CN111303296B

CN111303296B - 双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用

Info

Publication number: CN111303296B
Application number: CN201911291987.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋俊; 林鑫; 谢桦函
Original assignee: Qichensheng Biotechnology Zhuhai Co ltd
Current assignee: Qichensheng Biotechnology Zhuhai Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN111303296A

Abstract

本发明提供一种双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用。本发明的双功能融合蛋白具有协同作用，大大提高了阻断HLA‑E与NKG2A/CD94的结合效果，解除HLA‑E通过NKG2A/CD94通路对NK细胞和T细胞的抑制作用，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，在体外实验中，表现出良好的抗肿瘤效果。

Description

双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是除T细胞和B细胞之外的第三类淋巴细胞，其不仅是重要性的外向性自然防御细胞，且也参体内的多种免疫细胞的调节，约占人肝脏内淋巴细胞的25％-40％。NK细胞在抑制癌症的发展中具有重要的作用，能够通过产生细胞因子和细胞毒性活动来杀伤肿瘤细胞。NK细胞的活性通过激活和抑制受体来调节。NK细胞表达多种活化受体和抑制性受体，活化受体包括NKG2D、NKG2C、CD226(DNAM-1)、2B4、CD16和天然细胞毒受体(NCR)家族的NKp46、NKp30及NKp44等，抑制性受体主要有杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、CD94/NKG2A、TIGIT和CD96等。

研究表明，在肿瘤微环境下，不仅NK细胞的活化受体的表达会受到影响，NK细胞功能的丧失还与抑制性受体表达的上调有关，许多肿瘤微环境中的NK细胞表现为抑制性受体(如NKG2A、KIR)表达增加，用KIR或NKG2A阻断性抗体处理可明显恢复NK细胞的活化和功能。同时，肿瘤细胞亦能通过下调自身所表达的NK细胞活化受体的配体的表达或者上调NK细胞抑制性受体的配体来逃逸NK细胞的识别与攻击。其作用于NK细胞活化受体表达下调主要表现在活化受体NKG2D及其配体MICA、MICB及ULBPs和NKp30的配体B7-H6,BAG6，而抑制性受体配体表达的上调主要表现在CD94/NKG2A的配体HLA-E和ILT2/4及KIR2DL4的配体HLA-G。

由于抑制性受体在调控自然杀伤细胞活化中发挥关键的免疫检查点(checkpoint)作用，且肿瘤微环境存在NK细胞抑制性受体表达占优势的免疫耐受状态。这种免疫检查点阻断疗法亦适用于基于激活NK细胞的抗肿瘤免疫治疗，通过阻断NK细胞抑制性信号纠正NK受体失衡的免疫功能状态，从而增强NK细胞抗肿瘤免疫应答，因此展示出很好的应用前景。

例如，靶向重要的NK细胞抑制性受体的单抗药物IPH2201正在进行复发或难治性慢性淋巴细胞白血病的I期和II期实验治疗(NCT02557516)。NK细胞表达TIM-3和LAG-3抑制性免疫检查点受体，其在肿瘤患者NK细胞高表达，促进肿瘤微环境NK细胞的免疫抑制状态。目前，抗TIM-3单抗药物MBG453正开始招募参与者单独或与抗PD-1单抗联合用于肺癌、肾癌等恶性肿瘤的I期和II期临床实验性治疗(NCT02608268)。抗LAG-3单抗也正在进行难治性或复发性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的I期临床实验性治疗(NCT 02061761)或与抗PD-1单抗联合用于肝癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和非小细胞肺癌等进展期实体瘤的实验性治疗(NCT 01968109)。

再例如，Sivori等人的研究提到了鼠抗-NKG2A抗体Z270[Pende D,Parolini S,Pessino A,et al.Identification and Molecular Characterization of Nkp30,aNovel Triggering Receptor Involved in Natural Cytotoxicity Medi ated by HumanNatural Killer Cells.Journal of Experimental Medicine,1999,190(10):1505-1516.]。Carretero等人(Eur J Immunol 1997；27：563-567)的研究中描述了鼠抗-NKG2A抗体Z199(现在可商业获得于Beckman Coulte r，Inc.，产品号IM2750，USA)。Vance等人的研究中(J Exp Med 1999；190：1801-1812)提到鼠抗-NKG2-抗体20D5(现在可商业获得于BDBiosciences Pharmingen，目录号550518，USA)。此外，美国专利申请US20030095965公开了一种结合于NKG2A、NKG2C和NKG2E的鼠抗体3S9。目前，全球至少有70个临床试验在早期临床试验中测试NK细胞产品的安全性和有效性，NK细胞也在通过嵌合抗原受体重新定向肿瘤、其他基因修饰策略以及肿瘤特异性激活策略(如在有或没有细胞因子刺激的双特异性增效剂)的背景下进行测试。AndréP等人于2018年的研究报道了一种NKG2A抗体-Monalizumab，其是一种人化抗-NKG2A抗体，通过结合PD-x axis的阻断可以增强NK细胞对抗多种肿瘤细胞的活性并挽救CD8+T细胞的功能。在先前治疗的头颈部鳞状细胞癌的人体试验中，Monalizumab加西妥昔单抗的II期试验的中期结果显示31％的客观反应率，并且50％患者的疾病得到稳定控制。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种双功能融合多肽，本发明的融合多肽能够改善DC疫苗致敏T细胞的能力，提高NK细胞活性，并提高DC疫苗治疗肿瘤的效果。融合蛋白的两部分结构之间协同作用，可以有效解除T细胞抑制作用。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种双功能融合多肽，该双功能融合多肽包含第一功能肽、第二功能肽，且所述第一功能肽与所述第二功能肽之间通过连接子共价连接，从而形成双功能融合多肽结构，所述连接子依次包含第一弹性区、回转区和第二弹性区，且所述第一弹性区与所述第二弹性区分别含有形成共价键的基团。

根据本发明的双功能融合多肽，优选地，所述第一功能肽包含选自由NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E和NKG2H所组成的组中的至少之一的胞外区序列。

根据本发明的双功能融合多肽，优选地，所述第二功能肽包含CD94的胞外区序列。

根据本发明的双功能融合多肽，优选地，所述形成共价键的基团为巯基。

根据本发明的双功能融合多肽，优选地，所述第一弹性区和第二弹性区各自分别包含SEQ ID No.5所示的序列，且所述回转区包含SEQ ID No.6所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种细胞，其包含根据第一方面所述的双功能融合多肽，或包含所述双功能融合多肽的编码核酸。

根据本发明的细胞，优选地，所述细胞为抗原递呈细胞，且所述抗原递呈细胞包含抗原或编码所述抗原的核酸。

本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含根据第一方面所述的双功能融合多肽，或包含根据第二方面所述的细胞和/或其分泌物。

本发明的第四方面，提供一种用于提高NK细胞活性的方法，其包括使根据第一方面所述的双功能融合蛋白或根据第三方面所述的药物组合物与NK细胞接触的步骤。

本发明的第五方面，提供根据第一方面所述的双功能融合蛋白在制备用于治疗癌症或者预防癌症复发的药物中的应用，所述癌症包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌、头颈鳞癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤和神经胶质瘤。

本发明的双功能融合蛋白的两个融合部分之间能够发挥协同作用，大大提高了阻断HLA-E与NKG2A/CD94结合的效果，解除HLA-E通过NKG2A/CD94通路对NK细胞和T细胞的抑制作用，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，在体外实验中，表现出良好的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为使用编码本发明融合蛋白的mRNA转染DC细胞后的DC细胞表型的鉴定结果。图1的各组柱中，从左到右分别为mDC、mDC+GPC3和mDC+GPC3+NKG2A-CD94。

图2为使用编码本发明融合蛋白的mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD8 TNF-α+、CD8 IFN-γ+。

图3为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图3的各组柱中，从左到右分别为CD4 TNF-α+CD4、IFN-γ+。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[双功能融合多肽]

本发明的第一方面，提供一种双功能融合多肽。本发明的“双功能融合多肽”，有时也称作“双功能融合蛋白”或简称“融合蛋白”，指的是第一功能肽与第二功能肽之间通过连接子共价连接形成的融合多肽。共价健结合的实例包括二硫键或肽键。融合蛋白的两个多肽片段之间通常通过柔性连接子连接，从而有利于两个多肽片段之间功能的发挥。

本发明中，连接子依次包含第一弹性区、回转区和第二弹性区，且所述第一弹性区与所述第二弹性区分别含有形成共价键的基团。

本发明中，第一功能肽为自然杀伤细胞的受体的可溶性片段。优选地，第一功能肽包含选自由NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E和NKG2H所组成的组中的至少之一的胞外区序列。更优选地，第一功能肽包含选自由NKG2A、NKG2B和NKG2E所组成的组的至少之一的胞外区序列。还优选地，第一功能肽为NKG2A的胞外区序列。在某些实施方案中，本发明的第一功能肽具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的第一功能肽除了SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列外，还可包含其他序列，例如在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的N端具有如下所示的氨基酸序列，从而有利于多肽被分泌至细胞外：MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSG。

本发明中，第一功能肽的编码核酸序列不特别限定，其实例包括含SEQ ID No.2所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明中，第二功能肽为源自CD94的多肽。天然情况下，机体内的CD94是凝集素、分化簇和参与细胞信号转导的受体，在先天免疫系统的自然杀伤细胞表面表达。人CD94以及其他的CD94受体识别Ib类分子人类白细胞抗原HLA-E，因此HLA-E主要通过与其相应受体CD94的结合激活下游信号来参与机体免疫功能的调节，其中CD94为该受体家族中的主要抑制性受体。本发明通过将源自CD94的多肽作为第二功能肽与第一功能肽融合，不仅提高肿瘤特异性淋巴细胞抗肿瘤细胞的溶胞活性，而且还促进了第一功能肽功能的协同作用。本发明的第二功能肽优选包含CD94的胞外区序列。更优选地，第二功能肽具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明中，第二功能肽的编码核酸序列不特别限定，其实例包括含SEQ ID No.4所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明的双功能融合蛋白中除了自然杀伤细胞的受体的胞外结构域和CD94的胞外结构域外还包含用于将两者连接到一起的连接子。本发明的连接子依次包含第一弹性区、回转区和第二弹性区。本文中，第一弹性区和第二弹性区有时统称为弹性区。弹性区用于为融合的两个功能肽提供柔性，从而促进两者功能的协同。为了实现上述目的，本发明的弹性区的长度一般为8-20个氨基酸，优选10-16个氨基酸。第一弹性区和第二弹性区还分别含有可形成共价键的基团。此类基团的实例包括但不限于巯基(-SH)。各弹性区内可形成共键的基团的数量不特别限定，可以是1个、2个、3个或更多个。第一弹性区和第二弹性区仅仅是为了区别两个弹性区的位置，并不表示弹性区之间必然存在区别。实际上，第一弹性区和第二弹性区可以具有相同的结构或组成。例如，在某些实施方案中，本发明的第一弹性区和第二弹性区分别具有SEQ ID No.5所示的序列。具有此序列的弹性区有利于形成二硫键，而不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度的扭曲。用于形成本发明的第一弹性区和第二弹性区的核酸不限定，优选SEQ ID No.7所示的序列或与其同源性为95％以上，优选96％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上的序列。

本发明的回转区是位于第一弹性区和第二弹性区之间的氨基酸序列。回转区一般具有柔性，从而能够使两侧的序列靠近。优选地，回转区具有SEQ ID No.6所示的序列。

在某些实施方案中，本发明的双功能融合蛋白具有SEQ ID No.8所示的序列。在某些实施方案中，本发明的双功能融合蛋白由包含SEQ ID No.9所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列编码得到。

[细胞]

本发明的第二方面，提供一种细胞，其包含根据第一方面所述的双功能融合多肽，或包含所述双功能融合多肽的编码核酸。优选地，本发明的细胞为抗原递呈细胞，更优选为人为改造的抗原递呈细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，通过从外周血单核细胞(PBMC)中分离的单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或编码抗原的核酸。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为GPC3，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的序列组成，编码序列如SEQ ID No.11所示的序列组成。

[药物组合物]

本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的双功能融合多肽或包含根据第二方面所述的细胞和/或其分泌物。本发明的药物组合物能够提高NK细胞的活性。优选地，本发明的药物组合物还能够为有需要的受试者提供一种或多种抗原(优选肿瘤原)，并且能够提高该抗原的免疫性，进而减轻、缓解、延缓或治愈受试者所患病况或病症。与单独提供抗原的药物相比，或提供抗原和第一功能肽和/或第二功能肽的药物组合物相比，本发明的药物组合物具有增强、提高或加强的免疫能力，能够有效阻断HLA-E与NKG2A/CD94的结合，解除HLA-E通过NKG2A/CD94通路对NK细胞和T细胞的抑制作用，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

本发明的药物组合物可选地还可包含其他成分，例如药物学可接受载体。合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

[提高NK细胞活性的方法]

本发明的第四方面，提供一种用于提高NK细胞活性的方法，其包括使第一方面所述的双功能融合蛋白或第三方面所述的药物组合物与NK细胞接触的步骤。

本发明的第五方面，提供根据第一方面所述的双功能融合蛋白在制备用于治疗肿瘤或者预防癌症复发的药物的应用。所述癌症包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌、头颈鳞癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤和神经胶质瘤。在具体实施方案中，所述癌症为肝癌。

实施例1

本实施例用于制备编码抗原以及本发明融合多肽的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码可溶性NKG2A、可溶性CD94和双功能融合蛋白的mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码的DNA序列。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1基因序列表

名称	序列号
		可溶性NKG2A(含Fc片段)	SEQ ID No.2
可溶性CD94	SEQ ID No.4
		双功能融合蛋白	SEQ ID No.9

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

3.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL GM-CSF和1000U/mL IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

4.转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染5μgmRNA的比例，混合DC细胞和融合多肽的mRNA，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的AIM-V培养基重悬，调整细胞密度到1×10⁶DCs/ml，以每孔200ul的体积种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养。以同样的条件转染GFP mRNA到DC细胞中，作为对照组。

5.转染效率的测定

转染24小时后，以流式细胞仪分析表达绿色荧光蛋白的DC细胞占所有DC细胞的比例，转染24小时后DC细胞转染效率大于50％。

6.DC细胞表型的鉴定

应用直接免疫荧光标记法，将转染DC细胞离心，用FACS buffer(含2％FBS的PBS溶液)重悬DC细胞，细胞浓度为1×10⁶cells/ml，取100μl转染DC细胞悬液加入流式细胞管，分别加入5μl相应的抗体CD80、CD83、CD86，以及相应的同型对照。4℃避光染色30min。每管加入3ml FACS Buffer洗细胞，弃上清，加入500μl FACS buffer，流式分析检测CD80、CD83、CD86的表达。

DC细胞表型的鉴定结果如图1所示，与未转染的DC细胞相比，转染了本发明所述融合蛋白的DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86稳定表达，没有明显的差异。

实施例2

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取健康人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO2培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO2培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL GM-CSF和1000U/mL IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml))，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照

2)只加编码GPC3抗原的mRNA

3)编码GPC3抗原的mRNA与编码可溶性NKG2A的mRNA和可溶性CD94的mRNA的组合

4)编码GPC3抗原的mRNA与编码双功能整合蛋白的mRNA(实验组)。

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述四个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

4.1在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

4.2准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

4.3在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

结果如图2和图3所示，使用本发明提供的融合蛋白能够显著提高CD4T和CD8T细胞亚群中IFN-γ和TNF-α细胞比例，尤其是与使用融合蛋白中的单独的组分相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。

仅仅使用编码GPC3抗原的mRNA负载的DC细胞，仅能引起少部分的CD4以及CD8 T细胞应答。仅使用了NKG2A-Fc和可溶性CD94的组，其CD4 T和CD8细胞亚群中，TNF-α+和IFN-γ+细胞比例有一定提高，说明融合蛋白中单独的组分不足以增强CD细胞致敏T细胞的能力，充分的解除T细胞的抑制状态。而在使用了本发明所述融合蛋白的组中，CD4和CD8 T细胞的免疫应答均有显著提高。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用

<141> 2019-12-16

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 134

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg His

1 5 10 15

Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala Cys

35 40 45

Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu Met

50 55 60

Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe Arg

65 70 75 80

Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe Lys

85 90 95

His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val Leu

100 105 110

Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile Tyr

115 120 125

His Cys Lys His Lys Leu

130

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atgaggcaca acaattcttc cctgaataca agaactcaga aagcacgtca ttgtggccat 60

tgtcctgagg agtggattac atattccaac agttgttact acattggtaa ggaaagaaga 120

acttgggaag agagtttgct ggcctgtact tcgaagaact ccagtctgct ttctatagat 180

aatgaagaag aaatgaaatt tctgtccatc atttcaccat cctcatggat tggtgtgttt 240

cgtaacagca gtcatcatcc atgggtgaca atgaatggtt tggctttcaa acatgagata 300

aaagactcag ataatgctga acttaactgt gcagtgctac aagtaaatcg acttaaatca 360

gcccagtgtg gatcttcaat aatatatcat tgtaagcata agctttaggc acctgaactc 420

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 480

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 960

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1020

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag agcccaaatc ttgtgacaaa 1080

actcacacat gcccaccgtg ccca 1104

<210> 3

<211> 146

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Ser Phe Thr Lys Leu Ser Ile Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn

1 5 10 15

Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu Lys Trp

20 25 30

Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln Lys Thr

35 40 45

Trp Asn Glu Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu Leu

50 55 60

Gln Leu Gln Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln Gln

65 70 75 80

Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp Leu

85 90 95

Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe Glu

100 105 110

Thr Phe Asn Thr Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Pro Ala Gly Asn Ala

115 120 125

Leu Asp Glu Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln Gln

130 135 140

Leu Ile

145

<210> 4

<211> 444

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

atgtctttta ctaaactgag tattgagcca gcatttactc caggacccaa catagaactc 60

cagaaagact ctgactgctg ttcttgccaa gaaaaatggg ttgggtaccg gtgcaactgt 120

tacttcattt ccagtgaaca gaaaacttgg aacgaaagtc ggcatctctg tgcttctcag 180

aaatccagcc tgcttcagct tcaaaacaca gatgaactgg attttatgag ctccagtcaa 240

caattttact ggattggact ctcttacagt gaggagcaca ccgcctggtt gtgggagaat 300

ggctctgcac tctcccagta tctatttcca tcatttgaaa cttttaatac aaagaactgc 360

atagcgtata atccaaatgg aaatgcttta gatgaatcct gtgaagataa aaatcgttat 420

atctgtaagc aacagctcat ttga 444

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gccca 45

<210> 8

<211> 527

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg His

1 5 10 15

Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala Cys

35 40 45

Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu Met

50 55 60

Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe Arg

65 70 75 80

Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe Lys

85 90 95

His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val Leu

100 105 110

Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile Tyr

115 120 125

His Cys Lys His Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

130 135 140

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

145 150 155 160

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

165 170 175

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

180 185 190

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

195 200 205

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

210 215 220

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

225 230 235 240

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

245 250 255

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

260 265 270

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

275 280 285

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

290 295 300

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

305 310 315 320

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

325 330 335

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

340 345 350

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Pro

355 360 365

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser Phe Thr

370 375 380

Lys Leu Ser Ile Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu

385 390 395 400

Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu Lys Trp Val Gly Tyr

405 410 415

Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln Lys Thr Trp Asn Glu

420 425 430

Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu Leu Gln Leu Gln

435 440 445

Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln Gln Phe Tyr Trp

450 455 460

Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp Leu Trp Glu Asn

465 470 475 480

Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe Glu Thr Phe Asn

485 490 495

Thr Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Pro Ala Gly Asn Ala Leu Asp Glu

500 505 510

Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln Gln Leu Ile

515 520 525

<210> 9

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60

cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtaggcacaa caattcttcc 120

ctgaatacaa gaactcagaa agcacgtcat tgtggccatt gtcctgagga gtggattaca 180

tattccaaca gttgttacta cattggtaag gaaagaagaa cttgggaaga gagtttgctg 240

gcctgtactt cgaagaactc cagtctgctt tctatagata atgaagaaga aatgaaattt 300

ctgtccatca tttcaccatc ctcatggatt ggtgtgtttc gtaacagcag tcatcatcca 360

tgggtgacaa tgaatggttt ggctttcaaa catgagataa aagactcaga taatgctgaa 420

cttaactgtg cagtgctaca agtaaatcga cttaaatcag cccagtgtgg atcttcaata 480

atatatcatt gtaagcataa gcttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 540

ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 600

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 660

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 720

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 780

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 840

ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 900

gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 960

ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1020

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1080

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1140

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1200

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccatcttt tactaaactg 1260

agtattgagc cagcatttac tccaggaccc aacatagaac tccagaaaga ctctgactgc 1320

tgttcttgcc aagaaaaatg ggttgggtac cggtgcaact gttacttcat ttccagtgaa 1380

cagaaaactt ggaacgaaag tcggcatctc tgtgcttctc agaaatccag cctgcttcag 1440

cttcaaaaca cagatgaact ggattttatg agctccagtc aacaatttta ctggattgga 1500

ctctcttaca gtgaggagca caccgcctgg ttgtgggaga atggctctgc actctcccag 1560

tatctatttc catcatttga aacttttaat acaaagaact gcatagcgta taatccagct 1620

ggaaatgctt tagatgaatc ctgtgaagat aaaaatcgtt atatctgtaa gcaacagctc 1680

atttga 1686

<210> 10

<211> 618

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp

50 55 60

Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr

115 120 125

Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp

180 185 190

Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu

195 200 205

Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys

210 215 220

Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly

245 250 255

Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met

260 265 270

Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys

275 280 285

Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu

290 295 300

Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu

305 310 315 320

Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr

325 330 335

Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys

340 345 350

Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp

355 360 365

Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser

385 390 395 400

Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser

405 410 415

Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val

420 425 430

Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe

435 440 445

Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln

450 455 460

Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser

465 470 475 480

Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe

485 490 495

Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu

515 520 525

Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln

530 535 540

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn

545 550 555 560

Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val

565 570 575

Cys Phe Phe Phe Leu Val His Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg

595 600 605

Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

610 615

<210> 11

<211> 1985

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

gagaccggcc ucgagcagcu gaagcuuccu gcaggucgac ucuagagcca ccaugagggc 60

ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

gcacgccaag aacuacacca acgccauguu caagaacaac uaccccagcc ugacaccuca 480

ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

ccagcugaug aacccaggcc ugccagauag cgcucuggau aucaacgagu gccugagggg 660

agccagaaga gaccugaagg uguucggcaa cuuccccaag cugaucauga cccagguguc 720

caagagccug caggucacca ggaucuuccu gcaggcccug aaccugggca ucgaggucau 780

caacaccacc gaccaccuga aguucagcaa ggauugcggc cggaugcuca cccgcaugug 840

guauuguagc uauugccagg gccugaugau ggugaagccu ugcggcggcu auugcaacgu 900

cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

Claims

1.双功能融合多肽用于提高体外CD4T细胞和CD8T细胞亚群中IFN-γ阳性细胞的比例或TNF-α阳性细胞的比例的用途，其特征在于，所述双功能融合多肽由第一功能肽、第二功能肽和所述第一功能肽与所述第二功能肽之间共价连接的连接子组成，所述连接子由依次连接的第一弹性区、回转区和第二弹性区组成，且所述第一弹性区与所述第二弹性区分别含有可形成巯基的基团，所述第一弹性区和所述第二弹性区各自的序列如SEQ ID No. 5所示，所述回转区的序列如SEQ ID No.6所示，所述第一功能肽为NKG2A的胞外区序列，其序列如SEQ ID No.1所示，且在其N端具有MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSG所示的序列，所述第二功能肽为CD94的胞外区序列，其序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种用于增强DC细胞体外致敏T细胞的能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用编码GPC3抗原的mRNA和编码双功能融合多肽的mRNA转染DC细胞得到负载有mRNA的DC细胞的步骤，具体地，转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml，按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和融合多肽的mRNA，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中，电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时；其中：

所述双功能融合多肽由第一功能肽、第二功能肽和所述第一功能肽与所述第二功能肽之间共价连接的连接子组成，所述连接子由依次连接的第一弹性区、回转区和第二弹性区组成，且所述第一弹性区与所述第二弹性区分别含有可形成巯基的基团，所述第一弹性区和所述第二弹性区各自的序列如SEQ ID No. 5所示，所述回转区的序列如SEQ ID No.6所示，所述第一功能肽为NKG2A的胞外区序列，其序列如SEQ ID No.1所示，且在其N端具有MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSG所示的序列，所述第二功能肽为CD94的胞外区序列，其序列如SEQ ID No.3所示；

(2)将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活，向孔中加入负载有mRNA的DC细胞至PBMC:DC=10:1，将细胞于37℃培养10-12天。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，编码双功能融合多肽的mRNA对应的基因序列如SEQ ID No.9所示。