CN112105632A - 细胞因子融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供了细胞因子融合蛋白，所述细胞因子融合蛋白包括与第二细胞因子融合的第一细胞因子，例如与肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)的N末端融合的白介素‑2(IL‑2)或干扰素‑β(IFN‑β)；以及用于治疗癌症的相关组合物和其使用方法，所述相关组合物呈单独药剂或与自体肿瘤疫苗和/或免疫检查点调节剂的组合的形式。

Description

细胞因子融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月4日提交的申请第PCT/CN2018/119071号；以及于2018年1月24日提交的申请第PCT/CN2018/073940号的权益，所述申请中的每个申请均通过引用以其整体并入。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为BEPE_004_02WO_ST25.txt。文本文件为58KB，创建于2019年1月23日并且通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开部分涉及细胞因子融合蛋白，所述细胞因子融合蛋白包括与第二细胞因子融合的第一细胞因子，例如，与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的N末端融合的人白介素-2(IL-2)或干扰素-β(IFN-β)，以及用于治疗癌症的呈单独药剂或与自体肿瘤疫苗和/或免疫检查点调节剂的组合的形式的相关组合物和其使用方法。
发明内容
本公开的实施例包含细胞因子融合蛋白，其包括第一人细胞因子，所述第一人细胞因子与第二人细胞因子的N末端融合，其中所述第一细胞因子不同于所述第二细胞因子，并且其中所述第一细胞因子和所述第二细胞因子选自IL-2、TNF-α、IFN-β、IFN-α(例如，IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21)、IFN-γ、IL-12、GM-CSF、IL-7、IL-23和IL-27，并且任选地其中所述第一细胞因子和所述第二细胞因子由肽连接子分离。在一些实施例中，IL-2、TNF-α、IFN-β、IFN-α、IFN-γ、IL-12、GM-CSF、IL-7、IL-23和/或IL-27的氨基酸序列选自表C1，包含其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的片段和变体。
在具体实施例中，所述第一细胞因子为IL-2或IFN-β，并且所述第二细胞因子为TNF-α。在一些实施例中，所述IL-2包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ IDNO:1或2或SEQ ID NO:1或2的残基21-153至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述IL-2包括C125S或C125A突变。在一些实施例中，所述IFN-β包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:15至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述TNF-α包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQID NO:3-6中的任一个至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述TNF-α包括至少一个突变，所述至少一个突变将TNF-α的比活性降低约或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍和/或相对于与TNFR2的优先结合，增加与TNFR1的优先结合，任选地其中所述至少一个突变选自S86T、R31E和R32W，包含其组合。
在一些实施例中，所述融合蛋白包括肽连接子，任选地生理稳定的连接子或可释放连接子，任选地柔性连接子或刚性连接子。在一些实施例中，所述肽连接子的长度为约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-50个氨基酸、约1-40个氨基酸、约1-30个氨基酸、约1-20个氨基酸、约1-10个氨基酸或约1-5个氨基酸，或长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个或100个氨基酸。在一些实施例中，所述肽连接子选自表L1。
具体融合蛋白包括以下结构：
-IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:19)；
-IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:20)；
-IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:21)；
-IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:22)；
-IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:23)；
-IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:24)；
-IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:25)；
-IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(R31E，S86T)；
-IFN-β-(GGGGS)2-TNF-α(SEQ ID NO:26)。
在一些实施例中，所述融合蛋白包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与选自表F1的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
还包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸对本文所述的融合蛋白进行编码，包括所述分离的多核苷酸的表达载体或包括所述分离的多核苷酸或所述表达载体的宿主细胞。
某些实施例包含治疗组合物或疫苗组合物，所述治疗组合物或疫苗组合物包括本文所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂。某些实施例包括延时释放调配物。在一些实施例中，所述延时释放调配物包括以下中的任何一种或多种：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)、微颗粒/微球、纳米颗粒/纳米球和/或脂质体，包含其任何组合。在一些实施例中，所述延时释放调配物包括PLGA纳米颗粒和/或PLGA-PEG纳米颗粒。
一些实施例包括来自受试者的自体肿瘤细胞疫苗。在一些实施例中，所述自体肿瘤细胞疫苗包括全肿瘤细胞疫苗和/或其细胞裂解物。在一些实施例中，所述肿瘤细胞来自选自以下中的一种或多种的癌症：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。在一些实施例中，所述自体肿瘤细胞疫苗包括癌抗原，所述癌抗原选自以下中的一种或多种：人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、α甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、存活蛋白、整合蛋白αvβ3、整合蛋白α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板源性生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶-3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
某些实施例包括至少一种免疫检查点调节剂，所述至少一种免疫检查点调节剂选自：(a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；以及(b)刺激性免疫检查点分子的激动剂。在一些实施例中，所述免疫检查点调节剂与所述免疫检查点分子特异性结合，并且任选地为多肽，包含抗体或其抗原结合片段、或配体或小分子。
在一些实施例中，所述抑制性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。在一些实施例中，(a)的所述拮抗剂选自以下中的一种或多种：
PD-L1和/或PD-L2拮抗剂，所述PD-L1和/或PD-L2拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)以及度伐单抗(durvalumab)(MEDI4736)；
PD-1拮抗剂，所述PD-1拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、MK-3475、AMP-224、AMP-514、PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)；
CTLA-4拮抗剂，所述CTLA-4拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹单抗(ipilimumab)和替西利姆单抗(tremelimumab)；
IDO拮抗剂，所述IDO拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(indoximod)(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满(norharmane)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝他(epacadostat)；
TDO拮抗剂，所述TDO拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10；
TIM-3拮抗剂，所述TIM-3拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；
LAG-3拮抗剂，所述LAG-3拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016；
VISTA拮抗剂，所述VISTA拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；
BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂，所述BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；以及
TIGIT拮抗剂，所述TIGIT拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，所述刺激性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。在一些实施例中，(b)的所述激动剂选自以下中的一种或多种：
OX40激动剂，所述OX40激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998；
CD40激动剂，所述CD40激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、CP-870,893、达西珠单抗(dacetuzumab)、Chi Lob7/4、ADC-1013和rhCD40L；
GITR激动剂，所述GITR激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873；
CD137激动剂，所述CD137激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米鲁单抗(utomilumab)和4-1BB配体；
CD27激动剂，所述CD27激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、万利鲁单抗(varlilumab)和CDX-1127(1F5)；
CD28激动剂，所述CD28激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08；以及
HVEM激动剂，所述HVEM激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
在一些实施例中，本文所述的治疗组合物或疫苗组合物用于治疗有需要的受试者的癌症。
还包含治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的融合蛋白，例如，作为所述的治疗组合物或疫苗组合物的一部分。
一些实施例包括向所述受试者施用所述融合蛋白与组合。一些实施例包括在任选地与本文所述相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白和所述自体肿瘤疫苗。
一些实施例包括向所述受试者施用所述融合蛋白与免疫检查点调节剂的组合。一些实施例包括在任选地与本文所述相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白和所述免疫检查点调节剂。
一些实施例包括向所述受试者施用所述融合蛋白与自体肿瘤疫苗和免疫检查点调节剂的组合。
一些实施例包括在任选地与本文所述相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白、所述自体肿瘤疫苗和所述免疫检查点调节剂。
在一些实施例中，所述癌症为原发性癌症。在一些实施例中，所述癌症为转移性癌症。在一些实施例中，所述癌症选自以下中的一种或多种：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
在一些实施例中，所述转移性癌症选自以下中的一种或多种：
(a)已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的膀胱癌；
(b)已经转移到骨骼、大脑、肝脏和/或肺的乳腺癌；
(c)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的结肠直肠癌；
(d)已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或肺的肾癌；
(e)已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或其它肺部位的肺癌；
(f)已经转移到骨骼、大脑、肝脏、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；
(g)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的卵巢癌；
(h)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胰腺癌；
(i)已经转移到肾上腺、骨骼、肝脏和/或肺的前列腺癌；
(j)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胃癌；
(l)已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的甲状腺癌；以及
(m)已经转移到骨骼、肝脏、肺、腹膜和/或阴道的子宫癌。
一些实施例包括通过以下施用所述融合蛋白或所述治疗组合物或疫苗组合物：皮下、静脉内、皮内、肿瘤内、瘤周或淋巴结内注射，包含其任何组合。
附图说明
图1示出了针对融合蛋白ZKBY04A的SDS-PAGE测定。
图2A-2B示出了通过CCK-8方法测定的测试材料在L929细胞中的TNF-α活性。图2A示出了ZKBY04A融合蛋白的结果并且图2B示出了商业TNF-α单独的结果。
图3示出了ZKBY04A在IT注射时在WEHI-164鼠肿瘤模型中具有较强的抗肿瘤作用，并且在IP注射时对肿瘤生长具有稍弱的抑制作用。
图4示出了IL-2和TNF-α的组合抑制WEHI-164鼠肿瘤模型中的肿瘤生长。当IL-2和TNF-α与PD-1抗体组合使用时，肿瘤抑制作用更显著。
图5示出了先前清除了肿瘤生长的小鼠即使在用WEHI-164细胞再激发之后也未产生肿瘤。
图6A-6C示出了对IL-2+TNF-α+PD-1组进行药物注射之后的肿瘤的图像。第一次注射之后几天，肿瘤上出现溃疡并且之后在溃疡部位处形成了瘢痕组织。
图7示出了对照组的图像，在所述对照组中肿瘤正常生长，没有溃疡和瘢痕形成。
图8A-8B示出了IL-2和TNF-α组合在CT26鼠癌症模型(8A)和B16-F10鼠黑色素瘤模型(8B)中的体内抗肿瘤作用。
图9示出了IFN-β和TNF-α的组合抑制WEHI-164鼠肿瘤模型中的肿瘤生长。
图10A-10B示出了IFN-β和TNF-α的组合抑制了同系Renca鼠肾癌模型(10A)和CT26鼠结肠癌模型(10B)中的肿瘤生长。
图11A-11D示出了IFN-β-TNF-α融合蛋白在CCK8测定中具有TNF-α活性，不论是表达为来自HEK293细胞(11A)还是直接转染到L929细胞(11B)中的分泌性融合蛋白。提供了TNF-α标准(11C)和对照转染(11D)作为参考。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法、材料、组合物、试剂、细胞可以用于实践或测试本公开的主题，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用以其整体并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献都具体并单独地表明为如完全阐述地通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文对于出版物和参考文献描述的方式通过引用以其整体并入本文。
除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域的技术人员范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多方法在下文中出于说明的目的而描述。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，《当代蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》、《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》或《当代免疫学指南(Current Protocols inImmunology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约,纽约州(New York,N.Y.),(2009)；Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in MolecularBiology)》,第3版,约翰·威利父子出版公司,1995；Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第3版,2001)；Maniatis等人,《分子克隆：实验室手册》,(1982)；《DNA克隆：实践方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I和II卷(D.Glover编辑)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,《分子克隆实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书，或者如本领域通常实现的或如本文所述的执行。这些和相关的技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的执行。除非提供具体的定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名以及实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
出于本公开的目的，下文中定义了以下术语。
本文使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”来指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。举例来说，“要素”包含“一种要素”和“多于一种要素”以及“至少一种要素”。
“约”是数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
“拮抗剂”是指干扰或以其它方式降低另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，拮抗剂与其它药剂或分子特异性结合。包含全部和部分拮抗剂。
“激动剂”是指增加或增强另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，激动剂与其它药剂或分子特异性结合。包含全部和部分激动剂。
如本文所使用的，术语“氨基酸”旨在表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。例如，天然存在的氨基酸包含在蛋白质生物合成期间使用的20(L)-氨基酸以及如4-羟基脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸等其它氨基酸。非天然存在的氨基酸包含本领域技术人员已知的例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等。氨基酸类似物包含天然和非天然存在的氨基酸的经过修饰的形式。此类修饰可以包含例如氨基酸上的或通过氨基酸的衍生化进行的化学基团和部分的取代或置换。氨基酸模拟物包含例如有机结构，其表现出功能相似的性质，如参考氨基酸的电荷和电荷间隔特性。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有位于相似分子空间中且具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同的迁移度的正电荷部分。模拟物还包含受约束的结构，以便维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域的技术人员已知或可以确定哪些结构构成功能等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
“生物相容的”是指通常对生物功能无害并且不会导致包含过敏原和疾病状态在内的任何程度的不可接受毒性的材料或化合物。
“编码序列”是指有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不直接有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。
贯穿本公开，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素组。
“由……组成”意味着包含并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列要素的活性或作用。
术语“融合蛋白”和“融合多肽”可互换使用，并且是指通过两个或更多个编码序列的结合而产生的多肽，所述两个或更多个编码序列是针对单独的多肽而最初或天然编码的；结合的编码序列的翻译产生单一的融合多肽，其通常具有衍生自每个单独的多肽的结构功能性质。
术语“不含内毒素”或“基本上不含内毒素”通常涉及至多含有痕量(例如，对受试者没有临床不利生理作用的量)内毒素以及优选地无法检测到的量的内毒素的组合物、溶剂和/或血管。内毒素是与某些微生物，如细菌(典型地革兰氏阴性细菌)相关的毒素，尽管可能在如单核细胞增生李斯特菌等革兰氏阳性细菌中发现内毒素。最普遍的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外膜中发现的并且表示这些细菌在引起疾病的能力方面的中心致病特征的脂多糖(LPS)或脂低聚糖(LOS)。人体中的少量内毒素可能产生发热、血压降低、炎症和凝血激活以及其它不良生理影响。
因此，在药物生产中，常常期望从药物产品和/或药物容器中除去大部分或全部痕量的内毒素，因为即使少量也可能对人类产生不良影响。除热原烘箱可以用于此目的，因为通常需要超过300℃的温度来分解大多数内毒素。例如，基于如注射器或小瓶等初级包装材料，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合常常足以实现内毒素水平的3log减少。设想了除去内毒素的其它方法，例如如本文所述的和本领域中已知的色谱法和过滤法。
可以使用本领域中已知的常规技术来检测内毒素。例如，利用来自马蹄蟹的血液的鲎变形细胞溶解物测定法是用于检测内毒素存在的非常灵敏的测定法。在此测试中，非常低水平的LPS就可以引起鲎裂解物的可检测到的凝血，这是由于强大的酶级联放大了这一反应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量。为基本上不含内毒素，内毒素水平可以低于活性化合物的约0.001EU/mg、0.005EU/mg、0.01EU/mg、0.02EU/mg、0.03EU/mg、0.04EU/mg、0.05EU/mg、0.06EU/mg、0.08EU/mg、0.09EU/mg、0.1EU/mg、0.5EU/mg、1.0EU/mg、1.5EU/mg、2EU/mg、2.5EU/mg、3EU/mg、4EU/mg、5EU/mg、6EU/mg、7EU/mg、8EU/mg、9EU/mg或10EU/mg。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。
多肽的“半衰期”可以指多肽相对于在施用于生物体的血清或组织时的此类活性、或相对于任何其它定义的时间点丧失其药理学、生理学或其它活性的一半所花费的时间。“半衰期”还可以指多肽的量或浓度在施用于生物体的血清或组织时相对于施用于生物体的血清或组织中的量或浓度或相对于任何其它定义的时间点减少起始量的一半所花费的时间。可以在血清和/或任何一种或多种所选组织中测量半衰期。
术语“调节”和“改变”包含通常相对于对照“增加”、“增强”或“刺激”以及“降低”或“减少”统计学上显著或生理学上显著的量或程度。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包含所有整数和其间的范围，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学上显著的”量的实例。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸的聚合物。术语“酶”包含多肽或蛋白质催化剂，并且其可与蛋白质、多肽或肽互换使用。所述术语包含如豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失等修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一个或多个氨基酸链，其中每个链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括多个通过肽键非共价和/或共价连接在一起、具有天然蛋白质序列的链，即，由天然存在的以及特别是非重组细胞、或基因工程化或重组细胞产生的蛋白质，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体地涵盖本文所述的酶/蛋白质，或具有蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施例中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包括一个或多个重组DNA分子，所述重组DNA分子通常由在细胞中无法以其它方式找到的异源多核苷酸序列或多核苷酸序列的组合制成。
本文提及的术语“分离的”多肽或蛋白质是指受试蛋白质：(1)不含至少一些其它蛋白质，通常将使用所述至少一些其它蛋白质在自然界中发现所述受试蛋白质；(2)基本上不含来自相同来源，例如，来自相同物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(5)不和与“分离的蛋白质”天然缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存在。此类分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中会发现的且会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。
在某些实施例中，组合物中任何给定药剂(例如，融合蛋白)的“纯度”可以被具体定义。例如，某些组合物可以包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的药剂，包含所有小数和其间的范围，例如且绝不限制，通过高效液相色谱法(HPLC)测量的，高效液相色谱法是在生物化学和分析化学中常用的用来分离、鉴定和定量化合物的公知形式柱色谱法。在一些情况下，组合物的纯度以聚集度为特征。例如，药剂(例如，融合蛋白)的聚集度可以通过尺寸排阻色谱(SEC)来确定，所述尺寸排阻色谱根据尺寸来分离颗粒。所述SEC是用于确定纯化蛋白质的三级结构和四级结构的普遍接受的方法。SEC主要用于分析大分子，如蛋白质或聚合物。SEC是通过将这些较小的分子捕获在颗粒的孔中来工作的。较大的分子只是通过孔传递，因为其太大而不能进入孔。因此，较大分子比较小分子更快地流过柱，即分子越小，保留时间越长。某些组合物也基本上不含聚集物(大于约95％，通过SEC HPLC呈现为单峰)。某些实施例不含具有大于约96％、约97％、约98％或约99％的通过SEC HPLC呈现为单峰的聚集物。
术语“参考序列”通常是指与另一序列正在进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都作为参考序列而包含，包含通过名称描述的参考序列和在表和序列表中描述的参考序列。
如本文所使用的术语“序列同一性”或例如，包括“与其50％相同的序列”是指在比较窗口内，在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575Science Drive Madison,Wis.,USA)遗传学电脑集团(Genetics Computer Group)的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式，或者通过检验各种所选方法中的任何方法产生的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)而进行。还可以参考例如由Altschul等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,25:3389,1997所公开的BLAST程序家族。
术语“溶解度”是指本文所述药剂(例如，融合蛋白)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，按每单位体积溶剂的溶质质量(每千克溶剂的溶质克数、g/dL(100mL)、mg/mL等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或其它类似的浓度描述计。可以溶解每种单位量溶剂的溶质的最大均衡量是所述溶质在包含温度、压力、pH和溶剂的性质的特定条件下在所述溶剂中的溶解度。在某些实施例中，在生理pH或其它pH，例如，pH5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8、或pH8.0(例如，约pH 5-8)下测量溶解度。在某些实施例中，在水或如PBS或NaCl(有或无NaP)的生理缓冲液中测量溶解度。在具体实施例中，在相对较低的pH(例如，pH 6.0)和相对较高的盐(例如，500mM的NaCl和10mM的NaP)下测量溶解度。在某些实施例中，在如血液或血清的生物流体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施例中，温度可以约为室温(例如，约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或约为体温(37℃)。在某些实施例中，药剂在室温或37℃下具有至少约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL的溶解度。
“受试者”或“有需要的受试者”或“患者”或“有需要的患者”包含哺乳动物受试者如人类受试者。
“基本上”或“实质上”意指几乎完全或彻底，例如，一些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更高。
“统计学上显著的”意味着结果不可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性度量包含p值，如果零假设为真，则p值是所观察的事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则零假设被否定。在简单的情况下，显著性水平限定在0.05或更小的p值。
“治疗反应”是指基于一种或多种治疗剂，例如，融合蛋白的给药改善症状(无论是否持续)。
如本文所使用的，受试者(例如哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包含但不限于施用组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。还包含“预防性”治疗，其可以针对于降低所治疗的疾病或病症的进展速率、延迟所述疾病或病症的发作、或降低其发病的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。
术语“野生型”是指在群体中最常观察到的基因或基因产物(例如，多肽)，并且因此被任意地称为基因的“正常”或“野生型”形式。
除非另外明确地说明，否则本说明书中的每个实施例在进行必要的修改后适用于所有其它实施例。
细胞因子融合蛋白
本公开的实施例部分涉及意外发现至少一种细胞因子与另一种细胞因子的融合，例如，白介素-2(IL-2)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的融合改善融合蛋白相对于每种细胞因子单独的药代动力学和/或生物活性。还涉及发现细胞因子融合蛋白可以改善对自体肿瘤疫苗的免疫应答，并且还可以改善如免疫检查点抑制剂等免疫检查点调节剂的抗肿瘤活性。
因此，某些实施例因此涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括第一人细胞因子，所述第一人细胞因子与第二人细胞因子的N末端融合，其中所述第一细胞因子不同于所述第二细胞因子。在特定实施例中，第一细胞因子和第二细胞因子选自：人IL-2、TNF-α、IFN-β(IFNB1)、IFN-α(例如，IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21)IFN-γ、IL-12、GM-CSF、IL-7、IL-23和IL-27，包含其具有“细胞因子信号传导活性”和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。每种细胞因子的示例性“细胞因子信号传导活性”在下文中提供。在一些实施例中，第一细胞因子和第二细胞因子由肽连接子分离。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人白介素-2(IL-2)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。IL-2是由T细胞响应于抗原刺激或促有丝分裂刺激而产生的，并且是T细胞增殖和对免疫应答的调节关键的其它活动所需要的。其还可以刺激B细胞、单核细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞和胶质瘤细胞。IL-2通过IL-2受体传导信号，所述IL-2受体是由三条链(被称为α链、β链和γ链)组成的复合物。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。TNF-α是与TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR结合的细胞因子。其主要是由巨噬细胞分泌的，并且可以诱导某些肿瘤细胞系的细胞死亡。例如，其以膜形式和可溶形式两者存在。可溶形式衍生自通过蛋白水解加工的膜形式。膜结合形式由SPPL2A或SPPL2B通过经过调节的膜内蛋白水解被进一步蛋白水解加工，产生在胞质溶胶中释放的TNF细胞内结构域(ICD1和ICD2)以及分泌到细胞外空间的TNF C-结构域1和C-结构域2。膜形式而非可溶形式在丝氨酸残基上被磷酸化。膜形式的去磷酸化通过与可溶性TNFRSF1A/TNFR1结合发生。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人干扰素或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。干扰素(IFN)是由宿主细胞响应于肿瘤细胞或病原体的存在而释放的一组细胞因子信号传导蛋白。在一些实施例中，人干扰素是I型干扰素，如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ或IFN-ω。IFN-α干扰素的特定实例包含IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。在一些实施例中，人干扰素是II型干扰素，也被称为人类中的IFN-γ。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人白介素-12(IL-12)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。IL-12是可以充当活化的T细胞和NK细胞的生长因子的细胞因子，可以增强NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性，并且可以通过静息PBMC刺激IFN-γ的产生。IL-12是由IL-12亚基α和IL-12亚基β组成的二硫键连接的异源二聚体。某些融合蛋白包括亚基α、亚基β或两种亚基。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。GM-CSF是刺激来自各种谱系的造血前体细胞的生长和分化的单体细胞因子，所述单体细胞因子包含粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和红细胞。
在某些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人白介素-7(IL-7)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。IL-7是能够刺激淋巴样祖细胞的增殖的造血生长因子。例如，其对B细胞成熟的某些阶段期间的增殖很重要。
在特定实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人白介素-23(IL-23)或其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的变体和/或片段。IL-23是在先天和适应性免疫细胞因子中起作用的异二聚体细胞因子，并且由IL-23亚基α和IL-12亚基β构成。IL-23与由IL-12RB1和IL-23R构成的异二聚体受体复合物结合，激活Jak-Stat信号传导级联，刺激记忆而非原初T细胞，并且促进促炎细胞因子的产生。某些基于IL-23的融合蛋白包括IL-23亚基α单独，并且某些融合蛋白包括IL-23亚基α和IL-12亚基β两者。
在一些实施例中，第一细胞因子或第二细胞因子是人白介素-27(IL-27)。IL-27是在先天免疫细胞中起作用的异二聚体细胞因子，并且由IL-27亚基α和IL-27亚基β构成。IL-27具有促炎和抗炎性质，所述促炎和抗炎性质可以调节T辅助细胞发育，抑制T细胞增殖，刺激细胞毒性T细胞活性并且诱导B细胞中的同种型切换。其还对先天免疫细胞具有不同影响。在IL-27的靶细胞中是CD4T辅助细胞，所述CD4T辅助细胞可以分化为1型效应细胞(TH1)、2型效应细胞(TH2)和产生辅助性T细胞(TH17)的IL17。其推动了原初但非记忆性CD4T细胞的快速克隆扩增。其还与IL-12协同以触发原初CD4T细胞的干扰素-γ/IFN-γ产生，并且与细胞因子受体WSX-1/TCCR结合。IL-27增强早期阶段的TH1应答，并且抑制TH2和TH17分化。其通过两种不同途径(p38MAPK/TBX21-依赖性途径和ICAM1/ITGAL/ERK依赖性途径)诱导TH1细胞的分化。其还诱导STAT1、STAT3、STAT4和STAT5磷酸化，并且通过STAT1激活TBX21/T-Bet，其中产生了IL12RB2上调，一种对TH1细胞定型至关重要的事件。其抑制GATA3的表达、抑制剂TH1细胞发育。在CD8T细胞中，其激活STAT以及GZMB。IL-27还对细胞因子产生具有影响，例如，其抑制如IL-2、IL-4、IL-5和IL-6等促炎细胞因子产生，并且激活如SOCS1和SOCS3等细胞因子信号传导的抑制因子。IL-27还通过对T细胞的直接作用而拮抗某些细胞因子如IL-6的作用。IL-27还具有抗肿瘤活性。某些基于IL-27的融合蛋白包括IL-27亚基α单独、IL-27亚基β单独或两种亚基。
前述细胞因子的氨基酸序列在下表C1中提供，包含其某些变体。技术人员将理解，通常融合蛋白的C末端部分处的细胞因子的序列将缺少N末端甲硫氨酸残基(来自表C1)。
Figure BDA0002615294910000161
Figure BDA0002615294910000171
Figure BDA0002615294910000181
因此，在一些实施例中，融合蛋白的每种细胞因子组分包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自表C1的氨基酸序列或其活性变体和/或片段。活性变体和片段的特定实例包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与选自表C1的序列至少80％、95％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。多肽“变体”和“片段”的另外实例在本文其它地方进行了描述。
在具体实施例中，第一细胞因子为IL-2并且第二细胞因子为TNF-α，也就是说，其中IL-2与TNF-α的N末端融合，并且在一些实例中由肽连接子(例如，–(GGGGS)2或–(GGGGS)3-连接子(参见表L1))分离。在一些实施例中，IL-2包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:1或2(具有信号肽)或SEQ ID NO:1或2(不具有信号肽)的残基21-153至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在特定实施例中，IL-2包括C125S或C125A突变(参见例如，SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，TNF-α包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:3-6至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在特定实施例中，TNF-α包括将TNF-α的比活性降低约或至少以下的至少一个突变(相对于野生型)：约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍，例如，降低到为IL-2的比活性的相对摩尔当量的比活性。在一些实施例中，TNF-α包括将其相对于与TNFR2的优先结合的与TNFR1的优先结合增加以下的至少一个突变(相对于野生型)：例如，约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在具体实施例中，TNF-α包括选自以下的至少一个突变：S86T(参见例如，SEQ ID NO:6)、R31E(参见例如，SEQ ID NO:5)和R32W，包含其组合，如S86T/R31E(参见例如，SEQ ID NO:7)和S86T/R32W。
在一些实施例中，第一细胞因子为IFN-β并且第二细胞因子为TNF-α，也就是说，其中IFN-β与TNF-α的N末端融合，并且在一些实例中由肽连接子分离(例如，–(GGGGS)2或–(GGGGS)3-连接子(参见表L1)。在一些实例中，IFN-β包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:15至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在一些实施例中，TNF-α包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:3-6至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。在特定实施例中，TNF-α包括将TNF-α的比活性降低约或至少以下的至少一个突变(相对于野生型)：约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍，例如，降低到为IFN-β的比活性的相对摩尔当量的比活性。在一些实施例中，TNF-α包括将其相对于与TNFR2的优先结合的与TNFR1的优先结合增加以下的至少一个突变(相对于野生型)：例如，约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在具体实施例中，TNF-α包括选自以下的至少一个突变：S86T(参见例如，SEQ ID NO:6)、R31E(参见例如，SEQ ID NO:5)和R32W，包含其组合，如S86T/R31E(参见例如，SEQ IDNO:7)和S86T/R32W。
在特定实施例中，融合蛋白包括以下结构：
-IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:19)；
-IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:20)；
-IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:21)；
-IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:22)；
-IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:23)；
-IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:24)；
-IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:25)；
-IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(R31E，S86T)；或
-IFN-β-(GGGGS)2-TNF-α(SEQ ID NO:26)
包含其活性变体/片段。
在一些实施例中，融合蛋白包括选自下表F1的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或者基本上由所述氨基酸序列组成。
Figure BDA0002615294910000201
因此，在一些实施例中，融合蛋白包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自表F1的氨基酸序列或其活性变体和/或片段。活性变体和片段的特定实例包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与选自表F1的序列至少80％、95％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。多肽“变体”和“片段”的另外实例在本文其它地方进行了描述。
连接子.某些融合蛋白包括一个或多个连接子肽。术语“连接”、“连接子”、“连接子部分”或“L”在本文中用于指可以用于将融合蛋白的一个多肽组分与另一多肽组分分离，例如，将第一细胞因子(例如，IL-2)与第二细胞因子(例如，TNF-α)分离的连接子。肽连接子可以是生理稳定的，或可以包含可释放连接子，如不稳定连接子或可酶促降解的连接子(例如，可蛋白水解切割的连接子)。肽连接子序列可以使用本领域的标准技术并入到融合蛋白中。
某些肽连接子序列可以基于以下示例性因素而选择：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的次级结构；(3)其生理稳定性；以及(4)缺乏可能与多肽功能性表位或其它特征反应的疏水残基或带电残基。参见例如，George和Heringa,J,《蛋白质工程(Protein Eng.)》15:871-879,2002。在一些实施例中，肽连接子是刚性连接子。在一些实施例中，肽连接子是柔性连接子。在特定实施例中，柔性连接子可以使用能够对肽本身建模的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊(PNAS)》90:2256-2260,1993；以及《美国国家科学院院刊》91:11099-11103,1994)或通过噬菌体展示方法进行合理设计。
在一些实施例中，肽连接子序列的长度为1个到约200个氨基酸。示例性连接子可具有以下总氨基酸长度：约1-200个氨基酸、1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个或更多个氨基酸。
肽连接子可以采用如本文其它地方描述的并且本领域已知的任何一种或多种天然存在的氨基酸、一种或多种非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物。可以有效地用作连接子的某些氨基酸序列包含以下中公开的那些：Maratea等人,《基因(Gene)》40:39-46,1985；Murphy等人,《美国国家科学院院刊》83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号以及美国专利第4,751,180号。特定肽连接子序列含有Gly残基、Ser残基和/或Asn残基。如果需要，肽连接子序列中还可以采用其它近中性氨基酸，如Thr和Ala。
某些示例性肽连接子在下表L1中提供。
Figure BDA0002615294910000221
因此，在某些实施例中，融合蛋白包括一种或多种选自表P1的肽连接子。在某些实施例中，前述连接子是任选的。
多肽变体.某些实施例包含本文所描述的参考序列的“变体”和“片段”，无论是通过名称还是通过参考表或序列标识符描述的。实例包含本文所述的任何细胞因子、融合蛋白和抗体。“变体”序列是指通过一个或多个取代、缺失(例如，截短)、添加和/或插入而与参考序列不同的多肽或多核苷酸序列。变体多肽是生物活性的，即，其继续具有参考多肽的酶促活性或结合活性。此类变体可以由例如遗传多态性和/或人为操纵产生。
在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的次级结构和亲水性质基本上不变的取代。如上所述，修饰可以在本公开的多核苷酸和多肽的结构进行，并且仍可以获得对具有所期望特性的变体或衍生多肽进行编码的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本文所述的多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域的技术人员通常将会改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个密码子。
例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失相互作用的结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，因此某些氨基酸序列取代可以在蛋白质序列中，以及当然，在其基础DNA编码序列中进行，并且仍然可以获得具有类似性质的蛋白质。因此预期可以在不明显丧失其效用的情况下对所公开组合物的肽序列或编码所述肽的对应DNA序列进行各种改变。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性是本领域公知的(Kyte和Doolittle,1982，通过引用并入本文)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的次级结构，所述次级结构进而定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。在氨基酸的疏水性和电荷特征的基础上，每种氨基酸都被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍导致具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等效蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。
在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(特别通过引用以其整体并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利第4,554,101号中所详述的，已经为氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(–0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；组氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨酸(–1.3)；缬氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；异亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，并且特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种改变时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特性的示例性取代是本领域的技术人员公知的，并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
氨基酸取代可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行。例如，带负电荷的氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包含赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其它氨基酸基团包含：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。
变体还可以或可替代地含有非保守变化。在优选实施例中，变体多肽与天然或参考序列的差异在于取代、缺失或添加少于约10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个氨基酸，或甚至1个氨基酸。变体还可以(或可替代地)通过例如对多肽的免疫原性、次级结构、酶活性和/或亲水性质影响最小的氨基酸的缺失或添加进行修饰。
在某些实施例中，多肽序列的长度为约、至少约、或多达约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个或更多个连续氨基酸，包含其间所有整数并且其可以包括参考序列的全部或一部分(参见例如表或序列表)。
在一些实施例中，多肽序列由以下组成：约或不多于约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个或更多个连续氨基酸，包含其间所有整数并且其可以包括参考序列的全部或一部分(参见例如，表或序列表)。
在某些实施例中，多肽序列为约10-1000个、10-900个、10-800个、10-700个、10-600个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、20-1000个、20-900个、20-800个、20-700个、20-600个、20-500个、20-400个、20-300个、20-200个、20-100个、20-50个、20-40个、20-30个、50-1000个、50-900个、50-800个、50-700个、50-600个、50-500个、50-400个、50-300个、50-200个、50-100个、100-1000个、100-900个、100-800个、100-700个、100-600个、100-500个、100-400个、100-300个、100-200个、200-1000个、200-900个、200-800个、200-700个、200-600个、200-500个、200-400个或200-300个连续氨基酸，包含其间所有范围，并且包括参考序列的全部或部分。在某些实施例中，任何参考多肽的C末端或N末端区均可以被截短约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、或800个或更多个氨基酸，或约10-50个、20-50个、50-100个、100-150个、150-200个、200-250个、250-300个、300-350个、350-400个、400-450个、450-500个、500-550个、550-600个、600-650个、650-700个、700-750个、750-800个或更多个氨基酸，包含其间所有整数和范围(例如，101、102、103、104、105)，只要所截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不少于其所衍生的生物活性参考多肽的活性的约1％、约5％、约10％、约25％或约50％。
在某些实例下，变体将显示与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性或序列同一性或序列同源性。此外，设想序列与天然或亲本序列的差异在于添加(例如，C末端添加、N末端添加、两者)、缺失、截短、插入或取代(例如，保守取代)了约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、或100个氨基酸(包含其间所有整数和范围)，但保留了亲本或参考多肽序列的特性或活性。
在一些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少一个但少于50个、40个、30个、20个、15个、10个、8个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸残基。在某些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少1％但少于20％、15％、10％或5％的残基。(如果此比较要求比对，则应比对序列以获得最大相似性。缺失或插入或错配的“环”出(looped out)序列被视为差异。)
序列之间的序列相似性或序列同一性的计算(这些术语在本文中可互换使用)如下进行。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。在某些实施例中，出于比较目的比对的参考序列长度是参照序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、以及甚至更优选地70％、80％、90％、100％。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在所述位置处是相同的。
两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位的数量和每个空位的长度，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在优选实施例中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是使用已经合并到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch,(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:444-453,1970)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6确定的。在又另一优选实施例中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdn CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6确定的。一组特别优选的参数(以及除非另有说明，否则应使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。
两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用已合并到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Cabios)》，4:11-17,1989)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。
本文描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，从而例如，标识其它家族成员或相关序列。此类搜索可以使用Altschul等人,(1990,《分子生物学杂志》215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来执行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)执行，以获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)执行，以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如在Altschul等人,(《核酸研究》25:3389-3402,1997)中所描述的有空位的BLAST。当使用BLAST和有空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST和XBLAST)的默认参数。
在一些实施例中，如上所述，可以使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列区段组成，每个序列区段中的一个序列区段被比较。对Smith-Waterman或Sellers算法的修正将找到所有不能通过扩展或修剪来改善分数的称为高分值区段对(HSP)的片段对。BLAST比对的结果包含统计学测量，以指示仅偶然可以预期BLAST分数的可能性。
根据与每个所比对序列相关联的空位和取代的数量计算原始分数S，其中较高的相似性分数表示更显著的比对。取代分数由查询表给出(参见PAM，BLOSUM)。
空位分数通常被计算为G(空位开放罚分)和L(空位延伸罚分)之和。对于长度为n的空位，空位成本将为G+Ln。空位成本G和L的选择是经验性的，但习惯上选择G的高值(10-15)，例如11，以及L的低值(1-2)，例如，1。
比特分数S'衍生自原始比对分数S，其中已经考虑了所使用的评分系统的统计特性。比特分数相对于评分系统被标准化，因此其可以用于比较来自不同搜索的比对分数。术语“比特分数”和“相似性分数”可互换使用。比特分数表示比对好的程度；分数越高，比对越好。
E值或预期值描述了具有相似分数的序列偶然出现在数据库中的可能性。E值或预期值是预测在数据库检索中偶然出现的具有等同于或优于S的分数的不同比对数量的预测。E值越小，比对越显著。例如，具有E值为e-117的比对意味着具有相似分数的序列很不可能只是偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期分数要求是负的，否则长比对将倾向于具有高分数而不管与比对的区段是否相关。另外，BLAST算法使用适当的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且对于有空位的比对，使用空位产生和延伸罚分。例如，BLAST比对和多肽序列的比较通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行。
在一些实施例中，根据使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行的BLAST分析报告序列相似性分数。
在特定实施例中，本文提供的序列同一性/相似性分数是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(Calif.))使用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比；使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊》，89:10915-10919,1992)的氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比。GAP利用Needleman和Wunsch的算法(《分子生物学杂志》48:443-453,1970)来找到两个完整序列的比对，所述比对将匹配数最大化并将空位数最小化。
在特定实施例中，变体多肽包括可以与参考多肽序列最佳比对的氨基酸序列(参见例如，序列表)，以产生至少约以下的BLAST比特分数或序列相似性分数：50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多，包含其间所有整数和范围，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1。
如上所述，参考多肽可以以各种方式改变，包含氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。用于此类操纵的方法是本领域公知的。例如，可以通过DNA的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(《美国国家科学院院刊》，82:488-492,1985)；Kunkel等人,(《酶学方法(Methods inEnzymol)》,154:367-382,1987)、美国专利第4,873,192号，Watson,J.D.等人,(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,本杰明-卡明斯公司(Benjamin/Cummings),门洛帕克(Menlo Park),加利福尼亚,1987)以及本文引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978),《蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区(Washington,D.C.))中找到。
用于筛选通过此类修饰制备的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选通过参考多肽的组合诱变产生的基因文库。作为一个实例，递归整体诱变(REM)，一种提高文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选测定组合使用以标识多肽变体(Arkin和Yourvan,《美国国家科学院院刊》89:7811-7815,1992；Delgrave等人,《蛋白质工程》6:327-331,1993)。
多核苷酸、表达载体和宿主细胞如本文所述，某些实施例涉及编码融合蛋白的多核苷酸。因此，某些实施例包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括表C1中的单独细胞因子的任何组合(包含其变体和/或片段)，所述融合蛋白包含包括表L1中的连接子的任何连接子的融合蛋白。某些实施例包含编码选自表F1的融合蛋白的多核苷酸(包含其变体和/或片段)，所述多核苷酸包含包括表E1中的示例性编码序列、由所述示例性编码序列组成或基本上由所述示例性编码序列组成的多核苷酸。
在其它使用中，可以使用这些和相关实施例来在宿主细胞中重组产生融合多肽。本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列可以具有最小的同源性。尽管如此，具体设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人类、酵母或细菌密码子选择而优化的多核苷酸。
如本领域的技术人员认识到的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支持材料。
多核苷酸可以包括天然序列(即，编码融合多肽或其组分的内源序列)或可以包括变体或此类序列的生物功能等同物。多核苷酸变体可以含有如本文所述的优选地使得变体多肽的活性相对于未经修饰的多肽基本上未降低的一个或多个取代、添加、缺失和/或插入。
另外的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支持材料。因此，无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸都可以与其它DNA或RNA序列，如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等组合，使得其总长度可以显著变化。
多核苷酸序列还可以具有混合基因组cDNA、RNA并且可以是合成来源的序列。例如，编码前导肽的基因组或cDNA序列可以结合到编码多肽的基因组或cDNA序列，之后可以通过插入编码用于根据熟知的程序同源重组的期望的氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选地使用适合的寡核苷酸通过PCR产生期望的序列而在位点处修饰DNA或RNA序列。在一些实施例中，信号序列可以包含在编码序列之前。此序列将信号肽N末端编码成编码序列，所述编码序列与宿主细胞通信以将多肽引导到细胞表面或将多肽分泌到培养基中。通常，信号肽在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞修剪掉(clipped off)。信号肽可以在原核生物和真核生物中的各种蛋白质中发现。
一个或多个多核苷酸可以编码本文所述的融合蛋白。此外，多核苷酸序列可以出于各种原因操纵。实例包含但不限于掺入用于增强多核苷酸在各种生物体中的表达的优选密码子(一般参见Nakamura等人,《核酸研究》28:292,2000)。另外，可以掺入沉默突变以引入或消除限制性位点，降低CpG二核苷酸基序的密度(参见，例如，Kameda等人,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》349:1269-1277,2006)，或降低单链序列形成茎环结构的能力：(参见，例如，Zuker M.,《核酸研究》31:3406-3415,2003)。另外，通过在起始密码子处包含Kozak共有序列(即，(a/g)cc(a/g)ccATGg)(SEQ ID NO:51)可以进一步优化哺乳动物表达。用于此目的的Kozak共有序列是本领域已知的(Mantyh等人,《美国国家科学院院刊》92:2662-2666,1995；Mantyh等人,《蛋白质表达与纯化(Prot.Exp.&Purif.)》6:124,1995)。
还包含包括多核苷酸的表达载体，以及包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。多肽和融合蛋白可以通过众所周知的技术在适合的宿主细胞中通过表达编码多肽的DNA或RNA序列来产生。术语“宿主细胞”用于指在其中已经引入或能够引入编码本文所述多肽中的一种或多种多肽的核酸序列，并且进一步表达或能够表达所关注多肽，如编码任何本文所述多肽的多核苷酸的细胞。所述术语包含亲本细胞的子代，无论所述子代是否在形态上或遗传构成上与原始亲本相同，只要存在所选基因即可。可以选择宿主细胞用于某些特征，例如，表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE)以将硫酸酯酶基序内的半胱氨酸或丝氨酸残基转化为甲酰甘氨酸(FGly)残基，或表达可以将非天然氨基酸，包括具有叠氮侧链、炔侧链或其它期望侧链的非天然氨基酸掺入到多肽的一种或多种氨酰基tRNA合成酶，以促进化学缀合或修饰。
在一些情况下，多核苷酸或表达载体包括另外的非编码序列。例如，表达载体中存在的“控制要素”或“调节序列”是载体的非翻译区，包含增强子、启动子，5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类要素的强度和特异性可以有所不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和翻译要素，包含组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,加利福利亚州拉荷亚市(La Jolla,Calif.))或PSPORT1质粒(GibcoBRL,马里兰州盖瑟斯堡市(Gaithersburg,Md.))等的杂合lacZ启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，则基于SV40或EBV的载体可以有利地与适当的可选标记一起使用。
各种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以利用以含有和表达多核苷酸序列。这些包含但不限于微生物，如用表达载体，例如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包含哺乳动物细胞以及更具体地用病毒、质粒、附加型、整合或其它表达载体转化的人细胞系统。因此，某些实施例包含包括编码本文所述的多肽，例如融合多肽的多核苷酸序列的表达载体。还包含包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。
某些实施例可以采用基于大肠杆菌的表达系统(参见，例如，结构基因组学联盟等,《自然方法(Nature Methods)》5:135-146,2008)。这些和相关实施例可以部分或完全依赖独立于连接的克隆(LIC)以产生适合的表达载体。在具体实施例中，蛋白质表达可以由T7RNA聚合酶(例如，pET载体系列)或具有替代启动子(包含例如TAC启动子)的经过修饰的pET载体控制。这些和相关实施例可以利用表达宿主菌株BL21(DE3)，一种支持T7介导的表达并且缺乏用于改善靶蛋白稳定性的lon和ompT蛋白酶的BL21的λDE3溶原菌。还包含携带编码大肠杆菌中很少使用的tRNA的质粒的表达宿主菌株，如ROSETTATM(DE3)和Rosetta 2(DE3)菌株。在一些实施例中，可以使用其它大肠杆菌菌株，包含其它大肠杆菌K-12菌株，如W3110(F-lambda-IN(rrnD-rrnE)1rph-1)和UT5600(F,araC14,leuB6(Am),secA206(aziR),lacY1,proC14,tsx67,Δ(ompTfepC)266,entA403,glnX44(AS),λ-,trpE38,rfbC1,rpsL109(strR),xylA5,mtl-1,thiE1)，所述其它大肠杆菌菌株可能导致翻译后修饰的水平在发酵期间降低。还可以使用以商标
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核酸酶和
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蛋白质提取试剂销售的试剂来改善细胞裂解和样品处理。对于细胞培养，自诱导培养基可以提高许多表达系统的效率，包含高通量表达系统。此类型的培养基(例如，OVERNIGHT EXPRESSTM自诱导系统)通过代谢转变逐渐引发蛋白质表达，无需添加如IPTG等人工诱导剂。
特定实施例采用六聚组氨酸标签(如以商标HIS·TAG融合物销售的标签)，然后采用固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化或相关的技术。然而，在某些方面，临床级蛋白质可以从大肠杆菌包涵体中分离，无需或不使用亲和标签(参见，例如，Shimp等人,《蛋白质表达与纯化(Protein Expr Purif.)》50:58-67,2006)。作为另外的实例，某些实施例可以采用冷休克诱导的大肠杆菌高产量生产系统，因为大肠杆菌中的蛋白质在低温下的过表达改善了大肠杆菌的溶解度和稳定性(参见，例如，Qing等人,《自然生物技术(NatureBiotechnology)》22:877-882,2004)。
还包含高密度细菌发酵系统。例如，真氧雷尔氏菌的高细胞密度培养允许在细胞密度超过150g/L时产生蛋白质，以及在滴度超过10g/L时表达重组蛋白。在酵母酿酒酵母中，可以使用许多含有如α因子、醇氧化酶和PGH等组成型或诱导型启动子的载体。对于评论，参见Ausubel等人(同上)和Grant等人,《酶学方法》153:516-544,1987。还包含巴斯德毕赤酵母(Pichia pandoris)表达系统(参见，例如，Li等人,《自然生物技术》24,210-215,2006；以及Hamilton等人,《科学(Science)》,301:1244,2003)。某些实施例包含被工程化以选择性地糖基化蛋白质的酵母系统，包含具有人源化N-糖基化途径的酵母等(参见，例如，Hamilton等人,《科学》313:1441-1443,2006；Wildt等人,《自然评论：微生物学(NatureReviews Microbiol.)》3:119-28,2005；以及Gerngross等人,《自然生物技术》22:1409-1414,2004；美国专利第7,629,163号；7,326,681；以及7,029,872)。仅举例来说，重组酵母培养物可以在冯巴赫瓶(Fernbach Flask)或15L、50L、100L和200L发酵罐等中生长。
在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可以由许多启动子中的任何启动子驱动。例如，如CaMV的35S和19S启动子等病毒启动子可以单独使用或与来自TMV(Takamatsu,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》6:307-311,1987)的ω前导序列组合使用。可替代地，可以使用如RUBISCO的小亚基或热休克启动子等植物启动子(Coruzzi等人,《欧洲分子生物学学会杂志》3:1671-1680,1984；Broglie等人,《科学》224:838-843,1984；以及Winter等人,《细胞分化的结果与问题(Results Probl.Cell Differ.)》17:85-105,1991)。可以通过直接的DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体引入到植物细胞中。此类技术在许多通常可获得的评论(参见，例如，麦格劳-希尔(McGraw Hill)的Hobbs,《科学技术年鉴(Yearbook of Science and Technology)》,第191-196页,1992)中进行了描述。
还可以使用昆虫系统表达所关注的融合蛋白。例如，在一个此类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体以在草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆到病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并且放置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入多肽编码序列将使多角体蛋白基因失活并且产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后可以使用重组病毒来感染例如可以表达所关注的多肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞(Engelhard等人,《美国科学院院刊》91:3224-3227,1994)。还包含杆状病毒表达系统，包含利用SF9、SF21和T.ni细胞的杆状病毒表达系统(参见，例如，Murphy和Piwnica-Worms,《蛋白质科学现行方案(Curr Protoc Protein Sci.)》,第5章:第5.4单元,2001)。昆虫系统可以提供类似于哺乳动物系统的翻译后修饰。
在哺乳动物宿主细胞中，许多表达系统在本领域是熟知的并且可商购获得。示例性哺乳动物载体系统包含例如来自英杰公司(Invitrogen)的pCEP4、pREP4和pREP7，来自库塞尔公司(Crucell)的PerC6系统以及如来自英杰公司的pLP1等基于慢病毒的系统等。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将编码所关注的多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。可以使用在病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入以获得能够在所感染宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan和Shenk,《美国国家科学院院刊》81:3655-3659,1984)。另外，可以使用如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子等转录增强子以增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
有用哺乳动物宿主细胞系的实例包含由SV40(COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学期刊(J.Gen.Virol.)》36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人宫颈肿瘤细胞(HELA、ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A、ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138、ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2、HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562、ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。其它有用哺乳动物宿主细胞系包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述中国仓鼠卵巢细胞包含DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216,1980)；以及如NSO和Sp2/0等骨髓瘤细胞系。对于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的评论，参见，例如，Yazaki和Wu,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第248卷(B.K.C Lo编辑,Humana出版社(HumanaPress),新泽西州托托瓦市(Totowa,N.J.),2003)，第255-268页。某些优选哺乳动物细胞表达系统包含基于CHO和HEK293细胞的表达系统。哺乳动物表达系统可以利用例如，T-烧瓶、滚瓶或细胞工厂中附着的细胞系，或例如，1L和5L旋转瓶、5L、14L、40L、100L和200L搅拌槽生物反应器中或20/50L和100/200L WAVE生物反应器等本领域已知的其它容器中的悬浮培养物。
另外，可以选择宿主细胞株，因其能够调节已插入序列的表达或以所期望方式加工所表达蛋白质。多肽的这些修饰包含但不限于翻译后修饰，如乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化，或插入非天然存在的氨基酸(一般参见美国专利第7,939,496号；第7,816,320号；第7,947,473号；第7,883,866号；第7,838,265号；第7,829,310号；第7,820,766号；第7,820,766号；第7,7737,226,7,736,872号；第7,638,299号；第7,632,924号和第7,230,068号)。切割蛋白质的“前体原”形式的翻译后加工还可以用于促进正确的插入、折叠和/或功能。除细菌细胞以外，还可以选择如酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138等具有或甚至缺乏此类翻译后活性的特定细胞机械和特征机制的不同宿主细胞，以确保正确修饰和加工外来蛋白质。
技术人员将理解，本文所述的各种细胞因子融合蛋白可以与本文所述的各种自体肿瘤细胞疫苗和/或免疫检查点调节剂中的任何一种或多种组合，并且根据本文所述的方法或组合物中的任何一种或多种使用。
自体肿瘤细胞疫苗
某些实施例采用自体肿瘤细胞疫苗。自体肿瘤细胞疫苗包括来自正在治疗的受试者的肿瘤细胞(参见，例如，Zhang等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》2013年10月；55(3-4):264-74；Fishman等人,《免疫疗法杂志(J Immunother.)》2008年1月；31(1):72-80；Berger等人,《药物科学杂志(J Pharm Sci)》2007；10(2):144-52；Schirrmacher V.,《癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother.)》2005年6月；54(6):587-98,其通过引用并入)。在一些实例中，通过从受试者中分离肿瘤细胞并且在体外或离体将这些肿瘤细胞加工或处理成疫苗调配物来制备此类疫苗；然后将疫苗施用给从其分离肿瘤细胞的受试者。
一般的实例包含自体全细胞肿瘤细胞疫苗和自体肿瘤细胞裂解物疫苗。在一些实例中，将肿瘤细胞转导(例如，用表达所关注基因的逆转录病毒)，并且然后施用给从其分离肿瘤细胞的受试者。在一些实例中，对肿瘤细胞进行辐射并且然后施用给从其分离肿瘤细胞的受试者。还包含基于树突状细胞(DC)的自体肿瘤细胞疫苗，所述自体肿瘤细胞疫苗包含从受试者中分离DC、暴露于来自受试者的肿瘤细胞裂解物并且然后施用给受试者的自体肿瘤细胞疫苗(参见，例如，Gonzales等人,《人类疫苗与免疫疗法(Hum VaccinImmunother.)》2014；10(11):3261-9)。因此，某些实施例包含自体肿瘤裂解物承载的DC疫苗。
在一些实施例中，自体肿瘤细胞疫苗的肿瘤是从选自以下中的一种或多种的癌症中分离的：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、复发性急性骨髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
在一些实施例中，自体肿瘤细胞疫苗包括癌抗原，所述癌抗原选自以下中的一种或多种：人类Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、α甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、存活蛋白、整合蛋白αvβ3、整合蛋白α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶-3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
技术人员将理解，本文所述的各种自体肿瘤细胞疫苗可以与本文所述的各种融合蛋白和/或免疫检查点调节剂中的任何一种或多种组合，并且根据本文所述的方法或组合物的任何一种或多种使用。
免疫检查点调节剂
某些实施例采用一种或多种免疫检查点调节剂。特定实例包含具有一个或多个抑制性免疫检查点分子的“拮抗剂”和具有一个或多个刺激性免疫检查点分子的“激动剂”。通常，免疫检查点分子是免疫系统的上调信号(共刺激分子)或下调信号的组分，所述组分的靶向在癌症中具有治疗潜力，因为癌细胞可以扰乱免疫检查点分子的天然功能(参见，例如，Sharma和Allison,《科学》348:56-61,2015；Topalian等人,《癌细胞(Cancer Cell.)》27:450-461,2015；Pardoll,《癌症自然评论(Nature Reviews Cancer.)》12:252-264,2012)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂(例如，拮抗剂、激动剂)与一个或多个免疫检查点分子“结合”或“特异性结合”，如本文所描述的。
在特定实施例中，免疫检查点调节剂是多肽或肽。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换地使用，然而，在某些实例中，术语“肽”可以指较短的多肽，例如由约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸组成的多肽，包含其间所有整数和范围(例如，5到10个、8到12个、10到15个)。多肽和肽可以由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸构成，如本文所描述。
抗体也作为多肽包含。因此，在一些实施例中，免疫检查点调节多肽剂是“抗体或其抗原结合片段”。如本文所使用的，术语“抗体”不仅包含完整多克隆或单克隆抗体，还包含其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有拥有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经过修饰的构型。本文更加详细地描述了抗体(和其抗原结合片段)的某些特征和特性。
抗体或抗原结合片段可以是基本上任何类型。如本领域众所周知的，抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个表位识别位点与靶标特异性结合的免疫球蛋白分子，如免疫检查点分子。
如本文所使用的术语“抗原结合片段”是指含有与所关注的抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。在此方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包括来自与靶分子结合的抗体的VH和VL序列的1个、2个、3个、4个、5个或所有6个CDR。
可以使用本领域熟知的方法对抗体和其抗原结合片段的结合性质进行定量(参见Davies等人,《生物化学年鉴(Annual Rev.Biochem.)》59:439-473,1990)。在一些实施例中，用为约或范围为约≤10-7到约10-8M的平衡解离常数将抗体或其抗原结合片段与靶分子，例如，免疫检查点分子或其表位或复合物特异性结合。在一些实施例中，平衡解离常数为约或范围为约≤10-9M到约≤10-10M。在某些说明性实施例中，抗体或其抗原结合片段对靶分子(其特异性结合的靶分子)的亲和力(Kd)为约、至少约、或小于约0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM。
如果如多肽或抗体等分子与特定细胞、物质或特定表位比其与替代性细胞或物质或表位更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为表现“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体结合比其与其它物质或表位亲和力更大地、亲合力更大地、更容易和/或持续时间更长地，例如，通过统计学显著的量结合，则所述抗体与靶分子或表位“特异性结合”或“优先结合”。通常，表现特异性结合的分子对的一个成员具有位于其表面上的区域或腔，所述一个成员与分子对的另一成员的特定空间组织和/或极性组织特异性结合并因此与其互补。因此，对的成员具有彼此特异性结合的性质。例如，与特异性表位特异性或优先结合的抗体是相比于其与其它表位结合亲和力更大地、亲合力更大地、更容易地和/或持续时间更长地与特异性表位结合的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶标特异性或优先结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不与第二靶标特异性或优先结合。术语也适用于其中例如抗体对由多种抗原携带的特定表位具有特异性，在此情况下，携带抗原结合片段或结构域的特异性结合成员将能够与携带表位的各种抗原结合；例如，其可以对来自共享共同表位的多种物种的多种不同形式的靶抗原具有交叉反应。
免疫结合通常是指发生在免疫球蛋白分子与抗原之间的类型的非共价相互作用，例如通过说明而非限制的方式，由于静电的、离子的、亲水的和/或疏水的吸引力或排斥力、空间力、氢键结合、范德华力和其它相互作用，免疫球蛋白对所述抗原具有特异性。可以在相互作用的解离常数(Kd)方面表达免疫结合相互作用的强度或亲和力，其中更小的Kd表示更大的亲和力。可以使用本领域众所周知的方法对所选多肽的免疫结合性质进行定量。一种此方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力并且取决于同样在两个方向上影响速率的几何参数。因此，可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)两者。具有Koff/Kon的速率实现消除与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。如本文所使用的，术语“亲和力”包含两种药剂的可逆结合的平衡常数，并且表示为Kd。结合蛋白对配体的亲和力，如抗体对表位的亲和力)以为例如约100纳摩尔(nM)到约0.1nM、约100nM到约1皮摩尔(pM)或约100nM到约1飞摩尔(fM)。如本文所使用的，术语“亲合力”是指稀释之后两种或更多种药剂的复合物对解离的耐性。
抗体可以通过本领域的普通技术人员已知的各种技术中的任何技术制备。参见，例如，Harlow和Lane,《抗体实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),1988。可以例如使用Kohler和Milstein,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》,6:511-519,1976以及对其的改进来制备对所关注的多肽具有特异性的单克隆抗体。还包含利用如小鼠等转基因动物表达人类抗体的方法。参见，例如，Neuberger等人,《自然生物技术》,14:826,1996；Lonberg等人,《实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)》,113:49-101,1994；以及Lonberg等人,《免疫学内部评论(Internal Review of Immunology)》,13:65-93,1995。特定实例包含
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的
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平台(参见，例如，美国专利第6,596,541号)。
还可以通过使用噬菌体展示文库或酵母展示文库产生或鉴定抗体(参见，例如，美国专利第7,244,592号；Chao等人,《自然实验手册(Nature Protocols)》1:755-768,2006)。可用文库的非限制性实例包含所克隆或合成文库，如人类组合抗体文库(HuCAL)，在所述文库中，人类抗体库的结构多样性由七个重链和七个轻链可变区基因表示。这些基因的组合产生主文库中的49个框架。通过在这些框架上叠加高度可变基因盒(CDR＝互补决定区)，可以复制大量人类抗体库。还包含设计有编码轻链可变区、重链CDR-3的人类供体来源的片段、编码重链CDR-1中的多样性的合成DNA以及编码重链CDR-2中的多样性的合成DNA的人类文库。适合使用的其它文库对本领域的技术人员而言将是清楚的。
在某些实施例中，如本文所描述的抗体和其抗原结合片段包含分别插置在重链与轻链框架区(FR)组之间的重链和轻链CDR组，所述FR组提供对CDR的支持并且限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文所使用的，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端出发，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包括单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对多种抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基形成与所结合抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的抗原接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
如本文所使用的，术语“FR组”是指框住重链或轻链V区的CDR组中的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触所结合抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，尤其是与CDR直接相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征是非常高度保守的。在此方面，所有V区序列含有具有大约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠成结合位点时，CDR被展示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常认识到存在FR的保守结构区，所述保守结构区将CDR环的折叠形状变成某些“规范”结构——无论精确的CDR氨基酸序列如何。进一步地，已知某些FR残基参与非共价结构域间接触，所述非共价结构域间接触使抗体重链和轻链的相互作用稳定。
免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以通过参考Kabat,E.A.等人,《免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第4版美国健康与人类服务部(US Department of Health and Human Services)1987以及其更新来确定。
还包含“单克隆”抗体，其是指均质抗体群，其中单克隆抗体包含表位的选择性结合中涉及的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还涵盖其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其它经过修饰的构型，所述免疫球蛋白分子包括所需特异性和结合表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)。不旨在限制关于抗体的源或其形成的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)。术语包含整个免疫球蛋白以及以上在“抗体”定义下描述的片段等。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生若干片段，所述片段(F(ab)片段)中的两个片段各自包括包含完整抗原结合位点的共价异源二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供若干片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')2片段。可以通过对IgM以及很少的IgG或IgA免疫球蛋白分子进行的优先蛋白水解切割来产生用于根据本发明的某些实施例使用的Fv片段。然而，Fv片段更一般地使用本领域已知的重组技术衍生。Fv片段包含非共价VH::VL异源二聚体，所述非共价VH::VL异源二聚体包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。参见Inbar等人,《美国国家科学院院刊》69:2659-2662,1972；Hochman等人,《生物化学(Biochem.)》15:2706-2710,1976；以及Ehrlich等人,《生物化学》19:4091-4096,1980。
在某些实施例中，设想了单链Fv(scFV)抗体。例如，Kappa体(Ill等人,《蛋白质工程》10:949-57,1997)；迷你体(Martin等人,《欧洲分子生物学学会杂志》13:5305-9,1994)；双体(Holliger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-8,1993)；或Janusins(Traunecker等人,《欧洲分子生物学学会杂志》10:3655-59,1991；以及Traunecker等人,《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》7:51-52,1992)可以使用遵循本申请关于选择具有期所望特异性的抗体的教导的标准分子生物学技术来制备。
单链Fv(scFv)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其根据包含通过肽编码连接子连接的VH和VL编码基因的基因融合表达。Huston等人,《美国国家科学院院刊》85(16):5879-5883,1988)。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚合但是化学分离的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转换成scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上类似的三维结构。参见，例如，授予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；以及授予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。这些实施例涉及通常使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点以及分子的基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域的完整可变结构域或者仅包括接枝到可变结构域中的适当框架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型的或可以由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了作为人类个体的免疫原的恒定区，但是仍然存在对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio等人,《美国国家科学院院刊》86:4220-4224,1989；Queen等人,《美国国家科学院院刊》86:10029-10033,1988；Riechmann等人,《自然(Nature.)》332:323-327,1988)。抗体的人源化的说明性方法包含美国专利第7,462,697号中所描述的方法。
另一种方法不仅着重于提供人类衍生的恒定区，还着重于修改可变区，以便尽可能地将其重塑为人类形式。已知重链和轻链两者的可变区含有被四个框架区(FR)侧接的三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区响应于讨论的表位而变化并且确定结合能力，所述四个框架区在给定物种中相对保守并且推定地为CDR提供支架。当制备关于特定表位的非人抗体时，可以通过将衍生自非人抗体的CDR接枝于存在于待修饰的人抗体中的FR上来对可变区进行“重塑”或“人源化”。此方法在各种抗体中的应用已在以下文献中报道：Sato等人,《癌症研究(Cancer Res.)》53:851-856,1993；Riechmann等人,《自然》332:323-327,1988；Verhoeyen等人,《科学》239:1534-1536,1988；Kettleborough等人,《蛋白质工程》4:773-3783,1991；Maeda等人,《人抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》2:124-134,1991；Gorman等人,《美国国家科学院院刊》88:4181-4185,1991；Tempest等人,《生物技术(Bio/Technology)》9:266-271,1991；Co等人,《美国国家科学院院刊》88:2869-2873,1991；Carter等人,《美国国家科学院院刊》89:4285-4289,1992；以及Co等人,《免疫学杂志》148:1149-1154,1992。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体而改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，所述一个或多个CDR也被称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
在一些实施例中，药剂是或包括免疫检查点分子的“配体”，例如，天然配体。“配体”通常是指与靶分子(例如，生物分子)形成复合物以用作生物学目的的物质或分子，并且包含“蛋白质配体”，所述蛋白质配体通常通过与靶分子或靶蛋白上的位点结合而产生信号。因此，某些药剂是天然与免疫检查点分子结合并且产生信号的蛋白质配体。还包含“经过修饰的配体”，例如，与药代动力学修饰剂融合的蛋白质配体，例如，衍生自免疫球蛋白的Fc区。
可以使用本领域已知的方法对配体的结合性质进行定量(参见Davies等人,《生物化学年鉴》59:439-473,1990)。在一些实施例中，用为约或范围为约≤10-7到约10-8M的平衡解离常数将配体与靶分子，例如，免疫检查点分子或其表位特异性结合。在一些实施例中，平衡解离常数为约或范围为约≤10-9M到约≤10-10M。在某些说明性实施例中，配体对本文所描述的靶标(其特异性结合的靶标)的亲和力(Kd)为约、至少约、或小于约0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM。
在一些实施例中，药剂是“小分子”，所述小分子是指具有合成源或生物源(生物分子)但通常不是聚合物的有机化合物。有机化合物是指大类化学化合物，其分子含有碳，通常不包含仅含有碳酸盐、简单的碳氧化物或氰化物的化学化合物。“生物分子”通常是指由活的生物体产生的有机分子，包含如肽、多糖以及核酸等大聚合分子(生物聚合物)以及如初级次级代谢物、脂质、磷脂质、醣脂、甾醇、甘油脂、维生素和激素等小分子。“聚合物”通常是指包含重复结构单元的大分子或高分子，所述重复结构单元通常由共价化学键连接。
在某些实施例中，小分子的分子量为约或小于约1000道尔顿-2000道尔顿，通常介于约300道尔顿与700道尔顿之间，并且包含约或小于约50道尔顿、100道尔顿、150道尔顿、200道尔顿、250道尔顿、300道尔顿、350道尔顿、400道尔顿、450道尔顿、500道尔顿、550道尔顿、500道尔顿、650道尔顿、600道尔顿、750道尔顿、700道尔顿、850道尔顿、800道尔顿、950道尔顿、1000道尔顿或2000道尔顿。
某些小分子可以具有针对本文的多肽，如抗体描述的“特异性结合”特性。例如，在一些实施例中，小分子以约、至少约或小于约以下的结合亲和力(Kd)与靶标，例如，免疫检查点分子特异性结合：0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是具有一个或多个抑制性免疫检查点分子的拮抗剂或抑制剂。示范性抑制性免疫检查点分子包含：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
在某些实施例中，药剂是PD-1(受体)拮抗剂或抑制剂，其靶向已经被示出为恢复肿瘤环境下的免疫功能(参见，例如，Phillips等人,《国际免疫杂志(Int Immunol.)》27:39-46,2015)。PD-1是属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B细胞上表达的细胞表面受体。PD-1与两个配体(PD-L1和PD-L2)相互作用。PD-1例如通过减少或防止T细胞的活化来充当抑制性免疫检查点分子，这进而降低了自身免疫性并且促进了自身耐受性。PD-1的抑制效果至少部分地通过促进抗原特异性T细胞在淋巴结中的细胞凋亡，同时还减少调节性T细胞(抑制性T细胞)的细胞凋亡的双重机制而实现。PD-1拮抗剂或抑制剂的一些实例包含与PD-1特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性(例如，其下游信号传导或其与PD-L1的相互作用)的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-1拮抗剂或抑制剂的具体实例包含抗体纳武单抗、派姆单抗、PDR001、MK-3475、AMP-224、AMP-514和皮地利珠单抗以及其抗原结合片段(参见，例如，美国专利第8,008,449号、第8,993,731号、第9,073,994号、第9,084,776号、第9,102,727号、第9,102,728号、第9,181,342号、第9,217,034号、第9,387,247号、第9,492,539号、第9,492,540号和美国申请第2012/0039906号、第2015/0203579号)。
在一些实施例中，药剂是PD-L1拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L1是PD-1受体的天然配体之一。PD-L1拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与PD-L1特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性(例如其与PD-1受体结合)的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-L1拮抗剂的具体实例包含抗体阿特朱单抗(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)和度伐单抗(MEDI4736)以及其抗原结合片段(参见，例如，美国专利第9,102,725号；第9,393,301号；第9,402,899号；第9,439,962号)。
在一些实施例中，药剂是PD-L2拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L2是PD-1受体的天然配体之一。PD-L2拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与PD-L2特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性(例如，其与PD-1受体结合)的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是CTLA-4拮抗剂或抑制剂。CTLA4或CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也被称为CD152(分化簇152)，是例如，当其与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，通过向T细胞传递抑制信号充当抑制性免疫检查点分子的作用的蛋白质受体。一般实例CTLA-4拮抗剂或抑制剂包含与CTLA-4特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子。特定实例包含抗体伊匹单抗和替西利姆单抗以及其抗原结合片段。据信伊匹单抗的活性中的至少一些活性由表达CTLA-4的抑制因子Treg的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤介导。
在一些实施例中，药剂是IDO拮抗剂或抑制剂或TDO拮抗剂或抑制剂。IDO和TDO是具有免疫抑制性质的色氨酸分解代谢酶。例如，已知IDO抑制T细胞和NK细胞，产生并且激活Treg和髓源性抑制细胞，并且促进肿瘤血管生成。IDO和TDO拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与IDO或TDO(参见，例如，Platten等人,《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:673,2014)特异性结合并且降低或抑制一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。IDO拮抗剂或抑制剂的具体实例包含吲哚莫德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝他(参见，例如，Sheridan,《自然生物技术》33:321-322,2015)。TDO拮抗剂或抑制剂的具体实例包含680C91和LM10(参见，例如，Pilotte等人,《美国国家科学院院刊》109:2497-2502,2012)。
在一些实施例中，药剂是TIM-3拮抗剂或抑制剂。T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)在活化的人CD4+T细胞上表达并且调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3还通过与其配体半乳糖凝集素-9的相互作用触发细胞死亡而起到Th1/Tc1功能的负调节因子的作用。TIM-3有助于抑制性肿瘤微环境，并且其过表达与各种癌症的不良预后相关联(参见，例如，Li等人,《肿瘤学报(Acta Oncol.)》54:1706-13,2015)。TIM-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与TIM-3特异性结合并且减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是LAG-3拮抗剂或抑制剂。淋巴细胞活化基因3(LAG-3)在活化的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达。其以与CTLA-4和PD-1类似的方式负调节T细胞的细胞增殖、活化和稳态(参见，例如，Workman和Vignali,《欧洲免疫学杂志》33:970-9,2003；以及Workman等人,《欧洲免疫学杂志》172:5450–5,2004)，并且已报道在Treg抑制功能(参见，例如，Huang等人,《免疫学(Immunity.)》21:503-13,2004)中起作用。LAG3还将CD8+T细胞维持在耐受性状态下，并且与PD-1结合以维持CD8+T细胞衰竭。LAG-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与LAG-3特异性结合并且抑制其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。具体实例包含抗体BMS-986016和其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是VISTA拮抗剂或抑制剂。T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)主要在造血细胞上表达，并且是抑制T细胞活化，诱导Foxp3表达，并在其抑制抗肿瘤T细胞应答的肿瘤微环境内高表达的抑制性免疫检查点调节剂(参见，例如，Lines等人,《癌症研究》74:1924-32,2014)。VISTA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与VISTA特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是BTLA拮抗剂或抑制剂。B和T淋巴细胞弱化子(BTLA；CD272)表达在T细胞活化期间诱导，并且其通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)和B7细胞表面受体家族相互作用来抑制T细胞。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，也被称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物例如通过抑制人CD8+癌症特异性T细胞(参见，例如，Derré等人,《临床研究杂志(J Clin Invest)》120:157–67,2009)的功能负调节T细胞免疫应答。BTLA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与BTLA-4特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是HVEM拮抗剂或抑制剂，例如，与HVEM特异性结合并且干扰其与BTLA或CD160的相互作用的拮抗剂或抑制剂。HVEM拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与HVEM特异性结合、任选地减少HVEM/BTLA和/或HVEM/CD160相互作用并且由此减少HVEM的免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是CD160拮抗剂或抑制剂，例如，与CD160特异性结合并且干扰其与HVEM的相互作用的拮抗剂或抑制剂。CD160拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与CD160特异性结合、任选地减少CD160/HVEM相互作用并且由此减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。
在一些实施例中，药剂是TIGIT拮抗剂或抑制剂。T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)是在各种淋巴样细胞的表面上发现的共抑制受体并且例如通过Treg抑制抗肿瘤免疫性(Kurtulus等人,《临床研究杂志》125:4053-4062,2015)。TIGIT拮抗剂或抑制剂的一般实例包含与TIGIT特异性结合并且减少其免疫抑制活性中的一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子(参见，例如，Johnston等人,《癌细胞》26:923-37,2014)。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂是具有一种或多种刺激性免疫检查点分子的激动剂。示范性刺激性免疫检查点分子包含OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
在一些实施例中，药剂是OX40激动剂。OX40(CD134)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增并且抑制T调节性细胞的分化和活性(参见，例如，Croft等人,《免疫学评论》229:173-91,2009)。其配体是OX40L(CD252)。由于OX40信号传导影响T细胞活化和存活两者，因此其在启动淋巴结中的抗肿瘤免疫应答以及在肿瘤微环境下保持抗肿瘤免疫应答方面起重要作用。OX40激动剂的一般实例包含与OX40特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。具体实例包含OX86、OX-40L、Fc-OX40L、GSK3174998、MEDI0562(人源化OX40激动剂)、MEDI6469(鼠类OX4激动剂)和MEDI6383(OX40激动剂)以及其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是CD40激动剂。CD40在抗原呈递细胞(APC)和一些恶性肿瘤上表达。其配体是CD40L(CD154)。在APC上，连接导致共刺激分子上调，从而潜在地绕过对抗肿瘤免疫应答中的T细胞辅助的需要。CD40激动剂疗法在APC成熟和其从肿瘤到淋巴结的迁移从而导致提高抗原呈递和T细胞活化中起重要作用。抗CD40激动剂抗体产生动物模型中的实质性应答和持久性抗癌免疫，这是至少部分地由细胞毒性T细胞介导的效果(参见，例如，Johnson等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》21:1321-1328,2015；以及Vonderheide和Glennie,《临床癌症研究》19:1035-43,2013)。CD40激动剂的一般实例包含与CD40特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CP-870,893、达西珠单抗、Chi Lob 7/4、ADC-1013、CD40L、rhCD40L以及其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是GITR激动剂。糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)增加T细胞扩增，抑制Treg的抑制活性并且延长T效应细胞的存活。GITR激动剂已经被示出为通过缺失Treg谱系稳定性来促进抗肿瘤应答(参见，例如，Schaer等人,《癌症免疫学研究》1:320-31,2013)。这些不同机制示出了GITR在启动淋巴结中的免疫应答以及在保持肿瘤组织中的免疫应答方面起重要作用。其配体是GITRL。GITR激动剂的一般实例包含与GITR特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含GITRL、INCAGN01876、DTA-1、MEDI1873以及其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是CD137激动剂。CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并且CD137的交联会增强T细胞增殖、IL-2分泌、存活和溶细胞活性。CD137介导的信号传导还保护如CD8+T细胞等T细胞免受活化诱导的细胞死亡。CD137激动剂的一般实例包含与CD137特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD137(或4-1BB)配体(参见，例如，Shao和Schwarz,《白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol.)》89:21-9,2011)和抗体乌托米鲁单抗，包含其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是CD27激动剂。对CD27的刺激会增加初始T细胞的抗原特异性扩增并且有助于T细胞记忆和T细胞免疫的长期保持。其配体是CD70。具有激动剂抗体的人CD27的靶向刺激T细胞活化和抗肿瘤免疫(参见例如，Thomas等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology.)》2014；3:e27255.doi:10.4161/onci.27255；以及He等人,《免疫学杂志》191:4174-83,2013)。CD27激动剂的一般实例包含与CD27特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD70和抗体万利鲁单抗和CDX-1127(1F5)，包含其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是CD28激动剂。CD28是组成地表达的CD4+T细胞、一些CD8+T细胞。其配体包含CD80和CD86，并且其刺激增加T细胞扩增。CD28激动剂的一般实例包含与CD28特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD80、CD86、抗体TAB08以及其抗原结合片段。
在一些实施例中，药剂是CD226激动剂。CD226是与TIGIT共享配体并且与TIGIT相对的刺激受体，CD226的接合增强T细胞活化(参见，例如，Kurtulus等人,《临床研究杂志》125:4053-4062,2015；Bottino等人,《实验医学杂志》1984:557-567,2003；以及Tahara-Hanaoka等人,《国际免疫杂志》16:533-538,2004)。CD226激动剂的一般实例包含与CD226特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体(例如，CD112、CD155)。
在一些实施例中，药剂是HVEM激动剂。疱疹病毒进入介体(HVEM)，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)，是TNF受体超家族的人细胞表面受体。HVEM发现于包含T细胞、APC和其它免疫细胞的各种细胞上。与其它受体不同，HVEM以高水平在静息T细胞上表达并且在活化时被下调。已经示出HVEM信号传导在T细胞活化的早期阶段中以及在肿瘤特异性淋巴细胞群在淋巴结中的扩增期间起重要作用。HVEM激动剂的一般实例包含与HVEM特异性结合并且增加其免疫刺激活性中的一种或多种免疫刺激活性的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
技术人员将理解，本文所述的各种免疫检查点调节剂可以与本文所述的各种融合蛋白和/或自体肿瘤细胞疫苗中的任何一种或多种组合，并且根据本文所述的方法或组合物中的任何一种或多种使用。
使用方法和组合物/调配物
还包含使用本文所述的细胞因子融合蛋白以治疗有需要的受试者的方法，以及包括所述融合蛋白的组合物。例如，某些实施例包含治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制所述癌症的进展的方法或组合物，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的细胞因子融合蛋白，所述组合物包括所述融合蛋白。某些实施例包含减少或预防有需要的受试者的癌症，例如转移性癌症的复发，其中施用治疗组合物实现了产生对癌症的免疫记忆。
还包含用于治疗癌症的组合疗法，所述组合疗法包含治疗改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向受试者施用至少一种细胞因子融合蛋白与至少一种自体肿瘤细胞疫苗(从有需要的受试者获得)的组合。一些组合疗法包含治疗改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向受试者施用至少一种细胞因子融合蛋白与至少一种检查点调节剂的组合。具体组合疗法包含治疗改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向受试者施用至少一种细胞因子融合蛋白与至少一种自体肿瘤细胞疫苗(从有需要的受试者获得)和至少一种检查点调节剂的组合。示例性细胞因子融合蛋白、自体肿瘤细胞疫苗、免疫检查点调节剂以及包括所述细胞因子融合蛋白、自体肿瘤细胞疫苗、免疫检查点调节剂的治疗组合物或疫苗组合物在本文其它地方进行了描述。
在一些实例中，细胞因子融合蛋白和自体肿瘤细胞疫苗作为同一治疗组合物或疫苗组合物的一部分施用。在一些实例中，细胞因子融合蛋白和免疫检查点调节剂作为同一治疗组合物或疫苗组合物的一部分施用。在特定实例中，在一些实例中，细胞因子融合蛋白、自体肿瘤细胞疫苗和免疫检查点调节剂作为同一治疗组合物或疫苗组合物的一部分施用。在某些实例中，组合治疗剂中的一种或多种组合治疗剂(即，细胞因子融合蛋白、自体肿瘤疫苗和/或免疫检查点调节剂)作为单独的治疗组合物或疫苗组合物单独施用。
在一些实施例中，本文所述的方法和组合物将患者的中位生存时间增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长。在某些实施例中，本文所述的方法或组合物将患者的中位生存时间增加1年、2年、3年或更长。在一些实施例中，本文所述的方法和组合物将无进展生存增加2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长。在某些实施例中，本文所述的方法和组合物将无进展生存增加1年、2年、3年或更长。
在某些实施例中，施用的组合物足以产生肿瘤消退，如通过活性肿瘤的量的统计学显著降低，例如，肿瘤质量的至少10％、20％、30％、40％、50％或更多降低，或通过所改变的(例如，具有统计显著性的所降低的)扫描尺寸所指示的。在某些实施例中，所施用的组合物足以使疾病稳定。在某些实施例中，所施用的组合物足以产生熟练的临床医生已知的特定疾病适应症的症状的稳定或临床相关性减少。
用于治疗癌症的方法和组合物可以与其它治疗方式组合。例如，本文所述的一种或多种药剂或组合物可以在其它治疗性干预之前、期间或之后向受试者施用，所述其它治疗性干预包含对症护理、化学疗法、放射疗法、外科手术、移植、激素疗法、光动力疗法、抗生素疗法或其任何组合。对症护理包含施用皮质类固醇，以减轻脑水肿、头痛、认知功能障碍和呕吐，以及施用抗惊厥药，以减少癫痫。放射治疗包含全脑照射、分次放射治疗和如立体定向放射外科手术等放射外科手术，所述放射外科手术可以进一步与传统外科手术组合。
本文所述的方法和组合物可以用于治疗任何种类的癌症。在一些实施例中，癌症为原发性癌症，即，生长在肿瘤进展开始并且产生癌块的解剖部位的癌症。在一些实施例中，癌症为次级癌症或转移性癌症，即，已经从原始的初级部位或组织扩散到一个或多个不同的部位或组织的癌症。在一些实施例中，受试者或患者患有选自以下中的一种或多种的癌症：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、复发性急性骨髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌或HCC)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌(例如，雌激素受体阳性(ER+)、雌激素受体阴性(ER-)、Her2阳性(Her2+)、Her2阴性(Her2-)，或其组合，例如ER+/Her2+、ER+/Her2-、ER-/Her2+或ER-/Her2-或“三阴性”乳腺癌，所述“三阴性”乳腺癌是雌激素受体阴性、黄体酮受体阴性和HER2阴性)、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤或脉络丛乳头状瘤)、多形性成胶质细胞瘤(例如，巨细胞胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、病毒诱导的肿瘤，例如，乳头状瘤病毒诱导的肿瘤(例如，宫颈肿瘤、宫颈癌)、腺癌、疱疹病毒诱导的肿瘤(例如，伯基特(Burkitt)淋巴瘤、EBV诱导的B细胞淋巴瘤)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1诱导的淋巴瘤和HTLV-2诱导的淋巴瘤、听神经瘤、肺癌(例如，肺肿瘤、支气管肿瘤)、小细胞肺肿瘤、咽喉癌、肛门肿瘤、成胶质细胞瘤、直肠肿瘤、星形细胞瘤、脑肿瘤、视网膜母细胞瘤、基底细胞瘤、脑转移瘤、成神经管细胞瘤、阴道癌、胰腺癌、睾丸癌、霍奇金综合征(Hodgkin'ssyndrome)、脑膜瘤、施耐博格病(Schneeberger disease)、垂体肿瘤、蕈样肉芽肿、类癌瘤、神经鞘瘤、脊柱瘤、伯基特淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、子宫体肿瘤、骨癌、非霍奇金淋巴瘤、尿道癌、CUP综合征、头/颈肿瘤、少突胶质细胞瘤、外阴癌、肠癌、结肠直肠肿瘤、食管癌(例如，食管肿瘤)、疣受累、小肠肿瘤、颅咽管瘤、卵巢肿瘤、生殖道肿瘤、卵巢癌(例如，卵巢肿瘤)、胰腺癌(例如，胰腺肿瘤)、子宫内膜肿瘤、肝转移、阴茎癌、舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤和眼睑肿瘤。
在一些实施例中，如以上所述，癌症或肿瘤是转移性癌症。进一步地对于以上癌症，示例性转移性癌症包含但不限于已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的膀胱癌；已经转移到骨骼、大脑、肝脏和/或肺的乳腺癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的结肠直肠癌；已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或肺的肾癌；已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或其它肺部位的肺癌；已经转移到骨骼、大脑、肝脏、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的卵巢癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胰腺癌；已经转移到肾上腺、骨骼、肝脏和/或肺的前列腺癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胃癌；已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的甲状腺癌；以及已经转移到骨骼、肝脏、肺、腹膜和/或阴道的子宫癌；等等。
在例如，其中癌症免疫治疗剂是PD-1或PD-L1拮抗剂或抑制剂的一些实施例中，受试者患有一种或多种使其合适于PD-1或PD-L1抑制剂疗法的生物标志物(例如，在如癌细胞或癌症特异性CTL等细胞中增加的PD-1或PD-L1水平)。例如，在一些实施例中，受试者在肿瘤浸润性CD8+T细胞子集(参见，例如，Daud等人,《临床研究杂志》126:3447-3452,2016)内的程序性细胞死亡1高/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4高(例如，PD-1hiCTLA-4hi)细胞的分数增加。作为另一个实例，在一些实施例中，受试者在循环肿瘤反应性(例如，PD-1+CD11ahiCD8+)T细胞中的Bim(B细胞淋巴瘤2-相互作用(Bcl2-相互作用)介体)的水平增加，并且任选地患有转移性黑色素瘤(参见，例如，Dronca等人,《临床调查透视(JCI Insight)》5月5日；1(6):e86014,2016)。
某些具体组合包含用于治疗选自结肠直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺肿瘤、膀胱癌和肾细胞癌中的一种或多种的癌症的细胞因子融合蛋白和PD-L1拮抗剂或抑制剂，例如，阿特朱单抗(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)和度伐单抗(MEDI4736)。
一些具体组合包含用于治疗选自霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌中的一种或多种的癌症的细胞因子融合蛋白和PD-1拮抗剂，例如，纳武单抗。
特定的具体组合包含用于治疗选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌以及尿路上皮癌中的一种或多种的癌症的细胞因子融合蛋白和PD-1拮抗剂，例如，派姆单抗。
某些具体组合包含用于治疗选自黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的一种或多种的癌症的细胞因子融合蛋白和CTLA-4拮抗剂，例如，伊匹单抗和替西利姆单抗。
一些具体组合包含用于治疗选自转移性乳腺癌和脑癌、任选地多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤或恶性脑肿瘤中的一种或多种的癌症的细胞因子融合蛋白和IDO拮抗剂，例如，吲哚莫德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸或依帕卡朵丝他。
用于标识患有本文所述的疾病或病症中的一种或多种的受试者的方法是本领域已知的。
对于体内使用，例如，用于治疗人类疾病或测试，本文所述的融合蛋白通常在施用前掺入到一种或多种组合物中，所述组合物包含药物组合物、治疗组合物和/或疫苗组合物。在一些实例中，组合物包括本文所述的至少一种细胞因子融合蛋白与生理学上可接受的载剂或赋形剂的组合。在一些实例中，包括至少一种细胞因子融合蛋白的组合物进一步包括自体肿瘤细胞疫苗。在一些实施例中，包括至少一种细胞因子融合蛋白的组合物进一步包括至少一种免疫检查点调节剂。在具体实施例中，包括至少一种细胞因子融合蛋白的组合物进一步包括自体肿瘤细胞疫苗和免疫检查点调节剂。
一些组合物包括(和某些方法利用)仅一种细胞因子融合蛋白。某些组合物包括(和某些方法利用)至少两种、三种、四种或五种不同的细胞因子融合蛋白的混合物。
在特定实施例中，包括如细胞因子融合蛋白、抗体和/或其它多肽剂等药剂的组合物在蛋白质的基础上或重量-重量的基础上基本上是纯的，例如，其中组合物的纯度在蛋白质的基础上或在重量-重量的基础上为至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％。
在一些实施例中，本文所提供的细胞因子融合蛋白或其它多肽剂不会形成聚集物，具有所期望的溶解度，和/或具有适用于人类的免疫原性特征，如本文所述和本领域已知的。因此，在一些实施例中，包括多肽剂(例如，细胞因子融合蛋白和任选地抗体)的治疗组合物基本上是无聚集物的。例如，某些组合物包括小于约10％(在蛋白质的基础上)的高分子量聚集蛋白、或小于约5％的高分子量聚集蛋白、或小于约4％的高分子量聚集蛋白、或小于约3％的高分子量聚集蛋白、或小于约2％的高分子量聚集蛋白、或小于约1％的高分子量聚集蛋白。一些组合物包括相对于其表观分子量至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％单分散的多肽剂(例如，细胞因子融合蛋白和任选地抗体)。
在一些实施例中，多肽剂被浓缩到约或至少约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6、0.7、0.8、0.9、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11、12、13、14或15mg/ml，并且被调配用于生物治疗用途。
为了制备组合物(例如，药物组合物、治疗组合物和/或疫苗组合物)，将有效量或所期望量的一种或多种药剂与本领域的技术人员已知的适用于特定药剂和/或施用模式的任何一种或多种药物载剂或赋形剂混合。药物载剂可以呈液体、半液体或固体的形式。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包含，例如，无菌稀释剂(如水)、盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水；PBS)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗微生物剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用(例如，通过IV输注)，则适合的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物的增稠剂和增溶剂的溶液。
以纯粹形式或以适当的组合物施用本文所述的药剂可以通过用于类似用途的药剂的可接受的施用模式的任何施用模式进行。组合物可以通过将含有药剂的组合物与适当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以被调配成呈固体、半-固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。此外，其它药物活性成分(包含如本文其它地方描述的其它小分子)和/或适合的赋形剂，如盐、缓冲剂和稳定剂，可以但不必存在于组合物中。
载剂可以包含，例如，在所采用的剂量和浓度下，对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上或生物学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。通常生理学上可接受的载剂是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包含如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等缓冲液；抗氧化剂，所述抗氧化剂包含抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯20(TWEENTM)聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICSTM)等。
在一些实施例中，一种或多种药剂可以包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。此类技术在《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Oslo A.编辑,(1980)中进行了公开。一种或多种颗粒或脂质体可以进一步包括其它治疗剂或诊断剂。
本文所述的组合物可以用如定时释放调配物或包衣等保护药剂不会从身体中快速消除的载剂制备。此类载剂包含控释调配物，如但不限于植入物和微囊化递送系统，以及可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及本领域的普通技术人员已知的其它物质。因此，特定实施例包含包括延时释放调配物的组合物。实例包含包括以下中的任何一种或多种的组合物：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)、微颗粒/微球、纳米颗粒/纳米球和/或脂质体，包含其任何组合。在具体实施例中，组合物包括延时释放调配物，所述延时释放调配物包括PLGA纳米颗粒和/或PLGA-PEG纳米颗粒。
组合物可以呈固体或液体的形式。在一个实施例中，一种或多种载剂为颗粒，使得组合物呈例如片剂或粉末形式。一种或多种载剂可以为液体，其中组合物呈例如口服油、可注射液体或气雾剂形式，其可用于例如吸入施用。当旨在用于口服施用时，组合物优选地呈固体或液体形式，其中半-固体、半-液体、悬浮和凝胶形式包含在本文中被视为固体或液体的形式中。某些实施例包含无菌可注射溶液。
如同用于口服施用的固体组合物，药物组合物可以被调配成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等。此类固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。另外，可能存在以下中的一种或多种：粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂、如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等崩解剂；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味调味剂；以及着色剂。当药物组合物呈胶囊形式，例如，明胶胶囊时，除了上述类型的材料外，所述药物还可以含有如聚乙二醇或油等液体载剂。
组合物可以呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当旨在用于口服施用时，除本发明化合物外，优选的组合物含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
液体组合物，无论其呈溶液、悬浮液或其它类似形式，均可以包含以下佐剂中的一种或多种：如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏(Ringer's)溶液、等渗氯化钠等无菌稀释剂，如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂等固定油；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
旨在用于肠胃外或口服给药的液体组合物应含有一定量的药剂，以便获得合适的剂量。通常，此量为组合物中所关注药剂的至少0.01％。当旨在用于口服给药时，此量可以在组合物的重量的0.1％与约70％之间变化。某些口服治疗组合物或药物组合物含有介于约4％到约75％的所关注药剂。在某些实施例中，制备根据本发明的治疗组合物或药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位在稀释前含有所关注药剂的重量的0.01％到10％。
组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳剂、乳膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇的稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的治疗组合物或药物组合物中。如果旨在用于透皮施用，则所述组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗疗法装置。
组合物可以旨在用于例如栓剂形式的直肠施用，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有油性基质作为适合的无刺激性赋形剂。此类基质包含但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
组合物可以包含各种材料，所述各种材料改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如，糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的治疗组合物或药物组合物可以包含与药剂结合并且从而有助于化合物的递送的成分。可以以这种能力起作用的合适组分包含单克隆抗体或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。
组合物可以基本上由可以以气雾剂形式施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示范围从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的各种系统。递送可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵系统进行。气雾剂可以以单相、双-相或三-相系统的形式递送，以递送一种或多种活性成分。气雾剂的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些可以一起形成试剂盒。本领域的普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气雾剂。
其可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的组合物可以包括盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种，其与无菌蒸馏水一起形成溶液。可以加入表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与药剂非共价相互作用，以促进药剂在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断来确定。也可以执行受控的临床试验。剂量还可以随着待缓解的病症的严重程度而变化。通常配制和施用药物组合物以发挥治疗有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量以每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可以根据个体需要随时间调整具体剂量方案。
施用可以通过各种不同途径实现，包含口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、肌肉内、皮下或局部施用。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病症的性质。特定实施例包含通过皮下注射、静脉内(IV)输注、皮内注射、肿瘤内注射、瘤周注射或淋巴结内注射施用，包含其任何组合。
因此，施用这些和相关治疗组合物或疫苗组合物的典型途径包含但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内。如本文所使用的术语肠胃外包含皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。调配根据某些实施例的治疗组合物或疫苗组合物，以便在将组合物施用于受试者或患者时允许其中含有的活性成分是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，并且本文所述的气雾剂形式的药剂的容器可以容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法对于本领域的技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版(费城医药科学学院(Philadelphia College of Pharmacy and Science),2000)。待施用的组合物通常将含有治疗有效量的本文所述的用于治疗关注疾病或病症的药剂。
本文所述的组合疗法可以包含施用单剂量调配物，所述单剂量调配物含有细胞因子融合蛋白和自体肿瘤细胞疫苗和/或免疫检查点调节剂(任选地具有一种或多种另外的活性剂)；以及施用包括每种均呈其各自单独的剂量调配物形式的细胞因子融合蛋白和自体肿瘤细胞疫苗和/或免疫检查点调节剂的组合物。例如，可以以单个IV、胃肠外给药、瘤内、瘤周或其它剂量组合物的形式，如以盐溶液或其它生理学上可接受的溶液形式，或以单独剂量调配物形式施用的每种药剂的形式将细胞因子融合蛋白和自体肿瘤细胞疫苗和/或免疫检查点调节剂一起施用于受试者。作为另一实例，对于基于细胞的疗法，细胞因子融合蛋白可以在施用前与自体肿瘤细胞疫苗的细胞混合，可以作为单独组合物的一部分施用，或两者。当使用单独的剂量调配物时，组合物可以基本上同时施用，即，同时施用，或分开交错施用，即，依次和以任何顺序施用；组合治疗应理解为包含所有这些方案。
还包含患者护理试剂盒，所述患者护理试剂盒包括一种或多种融合蛋白、自体肿瘤细胞疫苗、免疫检查点调节剂和/或本文所述的组合物。某些试剂盒还包括一种或多种药学上可接受的稀释剂或溶剂，如水(例如，无菌水)。在一些实施例中，试剂盒的组分储存在小瓶、盒、双室注射器和/或预填充混合系统中。
本文的试剂盒还可以包含一种或多种另外的治疗剂或适合于或期望用于所治疗适应症或用于期望诊断应用的其它组分。本文的试剂盒还可以包含一个或多个注射器或促进预期递送模式所需或期望的其它组分(例如，支架、可植入贮库等)。
在一些实施例中，患者护理试剂盒含有用于一或多种组合物和一种或多种信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，一种或多种组合物可以包含在瓶子、小瓶或注射器中，并且一种或多种信息材料可以与容器相关联而包含。在一些实施例中，试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器内。例如，组合物包含在其上贴有标签形式的信息材料的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施例中，试剂盒包含每个含有一种或多种单位剂型(例如，本文所描述的剂型)的细胞因子融合蛋白和任选地免疫检查点调节剂的多个(例如，一包)单独的容器。例如，一些试剂盒包含每个含有单个单位剂量的细胞因子融合蛋白和任选地免疫检查点调节剂的多个注射器、安瓿、箔袋、泡罩包装。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，不透于水分变化或蒸发)和/或不透光的。
患者护理试剂盒任选地包含适用于施用组合物的装置，例如，注射器、吸入器、滴管(例如，眼滴管)、药签(例如，棉签或木签)或任何此类递送装置。在一些实施例中，装置是分配所计量剂量的一种或多种药剂的可植入装置。还包含，例如，通过组合本文所述的组分提供试剂盒的方法。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是根据本公开的教导，对于本领域的普通技术人员而言应当容易了解到，可以在不偏离随附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。以下实例仅通过说明的方式而非限制的方式提供。本领域的技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
实例
实例1
IL-2和TNF-α的组合的抗肿瘤功效
开发了重组IL-2-TNF-α融合蛋白，并且单独且以与(a)自体肿瘤细胞裂解物、(b)和-PD-1抗体以及(a)和(b)两者的组合的形式对其抗肿瘤功能进行了测试。
根据标准克隆技术制备了IL-2-TNF-α融合蛋白。将突变引入到天然序列；对于人IL-2(不具有信号肽)，引入了C125S或C125A突变以减少不正确的二硫键形成，并且对于可溶人TNF-α，引入了S86T、R31E和/或R32W突变以降低其特异性活性和对TNFR2的亲和力。某些构建体如下：
[ZKBY03]hIL-2(C125S)-(GGGGS)3-hTNF-α(S86T)(SEQ ID NO:19)；
[ZKBY04A]hIL2(C125A)-(GGGGS)2-hTNF-α(S86T)(SEQ ID NO:20)；
[ZKBY04B]hIL2(C125A)-(GGGGS)2-hTNF-α(R32W)(SEQ ID NO:21)；
[ZKBY05A]hIL2(C125A)-PAPAP-hTNF-α(S86T)(SEQ ID NO:22)；
[ZKBY05B]hIL2(C125A)-PAPAP-hTNF-α(R32W)(SEQ ID NO:23)；
[ZKBY06]hIL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-hTNF-α(S86T)(SEQ ID NO:24)；
[ZKBY06B]hIL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-hTNF-α(R32W)(SEQ ID NO:25)；以及
hIL-2(C125S)-(GGGGS)3-hTNF-α(R31E，S86T)。
对IL2-TNF-α融合蛋白序列进行了设计并且合成了DNA。将DNA亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a中。用N末端His-tag克隆经过编码的蛋白质，之后在纯化工艺期间除去所述N末端His-tag。对所述蛋白质进行表达和纯化。选择一个构建体(ZKBY04A，还在图中表示为ZKBY04)以用于基于体外活性测定结果进行进一步研究。
以包涵体的形式在大肠杆菌中表达所述融合蛋白(ZKBY04A)。将包涵体溶解于尿素中，并且在变性条件下用Ni柱对蛋白质进行纯化。然后将蛋白质在含有50mM Tris-HCl、10％甘油、150mM NaCl和0.5M L-精氨酸的重折叠缓冲液中重折叠。在去除tag区之后，在变性条件下使蛋白质再次经受Ni柱。将蛋白重折叠并且通过过滤对其杀菌。确定蛋白质制剂中的肠毒素水平，并且分别通过SDS-PAGE和布拉德福法(Bradford method)测定蛋白质纯度和产量。将最终产物等分并且在-80℃下储存。用于融合蛋白ZKBY04A的SDS-PAGE测定被示出在在图1中。
执行IL-2-TNF-α融合蛋白的活性测量，所述活性测量包含与单个药剂IL-2和TNF-α进行比较。IL-2活性通过测量CTLL-2细胞增殖测定。
融合蛋白(ZKBY04A)的TNF-α活性在L929细胞中通过CCK-8法测定。将ZKBY04A融合蛋白的连续稀释液应用于L929细胞，并且执行CCK-8测定。绘制数据，并且相比于TNF-α单独的S形曲线，蛋白质ZKBY04A的结果示出了更复杂的响应曲线。图2A示出了ZKBY04A融合蛋白的结果，并且图2B示出了单独商业TNF-α的结果。
使用了同系小鼠模型ct-26和pan-02以测试通过PD-1抗体和IV注射的IL-2-TNF-α融合蛋白对肿瘤生长抑制的组合作用。
在WEHI-164鼠肿瘤模型中测试了IL2-TNF融合蛋白ZKBY04A的体内抗肿瘤作用。通过将WEHI-164细胞植入到小鼠(指定为0传代)产生了软组织肉瘤模型。当肿瘤大小达到150mm3时，将小鼠随机分组，并且肿瘤内(IT)或腹膜内(IP)注射药物。每隔三天注射药物，共注射三次。每隔三天测量肿瘤大小。如图3所示出的，ZKBY04A示出了在进行IT注射时抗肿瘤作用较强，而在进行IP注射时，对肿瘤生长的抑制作用稍弱。
还在鼠肿瘤模型WEHI-164中测试了IL-2和TNF-α与PD-1抗体的组合的体内抗肿瘤作用。类似于上文，给WEHI-164小鼠注射PD-1抗体、IL-2和TNF-α的组合或PD-1抗体+IL-2+TNF-α。将STING激动剂ADU-S100用作对比。如图4中所示出的，IL-2与TNF-α的组合示出了对肿瘤生长的良好抑制。当IL-2和TNF-α与PD-1抗体组合使用时，效果更显著。在利用IL-2+TNF-α+PD-1抗体的组中的所有三只小鼠中，肿瘤在第一次药物治疗后的21天之后消失。利用IL-2+TNF-α的组中的一只小鼠示出了在31天之后肿瘤消失。
然后用WEHI-164细胞对清除了肿瘤生长的四只小鼠进行再激发，并且保持三周以上。如图5中所示出的，没有小鼠发展肿瘤，这表明完全治愈和免疫的发展或保护随后不会暴露于WEHI-164肿瘤。
图6A-6C示出了对IL-2+TNF-α+PD-1组进行药物注射之后的肿瘤的图像。第一次注射之后几天，肿瘤上出现溃疡并且之后在溃疡部位处形成了瘢痕组织。然而，最后，伤疤脱落，并且小鼠没有可测量肿瘤。图7示出了对照组的图像，在所述对照组中肿瘤正常生长，没有溃疡和瘢痕形成。
测试了IL-2和TNF-α在CT26鼠癌症模型和B16-F10鼠黑色素瘤模型中的体内抗肿瘤作用。图8A示出了CT26模型中的肿瘤生长抑制，并且图8B示出了在B16-F10模型中类似的肿瘤生长抑制。
对用PLGA或PLGA-PEG纳米颗粒进行的药物递送进行测试。将IL-2-TNF-α融合蛋白溶解为双乳液的第一水相。也将全自体肿瘤细胞裂解物+IL-2-TNF-α融合物溶解为双乳液的第一水相。测量PLGA蛋白复合物中的蛋白水平(总蛋白水平和IL-2-TNF-α的蛋白水平)：Bradford和ELISA法或西方墨点法(western-blot)。
还测试了呈自体肿瘤抗原和肿瘤疫苗的调配物的肿瘤全细胞裂解物与融合蛋白的组合。例如通过用PLGA以及IL-2-TNF-α融合蛋白一起包裹裂解物以形成个体化肿瘤疫苗来制备来自肿瘤细胞或肿瘤组织的全细胞裂解物。将制剂冻干，并且测量总蛋白水平。
测试了IL-2-TNF-α融合蛋白、自体肿瘤细胞裂解物和PD-1抗体在同系小鼠模型(包含ct-26、Pan-02和食管肿瘤模型)中的单独和组合作用。对小鼠进行静脉内注射、肿瘤内注射和/或瘤周注射。剂量和时间表是变化的以标识最佳作用，并且执行机理和功能研究，包含通过IHC和细胞因子释放分析。
实例2
IFN-β和TNF-α的组合的抗肿瘤功效
最初测试了干扰素-β(IFN-β)和TNF-α的组合在WEHI-164鼠肿瘤模型、同系Renca鼠肾癌模型和CT26鼠结肠癌模型中的体内抗肿瘤作用。图9示出了在WEHI-164模型中的肿瘤生长抑制，图10A示出了在Renca模型中的肿瘤生长抑制，并且图10B示出了在CT26模型中的肿瘤生长抑制。
测试了IFN-β-TNF-α融合蛋白的体外活性。此处，使用了mRNA方法来制备融合蛋白构建体(IFN-β-GGGGS2-TNF-α)。对没有信号肽的含有全长人IFN-β、连接子区和人TNF-α的DNA序列进行了设计、合成，并且将其克隆到真核质粒载体中。构建体的序列被示出在下文表E1中。
Figure BDA0002615294910000601
然后使用具有所添加3'-聚A尾的引物对执行PCR。使用了PCR产物作为体外转录的模板以制备mRNA，将经过修饰的5'-帽、假UTP和甲基化的CTP结合，以进行mRNA优化。将mRNA制剂转染到HEK293细胞中。
24小时温育之后，收集培养基，以通过在L929细胞中进行CCK8测定测试TNF-α活性，这应该表明分泌性融合蛋白IFNβ-TNFα的产生。还对含有IFNβ-TNFα的质粒进行转染，并且使用了TNF-α蛋白作为CCK8测定中的阳性对照。图11A-11D示出了IFN-β-TNF-α融合蛋白在CCK8测定中均具有TNF-α活性，而不论是表达为来自HEK293细胞的分泌性融合蛋白还是直接转染到L929细胞中。
序列表
<110> 北京智康博药肿瘤医学研究有限公司（Beijing Percans Oncology Co.,Ltd.）
Chen, Yiyou
Guo, Dagang
<120> 细胞因子融合蛋白
<130> BEPE-004/02WO 327425-2016
<150> PCT/CN2018/119071
<151> 2018-12-04
<150> PCT/CN2018/073940
<151> 2018-01-24
<160> 52
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<212> PRT
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Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
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Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
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Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
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<213> 智人（Homo sapiens）
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Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185
<210> 16
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu
20 25 30
Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu
100 105 110
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg
115 120 125
Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys
130 135 140
Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
165 170 175
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
180 185
<210> 17
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 18
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
50 55 60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75 80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
100 105 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
115 120 125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
130 135 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145 150 155 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
165
<210> 19
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-(GGGGS)3-TNFα（S86T）融合构建体
<400> 19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
145 150 155 160
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
165 170 175
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
180 185 190
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
195 200 205
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
210 215 220
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Thr Tyr Gln Thr Lys Val Asn
225 230 235 240
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
245 250 255
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
260 265 270
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
275 280 285
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
290 295 300
Leu
305
<210> 20
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-(GGGGS)2-TNFα（S86T）融合构建体
<400> 20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
130 135 140
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
145 150 155 160
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala
165 170 175
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
180 185 190
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
195 200 205
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Ile Ala Val Thr Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
225 230 235 240
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
245 250 255
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
260 265 270
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295 300
<210> 21
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-(GGGGS)2-TNFα（R32W）融合构建体
<400> 21
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
130 135 140
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
145 150 155 160
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala
165 170 175
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
180 185 190
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
195 200 205
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
225 230 235 240
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
245 250 255
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
260 265 270
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295 300
<210> 22
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-PAPAP-TNFα（S86T）融合构建体
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Val Arg Ser Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala
145 150 155 160
Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala
165 170 175
Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly
180 185 190
Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro
195 200 205
Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Thr
210 215 220
Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln
225 230 235 240
Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile
245 250 255
Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala
260 265 270
Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val
275 280 285
Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295
<210> 23
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-PAPAP-TNFα（R32W）融合构建体
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Val Arg Ser Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala
145 150 155 160
Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala
165 170 175
Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly
180 185 190
Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro
195 200 205
Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser
210 215 220
Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln
225 230 235 240
Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile
245 250 255
Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala
260 265 270
Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val
275 280 285
Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295
<210> 24
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-PAEAAAKEAAAKA-TNFα（S86T）融合构建体
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
130 135 140
Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
145 150 155 160
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
165 170 175
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
180 185 190
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
195 200 205
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
245 250 255
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295 300
<210> 25
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IL2(C125S)-PAEAAAKEAAAKA-TNFα（R32W）融合构建体
<400> 25
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
130 135 140
Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
145 150 155 160
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
165 170 175
Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
180 185 190
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
195 200 205
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
245 250 255
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
290 295 300
<210> 26
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 - IFNβ-GGGGS2-TNFα融合构建体
<400> 26
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
195 200 205
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln
210 215 220
Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
225 230 235 240
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr
245 250 255
Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Leu Leu
260 265 270
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
305 310 315 320
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
325 330 335
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
340 345 350
Leu
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 27
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 28
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 31
Gly Asn Gly Asn
1
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 32
Gly Gly Asn Gly
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 33
Gly Gly Gly Asn
1
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Asn
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 35
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 36
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 37
Ala Pro Ala Pro Lys Pro
1 5
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 38
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Lys Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 40
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 41
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 42
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 43
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 44
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 45
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 46
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 47
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 48
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 49
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽连接子
<400> 50
Pro Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Kozak共有序列
<400> 51
rccrccatgg 10
<210> 52
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实验室中制备 –用于IFNβ-GGGGS2-TNFα融合构建体的mRNA
<400> 52
atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60
tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120
ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac 180
atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240
tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300
aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360
acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt 420
ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480
cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540
cttacaggtt acctccgaaa cggtggcggt ggctctggag ggggagggtc cgtcagatca 600
tcttctcgaa ccccgagtga caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag 660
gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg 720
agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc 780
ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc 840
gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg 900
gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc 960
ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga ctatctcgac 1020
tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtga 1065

Claims (41)

1.一种细胞因子融合蛋白，其包括第一人细胞因子，所述第一人细胞因子与第二人细胞因子的N末端融合，其中所述第一细胞因子不同于所述第二细胞因子，并且其中所述第一细胞因子和所述第二细胞因子选自IL-2、TNF-α、IFN-β、IFN-α(任选地选自IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21)、IFN-γ、IL-12、GM-CSF、IL-7、IL-23和IL-27，并且任选地其中所述第一细胞因子和所述第二细胞因子由肽连接子分离。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中IL-2、TNF-α、IFN-β、IFN-α、IFN-γ、IL-12、GM-CSF、IL-7、IL-23和/或IL-27的氨基酸序列选自表C1，包含其具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的片段和变体。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一细胞因子为IL-2或IFN-β，并且其中所述第二细胞因子为TNF-α。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述IL-2包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:1或2或SEQ ID NO:1或2的残基21-153至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述IL-2包括C125S或C125A突变。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述IFN-β包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:15至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
7.根据权利要求3到6中任一项所述的融合蛋白，其中所述TNF-α包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:3-6中的任一个至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述TNF-α包括至少一个突变，所述至少一个突变将TNF-α的比活性降低约或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍和/或相对于与TNFR2的优先结合，增加与TNFR1的优先结合，任选地其中所述至少一个突变选自S86T、R31E和R32W，包含其组合。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括肽连接子，任选地生理稳定的连接子或可释放连接子，任选地柔性连接子或刚性连接子。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述肽连接子的长度为约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-50个氨基酸、约1-40个氨基酸、约1-30个氨基酸、约1-20个氨基酸、约1-10个氨基酸或约1-5个氨基酸，或长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个或100个氨基酸。
11.根据权利要求9或10所述的融合蛋白，其中所述肽连接子选自表L1。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的融合蛋白，其包括以下结构：
IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:19)；或
IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:20)；
IL2(C125A)-(GGGGS)2-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:21)；
IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:22)；
IL2(C125A)-PAPAP-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:23)；
IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(S86T)(SEQ ID NO:24)；
IL2(C125A)-PAEAAAKEAAAKA-TNF-α(R32W)(SEQ ID NO:25)；
IL-2(C125S)-(GGGGS)3-TNF-α(R31E，S86T)；或
IFN-β-(GGGGS)2-TNF-α(SEQ ID NO:26)。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的融合蛋白，其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：与选自表F1的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且具有细胞因子信号传导活性和/或抗肿瘤活性的氨基酸序列。
14.一种分离的多核苷酸，其对根据权利要求1到13中任一项所述的融合蛋白进行编码，一种包括所述分离的多核苷酸的表达载体或一种包括所述分离的多核苷酸或所述表达载体的宿主细胞。
15.一种治疗组合物或疫苗组合物，其包括根据权利要求1到13中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂。
16.根据权利要求15所述的治疗组合物或疫苗组合物，其包括延时释放调配物。
17.根据权利要求16所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述延时释放调配物包括以下中的任何一种或多种：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)、微颗粒/微球、纳米颗粒/纳米球和/或脂质体，包含其任何组合。
18.根据权利要求16或17所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述延时释放调配物包括PLGA纳米颗粒和/或PLGA-PEG纳米颗粒。
19.根据权利要求15到18中任一项所述的治疗组合物或疫苗组合物，其包括来自受试者的自体肿瘤细胞疫苗。
20.根据权利要求19所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述自体肿瘤细胞疫苗包括全肿瘤细胞疫苗和/或其细胞裂解物。
21.根据权利要求19或20所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述肿瘤细胞来自选自以下中的一种或多种的癌症：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
22.根据权利要求19到21中任一项所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述自体肿瘤细胞疫苗包括癌抗原，所述癌抗原选自以下中的一种或多种：人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、α甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、存活蛋白、整合蛋白αvβ3、整合蛋白α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板源性生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶-3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
23.根据权利要求15到22中任一项所述的治疗组合物或疫苗组合物，其包括至少一种免疫检查点调节剂，所述至少一种免疫检查点调节剂选自：(a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；以及(b)刺激性免疫检查点分子的激动剂。
24.根据权利要求23所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述免疫检查点调节剂与所述免疫检查点分子特异性结合，并且任选地为多肽，包含抗体或其抗原结合片段、或配体或小分子。
25.根据权利要求23或24所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述抑制性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
26.根据权利要求25所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中(a)的所述拮抗剂选自以下中的一种或多种：
PD-L1和/或PD-L2拮抗剂，所述PD-L1和/或PD-L2拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)以及度伐单抗(durvalumab)(MEDI4736)；
PD-1拮抗剂，所述PD-1拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、MK-3475、AMP-224、AMP-514、PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)；
CTLA-4拮抗剂，所述CTLA-4拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹单抗(ipilimumab)和替西利姆单抗(tremelimumab)；
IDO拮抗剂，所述IDO拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(indoximod)(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满(norharmane)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝他(epacadostat)；
TDO拮抗剂，所述TDO拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10；
TIM-3拮抗剂，所述TIM-3拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；
LAG-3拮抗剂，所述LAG-3拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016；
VISTA拮抗剂，所述VISTA拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；
BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂，所述BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子；以及
TIGIT拮抗剂，所述TIGIT拮抗剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子。
27.根据权利要求23或24所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中所述刺激性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
28.根据权利要求27所述的治疗组合物或疫苗组合物，其中(b)的所述激动剂选自以下中的一种或多种：
OX40激动剂，所述OX40激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998；
CD40激动剂，所述CD40激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、CP-870,893、达西珠单抗(dacetuzumab)、Chi Lob 7/4、ADC-1013和rhCD40L；
GITR激动剂，所述GITR激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873；
CD137激动剂，所述CD137激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米鲁单抗(utomilumab)和4-1BB配体；
CD27激动剂，所述CD27激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、万利鲁单抗(varlilumab)和CDX-1127(1F5)；
CD28激动剂，所述CD28激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08；以及
HVEM激动剂，所述HVEM激动剂任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
29.根据权利要求1到13中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求13到26中任一项所述的治疗组合物或疫苗组合物，其用于治疗有需要的受试者的癌症。
30.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到13中任一项所述的融合蛋白，任选地以根据权利要求15到28中任一项的所述的治疗组合物或疫苗组合物形式。
31.根据权利要求30所述的方法，其包括向所述受试者施用所述融合蛋白与来自所述受试者的自体肿瘤细胞疫苗的组合。
32.根据权利要求31所述的方法，其包括在任选地与根据权利要求17到24中任一项所定义相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白和所述自体肿瘤疫苗。
33.根据权利要求32所述的方法，其包括向所述受试者施用所述融合蛋白与免疫检查点调节剂的组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其包括在任选地与根据权利要求23到28中任一项所定义相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白和所述免疫检查点调节剂。
35.根据权利要求30所述的方法，其包括向所述受试者施用所述融合蛋白与自体肿瘤疫苗和免疫检查点调节剂的组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其包括在任选地与根据权利要求15到28中任一项所定义相同的治疗组合物或疫苗组合物中一起施用所述融合蛋白、所述自体肿瘤疫苗和所述免疫检查点调节剂。
37.根据权利要求30到36中任一项所述的方法，其中所述癌症为原发性癌症。
38.根据权利要求30到36中任一项所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。
39.根据权利要求30到38中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下中的一种或多种：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述转移性癌症选自以下中的一种或多种：
(a)已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的膀胱癌；
(b)已经转移到骨骼、大脑、肝脏和/或肺的乳腺癌；
(c)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的结肠直肠癌；
(d)已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或肺的肾癌；
(e)已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或其它肺部位的肺癌；
(f)已经转移到骨骼、大脑、肝脏、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；
(g)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的卵巢癌；
(h)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胰腺癌；
(i)已经转移到肾上腺、骨骼、肝脏和/或肺的前列腺癌；
(j)已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胃癌；
(l)已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的甲状腺癌；以及
(m)已经转移到骨骼、肝脏、肺、腹膜和/或阴道的子宫癌。
41.根据权利要求30到40中任一项所述的方法，其包括通过以下施用所述融合蛋白或治疗组合物或疫苗组合物：皮下、静脉内、皮内、肿瘤内、瘤周或淋巴结内注射，包含其任何组合。
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