Cytokin-Protein durch Tumorzellen auf die Fähigkeit der Zellen, in einem Tier mit einem normalen Immunsystem Tumoren zu bilden. In 17A werden vier Sätze von Mäusen verglichen: C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, (schwarze Rauten); C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 5 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, (weiße Rauten); C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12 exprimierten, (schwarze Dreiecke); und C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 5 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12 exprimierten, (weiße Dreiecke). 17B vergleicht C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, (schwarze Rauten); C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 5 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, (weiße Rauten); C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12-IL-2 exprimierten, (X); und C57BL/6-Mäuse, denen s.c. 5 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12 exprimierten, (weiße Kreise). Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der Injektion der Tumorzellen; die Y-Achse zeigt das Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
18 zeigt die Wirkung der Sekretion von Einzel- oder Mehrfach-Cytokin-Protein durch Tumorzellen auf die Fähigkeit der Zellen, Tumoren in einem immundefizienten Tier zu bilden. Diese Figur vergleicht SCID-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, (schwarze Rauten); SCID-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12 exprimierten, (schwarze Dreiecke); und SCID-Mäuse, denen s.c. 1 × 10⁶ LLC-Tumorzellen injiziert wurden, die scIL-12 exprimierten, (weiße Kreise). Die X-Achse zeigt die Anzahl Tage nach der Injektion der Tumorzellen; die Y-Achse zeigt das Tumorvolumen in Kubikmillilitern.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Proteinmoleküle bereit, in denen zwei oder mehrere unterschiedliche Cytokine fusioniert oder komplexiert sind. Die Proteinkomplexe oder Fusionsproteine können gegebenenfalls zusätzliche Proteineinheiten beinhalten, einschließlich Einheiten, die zur Multimerisierung und Zielsteuerung in der Lage sind, wie Antikörper-Fc-Regionen und Antikörperregionen, die Antigenvereinigungsstellen enthalten. Die Erfindung stellt auch Nucleinsäuren bereit, die Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen kodieren. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Konstruktion von Nucleinsäuren, die Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen kodieren, Verfahren zur Produktion von Fusionsproteinen mit mehreren Cytokinen und die Verwendung von Fusionsproteinen mit mehreren Cytokinen zur Behandlung von Erkrankungen und medizinischen Zuständen bereit.
Wie hier verwendet, betrifft "Cytokin" ein sekretiertes Protein oder ein aktives Fragment oder eine Mutante davon, das die Aktivität von Zellen des Immunsystems moduliert. Beispiele für Cytokine sind u.a. die Interleukine, Interferone, Chemokine, Tumornekrosefaktor, Kolonie-stimulierende Faktoren für Immunzellvorläufer und so weiter.
Wie hier verwendet, betrifft "heterodimeres Cytokin" ein Cytokin, das aus zwei verschiedenen Proteinuntereinheiten besteht. Zurzeit ist IL-12 das einzige natürlich vorkommende heterodimere Cytokin, das bekannt ist. Künstliche heterodimere Cytokine können jedoch konstruiert werden. Zum Beispiel können IL-6 und ein lösliches Fragment von IL-6R unter Bildung eines heterodimeren Cytokins kombiniert . werden, ebenso wie CNTF und CNTF-R-alpha [Trinchieri (1994) Blood 84:4008].
Wie hier verwendet, betrifft "Interleukin-12" (IL-12) das Zwei-Untereinheiten-Cytokin, das aus einer p35- und einer p40-Untereinheit besteht, oder eine aktive einkettige Fusion von p35 und p40 oder eine Speziesvariante, ein Fragment oder ein Derivat davon.
Wie hier verwendet, betrifft "Interleukin-2" (IL-2) jedes Säuger-IL-2, wie humanes IL2, Maus-IL-2, oder eine aktive Spezies- oder allelische Variante, ein Fragment oder ein Derivat davon.
Wie hier verwendet, betrifft "GM-CSF" ein Granulozyten/Monozyten-Koloniestimulierender-Faktor-Cytokinprotein, wie humanen GM-CSF, Maus-GM-GSF, oder eine aktive Spezies- oder allelische Variante, ein Fragment oder ein Derivat davon.
Wie hier verwendet, bedeutet "Immunglobulin-Fc-Region" den carboxyterminalen Abschnitt der konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette oder ein Analogon oder ein Teil davon. Zum Beispiel kann eine Immunglobulin-Fc-Region von IgG mindestens einen Teil einer Hinge-Region, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fc-Region mindestens einen Teil einer Hinge-Region und eine CH3-Domäne. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fc-Region mindestens eine CH2-Domäne und umfasst stärker bevorzugt auch mindestens einen Teil einer Hinge-Region.
Wie hier verwendet, bedeutet "Peptidlinker" ein oder mehrere Peptide, die dazu verwendet werden, zwei Proteine miteinander zu koppeln (z.B. ein Protein und eine Fc-Region). Der Peptidlinker ist oft eine Abfolge von Aminosäuren, wie z.B. hauptsächlich Glycin und/oder Serin. Vorzugsweise ist der Peptidlinker eine gemischte Abfolge von hauptsächlich Glycin- und Serinresten und ist etwa 10–15 Aminosäuren lang.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "multimer" stabile Verbindung von zwei oder mehreren Proteinuntereinheite durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkung, z.B. Disulfidbindung.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "dimer" ein spezifisches multimeres Molekül, in dem zwei Proteinuntereinheiten kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen stabil verbunden sind. Ein stabiler Komplex ist ein Komplex mit einer Dissoziationsrate, oder Off-Rate, von mindestens mehreren Minuten (so dass der Komplex während der In-vivo-Verwendung lange genug stabil bleibt, um ein Zielgewebe zu erreichen und eine biologische Wirkung auszuüben). Das Fc-Fragment selbst bildet üblicherweise ein Dimer der schweren-Ketten-Fragmente, das einen Teil der Hinge-Region, CH2-Domäne und/oder CH3-Domäne umfasst. Es ist jedoch bekannt, dass viele Proteinliganden an ihre Rezeptoren als Dimer binden. Wenn ein Cytokin X natürlicherweise dimerisiert, dimerisiert die X-Einheit in einem Fc-X-Molekül in einem viel gößeren Ausmaß, weil der Dimerisierungsvorgang konzentrationsabhängig ist. Die physikalische Nähe der beiden X-Einheiten, die durch Fc verbunden sind, macht die Dimerisierung zu einem intramolekularen Vorgang, wodurch das Gleichgewicht stark zur Seite des Dimers verschoben wird und seine Bindung an den Rezeptor verstärkt wird.
Wie hier verwendet, bedeutet "Vektor" jede Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die in der Lage ist, in eine Wirtszelle aufgenommen zu werden und mit dem Wirtszellgenom rekombiniert und in dieses integriert zu werden oder sich autonom als ein Episom zu replizieren. Solche Vektoren sind u.a. lineare Nuc leinsäuren, Plasmide, Phagemide, Cosmide, RNA-Vektoren, virale Vektoren und dergleichen. Nicht-beschränkende Beispiele für einen viralen Vektor sind u.a. ein Retrovirus, ein Adenovirus und ein adeno-assoziiertes Virus.
Wie hier verwendet, soll "Genexpression" oder "Expression eines Proteins" so verstanden werden, dass die Transkription der DNA-Sequenz, Translation des mRNA-Transkripts und entweder Sekretion eines Proteinprodukts oder Produktion des Proteinprodukts in einer isolierbaren Form gemeint ist.
Wie hier verwendet, ist ein "Immuncytokin" ein Fusionsprotein, das einen Antikörper und ein Cytokin umfasst, wie im U.S.-Patent Nr. 5,650,150 offenbart.
Wie hier verwendet, ist eine "Leader-Sequenz" eine Proteinsequenz, die in der Regel am N-Terminus an eine zweite Proteinsequenz gebunden ist und die zweite Proteinsequenz derart steuert, dass diese aus der Zelle sekretiert wird. Die Leader-Sequenz wird gewöhnlich von der zweiten Proteinsequenz abgespalten und entfernt, die zum reifen Protein wird. Der Begriff "Leader-Sequenz" ist gewöhnlich synonym mit "Signalsequenz.
Wie hier verwendet, betrifft "EpCAM" epitheliales Zelladhäsionsmolekül (Cirulli et al. [1998] 140:1519–1534) und ist synonym mit "KSA", was das von dem monoklonalen Antikörper KS-1/4 gebundene Antigen bedeutet. EpCAM ist ein Zelloberflächenprotein, das auf Krebszellen, die von Epithelzellen stammen, in großer Zahl exprimiert wird.
Wie hier verwendet, betrifft "KS-1/4" einen bestimmten monoklonalen Antikörper, der an EpCAM bindet.
Wie hier verwendet, betreffen "KS-IL2", "KS-IL12" und "KS-IL12-IL2" (und dergleichen) Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine, die aus KS-1/4 mit Interleukin-2, KS-1/4 mit Interleukin-12 bzw. KS-1/4 mit sowohl Interleukin-12 als auch Interleukin-2 bestehen. Analog benannte Fusionsproteinkonstrukte werden hier ebenfalls verwendet. Weil es möglich ist, Cytokine an mehreren Positionen an einem Antikörpermolekül zu fusionieren, betrifft eine Beschreibung, wie "KS-IL12-IL2" die Klasse von Proteinen, die KS-1/4 mit sowohl Interleukin-12 als auch Interleukin-2, fusioniert an jeder möglichen Position, umfassen, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Wie hier verwendet, betrifft "14.18" einen bestimmten monoklonalen Antikörper, der an das tumorspezifische Antigen GD2 bindet.
Mehrere veranschaulichende Ausführungsformen von Proteinkonstrukten, die die Erfindung verkörpern, sind in den 1–5 dargestellt. Teile der in den 2–5 schematisch dargestellten Moleküle sind mit 1A–1I bezeichnet, was sich auf die in den 1A–1I gezeigten Fusionsproteine bezieht und verdeutlicht, dass jedes der Fusionsproteine aus 1 wie angegeben weiter an andere Proteine fusioniert werden kann. Cytokine sind als Rechtecke dargestellt, konstante Regionen von Antikörpern als Ovale, und die variable Region der schweren Kette sowie die variable Region der leichten Kette sind als beschriftete Ovale dargestellt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Proteinkomplexe, die zwei verschiedene Cytokine und gegebenenfalls weitere Proteineinheiten beinhalten. Ein homodimeres Cytokin (z.B. Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferon-gamma, IL-5, IL-8 oder dergleichen) enthält zwar mehrere Untereinheiten, ist aber dennoch ein einziges Cytokin. Ebenso ist ein heterodimeres Cytokin, wie IL-12, ein einziges Cytokin, obwohl es Untereinheiten enthält, die unterschiedlich sind. Ferner ist eine heterodimere Form von normalerweise homodimeren Cytokinen, wie ein MCP-1/MCP-2-Heterodimer, oder von zwei Allelen eines normalerweise homodimeren Cytokins (z.B. Zhang, J. Biol. Chem. [1994] 269:15918–24) ein einziges Cytokin. Die erfindungsgemäßen Komplexe enthalten zwei verschiedene Cytokine, von denen jedes (z.B. IL-2, IL-12 und GM-CSF) eine Aktivität einer Zelle des Immunsystems modulieren kann.
1A zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung: im Fusionsprotein 10 ist der C-Terminus eines ersten Cytokins 12 an den N-Terminus eines zweiten Cytokins 14, gegebenenfalls über eine Linkerregion (nicht gezeigt), fusioniert. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung enthält der erfindungsgemäße Proteinkomplex mindestens zwei Cytokine mit signifikant unterschiedlichen Serum-Halbwertszeiten. Zum Beispiel führt die Verwendung eines kleinen und eines großen Proteins oft zu einem Fusionsprotein mit einer Zirkulationshalbwertszeit, die für das größere Protein charakteristisch ist. In Situationen, in denen die kombinierten Wirkungen von IL-12 und einem zweiten Cytokin gewünscht sind, wäre es deshalb vorteilhaft, die zwei Cytokine als Fusionsprotein der allgemeinen Formel: IL-12-X oder X-IL-12 zu exprimieren, wobei X ein zweites Cytokin ist. Man erkennt zwei besondere Vorteile. Erstens wird die Serum-Halbwertszeit des schneller ausgeschiedenen Cytokins verlängert. Zweitens werden die Serum-Halbwertszeiten beider Cytokine einander sehr ähnlich.
Ein zweikettiges Cytokin, wie IL-12, kann an ein anderes Cytokin an den N- oder C-Terminus jeder des Ketten des zweikettigen Cytokins fusioniert werden. Bei einer Ausführungsform wird ein zweites Cytokin entweder an den N-Terminus oder den C-Terminus entweder der p35- oder der p40-Untereinheit von IL-12 fusioniert (1B-1E). Im Fusionsprotein 16 der 1B ist der N-Terminus eines ersten Cytokins 12 an den C-Terminus der IL-12-Untereinheit p40 18 fusioniert. Die Untereinheit p40 18 ist an die IL-12-Untereinheit p35 20 durch eine kovalente Bindung 22 gebunden. Im Fusionsprotein 24 der 1C ist der N-Terminus der p40-Untereinheit 18 an den C-Terminus des ersten Cytokins 12 fusioniert und an die p35-Untereinheit 20 durch eine kovalente Bindung 22 gebunden. 1D zeigt das Fusionsprotein 26, in dem der N-Terminus des ersten Cytokins 12 an den C-Terminus der p35-Untereinheit 20 fusioniert ist, die über eine kovalente Bindung 22 an die p40-Untereinheit 18 gebunden ist. In Figur IE beinhaltet das Fusionsprotein 28 die p35-Untereinheit 20, die an ihrem N-Terminus an den C-Terminus des ersten Cytokins 12 fusioniert und durch eine kovalente Bindung 22 an die p40-Untereinheit 18 gebunden ist.
Bei einer zweiten Ausführungsform können die Untereinheiten von IL-12 unter Bildung eines einkettigen Proteins, scIL-12, fusioniert sein, wobei sich entweder die p35-Untereinheit oder die p40-Untereinheit in der N-terminalen Position befindet; das zweite Cytokin kann an den N- oder den C-Terminus des so erhaltenen scIL-12 gebunden sein (1F–1I). Somit enthält bei einer bevorzugten, in 1F dargestellten Ausführungsform das Fusionsprotein 30 einkettiges IL-12, in dem der N-Terminus der p40-Untereinheit 18, gegebenenfalls über einen Peptidlinker, an den C-Terminus der p35-Untereinheit 20 fusioniert ist. Bei dieser Ausführungsform ist der N-Terminus des Cytokins 12 an den C-Terminus der p40-Untereinheit 18 fusioniert. Bei der in 1G gezeigten Ausführungsform ist der N-Terminus der p35-Untereinheit 20, gegebenenfalls über einen Peptidlinker, an den C-Terminus des Cytokins 12 fusioniert. Die 1H und 1I zeigen die Fusionsproteine 34 and 36, die eine andere einkettige Version von IL-12 enthalten, in der der N-Terminus der p35-Untereinheit, gegebenenfalls über einen Peptidlinker, an den C-Terminus der p40-Untereinheitfusioniert ist. Im Fusionsprotein 34, das in 1H gezeigt ist, ist der N-Terminus von Cytokin 12 an den C-Terminus der p35-Untereinheit 20 fusioniert. Im Fusionsprotein 36, das in 1I gezeigt ist, ist der N-Terminus der p40-Untereinheit 18 an den C-Terminus von Cytokin 12 fusioniert. Bei einer stark bevorzugten Ausführungsform ist IL-12 an IL-2 fusioniert.
Die Herstellung solcher Moleküle ist in den Beispielen veranschaulicht.
Es ist oft geeignet, heteromultimere Moleküle, wie IL-12 oder einen Antikörper, als einkettige Moleküle zu exprimieren, in denen die nicht-identischen Untereinheiten durch kurze Aminosäurelinker verbunden sind [Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 5879; Lieschke et al. (1997) Nat Biotechnol. 15:35; Lieschke; G. J. und Mulligan; R. C., U.S.-Patent Nr. 5,891,680]. Eine Genfusion wird konstruiert, und dann kann das gewünschte Protein in Zellen exprimiert werden, die ein einziges rekombinantes DNA-Konstrukt enthalten. Diese einkettigen Versionen eines heteromultimeren Cytokins können weiter an ein zweites Cytokin fusioniert werden, was immer noch die Expression eines Fusionsproteins mit den gewünschten Aktivitäten von einem einzigen rekombinanten DNA-Konstrukt gestattet. Die Expression solcher Moleküle ist in den Beispielen veranschaulicht.
Die Erfindung beschreibt auch Fusionsproteine, in denen mehrere unterschiedliche fusionierte Cytokine weiter an ein Protein fusioniert werden, das zur Bildung von Multimeren, wie Homodimeren oder Heterodimeren, in der Lage ist. Der Vorteil eines solchen Moleküls ist, dass die Stärke von einem oder mehreren der Cytokine durch Dimerisierung erhöht werden kann. In einigen Fällen kann eine Erhöhung der Stärke durch Dimerisierung auftreten, weil das Cytokin als Dimer an seinen Rezeptor bindet. Bei einer Ausführungsform werden mehrere Cytokine an einen Teil eines Antikörpermoleküls, wie eine Fc-Region (2), fusioniert. Bei einer anderen Ausführungsform sind IL-12 und ein zweites Cytokin an die homodimerisierende Proteineinheit fusioniert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Cytokin IL-2 oder GM-CSF. Die Fusionsproteine können auf eine Mehrzahl Weisen erzeugt werden, die alle verschiedenen Abfolgen mehrerer unterschiedlicher Proteineinheiten von den N- bis zu den C-Termini in einem Fusionsprotein widerspiegeln. Wenn zum Beispiel Interleukin-12 und ein zweites Cytokin an eine Fc-Region fusioniert werden, können die zwei Cytokine in jeder Reihenfolge an den N- oder C-Terminus der Fc-Region fusioniert werden, oder ein Cytokin kann an den N-Terminus und das andere an den C-Terminus fusioniert werden.
Einige dieser Permutationen sind in 2 veranschaulicht. Bei der in 2A gezeigten Ausführungsform ist zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein 44 an den C-Terminus einer Fc-Region fusioniert, die die Hinge-Region 38, die CH2-Region 40 und die CH3-Region 42 enthält. Das Fusionsprotein 44 könnte eine Mehrzahl von Strukturen besitzen, einschließlich beispielsweise der Strukturen der Fusionsproteine 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 oder 36, die in den 1A–1I dargestellt sind. Wenn das Fusionsprotein 44 mehr als einen N-Terminus und C-Terminus hat, wie in den Fusionsproteinen 16, 24, 26 und 28, könnte die Fc-Region an jeden beliebigen N-Terminus des Fusionsproteins 44 fusioniert werden. Wie in 2B gezeigt, könnte das Fusionsprotein 44 an den N-Terminus einer Fc-Region fusioniert werden. Bei der in 2C gezeigten Ausführungsform könnte ein erstes Cytokin 12 an den N-Terminus einer Fc-Region und ein zweites Cytokin 14 an den C-Terminus der Fc-Region fusioniert werden.
Strukturelle Überlegungen
Es ist wichtig zu beachten, dass Cytokine als eine Klasse von Proteinen eine ähnliche Größe und ähnliche allgemeine Faltungseigenschaften besitzen. Somit veranschaulichen die hier offenbarten spezifischen Beispiele für die Familie der Cytokinproteine, wie Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen konstruiert werden sollen. Zum Beispiel fallen viele Cytokine in eine Proteinfaltungsklasse, die als "Vier-Helix-Bündel" bezeichnet wird. Vier-Helix-Bündel-Proteine umfassen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Interleukin 6 (IL-6), Leukämieinhibitorischen Faktor (LIF), Wachstumshormon, ziliären neurotrophischen Faktor (CNTF), Leptin, Erythropoetin, Granulozyten-Maktrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), Interleukin-5 (IL5), Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), IL-2, IL-4, Interleukin-3 (IL-3), IL-10, Interferonbeta, die alpha-Interferone und das nahe verwandte Interferon tau sowie Interferon gamma (IFN-gamma).
Mit Ausnahme von IL-5 und IFN-gamma falten sich alle diese Proteine als Monomere mit vier ungefähr parallelen alpha-Helices und zwei Überkreuzverbindungen. In jedem Fall, mit Ausnahme von IL-5 und IFN-gamma, befinden sich der N-Terminus und der C-Terminus auf derselben Seite des Proteins. Weil die Vier-Helix-Bündel-Proteine, mit Ausnahme von IL-5 und IFN-gamma, das gleiche Faltungsmuster besitzen, gelten die hier für IL-2, IL-4 und GM-CSF beschriebenen Verfahren auch für andere Vier-Helix-Bündel-Proteine und andere kleine Cytokinproteine, die sich als Monomere falten.
Chemokine sind eine spezifische Klasse von Cytokinen, von denen angenommen wird, dass sie extrazelluläre Gradienten bilden und die Chemotaxis spezifischer Klassen von Immunzellen vermitteln. Zum Beispiel ist MCP-1 ein Chemoattrak tans für Monozyten, Makrophagen und aktivierte T-Zellen; Eotaxin ist ein Chemoattraktans für Eosinophile; und Interleukin-8 ist ein Chemoattraktans für Neutrophile. Zusätzlich zu ihrer Chemoattraktansfunktion können Chemokine, wie andere Cytokine, die Expression spezifischer Gene in spezifischen Zielzellen induzieren. Es wird zum Beispiel angenommen, dass MCP-1 die Expression von Gewebsfaktor in glatten Gefäßmuskelzellen induziert (Schecter et al., J Biol Chem. [1997] 272:28568–73).
Die Erfindung offenbart Cytokin-Cytokin-Fusionen und Antikörper-Cytokin-Cytokin-Fusionen, in denen ein oder mehreren Cytokine ein Chemokin ist/sind.
Das menschliche Genom kodiert beispielsweise mindestens 50 Chemokine. Bekannte Chemokine haben gewöhnlich eine ähnliche dreidimensionale Monomerstruktur und ein ähnliches Proteinfaltungsmuster. Folglich können die hier offenbarten allgemeinen Typen von Proteinkonstrukten und Konstruktionsstrategien auf eine Mehrzahl bekannter und noch unentdeckter Chemokine angewendet werden.
Chemokine haben ein besonderes Faltungsmuster mit drei beta-Strängen und einer alpha-Helix. Chemokine falten sich als Monomere und dimerisieren dann in einigen, aber nicht allen Fällen nach der Faltung. Bei allen Chemokinen ist das Faltungsmuster der Monomeruntereinheit identisch, und die Gesamtstrukturen sind äußerst ähnlich. Zum Beispiel wurden die dreidimensionalen Strukturen von Interleukin-8, Plättchenfaktor 4, Melanom-Wachstums-stimulierender Aktivität (MGSA), Makrophagenentzündungsprotein, MIP, RANTES ("regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted"), Monozytenchemoattraktans-Protein-1 (MCP-1, MCAF), Eotaxin, Monozytenchemoattraktans-Protein-3 (MCP-3), Chemokin-Domäne von Fractalkin, Neutrophilen-aktivierendem Peptid-2 (NAP-2), Stromal-cell-derived-factor-1 (SDF-1), Makrophagenentzündungsprotein-2, Chemokin hcc-2 (Makrophagenentzündungsprotein-5), Gro beta, Cytokin-induziertem Neutrophilenchemoattraktans und CINC/Gro mittels Röntgenkristallographie- und/oder NMR-Verfahren bestimmt; diese sämtlichen Sturkturen zeigen die gleiche Faltung und sind im Allgemeinen ähnlich. Weil die Chemokine das gleiche Faltungsmuster besitzen, gelten die hier für Lymphotaktin beschriebenen Verfahren auch für anderen Chemokinproteine.
Ein freier N-Terminus eines Chemokins ist oft wichtig für seine Funktion. Daher ist es bei einigen Ausführungsformen vorteilhaft, Fusionen zu konstruieren, in denen ein zweites Cytokin, eine Antikörpereinheit oder eine andere Proteineinheit an den C-Terminus des Chemokins fusioniert werden kann. Um einen Proteinkomplex zu konstruieren, der zwei aktive Chemokine enthält, ist es zum Beispiel geeignet, die zwei verschiedenen Chemokine an die N-Termini einer schweren und leichten Antikörperkette zu fusionieren. Einige Chemokine, wie IL-8, sind unter physiologischen Bedingungen dimer. Für bestimmte Anwendungen ist es geeignet, eine Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusion, wie eine IL-8-Antikörper-Cytokin-Fusion, zusammen mit einer unfusionierten IL-8-Einheit oder einer IL-8-Einheit mit einem anderen Fusionspartner, der nicht mit der Antikörpereinheit wechselwirkt, zu coexprimieren. Auf diese Weise können die verschiedenen IL-8-Einheiten ohne räumliche Spannungen oder Polymerisierung heterodimerisieren, zu denen es kommen könnte, wenn alle IL-8-Einheiten an eine Antikörperkette fusioniert wären. Das gewünschte Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein kann dann auf Basis der Größe oder auf Basis eines antikörperbindenden Proteins, wie Staphylococcus-Protein A, abgetrennt werden.
Bei Fusionsproteinen mit mehreren Cytokinen, die ein Chemokin umfassen, ist eine bevorzugte Ausführungsform, dass das Fusionsprotein auch eine Lokalisierungsfunktion umfasst, wie eine Antikörpereinheit, die an ein Antigen bindet. Ohne durch ein Theorie gebunden sein zu wollen, wird allgemein angenommen, dass eine körperweite Verteilung eines Chemokins keine Wirkung hat oder zu einer allgemeinen Desensibilisierung von Zellen gegenüber dem Chemokin führt. Ferner wird angenommen, dass die Chemoattraktansfunktion eines Chemokins sich nur manifestieren kann, wenn es einen Konzentrationsunterschied des Chemokins gibt.
Verlängern der Halbwertszeit mehrfacher Cytokine mit kurzen Serum Halbwertszeiten Die Erfindung beschreibt auch Fusionsproteine, die zwei Cytokine mit jeweils einer kurzen Serum-Halbwertszeit umfassen, die an eine dritte Einheit mit langer Serum-Halbwertszeit fusioniert sind. Das so erhaltene Molekül ist ein starkes Stimulans der Proliferation und Aktivität dendritischer Zellen.
Die Fc-Region kann allein oder als Teil eines intakten Antikörpers Mehrfach-Cytokin-Fusionen mehrere Eigenschaften verleihen, die je nach der speziellen Anwendung vorteilhaft oder nachteilig sein können. Zu diesen Eigenschaften gehören Dimerisierung, Verlängerung der Serum-Halbwertszeit, Fähigkeit zur Komplementfixierung, Fähigkeit zur Vermittlung von antikörperabhängiger zellvermittelter Cytotoxizität (ADCC) und Bindung an Fc-Rezeptoren. Wenn die Verlängerung der Serum-Halbwertszeit ein primär gewünschtes Merkmal ist und die immunologischen Eigenschaften der Fc-Region unwichtig oder unerwünscht sind, ist es bevorzugt, eine Fc-Region zu verwenden, die eine natürliche Variante oder eine Mutante ist, der eine oder mehrere immunologische Eigenschaften fehlen. Wenn es beispielsweise wünschenswert ist, die Serum-Halbwertszeiten von zwei oder mehreren Cytokinen mit kurzen Serum-Halbwertszeiten anzugleichen und zu verlängern, ist es bevorzugt, ein Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein zu konstruieren, das eine Fc-Region von humanem IgG2 oder IgG4 besitzt, die eine verringerte bzw. keine Affinität für Fc-Rezeptoren besitzen, oder eine Fc-Region zu verwenden, die eine Mutation in der Fc-Rezeptor-Bindungsstelle trägt. Tatsächlich wurde bereits gezeigt, dass Fusionen einiger Cytokine an Antikörper die Affinität des Fusionsproteins für Fc-Rezeptoren erhöhen und dass dies zu schnelleren Ausscheidungsraten bei Tieren führt. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von Fc-Regionen mit verringerter Affinität zu Fc-Rezeptoren die Serum-Halbwertszeit dieser Moleküle stark verbessert (Gillies et al. [1999] Cancer Res. 59: 2159–2166). Unter bestimmten Umständen und je nach den verwendeten Cytokinen führt eine Fc-Region, die an den Fc-Rezeptor bindet, zur Internalisierung des Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteins und zum Abbau einer oder mehrerer Cytokineinheiten.
Zielsteuerung
Die Erfindung beschreibt auch Fusionsproteine, in denen zwei oder mehrere Cytokine an ein Protein gebunden sind, das die Cytokine an ein bestimmtes Zielmolekül, eine Zelle oder eine Stelle im Körper lokalisieren kann. Das bevorzugte Molekül mit Lokalisierungsfähigkeit ist ein Antikörper oder eine Einheit, die die antigenbindenden variablen Regionen eines Antikörpers umfasst. Andere lokalisierende Moleküle oder Domänen davon können jedoch verwendet werden, wie spezifische Liganden oder Rezeptoren, natürlich vorkommende Bindungsproteine, Enzyme, die an bestimmte Substrate binden, künstliche erzeugte Peptide, die hinsichtlich einer bestimmten Bindungs- oder Lokalisierungsfähigkeit selektiert wurden, Peptide mit unterscheidbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften, die zu einer Zielsteuerungsfähigkeit führen, Proteine, die eine Zielsteuerungsfähigkeit aufgrund der Bindung an ein anderes Molekül haben, das zielgesteuert wird, oder andere Typen von Proteinen. Im Fall der Fusion zweier Cytokine an ein Zielsteuerungsmolekül ist ein bevorzugtes erstes Cytokin IL-12. Wenn IL-12 verwendet wird, ist ein bevorzugtes zweites Cytokin IL-2 oder GM-CSF.
Im Fall eines Antikörpers gibt es eine große Zahl von Weisen, auf die zwei oder mehrere Cytokine fusioniert werden können, weil es mehrere mögliche Bindungsstellen gibt. Ein IgG-Antikörper besteht beispielsweise aus zwei schweren und zwei leichten Ketten. Die beiden Cytokine können miteinander fusioniert und dann an einen N- oder C-Terminus von entweder der schweren oder der leichten Kette fusioniert werden. Alternativ kann jedes Cytokin getrennt an einen der N- oder C-Termini am Antikörpermolekül fusioniert werden.
3 veranschaulicht eine Untergruppe der Weisen, auf die zwei Cytokine an ein Antikörpermolekül fusioniert werden können. Siehe zum Beispiel 3A: Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein 44 könnte an den C-Terminus einer schweren Immunglobulinkette 46, die mit einer leichten Immunglobulinkette 48 verbunden ist, fusioniert werden. Wie in 2, kann das Fusionsprotein 44 eine Mehrzahl von Strukturen besitzen, einschließlich beispielsweise der Strukturen der Fusionsproteine 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 oder 36, die in den 1A–1I dargestellt sind. Wie in 3B gezeigt, könnte ein Fusionsprotein 44 an den N-Terminus einer schweren Immunglobulinkette 46, die mit einer leichten Immunglobulinkette 48 verbunden ist, fusioniert werden. Bei den in den 3C und 3D gezeigten Ausführungsformen ist das Fusionsprotein 44 an den N-Terminus (3C) oder den C-Terminus (3D) einer leichten Immunglobulinkette 48, die mit einer schweren Immunglobulinkette 46 verbunden ist, fusioniert. Wie in den 3E und 3F gezeigt, kann ein erstes Cytokin 12 an eine leichte Immunglobulinkette 48 fusioniert werden, die mit einer schweren Immunglobulinkette 46 verbunden ist, die mit einem zweiten Cytokin 14 fusioniert ist. Die Cytokine 12 and 14 können an die N-Termini (3E) oder die C-Termini (3F) der Immunglobulinketten fusioniert werden. Alternativ kann, wie in 3G, das erste Cytokin 12 an den N-Terminus der leichten Immunglobulinkette 48 fusioniert werden, während das zweite Cytokin 14 an den C-Terminus der schweren Immunglobulinkette 46 fusioniert wird.
Fusionen an einkettige Antikörper
Es ist manchmal geeignet, Antikörper als einkettige Moleküle zu exprimieren. Die Erfindung stellt auch Fusionsproteine bereit, in denen zwei oder mehrere Cytokine an einen einkettigen Antikörper fusioniert sind. Dies hat den Vorteil, dass die Anzahl der DNA-Konstrukte reduziert wird, die bei der Expression des gewünschten Fusionsproteins verwendet werden, was besonders für die Gentherapie vorteilhaft sein kann. Genauer gesagt, gestattet die Fusion der Cytokine an den einkettigen Antikörper die Expression des Fusionsproteins als eine einzige Proteinkette, wenn die Cytokine einkettige Moleküle sind.
Wie in den 4A–4C gezeigt, können bei einigen Ausführungsformen Cytokine an den einkettigen Antikörper an seinen N-Terminus, seinen C-Terminus oder an beide Termini fusioniert werden. Wie in 4A gezeigt, kann das Fusionsprotein 44 beispielsweise an den C-Terminus eines einkettigen Antikörpers 50 fusioniert werden, der die variable Region 52 der leichten Kette und die variable Region 54 der schweren Kette besitzt. Wie in 4B gezeigt, kann das Fusionsprotein 44 auch an den N-Terminus des einkettigen Antikörpers 50 fusioniert werden. Bei der in 4C gezeigten Ausführungsform ist ein erstes Cytokin 12 an den N-Terminus des einkettigen Antikörpers 50 fusioniert, und ein zweites Cytokin 14 ist an den C-Terminus des einkettigen Antikörpers 50 fusioniert.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst eine Fusion von IL-12 und einem zweiten Cytokin an den einkettigen Antikörper. Eine stärker bevorzugte Ausführungsform umfasst IL-2 oder GM-CSF als zweites Cytokin.
Die konstanten Regionen von Antikörpern haben das Potenzial, eine Mehrzahl von Effektorfunktionen zu vermitteln. Zum Beispiel vermittelt IgG1 Komplementfixierung, ADCC und Bindung an den Fc-Rezeptor. Die Position, an der das Cytokin fusioniert ist, kann die Effektorfunktion der konstanten Antikörperregion verändern, was nützlich ist, wenn eine Modulation dieser Effektorfunktionen gewünscht ist.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Fusion von zwei oder mehreren Cytokinen an eine Einheit mit der Zielsteuerungsregion eines Antikörpers, aber ohne die konstanten Regionen, zu konstruieren. Ein solches Fusionsprotein ist kleiner als eine Fusion eines vollständigen Antikörpers an zwei oder mehrere Cytokine, was für bestimmte Zwecke vorteilhaft sein kann. Außerdem fehlen diesem Fusionsprotein eine oder mehrere der Effektorfunktionen eines intakten Antikörpers, wobei es aber die Zielsteuerungsfähigkeit eines Antikörpers beibehält.
Somit umfasst die Erfindung Fusionsproteine, in denen zwei oder mehrere Cytokine an eine einkettige Fv-Region fusioniert sind. Wie in den Ausführungsformen, die in den 5A–5C dargestellt sind, gezeigt ist, können zwei Cytokine an den N-Terminus oder den C-Terminus der Fv-Region fusioniert werden, oder ein Cytokin kann an jeden Terminus fusioniert werden. Wie in 5A dargestellt, kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein 44 an den C-Terminus einer einkettigen Fv-Region fusioniert werden, die eine variable Region 52 einer leichten Immunglobulinkette und eine variable Region 54 einer schweren Immunglobulinkette enthält. Ein Fusionsprotein 44 kann auch an den N-Terminus einer Fv-Region fusioniert werden, wie in 5B gezeigt. Wie in 5C dargestellt, kann ein erstes Cytokin 12 an den N-Terminus einer Fv-Region und ein zweites Cytokin 14 an den C-Terminus der Fv-Region fusioniert werden.
Antikörper als heterodimere Vehikel für mehrere Cytokine
Unter einigen Umständen ist es wünschenswert, eine Fusion von zwei oder mehreren Cytokinen zu konstruieren, in der für zwei der Cytokine das gleiche Ende des Proteins für die Aktivität essenziell ist. Es kann zum Beispiel sein, dass der natürlich vorkommende N-Terminus zweier verschiedener Cytokine für die Aktivität jedes Cytokins essenziell ist. Es ist nicht möglich, ein Fusionsprotein mit einer einzigen Polypeptidkette zu konstruieren, in dem beide Cytokineinheiten aktiv sind. Antikörper sind heterodimere Proteine, die aus schweren und leichten Ketten bestehen, die über Disulfidbindungen kovalent verknüpft sind. Wenn es gewünscht ist, ein Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein mit zwei Cytokineinheiten zu konstruieren, die beide einen intakten, unfusionierten N-Terminus benötigen, ist es bevorzugt, die zwei Cytokine getrennt an die N-Termini der schweren und der leichten Kette eines Antikörper zu fusionieren (3E). Wenn es gewünscht ist, ein Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein mit zwei Cytokineinheiten zu konstruieren, die beiden einen intakten, unfusionierten C-Terminus benötigen, ist es bevorzugt, die zwei Cytokine getrennt an die C-Termini der schweren und der leichten Kette eines Antikörper zu fusionieren (3F). Wenn der Antikörper nur als Vehikel verwendet wird, um zwei Cytokine auf diese Weise zu verbinden, kann es geeignet sein, die Teile des Antikörpers zu deletieren oder zu mutieren, die zusätzliche Eigenschaften in Zusammenhang mit der Immunfunktion verleihen. Es kann zum Beispiel bevorzugt sein, eine Fab-Region als Vehikel zu verwenden, weil die Fab-Region das Heterodimerisierungsmerkmal eines Antikörpers beibehält, aber nicht die für die Fc-Region charakteristischen Funktionen besitzt. Es kann ebenfalls geeignet sein, einen Antikörper oder Antikörperfragment zu verwenden, in dem die Antigenvereinigungsstelle nicht-funktionell ist.
Fusionen mehrerer Cytokine an Antikörper vereinigen viele der neuen Merkmale der Erfindung. Bei Antikörper-Mehrfach-Cytokin-Fusionen wird die Serum-Halbwertszeit der Cytokine angeglichen und verlängert; die Aktivität beider Cytokine wird auf ein Ziel lokalisiert und speziell toxische Wirkungen aufgrund von systemischer Verabreichung mehrerer synergistisch wirkender Cytokine werden vermieden; jedes Cytokin wird effizient dimerisiert oder multimerisiert; und die Cytokine müssen nicht direkt fusioniert werden, sondern können an verschiedene Stel len an den schweren und leichten Ketten des Antikörpermoleküls fusioniert werden.
Beim Design eines Fusionsproteins, das mehrere Cytokine und einen Antikörper umfasst, gibt es eine Reihe von Möglichkeiten und Konfigurationen, die durch Routineexperimente unterschieden werden können. Strukturbiologische Überlegungen sind ebenfalls nützlich. Zum Beispiel fallen viele Cytokine in eine Klasse, die als 4-Helix-bündel bezeichnet wird. Diese Strukturen bestehen aus vier alpha-Helices und haben den N-Terminus und C-Terminus in der gleichen Umgebung. In der Regel wird die Seite eines Cytokins um den N- und den C-Terminus nicht bei der Bindung an einen Cytokinrezeptor verwendet, so dass jeder Terminus für die Fusion an einen Antikörper oder ein zweites Cytokin verwendet werden kann. Manchmal ist es jedoch aus sterischen Gründen schwierig, sowohl den N- als auch den C-Terminus eines 4-Helix-Bündel-Cytokins an unterschiedliche Einheiten zu fusionieren. Wenn es wünschenswert ist, zwei verschiedene 4-Helix-Bündel-Cytokine an einen Antikörper zu fusionieren, ist es deshalb geeignet, jedes Cytokin an eine andere Stelle des Antikörpers zu fusionieren. Wenn es notwendig ist, eine Polypeptidkette der Form Ig-Kette-Cytokin-Cytokin zu konstruieren, können alternativ ein oder mehrere flexible Linker verwendet werden, um sterische Probleme zu bewältigen.
Es ist auch möglich, an Stelle eines Antikörpers andere sekretierte heterodimere Moleküle für das Tragen mehrerer Cytokine zu verwenden. Zum Beispiel könnte ein Komplex verwendet werden, der prostataspezifisches Antigen und den Proteaseinhibitor, mit dem es komplexiert, die schwere IgA-Kette und die J-Kette, Mitglieder der TGF-beta-Familie und ihre Astacin-ähnlichen Bindungspartner oder IL-12 enthält.
Nucleinsäuren
Die Erfindung umfasst auch Nucleinsäuren, die in der Lage sind, jedes der vorstehenden Typen von Proteinen zu exprimieren. Dazu gehören Nucleinsäuren, die Fusionsproteine kodieren, die zwei oder mehrere Cytokine umfassen, Fusionen, die zwei oder mehrere Cytokine und eine Dimerisierungsdomäne, wie eine Fc-Region, umfassen, Fusionen, die zwei oder mehrere Cytokine, fusioniert an einen Antikörper, und zwei oder mehrere Cytokine, fusioniert an eine Fv-Region, umfassen. Bevorzugte Formen der Nucleinsäuren sind DNA-Vektoren, von denen die Fusionsproteine in entweder Bakterien- oder Säugerzellen exprimiert werden können. Bei Fusionsproteinen, die mehrere Polypeptidketten umfassen, kann mehr als eine kodierende Nucleinsäure verwendet werden. Alternativ kann es geeignet sein, zwei oder mehrere Fusionsprotein-kodierende Sequenzen auf einem einzigen Nucleinsäuremolekül unterzubringen. Die Beispiele veranschaulichen besondere Formen der umfassten Nucleinsäuren, die mehrere Cytokine kodieren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren eignen sich besonders zur Expression von Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen, entweder zur Produktion dieser Proteine oder zu Gentherapiezwecken.
Verfahren zum Synthetisieren geeigneter Ausführungsformen der Erfindung sowie Assays, die sich zum Testen ihrer pharmakologischen Aktivitäten eignen, sind in den Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Verwendung zur Behandlung und Prävention einer großen Vielzahl an Erkrankungen bereit, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Behandlung von verschiedenen Infektionen und Krebs sowie Impfung gegen verschiedene Erkrankungen.
Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteine können zur Behandlung von bakteriellen, parasitischen, Pilz- oder viralen Infektionen oder Krebs verwendet werden. Zum Beispiel ist bekannt, dass IL-12 eine schützende Wirkung bei vielen Typen von Infektionen hat, einschließlich Infektionen mit dem Bakterium Listeria monocytogenes, den Parasiten Toxoplasma gondii, Leishmania major und Schistosoma mansoni; dem Pilz Candida albicans und den Viren Choriomeningitisvirus und Cytomegalievirus, aber nicht darauf beschränkt. Weil Cytokine gewöhnlich in Kombination wirken, ist es oft geeignet, Fusionsproteine zu verwenden, die zwei oder mehrere Cytokine umfassen, von denen bekannt ist, dass sie synergistisch wirken. Weil bekannt ist, dass IL-2 die Wirkungen von IL-12 potenziert, ist es geeignet, diese Cytokine bei der Behandlung von bakteriellen, parasitischen, Pilz- und viralen Erkrankungen zu kombinieren.
Eine bevorzugte Behandlung von Infektionskrankheit betrifft die Verwendung von Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen, die weiter an ein Zielsteuerungsmittel fusioniert sind, das die mehreren Cytokine an der Infektionsstelle platziert. Verschiedene Zielsteuerungsstrategien sind nachstehend beschrieben.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form fester, halbfester oder flüssiger Dosierungsformen, wie beispielsweise Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen oder dergleichen, vorzugsweise in Einheitsdosierungsformen, die sich zur Verabreichung genauer Dosierungen eignen, verwendet werden. Die Zusammensetzungen beinhalten einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder Excipienten und können zusätzlich andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Adjuvantien usw. umfassen. Zu diesen Excipienten können andere Proteine, wie beispielsweise humanes Serumalbumin oder Plasmaproteine, gehören. Zeitgemäße Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder für den Fachmann ersichtlich. Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung enthält in jedem Fall eine Menge des (der) Wirkstoff(s/e) in einer Menge, die wirksam ist, um die gewünschte Wirkung in dem behandelten Individuum zu erzielen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann auf eine der akzeptierten Weisen zur Verabreichung von Mitteln, die eine derartige Aktivität zeigen, erfolgen. Diese Verfahren umfassen orale, parenterale oder topische Verabreichung und ansonsten systemische Formen. Injektion ist ein bevorzugtes Verabreichungsverfahren.
Die Menge an verabreichtem Wirkstoff hängt natürlich von dem behandelten Individuum, der Schwere des Leidens, der Art der Verabreichung und dem Urteil des behandelnden Arztes ab.
Wie vorstehend beschrieben, hat man Cytokine, wie IL-2, IL-12, GM-CSF und andere, hinsichtlich der Behandlung von Krebs untersucht. Unter gewissen Umständen ist es vorteilhaft, aus Gründen der leichteren Verabreichung, erhöhten Serum-Halbwertszeit eines der Komponenten-Cytokine und/oder besserer Modulierung der relativen Aktivitäten der zwei Cytokine ein Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein zu verwenden.
Eine bevorzugte Verwendung zur Behandlung von Krebs beinhaltet die Zielsteuerung der Cytokine an ein bestimmtes Organ oder Gewebe, so dass die Wirkung der Cytokine konzentriert werden kann und die Nebenwirkungen von systemischer Verteilung vermieden werden können. Zum Beispiel wird erwartet, dass Fusionen mehrerer Cytokine an eine Fc-Region in der Leber angereichert werden, was zur Behandlung von Krebs, der auf die Leber beschränkt ist, nützlich sein kann. Ein stärker bevorzugter Ansatz ist die Verwendung eines Mehrfach-Cytokin- Fusionsproteins, das weiter an ein Zielsteuerungsmittel, wie einen Antikörper, fusioniert ist. Insbesondere sind die Antikörper KS-1/4 und 14.18 gegen tumorspezifische Antigene gerichtet (Varki NM et al., Cancer Res [1984] 44:681–7; Gillies et al., Journal of Immunological Methods 125:191 [1989]; U.S.-Patente Nr. 4,975,369 und 5,650,150). Bei Verwendung einer Antikörper-Mehrfach-Cytokin-Fusion ist es oft geeignet, den Typ des Tumors zu untersuchen und einen Antikörper zu wählen, der gegen ein Antigen gerichtet ist, das wahrscheinlich auf diesen Tumortyp vorhanden ist. Es kann beispielsweise nützlich sein, den Tumor mittels FACS-Analyse, Westernblot, Untersuchung der Tumor-DNA oder einfach durch Identifizieren des Typs der Tumorzelle zu charakterisieren. Solche Verfahren der Tumorcharakterisierung sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Tumorcharakterisierung, wie Onkologen und Tumorbiologen, bekannt. Es ist ebenfalls möglich, Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen durch eine Mehrzahl anderer Maßnahmen, wie Fusion an spezifische Liganden oder Rezeptoreinheiten, Fusion an Peptid-Aptamere mit zuvor ausgewählten Bindungsaktivitäten, chemische Konjugation an kleine Moleküle mit Lokalisierungseigeschaften usw., zielzusteuern. Diese Zielsteuerungsverfahren kann auch zur Behandlung anderer Erkrankungen, wie Infektionen, verwendet werden.
Behandlung von Krebs und anderen zellulären Störungen durch Gentherapie
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können als Gentherapiemittel zur Behandlung von Krebs und anderen Erkrankungen verwendet werden, bei denen es wünschenswert ist, das Immunsystem an einen spezifischen Zelltyp zu steuern. Es werden zum Beispiel Krebszellen aus einem Mensch oder Tier entnommen, eine oder mehrere Nucleinsäuren, die ein Fusionsprotein mit mehreren Cytokinen kodieren, werden in die Krebszellen transfiziert, und die Krebszellen werden dann wieder in den Menschen oder das Tier eingebracht. Alternativ kann die DNA in situ in die Krebszelle eingebracht werden. Der Mensch oder das Tier stellt dann eine Immunantwort auf die Krebszellen auf, die den Krebs heilen oder seine Schwere lindern kann. Eine Mehrfach-Cytokingenfusion, die an entsprechende regulatorische Elemente zur Förderung der Expression in Säugerzellen gekoppelt ist, kann in die Krebszellen durch jede einer Mehrzahl von Techniken, einschließlich des Calciumphosphat-Verfahren, einer "Genkanone", Adenovirusvektoren, kationischer Liposomen, retroviraler Vektoren oder jedes anderen effizienten Transfektionsverfahrens, transfiziert werden. Die Nucleinsäure kann ein Fusionsprotein mit mehreren Cytokinen kodieren, das weiter an andere Einheiten fusioniert ist.
Eine Anti-Krebs-Gentherapie mit einer Nucleinsäure, die eine Fusion von mehr als einem fusionierten Cytokin exprimiert, kann mit anderen Krebsbehandlungen, wie Behandlungen, die die immunstimulatorischen Eigenschaften des fusionierten Cytokinproteins erhöhen, kombiniert werden. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können zum Beispiel auch andere Proteineinheiten exprimieren, die zur Entwicklung einer Immunantwort gegen Antigene, die durch die Krebszellen exprimiert werden, beitragen, oder können mit anderen Nucleinsäuren, die solche Proteineinheiten exprimieren, cotransfiziert werden. Genauer gesagt, können Nucleinsäuren, die das costimulatorische B7-Oberflächenprotein exprimieren, in die Krebszellen cotransfiziert werden [Robinson et al., U.S.-Patent Nr. 5,738,852]. Eine Transfektion von Krebszellen mit einer Nucleinsäure, die eine Fusion mehrerer Cytokine exprimiert, kann auch von einer Behandlung mit einem Antikörper oder einem Immuncytokin begleitet sein, der/das die Krebszellen ansteuert [Lode et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:2475]. Eine Transfektion von Krebszellen mit einer Nucleinsäure, die eine Mehrfach-Cytokin-Fusion exprimiert, kann auch von einer Behandlung mit einem Angiogeneseblocker begleitet sein [Lode et al. (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. 9:1591].
Therapien unter Verwendung von zusätzlichen Immunstimulatoren und/oder Angiogeneseblockern können auch mit einer systemischen Behandlung mit Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen kombiniert werden. Ein Vorteil der gleichzeitigen Behandlung mit zusätzlichen lmmunstimulatoren oder Angiogeneseblockern ist, dass diese Behandlungen im Gegensatz zu DNA-schädigenden Mitteln und Zellzyklusblockern nicht die Immunzellen abtöten, die aufgrund der Stimulation durch das Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein in Teilung begriffen sein können.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Gentherapieansatzes ist das Einbringen von einer oder mehreren Nucleinsäuren, die IL-12 und ein zweites Cytokin kodieren, in Krebszellen und das anschließende Wiedereinbringen der Krebszellen in den Menschen oder das Tier. Das zweite Cytokin ist vorzugsweise IL-2 oder GM-CSF.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Impfstoffzusammensetzungen und Verwendungen zur Adjuvantierung von Impfstoffen bereit, die dazu bestimmt sind, in geimpften Wirtssäugern eine schützende zellvermittelte Immunantwort gegen bestimmte Pathogene unter Verwendung von zwei oder mehreren Cytokinen, die fusioniert worden sind, als Adjuvantien bereitzustellen. Wenn zum Beispiel eine Th1-Immunantwort gewünscht ist, können mehrere Th1-fördernde Cytokine fusio niert und die so erhaltenen Fusionsproteine einem Tier in Kombination mit einem Antigen verabreicht werden.
Insbesondere können IL-12 und IL-2 fusioniert und mit einem Antigen verabreicht werden. Alternativ können IL-12 und IL-2 weiter mit einem antigenen Protein selbst fusioniert und zur Stimulation einer Immunantwort verwendet werden. In diesem Fall betrifft die Erfindung Impfstoffe, die auf der zellvermittelten Immunität des Wirts, d.h. dem Hervorrufen cytotoxischer T-Lymphozyten und aktivierter Phagozyten, beruhen, um einen Schutz gegen Infektion mit einem bestimmten Pathogen bereitzustellen. Es ist besonders nützlich, Impfungen mit Fusionsproteinen durchzuführen, die IL-12, IL-2 und das Antigen umfassen, weil diese Kombination eine Th1-Antwort gegen das Antigen steuert. Herkömmliche, bei Menschen verwendete Adjuvantien, wie Alaun, neigen zur Induktion einer Th2-Antwort.
Die vorliegende Erfindung stellt auch neue therapeutische Zusammensetzungen und Verwendungen zur Adjuvantierung bereit, die dazu bestimmt sind, eine synergistische Wirkung mit bestimmten therapeutischen Zusammensetzungen bereitzustellen, einschließlich so genannter "Krebsimpfstoffe", die ein ausgewähltes Antigen, das auf einer Krebszelle vorkommt, enthalten können. Zum Beispiel kann ein Protein, das zwei oder mehrere fusionierte Cytokine umfasst, direkt auf einem geeigneten Weg zusammen mit angemessen behandelten Krebszellen verabreicht werden.
Beispiele
Beispiel 1: Konstruktion von Genfusionen, die Cytokin-Cytokin-Fusionsproteine exprimieren können
Zur Erzeugung multifunktioneller Proteine mit einer Mehrzahl an Cytokinen wurden Genfusionen zwischen p40 von IL-12 und IL-2 sowie zwischen p40 von IL-12 und GM-CSF synthetisiert. Außerdem wurde die kodierende Sequenz für reifes murines p35 (SEQ ID NR:1) an einen Promotor und eine Leader-Sequenz fusioniert, die hohe Expressionsspiegel und eine effiziente Sekretion gestatten. Die kodierenden Sequenzen von murines-p40-IL-2 und p40-GM-CSF sind in SEQ ID NR:2 bzw. SEQ ID NR:3 gezeigt. Eine human-p40-IL-2-Fusion wurde ebenfalls konstruiert (SEQ ID NR:4). Fusionen einer Maus-Fc-Region von IgG2a an Mausp35 (SEQ ID NR:5) und von human-p35 an eine humane Fc-Region von IgG1 (SEQ ID NR:6) wurden unter Verwendung zuvor offenbarter Expressionsplasmide (Lo et al., Protein Engineering 11:495–500 [1998]; Lo et al., U.S.-Patent Nr. 5,726,087) konstruiert.
Eine Fusion von Maus- und human-p35 an den C-Terminus der schweren Kette des KS-1/4-Antikörpers ist von Gillies et al. (J. Immunology [1998] 160:6195–6203) beschrieben worden. Fusionen von reifem Maus- und humanem p35 an den C-Terminus der schweren Kette des 14.18-Antikörpers wurden auf analoge Weise konstruiert (internationale PCT-Veröffentlichung WO99/29732).
Der hier für die Fusion von p40 an IL-2 und GM-CSF erläuterte Typ der Strategie ist auf die Fusion von zwei oder mehreren Cytokinen allgemein anwendbar. Genauer gesagt, umfasst die kodierende Sequenz der ganz N-terminal gelegenen Einheit eine Signalsequenz für die Sekretion, während die C-terminalen Einheiten keine Signalsequenz erfordern. Unter gewissen Umständen kann es geeignet sein, eine kodierende Sequenz für einen kurzen Peptidlinker, der vorzugsweise 10–15 Aminosäuren lang und reich an Glycin und Serin ist, zwischen die kodierenden Sequenzen für die zwei Cytokine einzubringen. Die an der Herstellung all dieser Typen von Fusionen beteiligten DNA-Fusionen liegen innerhalb der Fähigkeit des Standes der Technik.
Einzelheiten der Konstruktion einer Fusion zwischen der murinen IL-12-p40-Untereinheit und murinem IL-2 waren zum Beispiel wie folgt. Volllängen-cDNA der p40-Untereinheit von murinem IL-12 wurde mittels PCR aus Maus-Milzzellen, die mit Concavalin A (5 μg/ml in Kulturmedium für 3 Tage) aktiviert worden waren, kloniert. Der Vorwärts-Primer hatte die Sequenz AA GCTAGC ACC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC (SEQ ID NR:7), in die eine NheI-Stelle GCTAGC (Reste 3–8 von SEQ ID NR:7) stromaufwärts des Translationsinitiationscodons ATG eingebracht wurde, und der reverse Primer hatte die Sequenz CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG (SEQ ID NR:8), in die eine XhoI-Stelle CTCGAG (Reste 1–6 der SEQ ID NR:8) unmittelbar stromabwärts des Translationsstoppcodons TAG (Anticodon CTA) eingebracht wurde. Nach der Sequenzbestätigung wurde das NheI-XhoI-Fragment, das die mu-p40-cDNA mit ihrem nativen Leader enthielt, an den XbaI-XhoI-gespaltenen Expressionsvektor pdCs [Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495–500] ligiert. Die Restriktionsstellen NheI und XbaI haben kompatible überhängende Enden, und die NheI-Stelle wurde zur Klonierung von mu-p40 verwendet, weil mu-p40 eine interne XbaI-Stelle besitzt.
Zur Konstruktion von DNA, die mu-p40-muIL-2 kodiert, wurde ein Oligonucleotid-Linker dazu verwendet, die mu-p40-DNA über ihre PstI-Stelle (C TGC AG) mit einem SmaI-XhoI-Fragment zu verbinden, das die cDNA von reifem murinem IL-2 enthielt. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle des Fusionsproteins war C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC (SEQ ID NR:9), wobei C TGC AG (Reste 1–6 von SEQ ID NR:9) die PstI-Stelle ist, C CCG GG (Reste 15–20 von SEQ ID NR:9) die SmaI-Stelle ist, TCC der C-terminale Aminosäurerest von murinem p40 ist und GCA der N-terminale Rest von reifem murinem IL-2 ist.
Die DNA, die einkettiges muIL12-muGMCSF kodiert, wurde von dem vorstehenden DNA-Konstrukt, das einkettiges muIL12-muIL2 kodiert, durch Ersetzen der muIL2-cDNA durch die muGMCSF-cDNA an der SmaI-Stelle abgleitet. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle von einkettigem muIL12 und muGMCSF war C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA (SEQ ID NR:10), wobei C TGC AG (Reste 1–6 von SEQ ID NR:10) die PstI-Stelle ist, C CCG GG (Reste 17–22 von SEQ ID NR:10) die SmaI-Stelle ist, TCC der C-terminale Aminosäurerest von murinem p40 ist und GCA der N-terminale Rest von reifem murinem GMCSF ist.
Beispiel 2: Expression von IL-12-Fusionsproteinen
IL-12-IL-2-Fusionsproteine wurden wie folgt exprimiert. Verschiedene Kombinationen der einzelnen Vektoren, die p40-Fusionen kodieren, und von Vektoren, die Proteine kodieren, die p35 umfassen, wurden zur transienten Expression der Fusionsproteine in humane 293-Epidermiskarzinomzellen cotransfiziert. Die DNA wurde unter Verwendung von Präparationskits (Wizard, Promega Inc.) gereinigt, zur Sterilisierung mit Ethanol ausgefällt und in sterilem Wasser resuspendiert.
Zur Expression biologisch aktiver IL-12-Fusionsprotein-Heterodimere wurden verschiedene Kombinationen der einzelnen Vektoren, die Fusions- und Nicht-Fusionsformen der Untereinheiten kodierten, durch Cotransfektion humaner 293-Epidermiskarzinomzellen transient exprimiert. Die DNA wurde unter Verwendung von Präparationskits (Wizard, Promega Inc.) gereinigt, zur Sterilisierung mit Ethanol ausgefällt und in sterilem Wasser resuspendiert. Calciumphosphat-Niederschläge wurden durch Standardverfahren unter Verwendung von 10 μg DNA pro ml (jeweils 5 μg, wenn zwei Plasmide cotransfiziert wurden) präpariert, und 0,5 ml/Platte wurden zu 293-Kulturen, die in 60-mm-Platten wuchsen, bei etwa 70% Konfluenz zugefügt (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgb., Sambrook, Fritsch und Maniatis, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Nach 16 Std. wurde das Medium, das den Niederschlag enthielt, entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Nach 3 Tagen wurde der Überstand entnommen und hinsichtlich der Produktion der Expression des transfizierten Gens mittels ELISA, biologischer Bestimmung der IL-12-Aktivität oder Immunpräzipitation und Analyse der radioaktiv markierten Proteine auf SDS-Gelen analysiert. Zur Markierung wurde Medium ohne Methionin zum Ersetzen des Wachstumsmediums am zweiten Tag der Kultur verwendet, und ³⁵S-Methionin (100 μCi/ml) wurde zugegeben. Nach einer weiteren 16-stündigen Inkubation wurden die Medien geerntet, durch Zentrifugation geklärt (5 min bei 13000 U/min in einer Tischzentrifuge) und mit Protein-A-Sepharose-Kugeln (10 μl Kugelvolumen pro ml Kulturüberstand) inkubiert. Nach 1 Std. bei Raumtemperatur wurden die Kugeln durch wiederholte Zentrifugation und Resuspendieren in PBS-Puffer, der 1 % Nonidet-P40 (NP-40) enthielt, gewaschen. Das endgültige Sediment wurde in SDS-haltigem Gelpuffer resuspendiert und für 2 min gekocht. Nach Entfernen der Kugeln durch Zentrifugation wurde der Überstand in zwei Aliquote aufgeteilt. Reduktionsmittel (5% 2-Mercaptoethanol) wurde zu einer Probe hinzugefügt, und beide Proben wurden vor dem Auftragen auf ein SDS-Polyacrylamidgel für 5 min gekocht. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Röntgenfilm exponiert (Autoradiographie).
Es wurden Transfektionen unter Verwendung der folgenden Expressionsplasmide durchgeführt: mu.p35 plus mu.p40-IL-2, KS-1/4-mu.p35 plus mu.p40, KS-1/4-mu.p35 plus mu.p40-IL-2, 14.18-mu.p35 plus mu.p40-IL-2, hu.Fc-.p35 plus hu.p40-IL-2, KS-1/4-hu.p35 plus hu.p40-IL-2 und 14.18-hu.p35 plus hu.p40-IL-2, wobei "mu" murine Proteine und "hu" humane Proteine bezeichnet.
Wenn die Zellen mit ³⁵S-Methionin metabolisch markiert und die sekretierten Proteine durch reduzierende SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie untersucht wurden, wurde in jedem Fall eine hohes Expressionsniveau beobachtet. Die Molekulargewichte reduzierter Fusionsproteine wurden auf Basis der Molekulargewichte der Komponentenproteine wie folgt vorhergesagt: p35 von IL-12, 35 kD; p40 von IL-12, 40 kD; IL-2, 16 kD; Fc, 32 kD; Ig schwere Kette, 55 kD und Ig leichte Kette, 28 kD. Proteine, die mit etwa den vorhergesagten Molekulargewichten wanderten, wurden beobachtet.
Stabil transfizierte Zelllinien, die Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen exprimierten, wurden ebenfalls isoliert. Im Fall der heterodimeren Konstrukte Expres sionsvektoren, die IL-12-p40-IL-2- oder IL-12-p40-GM-CSF-Fusionsprotein kodierten, wie zuvor für die IL-12-p40-Untereinheit allein beschrieben (Gillies et al. [1998] J. Immunol. 160:6195–62030). Transfizierte Zelllinien, die die p40-Fusionsproteine exprimierten, wurden ein zweites Mal mit Expressionsvektoren, die entweder das IL-12-p35-Untereinheit-, ein Fc-p35-Fusionsprotein kodierten, oder mit einem Antikörper-p35-Fusionsprotein-Expressionsvektor, wie beschrieben (Gillies et al. [1998] J. Immunol. 160:6195–62030), transfiziert.
Überstand von stabil transfizierten Zellen, die human-Fc-IL-12-IL-2 exprimierten (d.h. KS-p35 und p40-IL-2 exprimierten), wurde gesammelt, und die Produkte wurden durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose gemäß den Verfahren des Herstellers (Repligen, Needham, MA) gereinigt. Die reinen Proteine wurden mittels ELISA hinsichtlich des IL-12- und IL-2-Gehalts getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die einzelnen Cytokingehalte, auf die Masse bezogen, etwa 4-fach unterschieden, was mit dem 4-fachen Unterschied im Molekulargewicht zwischen IL-12 und IL-2 korreliert. Ebenso ergab ein Assay der Produkte von transfizierten Zellen, die human-KS-IL-12-IL-2 exprimierten, mittels ELISA hinsichtlich der IL-12- und IL-2-Spiegel ähnliche Werte für IL-12 und IL-2. Somit zeigen innerhalb der Genauigkeit der ELISAs die gemessenen Werte, dass IL-12 und IL-2 in einem Molverhältnis von etwa 1:1 produziert werden. Die gleichen Ergebnisse wurden mit den IL-12-GM-CSF Fusionsproteinen erhalten, die entweder mit dem Fc oder ganzem Antikörper hergestellt wurden..
Beispiel 3: Synergistische Aktivität von Fusionsproteinen in einem IFN-γ-Induktionsassay
Die biologische Aktivität der IL-12-IL-2 Fusionsproteine wurde in einem IFN-γ-Induktionsassay unter Verwendung entweder ruhender oder mitogenaktiverter humaner mononucleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) von menschlichen Freiwilligen (6) gemessen. Die IFN-γ-Produktion wurde mittels ELISA gemessen.
Humane mononucleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) wurden von gesunden Freiwilligen erhalten und durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque(Pharmacia) Gradienten (1700 U/min für 20 min) gereinigt. Der "Buffy Coat", der die PBMC enthielt, wurde mit serumfreiem Kulturmedium (SF-RPMI) auf ein Volumen von 50 ml verdünnt und durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 5 min gesammelt. Nach der Gradientenzentrifugation wurden die Zellen in Zellkultur medium, das 10% fötales Rinderserum (RPMI-10) enthielt, mit oder ohne Phytohämagglutinin (PHA; 10 μg/ml) in einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und für 3 Tage bei 37 C in einem befeuchteten CO₂-Brutschrank kultiviert. Die Zellen wurde durch Zentrifugation gesammelt, dreimal mit einem gleichen Volumen SF-RPMI gewaschen und resuspended in frischem RPMI-10 (1 × 10⁶ Zellen/ml) resuspendiert. Aliquote (100 μl) wurden in die Vertiefungen von mehreren Platten mit 96 Vertiefungen abgegeben, so dass eine endgültige Zellzahl von 10⁵ pro Vertiefung erhalten wurde. Testproben aus dem Kulturmedium wurden in frischem Kulturmedium in Reihe verdünnt und zu Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Kontrollvertiefungen erhielten IL-12 (6A) oder ein äquimolares Gemisch von kommerziellem IL-2 und IL-12 (6B; Cytokine wurden von R & D Systems bezogen). Die Platten wurden für 48 Std. bei 37°C in einem CO₂-Brutschrank inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden Aliquote (20 μl) für die Analyse der IFN-γ-Konzentration mittels ELISA nach den Anweisungen des Herstellers (Endogen, Inc., Woburn, MA USA) entnommen.
In 6A wurden die Aktivitäten des human-IL-12-IL-2-Fusionsproteins mit IL-12 allein verglichen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass IL-12 allein IFN-γ bis auf mäßige Spiegel induziert, während das IL-12-IL-2-Fusionsprotein die IFN-γ-Synthese stark induzierte. Weil auch bekannt ist, dass IL-2 für die IFN-γ-Synthese nicht ausreicht, zeigen diese Ergebnisse, dass die IL-12- und IL-2-Einheiten beide innerhalb des Fusionsproteins funktionell sind und synergistisch wirken.
Als nächstes wurden die Aktivitäten eines Fc-IL-12-IL-2-Fusionsproteins, eines KS-IL-12-IL-2-Fusionsproteins und eines Gemischs, das aus IL-12 und IL-2 im Molverhältnis 1:1 bestand, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, IFN-γ zu induzieren, verglichen. Die Ergebnisse in 6B zeigen, dass das Fc-IL-12-IL-2-Fusionsprotein und das KS-IL-12-IL-2-Fusionsprotein etwa die gleiche Aktivität wie ein äquimolares Gemisch von IL-12 und IL-2 haben. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Mausformen von IL-2 und IL-12, die auf die gerade im Beispiel 1 für die humanen Formen beschriebene Weise konstruiert wurden, zur Konstruktion von Fusionsproteinen verwendet wurden.
Beispiel 4: Biologische Aktivität von IL-2 und IL-12 der IL-12-IL-2-Fusionsproteine.
Die Aktivitäten von IL-2 und IL-12 in den Fusionsproteinen wurden in Assays auf Basis der Proliferation mit den freien Cytokinen verglichen. Die Aktivität eines muriner-Antikörper-14.18-IL-12-IL-2-Moleküls wurde in einem üblichen IL-12-Proliferationsassay getestet. Gemäß einem Standardverfahren (Gately, M. K., Chizzonite, R. und Presky, D. H. Current Protocols in Immunology [1995] S. 6.16.1–6.16.15) wurden menschliche PBMCs von Freiwilligen gewonnen und mit 5 Mikrogramm/ml Phytohämagglutinin-P für drei Tage gezüchtet, mit Hanks-HBSS gewaschen und in Mikrotiterplatten zu 10⁵ Zellen pro Vertiefung ausplattiert. Die Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Testproteine für 48 Stunden gezüchtet, und 0,3 Mikrocurie ³H-Thymidin wurden zehn Stunden, bevor die Spiegel des radioaktiven Einbaus bestimmt wurden, zugegeben. IL-12 und ein äquimolares Gemisch von IL-12 und IL-2 stimulierten den Einbau von ³H-Thymidin in Zellen in dosisabhängiger Weise, und das 14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein war etwa gleich wirksam bei der Stimulation des Einbaus von ³H-Thymidin. IL-2 stimulierte den Einbau von ³H-Thymidin nur in höheren molaren Konzentrationen, was zeigt, dass der beobachtete Einbau von ³H-Thymidin, der durch das 14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein stimuliert wurde, hauptsächlich auf die IL-12-Aktivität zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Zusätzlich wurde die biologische Aktivität der IL-2-Einheit in einem anderen Zellproliferationsassay gemäß einem Standardverfahren (Davis, L. S., Lipsky, P. E., und Bottomly, K. Current Protocols in Molecular Immunology [1995] S. 6.3.1–6.3.7) getestet. Die Maus-CTLL-2-Zelllinie hängt für die Proliferation von IL-2 ab. Die CTLL-2-Zelllinie kann auch als Reaktion auf IL-4 proliferieren, reagiert aber nicht auf IL-12. CTLL-2-Zellen im aktiven log-Phasenwachstum wurden zweimal mit Medium ohne IL-2 gewaschen und zu etwa 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in Mikrotitervertiefungen in Gegenwart verschiedener Mengen an kommerziellem murinem IL-2, murinem-14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein oder kommerziellem murinem IL-12 ausplattiert und für 48 Stunden gezüchtet. Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Anzahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung des MTT/MTS-Assays quantifiziert. 8 zeigt ein Experiment, in dem die Spiegel von IL-2, IL-12 oder 14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein variiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, das murines IL-2 und murines-14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein bei der Stimulation der Proliferation etwa gleich stark sind, während steigende Mengen an murinem IL-12 keine nachweisbare Stimulation der Zellproliferation bewirkten. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Stimulation der CTLL-2-Zellproliferation durch 14.18-IL-12-IL-2-Fusionsprotein auf die IL-2-Einheit und nicht die IL-12-Einheit zurückzuführen ist.
Beispiel 5: Konstruktion und Expression einkettiger und mehrkettiger IL-12-IL-2-Fusionsproteine mit und ohne Antikörpereinheiten
Ein einkettiges murines-IL-12-IL-2-Fusionsprotein wurde wie folgt konstruiert. Eine Fusion der kodierenden Sequenzen von p40-IL-2 wurde durch Verfahren konstruiert, die zu den zur Konstruktion der human-p40-IL-2-Fusion im Beispiel 1 verwendeten analog waren. Um die DNAs, die die p35- und p40-Untereinheiten von IL-12 kodieren, zu verbinden und eine einzige kodierende Sequenz zu erzeugen, wurde eine DNA, die einen Linker kodierte, mit einer XhoI-Stelle am 5'-Ende und einer BamHI-Stelle am 3'-Ende synthetisiert. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz von reifem p40-IL-2 wurde modifiziert, um eine Restriktionsstelle einzuführen, und dann an das 3'-Ende des Linkers ligiert. Das 3'-Ende der kodierenden Sequenz von murinem p35 wurde modifiziert, um eine Restriktionsstelle zu erzeugen, und an die XhoI-Stelle des Linkers ligiert. Die cDNAs, die im Beispiel 1 beschriebenes einkettiges muIL12 und mu-p40-muIL2 kodieren, wurden unter Verwendung einer angemessenen Restriktionsstelle in p40 vereinigt, um ein drittes DNA-Konstrukt zu erhalten, das einkettiges-muIL12-muIL2 kodierte. Diese Schritte wurden unter Verwendung verschiedener Vektoren und DNA-Fragmentisolationen, je nach Bedarf, durchgeführt. Die Sequenz der erhaltenen kodierenden Region für murines-p35-inker-p40-IL-2 ist SEQ ID NR:11.
Gleichzeitig wurde eine entsprechende kodierende Sequenz für einkettiges murines IL-12 durch entsprechende Verfahren konstruiert. Die kodierende Sequenz ist SEQ ID NR:12.
Außerdem konstruierten wir ferner eine DNA-Sequenz, die eine murine IgG2a-Fc-Region, fusioniert an den N-Terminus von p35-Linker-p40-IL-2, kodiert. Die kodierende Sequenz ist SEQ ID NR:13.
Gezüchtete 293-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden transfiziert, die die murinen einkettigen Fc-IL-12-IL-2- und Fc-IL-12-Proteine kodierten. Die Expression der Fusionsproteine wurde wie im Beispiel 2 beschrieben getestet. Fc-Fusionsproteine wurden aufgrund ihrer Bindung an Protein-A-Sepharose gereinigt, und hohe Spiegel der Expression von Fc-IL-12-IL-2 und Fc-IL-12 wurden beobachtet. Die Proteine wurden intakt synthetisiert, wie aus den apparenten Molekulargewichten aus der Wanderung auf SDS-Gelen abgeleitet wurde: Fc-IL-12-IL-2, 123 kD; und Fc-IL-12, 107 kD.
Das im Beispiel 1 beschriebene KS-scIL12-IL2-Fusionsprotein ist ein Tetramer mit zwei verschiedenen Polypeptidketten: der leichten Kette von KS-1/4 und der schweren Kette von KS-1/4 mit der scIL12-IL2-Einheit am C-Terminus. Um zu untersuchen, welche Stellen an einem Antikörpermolekül für die Bindung von Cytokineinheiten geeignet sind, wurde ein zweites Fusionsprotein konstruiert, in dem die KS-1/4-Antikörper-, IL-12- und IL-2-Einheiten in einer von der KS-IL12-IL2-Konfiguration im Beispiel 1 verschiedenen Konfiguration vorlagen. Dieses zweite Protein war tetramer und bestand aus zwei verschiedenen Polypeptiden. Ein Polypeptid bestand aus der leichten Kette des KS-1/4-Antikörpers. Das andere Polypeptid besteht aus einem einkettigen muIL12, fusioniert an den reifen N-Terminus der schweren Kette des KS-1/4-Antikörpers, gefolgt von murinem IL-2 am Carboxylterminus der schweren Kette.
Die cDNA, die die p35-Untereinheit von murinem IL-12 kodiert, wurde mittels PCR aus Maus-Milzzellen, die mit Concanavalin A (5g/ml in Kulturmedium für 3 Tage) aktiviert worden waren, kloniert. Der Vorwärts-Primer hat die Sequenz AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGC TAC (SEQ ID NR:14), wobei eine HindIII-Stelle AAGCTT (Reste 1–6 von SEQ ID NR:14) stromaufwärts des Translationsinitiationscodons ATG eingebracht worden ist, und der reverse Primer hat die Sequenz CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC (SEQ ID NO: 15), wobei eine XhoI-Stelle CTCGAG (Reste 1–6 von SEQ ID NR:15) stromabwärts des Translationsstoppcodons TGA (Anticodon TCA) eingebracht worden ist.
Die DNA, die das einkettige IL-12 kodiert, umfasst die mup35-DNA in Verbindung mit Oligonucleotiden, die einen an Glycin- und Serinresten reichen Linker kodieren, gefolgt von mup40-DNA. Das erhaltene Konstrukt hat die folgende Sequenz an der Oligonucleotidverknüpfung:
wobei G AGC TC (Reste 1–6 von SEQ ID NR:16) eine SacI-Restriktionsstelle genau stromaufwärts des Translationsstoppcodons von murinem p35 ist, GCG den C-terminalen Aminosäurerest von murinem p35 kodiert, GGA TCC (Reste 50–55 von SEQ ID NR:16) eine BamHI-Restriktionsstelle ist, die eingebracht wurde, um die Ligation zu vereinfachen, und ATG den N-terminalen Rest von reifem mu-p40 kodiert.
Die DNA, die einkettiges muIL12-KS-schwere-Kette-muGMCSF kodiert, hat die folgende Sequenz an der Verknüpfung von mup40 und dem reifen N-Terminus der schweren Kette von KS:
wobei C TGC AG (Reste 1–6 von SEQ ID NR:18) eine PstI-Stelle gerade stromaufwärts des Translationsstoppcodons von murinem p40 ist, TCC den C-terminalen Aminosäurerest von murinem p40 kodiert und CAG den N-terminalen Rest der reifen schweren Kette von KS kodiert. Die erhaltene DNA, die einkettiges mu-IL12-KS-schwere-Kette-muIL2 kodiert, wurde dann mit der leichten Kette von KS coexprimiert.
Um weiter zu untersuchen, welche Enden eines Antikörpermoleküls für die Erzeugung von Fusionsverknüpfungen verfügbar sind, und um zu untersuchen, wie viele verschiedene Polypeptide zu einem Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein verbunden werden können, wurde ein drittes Protein, das KS-1/4, IL-12, und IL-2 enthielt, nämlich IL12-KS (leichte Kette)+KS (schwere Kette)-IL2, exprimiert und hinsichtlich seiner Aktivität getestet. Dieses Fusionsprotein ist hexamer und umfasst drei verschiedene Polypeptide. Ein Polypeptid besteht aus dem murinen p35, fusioniert an die leichte Kette des KS-1/4-Antikörpers. Ein zweites Polypeptid besteht aus der schweren Kette des KS-1/4-Antikörpers, fusioniert an humanes IL-2 [Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428], und ein drittes Polypeptid ist das murine p40. Nach Expression werden zwei leichte Ketten und zwei schwere Ketten mittels Disulfidbindungen zu der tetrameren Antikörper-Cytokin-Struktur verbunden. Außerdem wird p35 am N-Terminus der leichten Kette ebenfalls über Disulfidbindungen mit p40 verbunden.
Die DNA, die mup35-KS-leichte Kette kodiert, hat die folgende Sequenz an der Verknüpfung:
wobei G AGC TC (Reste 1–6 von SEQ ID NR:20) eine SacI-Restriktionsstelle gerade stromaufwärts des Translationsstoppcodons von murinem p35 ist, GCG den C-terminalen Aminosäurerest von murinem p35 kodiert, GGA TCC (Reste 50–55 von SEQ ID NR:20) eine BamHI-Restriktionsstelle ist, die zur Erleichterung der Ligation eingebracht wurde, und GAG den N-terminalen Aminosäurerest der leichten Kette kodiert.
Zur Expression dieses hexameren Fusionsproteins wurde eine murines p40 exprimierende Zelllinie durch Transfektion mit einem Expressionsvektor, der ein Neomycin-Resistenzgen enthielt, und Selektion durch G418 erzeugt. Die murines p40 exprimierende Zelllinie wurde dann mit einem Expressionsvektor transfiziert, der die Transkriptionseinheiten sowohl für die leichte Kette als auch für die schwere Kette und einen Dihydrofolatreduktase-Selektionsmarker enthielt, der eine Selektion durch Methotrexat gestattete [Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160:6195].
Beispiel 6: Aktivität der murinen einkettigen IL-12-IL-2-Fusionsproteine
Die gleichen Verfahren, wie im Beispiel 4, wurden verwendet, um die Aktivität von murinem einkettigem IL-12-IL-2, das mittels transienter Expression hergestellt wurde, zu testen. Die Menge jedes Cytokins im Zellkulturüberstand wurde zunächst mittels ELISA bestimmt und zur Erstellung eines Dosis-Wirkungs-Kurve verwendet. Die Aktivitäten deckten sich sehr stark mit dem, was mit den Fc- und Antikörper-IL-12-IL-2-Fusionsproteinen gefunden und vorstehend beschrieben wurde.
Genauer gesagt, wurde die IL-12-Aktivität eines murinen einkettigen (sc) IL-12-IL-2- und murinen Fc-scIL-12-IL-2-Moleküls in dem im Beispiel 4 beschriebenen Human-PBMC-Zellproliferationsassay getestet. IL-12 und ein äquimolares Gemisch von IL-12 und IL-2 stimulierten den Einbau von ³H-Thymidin in Zellen auf dosisabhängige Weise. Bezogen auf ein mol, waren sowohl das scIL-12-IL-2- als auch das Fc-scIL-12-IL-2-Fusionsprotein etwa so wirksam wie IL-12 bei der Stimulation des Einbaus von ³H-Thymidin (9). Wie im Beispiel 4 beschrieben, stimuliert IL-2 den Einbau von ³H-Thymidin nur bei viel höheren molaren Konzentrationen, was zeigt, dass der beobachtete, durch die scIL-12-IL-2 Fusionsproteine stimulierte Einbau von ³H-Thymidin hauptsächlich auf ihre IL-12-Aktivität zurückzuführen ist.
Außerdem wurde die biologische Aktivität der IL-2-Einheit in den scIL-12-IL-2-Fusionsproteinen in einem zellbasierten Assay getestet, und es wurde gefunden, dass sie innerhalb der Genauigkeit des Assays etwa die gleiche wie kommerzielles IL-2, bezogen auf ein mol, war. Die biologische Aktivität der IL-2-Einheit wurde in dem CTLL-2-Zellproliferationsassay, wie im Beispiel 4 beschrieben, getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass murines IL-2, murines scIL-12-IL-2- und murines Fc-IL-12-IL-2-Fusionsprotein bei der Stimulierung der Proliferation etwa gleich stark waren. Murines IL-12 bewirkt keine nachweisbare Stimulation der CTLL-2-Zellproliferation. Diese Ergebnisse zeigen, dass die CTLL-2-Zellproliferation durch scIL-12-IL-2-Fusionsproteine auf die IL-2-Einheit und nicht die IL-12-Einheit zurückzuführen war.
Die IL-12- und IL-2-Aktivitäten der im Beispiel 5 beschriebenen Fc-IL12-IL2-, IL12-KS-IL2- und IL12-KS (leichte Kette)+KS (schwere Kette)-IL2-Proteine wurden ebenfalls in zellbasierten Assays getestet. Unter Verwendung des Assay der PBMC-Zellproliferation/des Einbaus von tritiiertem Thyrnidin zeigten die Fc-IL12-IL2-, IL12-KS-IL2- und IL12-KS (leichte Kette) + KS (schwere Kette)-IL2-Proteine sämtlich eine starke IL-12-Aktivität. Ebenso zeigten die Fc-IL12-IL2-, IL12-KS-IL2- und IL12-KS (leichte Kette)+KS (schwere Kette)-IL2-Proteine bei Verwendung des CTLL-2-Zellproliferationsassays sämtlich eine starke IL-2-Aktivität. Zusätzlich banden in einem ELISA die IL12-KS-IL2- und IL12-KS (leichte Kette) + KS (schwere Kette)-IL2-Proteine beide fest an das EpCAM-Antigen, sogar obwohl die V-Regionen der schweren bzw. leichten Kette an ihren N-Termini an andere Proteine fusioniert waren.
Beispiel 7: Aktivität der murinen IL-12-GM-CSF-Fusionsproteine
Die IL-12-Aktivität eines murinen Fc-IL-12-GM-CSF-Moleküls wurde in einem Zellproliferationsassay getestet (10). Humane PBMCs wurden von drei Freiwilligen erhalten und gemäß einem Standardverfahren (Gately, M. K., Chizzonite, R., und Presky, D. H. Current Protocols in Immunology [1995] S. 6.16.1–6.16.15) mit 5 Mikrogramm/ml Phytohämagglutinin-P für drei Tage gezüchtet, mit Hanks-HBSS gewaschen und in Mikrotiterplatten zu 10⁵ Zellen pro Vertiefung ausplat tiert. Die Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Testproteine für 48 Stunden inkubiert, und 0,3 Mikrocurie ³H-Thymidin wurden dann zehn Stunden, bevor die Spiegel des radioaktiven Einbaus bestimmt wurden, zugegeben. IL-12 und ein äquimolares Gemisch von IL-12 und GM-CSF stimulierten den Einbau von ³H-Thymidin in Zellen auf dosisabhängige Weise, und das 14.18-IL-12-GM-CSF-Fusionsprotein war etwa gleich wirksam bei der Stimulation des Einbaus von ³H-Thymidin. GM-CSF stimulierte den Einbau von ³H-Thymidin bei den getesteten Konzentrationen nicht, was zeigt, dass der beobachtete Einbau von ³H-Thymidin, der durch das 14.18-IL-12-GM-CSF-Fusionsprotein stimuliert wurde, hauptsächlich auf seine IL-12-Aktivität zurückzuführen war.
Außerdem wird die biologische Aktivität der GM-CSF-Einheit verschiedener IL-12-Gm-CSF-Fusionsproteine in zellbasierten Assays getestet. Es wird gefunden, dass die GM-CSF-Einheit aktiv ist, wobei die Aktivität pro mol im gleichen allgemeinen Bereich liegt, wie kommerzielles GM-CSF. Zum Beispiel wird die biologische Aktivität der GM-CSF-Einheit in einem anderen Zellproliferationsassay getestet, wobei nach einem Verfahren vorgegangen wird, das dem Fachmann auf dem Gebiet der molekularen Immunologie bekannt ist (Cooper, S.C., und Broxmeyer, H. E. Current Protocols in Molecular Immunology [1996] S. 6.4.1–6.4.20),. Die Maus-32D(GM)-Zelllinie hängt zur Proliferation von GM-CSF ab; diese Linie wurde von der ursprünglichen, von Cooper und Broxmeyer beschriebenen 32D-Zelllinie derart angepasst, so dass sie besonders empfindlich für GM-CSF ist (Faas et al., Eur. J. Immunol. [1993] 23:1201–14). Die 32D(GM)-Zelllinie reagiert nicht auf IL-12. 32D(GM)-Zellen im aktiven log-Phasenwachstum werden zweimal in Medium ohne GM-CSF gewaschen und zu etwa 5 × 10³ Zellen pro Vertiefung in Gegenwart verschiedener Mengen an kommerziellem murinem GM-CSF oder murinem IL-12-GM-CSF-Fusionsprotein in Mikrotitervertiefungen ausplattiert und für 48 Stunden gezüchtet. 0,3 Mikrocurie ³H-Thymidin werden sechzehn Stunden, bevor die Spiegel an radioaktivem Einbau bestimmt werden, hinzugegeben. Es gibt eine dosisabhängige Zunahme des Einbaus von ³H-Thymidin mit steigenden Spiegeln an IL-12-GM-CSF-Fusionsprotein, was zeigt, dass die GM-CSF-Einheit des IL-12-GM-CSF-Fusionsproteins aktiv ist. Außerdem ist die biologische Aktivität von GM-CSF des Fusionsproteins, bezogen auf mol berechnet, mit derjenigen von kommerziellem murinem GM-CSF vergleichbar.
Beispiel 8: Behandlung von Kolonkarzinom in einem immunprofizienten Säuger mit einem Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein.
Um zu testen, ob ein Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein zur Behandlung von Kolonkarzinom bei einem Säuger mit einem intakten Immunsystem verwendet werden könnte, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. CT26 ist eine Kolonkarzinom-Zelllinie, die von Balb/C-Mäusen stammt. Durch Standard-Gentechnologieverfahren wurde diese Zelllinie genetisch verändert, so dass sie das humane epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) exprimiert, bei dem es sich um das vom KS-1/4-Antikörper erkannte Antigen handelt; diese Zellen werden als CT26/KSA-Zellen bezeichnet.
Balb/C-Mäuse wurden subkutan mit 2 × 10⁶ CT26/KSA-Zellen beimpft. Als die Tumoren ein Volumen von etwa 100–200 Kubikmillimeter erreicht hatten, wurden die Mäuse zur weiteren Untersuchung in drei Gruppen von 9 Mäusen randomisiert. Beginnend am Tag 0, wurden tumortragende Mäuse mit PBS, etwa 3,4 Mikrogramm KS-IL2, gemischt mit etwa 5,3 Mikrogramm KS-IL12, oder etwa 6 Mikrogramm KS-IL2-IL12 behandelt. Diese Dosen waren derart gestaltet, dass jedem Satz von Mäusen eine gleiche Anzahl IL-12- und IL-2-Moleküle zugeführt wurde. Sie wurden den Mäusen einmal täglich für fünf Tage intratumoral injiziert. Die Tumorgrößen wurden mit Schieblehren gemessen.
Die Ergebnisse eines solches Experiments sind in 11 gezeigt. Bei diesem Experiment verursachte KS-IL12-IL2 eine durchgreifende Hemmung des Tumorwachstums. Das Gemisch von KS-IL12 und KS-IL2 bewirkte ebenfalls eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums, aber nicht so vollständig wie KS-IL12-IL2. In der Gruppe von Mäusen, die mit KS-IL12-IL2 behandelt wurden, waren sechs der neun Mäuse anscheinend von ihren Tumoren geheilt: diese sechs Mäuse überlebten bis zum Tag 93, an dem das Experiment beendet wurde; und die Tumoren bei diesen Mäusen schrumpften und verschwanden, so dass von Tag 39 bis Tag 93 kein subkutaner Tumor nachgewiesen werden konnte. Die übrigen drei Mäuse hatten Tumoren, deren Wachstum verzögert war, so dass die Tumorvolumina erst nach Tag 87 4000 Kubikmillimeter überschritten.
Von den Mäusen, die mit einem Gemisch von KS-IL 12 und KS-IL2 behandelt worden waren, waren zwei Mäuse anscheinend von ihren subkutanen Tumoren geheilt und überlebten bis zum Ende des Experiments. Die Tumoren in den verbleibenden sieben Mäusen verschwanden nicht und wuchsen schließlich auf Volumina von 1000 Kubikmillimeter (1 Maus) oder mehr als 4000 Kubikmillimeter (6 Mäuse).
Die Tatsache, dass KS-IL12-IL2 wirksamer ist als ein äquimolares Gemisch von KS-IL12 und KS-IL2, ist überraschend. Die Dosen bei diesem Experiment führen etwa 15 Picomol Fusionsprotein pro Dosis zu, was etwa 9 × 10¹² Molekülen entspricht. Zu Beginn der Behandlung hat jeder Tumor ein Volumen von etwa 160 Kubikmillimeter, was etwa 160 Millionen Zellen entspricht. Jede Zelle exprimiert etwa 10⁶ Moleküle EpCAM, so dass es etwa 1,6 × 10¹⁴ EpCAM-Antigenmoleküle gibt, an die der KS-Antikörper binden kann. Wenn also KS-IL12 und KS-IL2 gemischt und in Mäuse, die derartige Tumoren trugen, injiziert wurden, ist es unwahrscheinlich, dass diese beiden Immuncytokin-Fusionsproteine miteinander um die Antigenbindungsstellen konkurrierten. Somit sollte die wirksame Dosis von IL-12 und IL-2 an der Tumorstelle für das Gemisch von KS-IL12 und KSIL2 zumindest so hoch wie für KS-IL12-IL2 gewesen sein.
Beispiel 9: Behandlung von Kolonkarzinom mit einem Mehrfach-Cytokin-Fusionsprotein bei einem immundefizienten Säuger.
Viele Formen der Krebstherapie haben die Wirkung, dass sie sich teilende Zellen, einschließlich Zellen des Immunsystems, abtöten. Dadurch werden Krebspatienten oft immunsupprimiert. Um zu untersuchen, ob Fusionsproteine mit mehreren Cytokinen zur Behandlung eines Säugers mit einem supprimierten Immunsystem verwendet werden können, wurden SCID-Mäuse, die CT26/KSA-Tumoren trugen, mit KS-IL12-IL2, einem Gemisch von KS-IL12 und KS-IL2 oder mit PBS behandelt. SCID-Mäuse sind sowohl im Hinblick auf die B-Zellen als auch die T-Zellen defizient und hängen für ihre Fähigkeit, Infektionen zu bekämpfen, von Zweigen des angeborenen Immunsystems, wie NK-Zellen, ab.
Mäuse mit subkutanen CT26/KSA-Tumoren wurden erzeugt, wie im Beispiel 8 beschrieben. Drei Gruppen von jeweils 8 Mäusen, die Tumoren von etwa 100 bis 200 Kubikmillimeter trugen, wurden mittels intratumoraler Injektion mit der gleichen Dosierung und dem gleichen Schema, wie im Beispiel 8, behandelt. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. In diesem Fall waren das KS-IL12-IL2-Fusionsprotein und das Gemisch von KS-IL12 und KS-IL2 etwa gleich wirksam: fünf von acht Mäusen waren in jeder Gruppe am Tag 25 geheilt. Bei den Mäusen, die nicht geheilt wurden, begannen jedoch fünf von sechs Tumoren mit einer Rate, die für Tumoren in unbehandelten Tieren charakteristisch ist, mit einer wirksamen Verzögerung von etwa 14 bis 21 Tagen zu wachsen. Dies steht im Gegensatz zu den Tumoren in immunprofizienten Mäusen im Beispiel 8: Sogar wenn die Tumoren durch die Behandlung mit KS-IL12-IL2 nicht vollständig beseitigt wurden, be gannen die Tumoren erst etwa 60 Tage nach dem Beginn des Experiments aggressiv zu wachsen.
Diese Experimente zeigen, dass ein Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein zur Behandlung von Krebs bei einem immunsupprimierten Tier verwendet werden kann.
Beispiel 10: Behandlung von Lungenkarzinom durch intratumorale Injektion eines Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteins: Vergleich mit der Behandlung durch einzelne Immuncytokine
Um die Wirksamkeit von Fusionsproteinen mit mehreren Cytokinen und Immuncytokinen, die einzelne Cytokineinheiten tragen, gegen einen von Lungenzellen stammenden Krebs zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Lewis-Lungenkarzinom (LLC) ist ein aggressiver, von C57BL/6-Mäusen stammender Tumor. Eine LLC-Zelllinie, die das humane EpCAM-Protein exprimiert, wurde durch Standardgentechnologie konstruiert; die Zelllinie wurde als LLC/KSA bezeichnet.
C57BL/6-Mäuse mit subkutanen LLC/KSA-Tumoren wurden erzeugt, wie im Beispiel 8 beschrieben (Überprüfen von # Zellen mit KML). Vier Gruppen mit jeweils 5 Mäusen, die Tumoren von etwa 100 bis 200 Kubikmillimetern trugen, wurden fünf Tage lang durch intratumorale Injektion behandelt. Den Mäusen wurden PBS, etwa 20 Mikrogramm KS-IL12, etwa 20 Mikrogramm KS-IL12 oder etwa 20 Mikrogramm KS-IL12-IL2 injiziert.
Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt. In diesem Fall war das KS-IL12-IL2-Fusionsprotein viel wirksamer als entweder KS-IL12 oder KS-IL2. Bei allen mit dem KS-IL12-IL2-Fusionsprotein behandelten Mäusen verschwanden die Tumoren bis zum Tag 27. Am Tag 74 wurden diese Mäuse für einen Lungenmetastase-Test, wie im Beispiel 14 beschrieben, verwendet; die ursprünglichen subkutanen Tumoren erschienen in der Zwischenzeit oder während des zweiten Experiments nicht wieder. Dagegen führte eine Behandlung mit entweder KS-IL2 oder KS-IL12 zu einer gewissen apparenten Tumorschrumpfung und einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums, aber die Tumoren wuchsen schließlich. Ein Vergleich der Ergebnisse dieses Beispiels und der vorhergehenden Beispiele zeigt, dass bei bestimmten Erkrankungen und Verabreichungsweisen eine Behandlung mit einem Gemisch von Immuncytokinen, die verschiedene Cytokineinheiten tragen, einer Behandlung mit einem einzigen Typ des Immuncytokins überlegen ist.
Beispiel 12: Behandlung von Lungenkarzinom durch intratumorale Injektion eines Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteins: Vergleich mit der Behandlung durch ein Gemisch von Immuncytokinen
Um die Wirksamkeit von Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen und Gemischen von Immuncytokinen, die verschiedene Cytokineinheiten tragen, gegen einen von Lungenzellen stammenden Krebs zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
C57BL/6-Mäuse mit subkutanen LLC/KSA-Tumoren wurden erzeugt, wie im Beispiel 11 beschrieben. Drei Gruppen von jeweils 7 Mäusen, die Tumoren von etwa 100 bis 200 Kubikmillimetern trugen, wurden für fünf Tage durch intratumorale Injektion behandelt. Den Mäusen wurden PBS, ein Gemisch von etwa 18 Mikrogramm KS-IL12 und etwa 11,5 Mikrogramm KS-IL12 oder etwa 20 Mikrogramm KS-IL12-IL2 injiziert.
Die Ergebnisse sind in 14 dargestellt. In diesem Fall war das KS-IL12-IL2-Fusionsprotein viel wirksamer als die Mischung von KS-IL12 und KS-IL2. In allen Mäusen, die mit dem KIL12-IL2-Fusionsprotein behandelt wurden, waren die Tumoren bis zum Tag 27 verschwunden. Dagegen führte eine Behandlung mit dem Gemisch von KS-IL12 und KS-IL2 zu einer gewissen apparenten Tumorschrumpfung und einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums, aber alle Tumoren in dieser Behandlungsgruppe wuchsen schließlich wieder.
Beispiel 13: Antigenabhängigkeit der Anti-Tumor-Aktivität eines Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsproteins
Um zu untersuchen, ob die Wirksamkeit eines Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsproteins bei der Behandlung eines Tumors von der tumorspezifischen Expression des Antigens abhing, das von dem Antikörper erkannt wird, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Ein Satz von sieben C57BL/6 Mäusen mit subkutanen LLC/KSA-Tumoren und ein zweiter Satz von neun Mäusen mit Tumoren, die von der parentalen LLC-Zelllinie stammten, wurde wie im Beispiel 11 beschrieben erzeugt. Diese zwei Gruppen von Mäusen, die Tumoren von etwa 100 bis 200 Kubikmillimeter trugen, wurden für fünf Tage durch intratumorale Injektion behandelt. Den Mäusen wurden etwa 20 Mikrogramm KS-IL12-IL2 injiziert.
Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. In diesem Fall wurden alle Mäuse, die LLC/KSA-Tumoren trugen, vollständig von ihren Tumoren geheilt. Dagegen wurden nur zwei der Mäuse geheilt, die LLC-Tumoren trugen; die anderen LLC-Tumor-tragenden Mäuse erfuhren sämtlich eine transiente Verringerung ihrer Tumorvolumina, aber ihre Tumoren wuchsen schließlich auf große Volumina.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Erkennung des EpCAM-Oberflächenantigens die Anheftung von KS-IL12-IL2 an die Oberfläche von LLC/KSA-Tumorzellen fördert, und die so erhaltene Immunantwort ist verstärkt. Es wurde auch eine gewisse Anti-Tumor-Wirkung gegen von LLC stammende Tumoren beobachtet; ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann die Anti-Tumor-Wirkung von KS-IL12-IL2 in diesem Fall auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass das Fusionsprotein direkt in den Tumor injiziert wurde und daher transient im Tumor lokalisiert war.
Beispiel 14: Erzeugung eines Immungedächtnisses gegen einen Tumorzelltyp
Die Entwicklung von Metastasen ist ein Hauptproblem bei der Behandlung von Krebs. Um zu testen, ob eine Behandlung mit einem Mehrfach-Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein zur Bildung eines langandauernden Immungedächtnisses gegen einen Tumorzelltyp führen und die Etablierung von Metastasen verhindern könnte, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Fünf C57BL/6-Mäuse von Beispiel 11 waren mit KS-IL12-IL2 behandelt und anscheinend von ihren subkutanen Tumoren geheilt worden. Am Tag 74, bezogen auf den Beginn der Behandlung, wie im Beispiel 14 beschrieben, wurden diesen fünf Mäusen 10⁶ LLC/KSA-Zellen i.v. injiziert. Als Kontrolle wurden acht C57BL/6-Mäusen ebenfalls 10⁶ LLC/KSA-Zellen i.v. injiziert.
Am Tag 28 wurden die Mäuse getötet, und die Lungen wurden auf Metastasen untersucht. Die Lungen der acht Kontrollmäuse waren zu 70% bis 100% mit Metastasen bedeckt, wobei die Bedeckung der Lungenoberfläche durchschnittlich 85% betrug. Das mittlere Lungengewicht betrug bei diesen Mäusen 0,86 Gramm. Dagegen wurden keine Metastasen auf der Oberfläche von Lungen der fünf vorbehandelten Mäuse gefunden, und das durchschnittliche Lungengewicht betrug 0,28 Gramm, was dem Gewicht einer normalen Mauslunge entspricht. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der ursprünglichen Tumorzellen zu einem langandauernden Immungedächtnis gegen die Tumorzellen führte; dieses Gedächtnis verhinderte die Etablierung von Metastasen dieses Tumorzelltyps.
Tabelle X. Schutz "rezidivierter " Mäuse vor LLC-KSA-Lungenmetastasen
Das durchschnittliche Lungengewicht der Kontrollgruppe ohne Tumor betrug 0,2 g. Die Metastasenbewertungen basieren auf % Oberflächenbedeckung der fusionierten metastatischen Nodi, wobei 0 = keine Metastasen, 1 = 1–25% Bedeckung; 2 = 25–50% Bedeckung; 3 = 50–75% Bedeckung und 4 = 75–100% Bedeckung
Ein zweites Experiment zum Testen der Immungedächtnisbildung verwendete sechs der sieben Mäuse von Beispiel 12, denen LLC/KSA-Tumorzellen injiziert worden waren, die subkutane Tumoren entwickelt hatten und bei denen diese Tumoren verschwunden waren. Zweiundsechzig Tage nach dem Beginn der Behandlung im Beispiel 12 wurden sechs vorbehandelten Mäusen und 10 nativen, unbehandelten C57BL/6-Kontrollmäusen s.c. 10⁶ LLC-Zellen injiziert. Diese Zellen exprimieren nicht das humane KS-Antigen, EpCAM.
In den nativen Mäusen bildeten die injizierten LLC-Zellen Tumoren, die in allen Mäusen mit einer schnellen Rate wuchsen. Dagegen wuchsen die Tumoren in den vorbehandelten Mäusen viel langsamer, und in einer Maus wurde kein subkutaner Tumor nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Weil das humane KS-Antigen, EpCAM, auf LLC-Zellen nicht exprimiert wird, basierte die Immunantwort auf die LLC-Zellen auf anderen, von diesen Zellen exprimierten Antigenen.
Beispiel 15: Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteine als Impfstoffe
Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteine können als Impfstoffe verwendet werden, wenn sie an ein Antigenprotein fusioniert werden. Die besondere Reihenfolge der Einheiten von N-Terminus zum C-Terminus oder, ob das Fusionsprotein eine ein zelne Polypeptidkette oder ein Oligomer ist, kann je nach der Einfachheit der Konstruktion der exprimierenden Plasmide variieren. Das Protein kann auf eine Mehrzahl an Wegen, wie intravenös, subkutan, intraperitoneal usw., verabreicht werden. Ebenso müssen die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung gewöhnlich empirisch bestimmt werden, wie es für Humanimpfstoffe Praxis und dem Fachmann auf dem Gebiet der Impfstoffentwicklung bekannt ist.
Zum Beispiel wird ein Fusionsprotein der Form Antigen-IL-12-Cytokin einer Maus verabreicht, wobei das Cytokin im Fusionsprotein ein von IL-12 verschiedenes, zweites Cytokin ist. Kontrollmäuse erhalten die gleiche Menge Antigen-Cytokin, Antigen-IL-12 oder nur Antigen. Zu verschiedenen Zeitpunkten während und/oder nach der Verabreichung des Antigen-Fusionsproteins werden Blutproben durch retro-orbitale Blutung gesammelt, und Plasma wird präpariert und hinsichtlich des Vorliegens von Antikörpern, die gegen das Antigen gerichtet sind, analysiert. Es wird gefunden, dass Antikörper gegen das Antigen gebildet werden. Außerdem ist die Art der Immunantwort gegen das Antigen charakteristisch für eine Th1-Antwort. Die Antikörperreaktion ist stärker und der erzeugte Antikörpertyp ist anders als bei bestimmten Kontrollimmunisierungen.
Genauer gesagt, wird ein humanisierter-Antikörper-murines-IL-12-IL-2-Fusionsprotein in PBS-Puffer intravenös (5 μg/Tag × 5) in Balb/c-Mäuse injiziert. Kontrollmäuse erhalten den gleichen Antikörper in den gleichen Mengen, aber ohne gebundenes IL-12-IL-2. Keine der Injektionslösungen enthält einen anderen Adjuvanstyp. Am Tag 10 werden Blutproben mittels retro-orbitaler Blutung in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, und Plasma wird durch Sammeln von Blutproben in Kunststoffröhrchen, die Natriumcitrat enthalten, gefolgt von Zentrifugation bei voller Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Tischmikrozentrifuge, präpariert. ELISA-Platten (96 Vertiefungen) werden mit dem humanisierten Antikörperprotein beschichtet, das die humane konstante Region enthält und zum Einfangen jeglicher Maus-Antikörper verwendet wird, die als Antwort auf die Immunisierung gebildet werden. Nach Abwaschen des ungebundenen Materials werden die gebundenen Maus-Antikörper mit Ziege-Anti-Maus-Fc-Antikörper (Jackson ImmunoResearch), der an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist, nachgewiesen. Jeder gebundene Antikörper könnte entweder gegen die humanen konstanten Regionen oder die variable Region gerichtet sein, die beide dem humanisierten Antikörper und den Fusionsproteinen gemeinsam sind.
Es gibt wenig oder keine Reaktivität mit dem humanisierten Antikörper ohne fusioniertes IL-12-IL-2. Das Fusionsprotein induziert dagegen eine starke Antikörperreaktion in Abwesenheit exogener Adjuvantien und trotz der Tatsache, dass der intravenöse Verabreichungsweg zur Induktion solcher Antworten verglichen mit entweder subkutaner oder intraperitonealer Verabreichung sehr ungünstig ist. Antikörper des IgG2a-Isotyps, die für durch IL-12 verstärkte Antworten typisch sind, werden bei der Gruppe, der Antikörper-IL-12-IL-2 injiziert wurde, aber nicht bei der Gruppe, der humanisierter Antikörper injiziert wurde, beobachtet.
Die Immunogenität der Antigen-IL-12-Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteine, die auf verschiedenen Wegen verabreicht wurden, wird durch Injizieren einer Lösung des Fusionsproteins (wie des vorstehend beschriebenen) in PBS oder einem anderen biologisch verträglichen Puffer oder einem bekannten Adjuvans, wie inkomplettem oder komplettem Freundschen Adjuvans, getestet. Zum Beispiel können einzelne oder mehrfache subkutane, intradermale oder intraperitoneale Injektionen alle zwei Wochen verabreicht werden. Alternativ kann das Fusionsprotein zuerst durch subkutane Injektion, dann gefolgt von intraperitonealer Injektion, verabreicht werden. Freundsches Adjuvans kann aufgrund der Reizung an der Injektionsstelle zur Verendung beim Menschen nicht eingesetzt werden. Alternative Adjuvantien, wie Niederschläge von Aluminiumhydroxid (Alaun), sind für die Verwendung bei Menschen zugelassen und können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Neue organisch-chemische Adjuvantien auf Basis von Squalen und Lipiden können ebenfalls für Injektionen in die Haut verwendet werden.
Beispiel 16: Gentherapie mit Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen
Die Anti-Krebs-Aktivität von Mehrfach-Cytokin-Fusionsproteinen, die durch Gentherapieverfahren zugeführt werden, wurde auch für die Behandlung von Lungenkrebs demonstriert. Lewis-Lungenkarzinomzellen wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen viralen Vektorsystems (pLNCX-scIL-12-IL-2- oder pLNCX-scIL-12-DNA, in die PA317-Verpackungszelllinie transfiziert) stabil transfiziert. Diese Konstrukte kodieren eine einkettige Version von IL-12, in dem die p35- und p40-Untereinheiten mit einem Linker verbunden sind. Die Klone wurden in vitro unter Verwendung von G418-haltigem Medium selektiert, und Klone, die stabil etwa 50 bis 60 ng/ml IL-12 exprimierten, wurden mittels ELISA (R & D Systems) identifiziert.
Etwa 1 × 10⁶ und etwa 5 × 10⁶ LLC-Zellen, die scIL-12 oder scIL-12-IL-2 exprimierten, wurden s.c. in C57BL/6-Mäuse und auch in SCID-Mäuse injiziert. Als Kontrolle wurden 2 × 10⁶ LLC-Zellen in C57BL/6-Mäuse und auch in SCID-Mäuse injiziert. Die LLC-Zellen, die IL-12 exprimieren, bilden Tumoren, die mit etwa der gleichen Rate wachsen, wie von LLC-Zellen stammende Tumoren, die nicht derart genetisch verändert wurden, dass sie Cytokine exprimieren. Sowohl in C57BL/6-Mäusen als auch in SCID-Mäusen bildeten jedoch LLC-Zellen, die scIL-12-IL-2 exprimierten, entweder keine subkutanen Tumoren oder bildeten Tumoren, die anschließend schrumpften und verschwanden (17 und 18).
Beispiel 17: Konstruktion von DNA, die Lymphotaktin-KS-IL2 kodiert, und Expression des Lymphotaktin-KS-IL2-Proteins.
Chemokine sind eine bestimmte Klasse von Cytokinen, von denen angenommen wird, dass sie Gradienten bilden und die Chemotaxis von Immunzellen vermitteln. Außerdem können Chemokine, wie andere Cytokine, die Expression spezifischer Gene in Zielzellen induzieren. Ein Merkmal von Chemokinen ist, dass der freie N-Terminus oft für die Aktivität erforderlich ist, was den Arten, wie Fusionsproteine konstruiert werden könnten, Beschränkungen auferlegen könnte.
Ein Cytokin-Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein wurde konstruiert, das aus dem Cytokin Lymphotaktin, einem Chemokin, dem Antikörper KS-1/4 und dem Cytokin IL-2 bestand. Dieses Fusionsprotein war tetramer und umfasste zwei verschiedene Polypeptide. ein Polypeptid bestand aus murinem Lymphotaktin, fusioniert an den N-Terminus der schweren Kette des KS-1/4-Antikörpers, gefolgt von IL-2 am C-Terminus. Die Fusion der schweren Kette von KS-1/4 mit IL-2 am C-Terminus, die "KS-IL2-schwere-Kette" ist zuvor beschrieben worden [Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428]. Das andere Polypeptid bestand aus der leichten Kette des KS-1/4-Antikörpers.
Die vollständige kodierende Sequenz von murinem Lymphotaktin wurde von Keiner und Zlotnik (Science 266:1395 [1998]) veröffentlicht. Um DNA zu konstruieren, die ein Fusionsprotein aus murinem Lymphotaktin und der schweren Kette von KS-IL2 kodiert, wurde die murine Lymphotaktin-cDNA mittels PCR angepasst, wobei der Vorwärts-Primer TCTAGAGCCACC ATG AGA CTT CTC CTC CTG AC (SEQ ID NR:29), in dem eine XbaI-Stelle TCTAGA (Reste 1–6 von SEQ ID NR:29) stromaufwärts des Translationsinitiationscodons ATG platziert wurde, und der reverse Primer GGA TCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG (SEQ ID NR:30), der eine BamHI-Stelle GGA TCC (Reste 1–6 von SEQ ID NR: 30) unmittelbar 3' des GGG-Codons (Anticodon CCC), das den C-terminalen Aminosäurerest von murinem Lymphotaktin kodiert, einbrachte, verwendet wurden. Nach Klonieren des PCR-Fragments und Sequenzbestätigung wurde das XbaI-BamHI-Fragment, das die murine Lymphotaktin-cDNA enthielt, an einen BamHI-AflII-Oligonucleotid-Duplex ligiert, der einen an Glycin- und Serinresten reichen flexiblen Peptidlinker kodierte. Das AflII-Ende wurde wiederum mit einer künstlichen AflII-Stelle verknüpft, die dem reifen N-Terminus der schweren Kette von KS-IL2 vorausging. Die DNA-Sequenz an den Verknüpfungen, die sich aus den zwei Ligationen ergibt, ist nachstehend angegeben:
wobei GGATCC (Reste 4–9 von SEQ ID NR:31) und CTTAAG (Reste 48–53 von SEQ ID NR:31) die beiden Restriktionsstellen BamHI bzw. AflII sind, die zur Rekonstruktion verwendet wurden; CCC den C-terminalen Aminosäurerest von murinem Lymphotaktin kodiert; CAG den reifen N-Terminus der schweren Kette von KS-IL2 kodiert; und die Aminosäuresequenz des GlySer-reichen Peptidlinkers über der DNA-Sequenz dargestellt ist. Die DNA, die die murines-Lymphotaktin-KS-IL2-schwere Kette kodiert, wurde dann in einen Expressionsvektor kloniert und dann mit der leichten Kette von KS-1/4 coexprimiert.
Das exprimierte Lymphotaktin-KS-IL2-Fusionsprotein wird in einem Boyden-Kammer-Wanderungsassay unter Verwendung von T-Zellen hinsichtlich der Lymphotaktin-Aktivität getestet (Leonard et al., [1999] Current Protocols in Immunology S. 6.12.3). Alternativ werden NK-Zellen verwendet. Alternativ wird Lymphotaktin-Aktivität in einem zellulären Standardassay des Calciumflusses als Reaktion auf die Aktivierung eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors beobachtet (Maghazachi et al., FASEB J. [1997]; 11:765–74.). Zusätzlich wird das Lymphotaktin-KS-IL2-Fusionsprotein in Assays im Hinblick auf die Fähigkeit, an EpCAM zu binden, getestet und stellt sich als aktiv heraus, und es ist ebenfalls in Assays der IL-2-Aktivität, wie dem CTLL-2-Zellproliferationsassay, aktiv.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein, umfassend eine Immunglobulin-Region, und ein Cytokin-Fusionsprotein, umfassend zwei verschiedene Cytokine, wobei das erste Cytokin IL-12 in einer heterodimeren oder in einer einkettigen Form ist, und das zweite Cytokin IL-2 oder GM-CSF ist, das an das Amino- oder Carboxylende der p35- oder p40-Untereinheit von IL-12 kovalent gebunden ist; wobei das Cytokin-Fusionsprotein mit dem Amino- oder Carboxylende der Immunglobulin-Region kondensiert ist.
Multifuntkionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die p35- und p40-Untereinheit von IL-12 über einen Polypeptid-Linker kondensiert sind.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei IL-12 und das zweite Cytokin des Cytokin-Fusionsproteins über einen Polypeptid-Linker kondensiert sind.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Immunglobulin-Region und das Cytokin-Fusionsprotein über einen Polypeptid-Linker kondensiert sind.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein, nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das zweite Cytokin in dem Cytokin-Fusionsprotein IL-2 ist.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Immunglobulin-Region eine konstante Region einer schweren Immunglobulinkette umfasst, welche eine Hinge-Region-Domäne, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne umfasst.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei die Immunglobulin-Region eine Fc-Region ist.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei die Immunglobulin-Region zudem eine CH1-Domäne umfasst.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei die Immunglobulin-Region zudem eine VH-Domäne umfasst, die mit einem krebsspezifischen Antigen oder einem viralen Antigen immunologisch reagiert.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 9, wobei die Immunglobulin-Region zudem eine leichte Immunglobulinkette umfasst, die mit der schweren Immunglobulinkette assoziiert ist, wodurch ein intakter Antikörper gebildet wird.
Multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ein einkettiger Antikörper ist.
Nukleinsäure, die für ein multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein multifunktionelles Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen Träger- oder Hilfsstoff.
Verwendung eines multifunktionellen Cytokin-Antikörper-Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs und Virusinfektionen.