CZ286046B6 - Přípravky na bázi analogů erythropoietinu a způsoby jejich přípravy a farmaceutické přípravky s jejich obsahem - Google Patents

Abstract

Analogy lidského erythropoietinu zahrnující analogy |X.sup.33.n., Cys.sup.139.n., des-Arg.sup.166.n.| a |Cys.sup.139.n., des-Arg.sup.166.n.|, způsoby přípravy a použití těchto analogů a farmaceutické přípravky s jejich obsahem.ŕ

Description

Analog lidského erythropoietinu, jej kódující dvouvláknová DNA a expresní vektor, hostitelská buňka a farmaceutický přípravek s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká analogů lidského erythropoietinu, což je glykoprotein, o němž je známo, že je použitelný k vyvolávání tvorby červených krvinek a při ošetřováni stavů, jako je anemie, které jsou důsledkem nízkého počtu erythrocytů nebo retikulocytů. Vynález se rovněž týká způsobů a přípravků při výrobě těchto analogů a způsobů použití těchto analogů k vyvolání erythropoiesy a k ošetřování stavů, jako je anemie, které jsou důsledkem nedostatečného počtu erythrocytů nebo retikulocytů.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin je přirozeně se vyskytující glykoproteinový hormon s molekulovou hmotností, která byla poprvé zaznamenána jako přibližně 39.000 dalton (T. Miyaki a d., J. Biol. Chem. 252:5558-5564 (1977)). Zralý hormon má délku 166 aminokyselin a „pre-pro“ forma hormonu sjeho vedoucím peptidem je dlouhá 193 aminokyselin (F. Lin, patent US 4,703.008). Zralý hormon má molekulovou hmotnost, vypočtenou z aminokyselinové sekvence, 18.399 dalton (K. Jacobs a d., Nátuře 313:806-810 (1985), J. K. Browne a d., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:693-702 (1986)).

Strukturní charakterizace lidského močového erythropoietinu identifikovala formu des-Argl66, která vznikne specifickým odstraněním zbytku Arg na karboxyterminálním konci zralého proteinu (M. A. Recny a d., J. Biol. Chem. 262:17156—17163 (1987)). Recny a d. uvádějí, že fyziologicky aktivní forma erythropoietinu, cirkulující v lidské plazmě, je forma des-Argl66.

Lidský erythropoietin obsahuje tři uhlohydrátové řetězce, spojené N-vazbami (H. Sasaki a d., J. Biol Chem. 262:12059-12076 (1987), E. Tsuda a d., Biochemistry 27:5646-5654 (1988, a M. Takeuchi a d., J. Biol. Chem. 263:3657-3663 (1988)). Obsah uhlohydrátů v erythropoietinu je podobný jak u přirozeně se vyskytujícího močového erythropoietinu, tak u hormonu, produkovaného v savčích buňkách v kultuře expresí klonované DNA, která byla transfikována do buněk, a která kóduje pre-pro-formu hormonu. Glykosylační místa sN-vazbou jsou umístěna v aminokyselinových zbytcích 24, 38 a 83. Jak močový, tak rekombinační erythropoietin také obsahuje jediné glykosylační místo s O-vazbou v aminokyselinovém zbytku 126 (H. Sasaki a d., viz výše, a M. Goto a d., Biotechnology 6:67-71 (1988)). Uhlohydráty, obsažené v erythropoietinu, tvoří komplexní fukosylovaný řetězec čtyřtykadlového typu s N-acetyllaktózaaminovými opakujícími se jednotkami a bez nich (M- Takeuchi a d., viz výše) a přispívá přibližně ze 40 % k hmotnosti erythropoietinu.

Lidský erythropoietin je primárně produkován jako glykoproteinový hormon v dospělé ledvině (Η. P. Koeffler a E. Goldwasser, Ann. Intern. Med. 97:44—47 (1981)). Buňky, které v ledvině erythropoietin produkují, jsou nečetné a jsou umístěny ve vnitřní kůře renálního parenchymu v meziprostorech mezi ledvinnými kanálky (S. T. Koury a d., Blood 71:524-528 (1988), a C. Lacombe a d., J. Clin. Invest. 81:620-623 (1988)). Proto při destrukci ledvinné tkáně, ke které dochází při selhání ledvin, dochází ke zvýšené produkci erythropoietinu a spolu s tím ke snížení počtu erythrocytů a anemii.

Erythropoietin mohou sice produkovat fetální jatemé buňky in vitro (A. Kurtz a d., Endocrinology 118:567-572 (1986)), ale v konečném stadiu u pacientů se selháním ledvin nedochází ke kompenzační produkci erythropoietinu a normální hladina sérového erythropoietinu se obnoví pouze po úspěšné transplantaci ledvin (W. F. Denny a d., J. Lab. Clin. Med. 67:386 (1966)).

- 1 CZ 286046 B6

Pozdní stadium erythropoiesy je ve většině případů uskutečňováno pomocí jediného glykosylovaného hormonu erythropoietinu, produkovaného v jediné tkáni. Vzácná alternativní cesta erythropoiesy byla dokumentována u lidského anefrického pacienta s vysokým hematokritem. Zjistilo se, že erythrotropním faktorem, izolovaným u tohoto pacienta, je lidskému insulinu podobný růstový faktor I (IGF-I; A. Brox a d., Exp. Hematol. 17:769-773 (1989), a L. F. Congote a d., J. Clin. Endocrin. Metab. 72:727-729). IGF—I je nepochybně lidským protějškem hovězího erythrotropního faktoru, pro nějž popisuje aktivitu in vivo i in vitro L. F. Congote {Biochem. Biophys. Res. CommunA\5-ATl-A%3 (1983)). Je známo, že lidských erythrocytech existují receptory IGF-I, a tyto receptory by mohly umožňovat průběh této vzácné cesty pozdní erythropoiesy prostřednictvím interakce IGF-I a jeho specifického receptorů (T. Izami a d., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62:1206-1212 (1986), a C. D. Costigan a d., Clin. Jnvest. Med. 11:4751 (1988)). Nukleotidová sekvence receptorového genu erythropoietinu je však známa a nevykazuje žádnou sekvenční homologii s receptorem lidského IGF-I (A. D. D'Andrea a d., Cell 57:277-285 (1989)), což dokazuje, že alternativní cesta erythropoiesy přes IGF-I není ve vztahu k erythropoietinem zprostředkované dráze pozdní erythropoiesy.

Nejsou sice známy žádné jiné alternativní cesty pozdní erythropoiesy, avšak bylo popsáno několik faktorů, které mohou potencovat působení erythropoietinu. Pozdní erythropoiesa je závislá na erythropoietinu, avšak je ovlivňována testosteronem, estrogeny a erythroid potencujícím faktorem, zatímco časné stadium erythropoiesy je závislé kromě erythropoietinu na aktivitě podporující vymršťování jader z kostní dřeně (N. N. Iscove v Hematopoietic Cell Differentiation, ed. D. W. Golde, M. J. Cline a C. F. Fox, Academie Press, New York, str. 3752). Je známo, že aktivitu při vymršťování mají faktory jako IL-3, faktor stimulující kolonie granulocytových makrofágů a interleukin-9. Není však jasné, zda tyto aktivity mají nějakou roli při erythropoiese (J. Suda a d., Blood 67:1002-1006 (1986); C. A. Sieff a d., Science 230:11711173 (1985) a R. E. Donahoe a d., Blood 75:2271-2275 (1989). V nedávné době se prokázalo, že faktor nazvaný „faktor diferenciace erythroidů“ potencuje aktivitu erythropoietinu in vivo a in vitro (Η. E. Broxmeyer a d., Proč. Nati. Acadl. Sci. 85:9052-9056 (1988); J. Yu a d., Nátuře 330:765-767 (1987)). Bylo zjištěno, že tento faktor je identický saktivinem A (protein uvolňující folikl stimulující hormon) a je inhibován follistatinem, specifickým inhibitorem aktivinu A; fyziologická role aktivinu A však zůstává nezjištěna (M. Shiozaki a d., Proč. Nati. Acad. Sci. 89:1553-1556 (1992)). Po téměř dvaceti letech výzkumů tedy neexistuje jasný důkaz, že by erythropoiesa byla kontrolována jiným hormonem než erythropoietinem.

Při absenci alternativních hormonů k ovlivnění erythropoiesy se v literatuře objevilo několik pokusů jednak sondovat strukturu erythropoietinu a jednak významně zlepšit charakteristiky erythropoietinu místně cílenou mutagenesí. Molekulárním klonováním lidského genu, kódujícího erythropoietin, byla zjištěna sekvence DNA, kódující pre-pro-hormon o 193 aminokyselinách a zralý hormon o 166 aminokyselinách. Dostupnost klonované DNA, kódující hormon a jeho prekurzor (tj. pre-pro-formu) poskytuje příležitost pro mutagenesi standardními metodami molekulární biologie, viz výše citovaný patent US 4,703.008.

První mutované erythropoietiny (tj. analogy erythropoietinů), připravené náhradami a delecemi aminokyselin, vykazovaly sníženou nebo nezlepšenou aktivitu. Jak je popsáno v patentu US 4,703.008, náhradou tyrosinových zbytků v polohách 15, 49 a 145 fenylalaninovými zbytky, náhradou cysteinového zbytku v poloze 7 histidinem, substitucí prolinu v poloze 2 asparaginem, vypuštěním zbytků 2 až 6, vypuštěním zbytků 163 až 166 a vypuštěním zbytků 27 až 55 se nedosáhne zjevného zvýšení biologické aktivity. Mutace Cys⁷ na His⁷ biologickou aktivitu odstraňuje. Rada mutovaných erythropoietinů se substitucí jedné aminokyseliny na místě asparaginového zbytku 24, 38 nebo 83 vykazuje silně sníženou aktivitu (substituce v poloze 24) nebo rychlou intracelulámí degradaci a zřejmý nedostatek sekrece (substituce zbytku 38 nebo 183). Odstraněním O-glykosylačního místa na šeřinu 126 dojde k rychlé degradaci nebo úbytku

-2CZ 286046 B6 sekrece analogu eryhtropoietinu (S. Dube a d., J. Biol. Chem. 33:17516-17521 (1988)). Tito autoři docházejí k závěru, že glykosylační místa na zbytcích 38, 83 a 126 jsou nutná pro řádnou sekreci a že glykosylační místa na zbytcích 24 a 38 mohou být využívána při biologické aktivitě zralého erythropoietinu.

Názor, že glykosylace erythropoietinu je nutná pro biologickou aktivitu in vitro, je v rozporu se zprávami, ukazujícími, že deglykosylovaný erythropoietin je v biologických zkouškách in vitro plně aktivní (M. S. Dordal a d., Endocrinology 116:2293-2299 (1985); J. K. Browne a d., Cold Spring Harbor Symp. Quan. Biol. 51:693-702 (1986); patent US 4,703.008; E. Tsuda a d., Eur. J. Biochem. 188:405—411 (1990), a K. Yamaguchi a d., J. Biol. Chem. 266:20434-20439 (1991)). Mutagenesí cílenou na oligonukleotidy byla zkonstruována sada analogů erythropoietinu, podobných jaké byly studovány výše citovaným Dubem a d., k sondování role glykosylačních míst v biosyntéze a biologické aktivitě erythropoietinu (K. Yamaguchi, viz výše). Z těchto výzkumů vyplývá, že glykosylace je významná pro správnou biosyntézu a sekreci erythropoietinu, ale nemá žádný vliv na aktivitu molekuly in vitro. Všechny mutované erythropoietiny, studované Yamaguchim a d., které obsahují změny na glykosylačních místech, však postrádaj í biologickou aktivitu in vivo.

Široce se uznává, že glykosylace erythropoietinu hraje kritickou roli při aktivitě hormonu in vivo (P. H. Lowy a d., Nátuře 185:102-105 (1960); E. Goldwasser a C. K. H. Kung, Ann. N. Y. Acad. Science 149:49-53 (1968); W. A. Lukowsky a R. H. Painter, Can. J. Biochem. 50:909-917 (1972); D. W. Briggs a d., Amer. J. Phys. 201:1385-1388 (1974); J. C. Schooley, Exp. Hematol. 13:994-998; N. Imai a d., Eur. J. Biochem. 194:457-462 (1990); M. S. Dordal a d„ Endocrinology 116:2293-2299 (1985); E. Tsuda a d., Eur. J. Biochem. 188:405-411 (1990); patent US 4,703.008;, J. K. Brown a d., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 51:693702 (1986), a K. Yamaguchi a d., J. Biol. Chem. 266:20434-20439 (1991)).

Absence biologické aktivity deglykosylovaných analogů erythropoietinu in vivo se připisuje rychlému vyloučení deglykosylovaného hormonu z oběhu ošetřených živočichů. Tento názor je podpořen přímým porovnáním poločasu životnosti glykosylovaného a deglykosylovaného erythropoietinu v plazmě (J. C. Spivak a B. B. Hoyans, Blood 73:90-99 (1989), a Μ. N. Fukuda a á.,Blood 73:84-89 (1989).

Mutagenese glykosylačních míst erythropoietinu cílená na oligonukleotidy byla účinná při sondování funkce glykosylace, avšak dosud neposkytla vzhled do účinné strategie pro významné zlepšení charakteristik hormonu pro terapeutické aplikace.

Byla zkonstruována řada mutantů se substitucí nebo delecí jedné aminokyseliny v místě aminokyselinových zbytků 15, 24, 49, 76, 78, 83, 143, 145, 160, 161, 162, 163, 164, 165 a 166. V těchto mutantech je pozměněn karboxyterminální konec, glykosylační místa a tyrosinové zbytky erythropoietinu. Mutanti byli podáváni zvířatům a byly monitorovány hladiny hemoglobinu, hematokritu a retikulocytů (zveřejněná evropská patentová přihláška č. 0 409 113). I když si mnozí z těchto mutantů zachovávají biologickou aktivitu in vivo, žádný z nich nevykázal významné zvýšení schopnosti zvyšovat hladinu hemoglobinu, hematokritu nebo retikulocytů (bezprostřední prekurzor erythrocytu) v porovnání s nativním erythropoietinem.

Další mutanti byli zkonstruováni k sondování funkce zbytků 99 až 119 (doména 1) a zbytků 111 až 129 (doména 2) (Y. Chem a d., Eur. J. Biochem. 202:225-230 (1991)). Mutanti v doméně jsou při biologickém testu in vitro rychle degradováni a inaktivní, zatímco mutanti v doméně 2 si při nej lepším zachovávají aktivitu in vitro. Tito mutanti také nevykazují zvýšenou aktivitu in vivo ve srovnání s divokým typem lidského erythropoietinu. Tito autoři z toho usuzují, že zbytky 99 až 119 hrají ve struktuře erythropoietinu kritickou roli.

-3 CZ 286046 B6

Molekula lidského eryhtropoietinu obsahuje dva disulfidické můstky, z nichž jeden spojuje cysteinové zbytky v polohách 7 a 161 a druhý spojuje cysteiny v polohách 29 a 33 (P.-H. Lai ad., J. Biol. Chem. 261:3116-3121 (1986)). K sondování funkce disulfidického můstku mezi cysteiny 29 a 33 v lidském erythropoietinu byla použita mutagenese cílená na oligonukleotidy. Cystein v poloze 33 byl přeměněn na prolinový zbytek, což v této poloze napodobuje strukturu myšího erythropoietinu. Vzniklý mutant má velmi sníženou aktivitu in vitro. Úbytek aktivity je tak značný, že z toho autoři usuzují, že disulfidický můstek mezi zbytky 29 a 33 je pro funkci erythropoietinu nezbytný (F.-K. Lin, Molecular and Cellular Aspects of Erythropoietin and Erythropoiesis, str. 23-36, ed. I. N. Rich, Springer-Verlag, Berlin (1987)).

Místně specifická na oligonukleotidy cílená mutagenese methioninového zbytku v poloze 54 lidského erythropoietinu vede k molekule, která si zachovává biologickou aktivitu in vivo rodičovské molekuly (divokého typu) a kromě toho má výhodu, že poskytuje erythropoietinový přípravek, méně podléhající oxidaci (Shoemaker, patent US 4,835.260).

V různých vědeckých publikacích a patentových přihláškách byl popsán velký počet mutantů genu lidského erythropoietinu. Tito mutanti pokryli celou délku molekuly, vyprodukovali částečně nebo úplně deglykosylované molekuly, změnili strukturu disulfidických můstků v molekule a pokusili se zlepšit terapeutickou účinnost molekuly. Žádný z těchto pokusů o modifikaci erythropoietinu neuspěl v získání molekuly se zvýšenou biologickou aktivitou in vivo nebo jinými zlepšenými vlastnostmi pro terapeutické aplikace.

Nemožnost rozpoznání přirozeně se vyskytující alternativní cesty erythropoiesy pozdního stadia a dosud neúspěšné pokusy o výrobu analogu erythropoietinu se zvýšenou aktivitou in vivo poskytují jen malý vhled do problému možností výroby zlepšené molekuly erythropoietinu.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že substituce cysteinu za arginin v poloze 139 lidského erythropoietinu a jeho analogů, včetně těch, kde cystain v poloze 33 je nahrazen jinou aminokyselinou, vede ke glykohormonu, který má významně zlepšenou erythropoietickou aktivitu in vivo a významně zvýšenou použitelnost v terapeutických aplikacích, jako je vyvolání erythropoiesy a léčba anemie.

Dále bylo neočekávaně zjištěno, že první analog savčího, zejména lidského erythropoietinu, který má významně sníženou nebo žádnou biologickou aktivitu in vitro nebo in vivo v důsledku změny aminokyselinové sekvence (v první poloze) oproti přirozeně se vyskytujícímu divokému typu proteinu, může být přeměněn na významně účinnější druhý analog dodatečnou kompenzující změnou aminokyselinové sekvence (v druhé poloze) oproti divokému typu proteinu. Tohoto výsledku se dosáhne i tehdy, je-li druhá poloha v primární sekvenci proteinu vzdálena od první polohy, neboť bylo zjištěno, že takový druhý analog může mít aktivitu in vivo nebo in vitro, která je téměř stejná nebo i větší než u erythropoietinu divokého typu. V tomto kontextu se výrazem „vzdálený“ rozumí odstup o alespoň jednu aminokyselinu, častěji alespoň asi 10 aminokyselin a popřípadě i více než 100 aminokyselin. Je možno snadno identifikovat takové dvojité mutanty, v nichž je snížení aktivity vlivem změny aminokyseliny v jedné poloze kompenzováno nebo dokonce překonáno změnou aminokyseliny v jiné, vzdálené poloze.

Poprvé objeveny a popsány jsou rovněž způsoby pro výrobu zlepšených analogů erythropoietinu podle vynálezu v savčích buňkách expresí sekvencí DNA, které kódují pre-pro-formu analogů, tj. analogy, které mají na aminoterminálním konci navěšen vedoucí peptid savčího erythropoietinu, a přípravky na jejich bázi.

-4CZ 286046 B6

Mnohé z analogů podle vynálezu jsou při podávání anemickým nebo neanemickým savcům překvapivě podstatně účinnější při erythropoiese než nativní erythropoietin a mají navíc překvapivou a podstatnou výhodu v tom, že k dosažení stanoveného terapeutického účinku vyžadují méně časté podávání než nativní erythropoietin.

Analogy savčího (a zejména lidského) erythropoietinu podle vynálezu si zachovávají podobné imunologické charakteristiky nebo biologickou aktivitu in vitro jako odpovídající nativní erythropoietin, takže koncentraci těchto analogů v krvi, kultivačních médiích, farmaceutických přípravcích apod. je možno snadno měřit a monitorovat běžnými prostředky používanými pro 10 nativní glykohormon.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je popsán v souvislosti s připojenými výkresy, kde:

Obr. 1 schematicky znázorňuje plazmid pEPOw5, jehož konstrukce je popsána v příkladu 1.

Obr. 2 schematicky znázorňuje způsob, popsaný v příkladu 1 a použitý k výrobě expresního 20 vektoru SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO, který může být použit k transformaci savčí buňky v kultuře pro výrobu nativního lidského erythropoietinu, z plazmidu pEPOw5 (opraveného) a plazmidu SV2dhfrSVdeltaSJneo.

Na obr. 3 je uveden graf, ilustrující aktivitu nativního „nerekombinovaného“ lidského erythro25 poietinu (standard hEPO), nativního „rekombinovaného“ lidského erythropoietinu, získaného kultivaci dhfr ovariálních buněk čínského křečka, které byly transformovány expresním vektorem SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO (rEPO), a „rekombinovaného“ analogu lidského erythropoietinu pm25 s prolinem v poloze 33 a cysteinem v poloze 139 (pm25), získaného kultivací dhfr ovariálních buněk čínského křečka, které byly transformovány analogem expresního vektoru 30 SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO, který zahrnuje DNA, kódující pre-pro-formu tohoto analogu místo pre-pro-formy nativního lidského erythropoietinu.

Obr. 4 schematicky znázorňuje nativní lidský erythropoietin a pm25.

V jednom z aspektů je předmětem vynálezu analog lidského erythropoietinu, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³, Cys^I39]-lidského erythropoietinu a [X³³,Cys^I39,des-Arg^l66]-lidského erythropoietinu, kde X³³ je vybráno ze skupiny tvořené 20 běžně se vyskytujícími aminokyselinami a sekvence lidského erythropoietinu je znázorněna jako SEQ ID NO: 1.

Přednostními příklady analogů podle vynálezu jsou ty, jimž chybí argininový zbytek v poloze 166, tj. X³³,Cys¹³⁹,desArg¹⁶⁶. Přednostní jsou dále analogy, kde X³³ je Pro nebo Cys.

V dalším aspektu je předmětem vynálezu dvouvláknová DNA, která zahrnuje segment 498 45 nukleotidů v sekvenci, která kóduje analog lidského erythropoietinu podle vynálezu, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³, Cys¹³⁹]-lidského erythropoietinu, nebo segment 495 nukleotidů v sekvenci, která kóduje analog lidského erythropoietinu, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³,Cys^l39,desArg¹⁶⁶]-lidského erythropietinu, kde X³³ je vybráno ze skupiny tvořené 20 běžně 50 se vyskytujícími aminokyselinami.

V dalším aspektu je předmětem vynálezu sekvence dvouvláknové DNA, kde segment o 498 nebo 495 nukleotidech je jedním ze dvou spolu souvisejících subsegmentů a druhý subsegment kóduje vedoucí peptid savčího pre-pro-erythropoietinu a je spojen se subsegmentem o 498 nebo 495

-5CZ 286046 B6 nukleotidech tak, že v polypeptidu, kódovaném těmito souvisejícími subsegmenty, sousedí karboxyterminální konec vedoucího peptidů s aminoterminálním koncem analogu erythropoietinu. Výhodně má vedoucí peptid sekvenci Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X³ Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val X⁴ Gly, kdy X³ je vybráno ze skupiny 5 tvořené Leu a Val a X⁴ je vybráno ze skupiny tvořené Leu a Pro. Přednostními vedoucími peptidy jsou vedoucí peptidy myšího, opičího, křeččího a lidského pre-pro-erythropoietinu, zvláště lidský vedoucí peptid. Aminokyselinová sekvence lidského, resp. opičího vedoucího peptidů je uvedená v dále uvedených sekvencích č. 6, resp. 7.

ίο V dalším aspektu je předmětem vynálezu sekvence dvouvláknové DNA, která je eukaryotním expresním vektorem pro expresi analogu pre-pro-erythropoietinu podle vynálezu v savčí buňce v kultuře. Pro tento účel je možno použít jakoukoli savčí buňku, ale přednost se dává ovariálním buňkám čínských křečků (CHO). Jak je známo, tento expresní vektor se vyrobí navázáním sekvence cDNA, která kóduje příslušný analog, do polohy ve vektoru, kde dojde k transkripci 15 cDNA, spolu se signály nutnými pro translaci transkriptu, když je vektor v buňce (například savčí buňce), která poskytuje proteiny a další složky nutné k rozpoznání signálů na vektoru k zahájení transkripce a signálů na RNA, přepsané z vektoru (včetně segmentu odpovídajícího vložené cDNA), k uskutečnění translace a produkce polypeptidu, kódovaného cDNA. Přednostně je expresní vektor tvořený SV2dhfrSVdeltaSJneo, v němž je v místě Xbal tohoto vektoru 20 operativně pro expresi analogu pre-pro-erythropoietinu vložena dvouvláknová DNA, zahrnující segment, který kóduje analog pre-pro-erythropoietinu. Umístění cDNA v expresním vektoru „operativně pro expresi“ znamená umístit ji tak, aby z vektoru mohla být přepsána RNA a přeložena do buňky, transformované vektorem, za vzniku proteinu, kódovaného cDNA.

Výhodně je expresní vektor tvořen SV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro³³,Cys¹³⁹]hEPO) nebo SV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys¹³⁹]hEPO).

Předmětem vynálezu je rovněž savčí buňka v kultuře, která zahrnuje eukaryotní expresní vektor pro expresi cDNA, kódující analog pre-pro-erythropoietinu podle vynálezu, v této buňce. Tato 30 exprese vede k sekreci zralého glykosylovaného analogu do kultivačního média.

Přednostně má savčí buňka podle vynálezu deficit dihydrofloát reduktasy (je dhfr-), přičemž expresní vektor je tvořen SV2dhfrSVdeltaSJneo, v němž je v místě Xbal tohoto vektoru operativně pro expresi, pre-pro-erythropoietinu vložena uvedená DNA, tvořená dvěma spolu 35 souvisejícími segmenty.

Výhodně je savčí buňkou podle vynálezu ovariální buňka čínského křečka.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický přípravek, vhodný k vyvolání erythropoiesy a/nebo 40 k ošetřování anemie u savce (přednostně člověka), který zahrnuje (a) terapeuticky účinné množství analogu lidského erythropoietinu podle nároku 1 v kombinaci s (b) farmaceuticky přijatelným nosičem. Tyto farmaceutické přípravky, podobně jako analogy podle vynálezu, jsou určeny k podávání pod vedením lékaře nebo veterináře v takovém množství nebo koncentraci, která je účinná při vyvolání potřebného množství erythropoiesy. Použitým nosičem může být 45 jakékoli fyziologicky tolerované vehikulem, zahrnující, aniž by se však na ně omezovalo, pufr, sůl, stabilizátor, konzervační nebo jinou přísadu, kombinované s glykohormonem ve formě, vhodné pro podávání injekcí (obvykle intravenózní nebo subkutánní) nebo jinak.

Podávání má být ve shodě s režimem dávkování, který může snadno stanovit odborník na základě 50 specifické aktivity in vivo analogu ve srovnání s lidským eiythropoietinem a na základě znalostí známého stavu, pokud jde o podávání lidského erythropoietinu k vyvolání eryhtropoiesy a ošetřování různých stavů, jako je anemie, u lidí včetně anemie u pacientů, trpících selháním ledvin. Dávkování analogu podle vynálezu se může poněkud lišit od jedince k jedinci v závislosti na konkrétním analogu a jeho specifické aktivitě in vivo, cestě podávání, zdravotním stavu, věku,

-6CZ 286046 B6 hmotnosti nebo pohlaví pacienta, na pacientově citlivosti vůči analogu nebo složkám vehikula a na dalších faktorech, které je snadno schopen vzít v úvahu ošetřující lékař.

S ohledem na terapeutické použití podle vynálezu se odkazuje na patenty US 4,703.008 a 4,835.260; viz rovněž kapitolu o (rekombinovaném) [des-Arg¹⁶⁶] lidském erythropoietinu na stranách 591-595 Physician's Desk Reference, 46. vyd. (Medical Economics Data, Montvale, New Jersey (1992)). Komerčně dostupné přípravky na bázi rekombinovaného [desArg^l66]lidského erythropoietinu obsahují 2.000, 3.000, 4.000 nebo 10.000 jednotek glykohormonu na ml ve vodném roztoku bez konzervačních přísad s 2,5 mg/ml lidského sérového albuminu, 5,8 mg/ml citrátu sodného, 5,8 mg/ml NaCl a 0,06 mg/ml kyseliny citrónové o pH 6,9 (+/-0,3).

Pokud se zde odkazuje na erythropoietin, není-li kvalifikován jinak, jedná se o „zralý“ lidský protein bez vedoucího peptidu a argininu v poloze 166.

„Pre-pro-eryhtropoietin“ znamená protein včetně vedoucího peptidu a Arg¹⁶⁶ po expresi cDNA kódující pre-pro-formu v savčí buňce, před zpracováním glykosylací a nakonec sekrecí zralého proteinu do kultivačního média. Aminokyselinová sekvence nativního lidského proteinu a nativního lidského pre-pre-proteinu je uvedena v popisu sekvence č. 1.

Výrazy „nativní“ a „divokého typu“ se zde používají jako synonyma.

Pro 20 „přirozeně se vyskytujících“ aminokyselin se zde používají tyto standardní zkratky:

L-alanin

Ala

L-arginin	Arg
L-asparagin	Asn
L-asparagová kyselina	Asp
L-cystein	Cys
L-glutamová kyselina	Glu
L-glutamin	Gin
glycin	Gly
L-histidin	His

L-isoleucin

Ile

L-leucin

Leu

L-lysin Lys

L-methionin Met

L-fenylalanin

L-prolin

L-serin

L-threonin

L-tryptofan L-tyrosin L-valin

Phe Pro Ser

Thr

Τφ

Tyr

Val

Standardní jednopísmenové kódy A, C, G a T se zde používají k označení adenylátových, cytidylátových, guanylátových, resp. thymidylátových nukleotidů. Odborníkovi je zřejmé, že v nukleotidy sekvencích DNA jsou 2'-deoxyribonukleotid-5'-fosfáty (nebo na 5'-konci trifosfáty), zatímco v sekvencích RNA se jedná o ribonukleotid-5'-fosfáty (nebo na 5'-konci trifosfáty) a na místě T se vyskytuje uridylát (U). Označením „N“ se rozumí kterýkoli ze čtyř nukleotidů.

Odkaz na analogický protein „protein X“, jako například „[X^a,Y^b,des-Z^c]protein X“, znamená analog, v němž byla aminokyselina v poloze a nativního proteinu X nahrazena aminokyselinou X, aminokyselina v poloze b nativního proteinu X byla nahrazena aminokyselinou Y a aminokyselina Z, normálně přítomná v poloze c nativního proteinu X, chybí.

Zde používaný symbol ,,SV2dhfrSVdeltaSJneo([X',Yb]hEPO)“ označuje expresní vektor SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO s cDNA, kódující pre-pro-erythropoietin (viz sekvence č. 1), nahrazenou cDNA takovou, že kultivované savčí buňky, transfíkované vektorem, vylučují [X^a.Y^b] analog zralého erythropoietinu.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je podrobně osvětlen na příkladech, které jej však nijak neomezují.

Další podrobnosti v souvislosti s prováděním různých zde popsaných postupů, jako je klonování, vložení cDNA do expresního vektoru operativně pro expresi, transfekce eukaryotních nebo savčích expresních vektorů do savčích buněk a selekce transfikovaných buněk, kultivace savčích buněk k získání požadovaného heterologního proteinu sekrecí do kultivačního média, sekvenování DNA, provádění amplifikace nukleových kyselin řetězovou reakcí s polymerasou (PCR), syntéza primerů pro provádění takové amplifikace, techniky čištění proteinů nebo nukleových kyselin apod., stejně jako další příklady savčích expresních vektorů, buněčných linií vhodných pro použití při expresi z těchto vektorů, kultivačních médií pro kultivaci transfikovaných buněčných linií, vedoucích peptidů pro savčí pre-pro-erythropoietiny jiné než lidský a opičí, metod amplifikace nukleových kyselin apod., jsou snadno dostupné a patří ke známému stavu techniky, viz například Current Protocols in Molecular Biology, ed. F. M. Ausubel a d., Wiley Interscience, John Wiley and Sons, lne., New York (1993) do dodatku 21; ATCC Catalogue of Cell Lineš and Hybridomas, 7. vyd., Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA (1992), a ATCC Media Handbook, Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (1984).

Příklad 1

Příprava plazmidového expresního vektoru SV2dhfrSVdeltaSJneo

A. Konstrukce syntetického genu kódujícího lidský erythropoietin

DNA, kódující lidský pre-pro-erythropoietin plné délky, byla připravena standardní fosforamiditovou metodou, při níž bylo připraveno 8 dvouvláknových oligonukleotidů se sekvencemi č. 8 až 15 a pak byla s použitím těchto 8 oligonukleotidů aplikována metoda Fok-1 genové syntézy, popsaná Mandeckim a Bollingem v Gene 68:101-108 (1988). Oligonukleotidy se sekvencemi č. 8 až 14 byly jednotlivě navázány na pWM500, jehož konstrukce je popsána ve výše uvedené práci Mandeckiho a Bollinga, v místě Smál a pak v tomto vektoru klonovány. Oligonukleotid se sekvencí č. 15 byl navázán na místo Smál pWM501, jehož konstrukce je rovněž popsána ve výše uvedené práci Mandeckiho a Bollinga, a pak klonován v tomto vektoru. Každý oligonukleotid byl po klonování získán digescí vektoru s Fok-1 a čištěním elektroelucí z polyakrylamidového gelu. Pak bylo všech 8 oligonukleotidů mezi sebou ligováno na polynukleotid o 640 párech bází („bp“), který obsahoval fragment BamHi o 625 bp s požadovanou sekvencí stejnou jako sekvence č. 1, která obsahovala segment, kódující pre-pro-erythropoietin. Fragment o 640 bp byl sestaven tak, aby měl na 5'-konci místo HindlII a na 3'-konci jediné místo EcoRI pro snadnost následujícího klonování. Po navázání, kterým vznikl fragment o 640 bp, byl tento fragment digerován s EcoRI a částečně digerován s HindlII a vzniklý

-8CZ 286046 B6 fragment o 640 bp byl navázán do podobně digerovaného pUC19 za vzniku plazmidu pEPOw5, který je zobrazen na obr. 1. Byla stanovena sekvence fragmentu o 640 bp v pEPOw5 jako pokus o ověřeni, zda by fragment kódující pre-pro-erythropoietin skutečně kódoval lidský pre-proerythropoietin.

B. Korekce chyb syntézy mutagenesí cílenou na oligonukleotidy

Fragment pEPOw5, kódující pre-pro-erythropoietin, obsahoval dvě chyby v nukleotidech, které měly za následek změny aminokyselin v polohách 84 a 95 oproti aminokyselinám přítomným v těchto polohách v lidském erythropoietinu. Oprava těchto chyb, tak, aby aminokyseliny v polohách 84 a 95 byly stejné jako v lidském erythropoietinu, vyžadovala změnu C, přítomného v poloze 352 sekvence č. 1, na T; změnu T, přítomného v poloze 353, na C; změnu C, přítomného v poloze 385, na G a změnu A, přítomného v poloze 387, na G. Proto byl pEPOw5 tedy kompletně digerován sEcoRI a částečně digerován sHindlIl. Digerovaný plazmid byl podroben elektroforéze v 0,7% agarosovém gelu a fragment o asi 640 pb byl 1 h při 100 V elektroeluován z agarosy do solného můstku 7,5M acetátu amonného s použitím elektroeluátoru model UEA (Intemational Biotechnologies lne., New Haven, Connecticut, USA). Replikativní forma M13mpl8 byla kompletně digerována sHindlIl a EcoRJ a navázána na eluovaný fragment. Navázané DNA byly transfikovány do E. coli (kmen DH5alfa F') a fágové plaky byly přeneseny do média 2x YT. Fágy byly preparativně propagovány v buňkách E. coli DH5alfa F'. Fágy byly titrovány na buňkách E. coli CJ236 [dut—1, ung-1] a fág obsahující uráčil byl připraven z téhož kmene infekcí 0,2 M.O.I., doporučenou výrobcem kitu pro mutagenesí MutaGene (Βίο-Rad Laboratories, Richmond, Califomia, USA). Templátová DNA byla z fága extrahována podle doporučení výrobce. Mutagenese zbytků 84 a 95 byla specifikována současným napojením fosforylovaného oligonukleotidu-1 se sekvencí č. 2 a oligonukleotidu-2 se sekvencí č. 3 na templátovou DNA. DNA s příslušnými opravami byla syntetizována in vitro podle doporučení výrobce kitu pro mutagenesí. Mutovaná (opravená) DNA byla transfikována do buněk DH5alfaF' a pro sekvenování DNA byly izolovány fágové plaky. Po potvrzení sekvence byl mutovaný (s opravenou sekvencí) fragment DNA, kódující pre-pro-erythropoietin, dále uvedeným způsobem subklonován pro expresi. Sekvence DNA, kódující syntetický lidský pre-pro-erythropoietin, je uvedena jako sekvence č. 1.

C. Konstrukce DNA, kódující pre-pro-pm25, mutagenesí cílenou na oligonukleotidy

Konstrukce DNA, kódující pre-pro-pm25 (tj. [Pro³³,Cys¹³⁹] lidský pre-pro-erythropoietin), mutagenesí cílenou na oligonukleotidy, byla provedena výše popsanými metodami a byla získána opravená DNA, kódující nativní lidský pre-pro-erythropoietin. Opravená DNA, kódující prepro-erythropoietin, byla použita jako zdroj templátové DNA k získání DNA, kódující pre-propm25. Primery pro mutagenesí DNA byly (i) oligonukleotid-3, mající sekvenci č. 4, u něhož jsou nukleotidy v polohách 199 a 200 sekvence č. 1 změněny na C, a (ii) oligonukleotid-4, mající sekvenci č. 5, v níž je nukleotid v poloze 517 v sekvenci č. 1 změněn na T.

D. Subklonování DNA, kódující pre-pro-erythropoietin a pre-pro-pm25, do eukaryotního expresního vektoru

Eukaryotní expresní vektor SV2dhfrSVdeltaSJneo byl 2 g digerován s Xbal a DNA byla extrahována stejným objemem směsi fenol/chloroform (1:1) nasycené pufrem a pak chloroformovou extrakcí. Digerovaná DNA byla vysrážená ethanolem, vysušena a resuspendována v 50 μΐ TE (10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA). Digerovaný vektor byl po dobu 1 h při 37 °C podroben působení telecí alkalické fosfatasy. Fosfatasovaný vektor byl extrahován směsí fenol/chloroform a chloroformem, vysušen a resuspendován v pufru REact2 (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl) (Ginco-BRL, Gaithersburg, Maryland, USA). Vyčnívající 5'-konce Xbal-digerovaného vektoru byly zarovnány vyplněním reakcí s velkým fragmentem

-9CZ 286046 B6

DNA polymerasy I (Klenow) a 0,1 mM 2'-deoxyribonukleosidtrifosfátů po dobu 30 min při teplotě místnosti. Klenowův fragment byl odstraněn extrakcí směsí fenol/chloroform a DNA byla vysrážena ethanolem a resuspendována v TE (50 μΐ).

Fragmenty DNA, kódující lidský pre-pro-erythropoietin a pre-pro-pm25, byly subklonovány do expresního vektoru, digerovaného Xbal a zarovnaného Klenowem, jako fragmenty BamHI, které byly také zarovnány. Fragmenty byly propagovány jako část plazmidů v kmeni E. coli HB-101. Přečištěný plazmid byl připraven z 1 I kultur lýzí s SDS při pH 8,0 a následujícím centrifugováním s gradientem hustoty chloridu česného (T. Maniatis a d., Molecular Cloning, str. 89-94, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Koncentrace plazmidové DNA byla stanovena absorbancí při 260 nm. Preparativní množství byla digerována s BamHI a podrobena elektroforéze v 0,7% agarosovém gelu v pufru Tris-acetát. Pás o přibližně 625 bp byl elektroeluován z agarosy do solného můstku 7,5M acetátu amonného s použitím elektroeluátoru model UEA (Intemational Technologies lne.) po dobu 1 h při 100 V. Eluovaná DNA byla vysrážena ethanolem a resuspendována vTE. Vyčnívající 5'-konce byly zarovnány enzymatickou opravou, popsanou výše pro expresní vektor. Zarovnaný expresní vektor a uvedené fragmenty byly ligovány po dobu 16 h při 15 °C pomocí T4 DNA ligasy. Navázaná směs byla transformována do E. coli a správný klon byl identifikován standardními metodami. Klony byly propagovány ve stadiu 1 litru a plazmidová DNA byla připravena lýzí dodecylsulfátem sodným (SDS) a centrifugováním s hustotním gradientem chloridu česného, jak je uvedeno výše. Plazmidy (expresní vektory) byly uchovávány v TE při 4 °C. Expresní vektor pro lidský prepro-erythropoietin byl označen SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO a expresní vektor pro [Pro³³,Cys¹³⁹] lidský pre-pro-erythropoietin byl označen SV2dhfrSVdeltaSJneopm25. Schematické znázorněné konstrukce a subklonování SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO je uvedeno na obr. 2.

SV2dhfrSVdeltaSJneo byl konstruován přídavkem expresní kazety genu rezistence proti neomycinu a expresní kazety SVdeltaSJ k veřejně dostupnému plazmidů pSV2-dhfr (Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, přírůstkové číslo 37146; Berg a d., Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981)). Plazmid pSV2-dhfr obsahuje fragment PvuII-to-EcoRI o velikosti 2,3 tisíc bp (kbp) (označený na obr. 2 „ori PBR amp“), který byl odvozen od pBR322 a má bakteriální počátek replikace („ori“) a β-laktamasový gen (který poskytuje rezistenci proti ampicilinu, „amp“) z plazmidů pBR322. Plazmid pSV2-dhfr obsahuje také expresní kazetu o 1,9 kbp, která obsahuje 0,34 kbp fragment PvuII-to-HindIII DNA opičího viru 40 (SV40) s Tantigenovým promotorem (označený na obr. 2 „SVE“), 0,74 kbp fragment HindIII-to-BgIII se sekvencí cDNA, kódující myší dihydrofolátreduktasu, (označený na obr. 2 „dhfr“), 1,6 kbp fragment BglII-to-EcoRI DNA SV40, zahrnující 0,82 kbp fragment BglII-to-BamHI se štěpením T-antigenové mRNA SV40 a polyadenylačními signály (označený na obr. 2 „sv40-A“) a 0,75 kbp fragment BamHI-to-EcoRI, jehož funkce není známa (označený na obr. 2 „sv40-B“). Expresní kazeta genu neomycinové rezistence (k dodání rezistence proti neomycinu buňkám transformovaným tímto vektorem) byla vložena do místa PvuII plazmidů pSV2-dhfr rutinními metodami subklonování (například Výše citovaný Maniatis a d.). Expresní kazeta genu neomycinové rezistence je fragment o velikosti 1,8 kbp, obsahující 0,25 kbp fragment PvuII-toSmal DNA viru Herpes simplex-1 („HSV1“) s thymidinkinasovým promotorem, 0,1 kbp fragmentem BglII-to-Smal transposonu TnS, kódujícího enzym dodávající rezistenci proti neomycinu, 0,6 kbp fragmentem Smal-to-PvuII DNA HSV1, kódujícím polyadenylační místo mRNA thymidinkinasy a signál; všechny tyto fragmenty jsou odborníkovi snadno dostupné. Expresní kazeta SVdeltaSJ je fragment o velikosti 2,5 kbp s 0,34 kbp fragmentem PvuII-toHindlII DNA SV40 s T-antigenovým promotorem (na obr. 2 „SVE“), místem Xbal pro vložení heterologní DNA a její exprimování pod kontrolou T-antigenového promotoru SV40, 0,44 kbp fragmentem DNA viru hepatitidy B (subtyp adw) se zesílením na 3-konci z genu povrchového antigenů viru hepatitidy B (označeným na obrázku „delta S“) a 1,85 kbp fragmentem BamHI-toPvuII DNA HSV1 z fragmentu BamHI J této DNA. Kazeta SVdeltaSJ byla předem sestavena a vložena do místa BamHI (po zarovnání Klenowem) v SV2-dhfr. Vložením expresní kazety

-10CZ 286046 B6 genu neomycinové rezistence a expresní kazety SVdeltaSJ do plazmidu pSV2-dhfr byl získán plazmidový expresní vektor SV2dhfrSVdeltaSJneo, znázorněný na obr. 2.

Příklad 2

Alternativní konstrukce syntetického genu kódujícího pm25

Při alternativním postupu přípravy výše uvedeného expresního vektoru SV2dhfrSVdeltaSJneopm25, se DNA, kódující plnou délku pm25, syntetizuje znovu s použitím standardní fosforamiditové chemie. Připraví se řada dvouvláknových oligonukleotidů podobným způsobem jako v příkladu 1, avšak na rozdíl od přístupu příkladu 1 oligonukleotidy po sestavení tvoří gen, již obsahující mutace v sekvenci nativního erythropoietinu, jako jsou například změny, kódující prolinový zbytek v poloze 33 a cysteinový zbytek v poloze 139. Syntetické oligonukleotidy se sestavují pomocí metody genové syntézy Fok-1 podle výše citovaných Mandeckiho a Bollinga nebo jinými metodami, známými odborníkům v oblasti genové syntézy. Sekvence získaného syntetického genu pm25 je potvrzena standardním sekvenováním DNA sestaveného pre-propm25 genu.

Sestavený gen pre-pro-pm25 se pak subklonuje do plazmidového vehikula/expresního vektoru výše popsanými standardními metodami, například zahrnutím jedinečných restrikčních míst na 5' a 3' konci syntetického genu pre-pro-pm25 s následující digescí s restrikční endonukleasou a subklonováním.

Příklad 3

Alternativní konstrukce genu pre-pro-pm25 mutagenesí RT-PCR

Geny analogu pre-pro-erythropoietinu mohou být připraveny rovněž s použitím řetězové reakce s reverzní transkripční polymerasou. Příkladem takového postupu je příprava sekvence DNA, kódující pre-pro-pm25, při níž se na savčí buňky v kultuře známým způsobem působí 48 h 100 μΜ chloridu kobaltu za účelem zvýšení úrovně exprese genu kódujícího nativní erythropoietin (H. Schloz a d., Am. J. Physiol. 263:474-479 (1992)). Buňky se pak promyjí chladným salinickým roztokem a sklízejí se z kultury centrifugováním. Peleta buněk se lyžuje resuspendováním ve fyziologickém roztoku s obsahem 1 % Tritonu X-100 a centrifuguje k odstranění jader; získaný supematant obsahuje úplnou mRNA. Alternativně je možno peletu buněk lyžovat guanidinisothiokyanátem k získání úplné RNA.

mRNA se pak izoluje napojením na perličky Dynabeads Oligo Dt 25 (deoxythymidin), nesoucími oligonukleotid, podle doporučení výrobce (Dynal A/S, N-0212 Oslo, Norsko). Úplná RNA se připraví z guanidinisothiokyanátem lyžovaných buněk standardními metodami. Komplementární DNA se syntetizuje zOligo-dt selektované mRNA, izolované z přibližně 10⁵ buněk nebo z přibližně 0,1 pg úplné RNA s použitím náhodných hexamerových primerů a reverzní transkriptasy, cDNA slouží jako templát pro mutagenní řetězovou reakci s polymerasou. Reakce PCR se provádí s použitím tří sad primerů a gen pre-pro-pm25 se syntetizuje jako tři odlišné fragmenty (amino, střední a karboxy) s jednou sadou primerů pro každý fragment.

5'-primer amino-fragmentu obsahuje restrikční místa pro následující molekulární manipulace a sekvence komplementární k 5'-konci templátu cDNA. 3'-primer amino-fragmentu obsahuje restrikční místo pro molekulární manipulaci a sekvence komplementární k templátu cDNA.

-11CZ 286046 B6

5'-primer středního fragmentu obsahuje restrikční místo schopné spojení s 3'-restrikčním místem amino-fragmentu, kodon kódující prolinový zbytek v poloze 33 pre-pro-pm25 a sekvence komplementární k templátu cDNA. 3'-primer středního fragmentu obsahuje kodon kódující cysteinový zbytek v poloze 139 pre-pro-pm25, restrikční místo pro následující molekulární manipulace a sekvence komplentámí k templátu cDNA.

5'-primer karboxy-fragmentu obsahuje restrikční místo schopné spojení s 3'-restrikčním místem 3'-primeru středního fragmentu a sekvence komplementární k templátu cDNA. 3'-primer karboxy-fragmentu obsahuje sekvence komplementární k templátu cDNA a restrikční místo pro následující manipulace.

Každý jednotlivý fragment může být před konečným sestavením celého genu pre-pro-pm25 subklonován a potvrzena jeho sekvence. Gen pre-pro-pm25 se sestavuje digescí fragmentů v restrikční endonuklease s použitím restrikčních míst, zavedených do každého primeru, a ligací získaných komplementárních konců. Sestavený gen pre-pro-pm25 obsahuje nepřeložené sekvence 5' a 3', původně se nacházející ve zprávě kódující erythropoietin, i kódující sekvence pro gen pre-pro-pm25. Tyto nepřeložené sekvence je možno odstranit použitím dalších PCR reakcí s primery, komplementárními ke kódujícím sekvencím genu pre-pro-pm25, metodami odborníkům známými. Úplný gen, kódující pre-pro-pm25, je pak výše uvedeným způsobem subklonován do vhodného expresního vektoru.

Příklad 4

Exprese proteinů transformovanými buněčnými liniemi

A. Transfekce ovariálních buněk čínského křečka (CHO) s deficitem dihydrofolátreduktasy

Každý zplazmidů SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO a SV2dhfrSVdeltaSJneopm25 byl s použitím postupu, zprostředkovaného kationtovým liposomem (P. L. Felgner a d., Proč. Nati. Acad. Sci. 84:7413-7414 (1987)), transfíkován do buněk CHO/dhfr[dxb-l 11] (Uriacio a d., Proč. Nat. Acad. Sci. 77:4461-4466 (1980); přírůstkové číslo Američan Type Culture Collection CRL 9094), které jsou odborníku snadno dostupné. Podobné transfekce byly provedeny s expresním plazmidem pro expresi povrchového antigenu viru hepatitidy B a získané transfikované buňky sloužily jako negativní kontrolní tekutina pro dále popsané biologické experimenty in vivo. Buňky CHO/dhfr byly kultivovány vHamově médiu F-12, doplněném 10% fetálního telecího séra, L-glutaminem (1 μΜ) a čerstvě nasazeném do baňky o 25 cm² při hustotě 5 až 8.10⁵ buněk na baňku 24 h před transfekcí. 10 pg plazmidové DNA bylo přidáno k 1,5 ml redukovaného sérového média Opti-MEM I s 2,4 g/1 bikarbonátu sodného (Gibco-BRL) a 100 μΐ činidla Lipofectin Reagent (Gibco-BRL) pro liposomem zprostředkovanou transfekci DNA do buněk ve tkáňové kultuře bylo přidáno k druhému podílu 1,5 ml média Opti-MEM I. Oba roztoky byly připraveny v polystyrénových trubičkách. Oba roztoky byly smíseny a inkubovány 20 min při teplotě místnosti. Kultivační médium bylo z buněk odstraněno a nahrazeno roztokem Opti-MEM I-Lipofectin-DNA. Buňky byly inkubovány 3 h při 37 °C, načež byl roztok Opti-MEM ILipofectin-DNA nahrazen na dalších 24 h kultivačním médiem, načež byla provedena selekce.

B. Selekce a amplifikace

Jeden den po transfekci byly buňky pasážovány 1:3 a inkubovány se selekčním médiem dhfr/G418 (dále „F-12 minus médium G“). Selekční médium bylo Hamovo F-12 s Lglutaminem a bez hypoxanthinu, thymidinu nebo glycinu (Gibco-BRL), doplněné dialyzovaným fetálním telecím sérem (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA) a 300 pg/ml G418 (GibcoBRL).

-12CZ 286046 B6

Kolonie, vykazující přítomnost dihydrofolátreduktasy (Ringold a d., J. Mol. Appl. Genet. 1:165174 (1981)) plus aminoglykosidfosfotransferasy (P. J. Southem a P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341 (1981)), se objevily po 4 až 5 dnech inkubace transfikovaných buněk sF-12 minut médium G. Po přibližně dvou týdnech byly buňky DHFR/G418 dostatečně expandovány, aby byla umožněna pasáž a trvalé uchovávání v F-12 minus médium G.

Amplifikace transfikovaných erythropoietinových nebo pm25 genů byly prováděna postupnou selekcí buněk DHFR+, G418+ methotrexátem (přehled R. Schimke, Cell 37:705-713 (1984)). Buňky byly inkubovány s F-12 minut médium G, obsahujícím 150 nM methotrexátu (MTX), po dobu přibližně dvou týdnů do objevení rezistentních kolonií. Buňky rezistentní na MTX byly pasážovány a uchovávány v příslušném selekčním médiu. Další amplifikace bylo dosaženo selekcí s 5 μΜ MTX a buňky byly trvale uchovávány v příslušném selekčním médiu.

C. Uchovávání a skladování buněčných linií

Buňky v kultuře a podrobené různým selekčním nebo amplifikačním postupům byly třikrát týdně doplňovány příslušným kultivačním médiem. Buňky byly pasážovány 1:5, s příslušným médiem, do baněk 75 cm² standardními metodami. Kryokonzervace se prováděla resuspendováním 2 až 4.10⁶ buněk v 1,8 ml příslušného kultivačního média s obsahem 5 % DMSO (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) a skladováním po dobu 24 h při -80 °C a pak trvale při -135 °C.

D. Produkce erythropoietinu a pm25 v médiu prostém séra

Buňky, transfikované DNA, exprimující buď erythropoietin (tj. rEPO-), nebo pm25, byly pěstovány do konfluence v F-12 minus médium G s obsahem 300 pg/ml G418, pak bylo kultivační médium odstraněno a nahrazeno produkčním médiem (5 ml/25 cm² povrchu). Produkčním médiem bylo médium VAS (kultivační médium neobsahující sérum, doplněné rybím protaminsulfátem) s L-glutaminem pufrem HEPES a bez fenolové červeně (JRH Biosciences). Buňky byly kultivovány 3 dny při 37 °C a kondicionované médium bylo použito jako zdroj rEPO nebo pm25.

Oba polypeptidy, získané z kondicionovaného média, tj. rEPO i pm25, byly des-Arg¹⁶⁶.

Příklad 5

Biologická účinnost exprimovaných proteinů in vitro

A. Biotesty in vitro

Erythropoietinová aktivita byla stanovena zabudováním radioaktivně značeného thymidinu do slezinných buněk myší, podrobených působení fenylhydrazinu (G. Krystal, Exp. Hematol. 11:649-660 (1983)). Samicím myší C57/6, starým alespoň 10 týdnů, byl 72 a 96 h před cervikální dislokací injekčně intraperitoneálně vpraven fenylhydrazin (60 mg/kg). Největší sleziny byly vyjmuty a opatrně rozdrobeny do kultivačního média aMEM (bez nukleotidů), doplněného 0,2 % hovězího sérového albuminu (BSA). Tkáňová suspenze byla 1 min inkubována v 50 ml polypropylenové trubičce a z velkých tkáňových agregátů byly odděleny slezinné buňky. Slezinné buňky byly 10 min centrifugovány při 1500 min'¹ v klinické odstředivce a resuspendovány ve slezinném kultivačním médiu (SCM). SCM je aMEM (bez nukleotidů) s obsahem antibiotik, 0,4 % BSA, 2,0 % Nutridoma NS (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA), 30 % fetálního telecího séra (Hyclone, Logan, Utah, USA), selektovaného na růst erythroidních buněk, a 0,1 mM 2-merkaptoethanolu. Z buněčné suspenze byly odstraněny agregáty průchodem přes nylonové síto (200 mesh); pak byly v hemato

-13CZ 286046 B6 cytometru spočteny nukleované buňky. Buňky byly inkubovány přibližně 3 h při teplotě místnosti za občasného míchání v SCM v množství 8.10⁶ buněk/ml. Alikvoty buněčné suspenze o 50 μΐ byly inokulovány do jamek 96jamkových mikrotitračních ploten tvaru U, do nichž byl přidán stejný objem vzorku v SCM. Buňky byly inkubovány 22 až 24 g při 37 °C v inkubátoru CO₂ (5 % CO₂), pak bylo do každé jamky přidáno 0,6 pCi tritiovaného thymidinu a inkubace pokračovala další 2 h. Reakce byly ukončeny položením mikrotitračních ploten na led. Buňky byly sklízeny na discích ze skelného vlákna pomocí přístroje PHD (Cambridge Technology, Watertown, Massachusetts, USA), promyty alespoň desetkrát destilovanou vodou a jednou 95% ethanolem. Radioaktivita byla měřena scintilačním čítačem (Beckman Instruments, Fullerton, Califomia, USA). Jako pozitivní kontrola byl ve všech testech obsažen v množství 0,25 až 16 milijednotek/jamku nativní lidský nerekombinovaný erythropoietin (hEPO, Toyobo, New York, lne., New York, New York, USA). Každý získaný údaj představuje průměr z trojnásobného stanovení z alespoň tří jamek/vzorek.

Jak je znázorněno na obr. 3, odpovědi v závislosti na dávce byly získány testováním hEPO (tj. erythropoietinový standard), iEPO (tj. rekombinovaný nativní eiythropoietin, získaný z buněk CHO transfikovaných SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO) a pm25. Údaje na obr. 3 představují výsledky z testu čištěného pm25 a rEPO při postupném ředění počínaje 15 pg/ml u pm25 a 18pg/ml u rEPO. Tyto údaje jasně prokazují, že mutovaný erythropoietin pm25 ([Pro³³, Cys¹³⁹]lidský erythropoietin) má účinnost in vitro totožnou s lidským erythropoietinem, i když pm25 nemá cysteinový zbytek v poloze 33, a tudíž nemůže tvořit disulfidickou vazbu mezi zbytky 29 a 33, kterou předchozí autoři pokládali za nezbytnou pro erythropoietinovou aktivitu.

B. Radioimunoanalýza a specifická aktivita in vitro

Hmoty rEPO a pm25 byly stanoveny pomocí komerční soupravy pro radioimunoanalýzu (Incstar, Stillwater, Minnesota, USA) podle návodu výrobce, oproti němuž však byl zahrnut hEPO jako pozitivní kontrola pro vytvoření standardní křivky. rEPO byl dále popsaným způsobem čištěn do homogenity a hmota byla stanovena analýzou složení aminokyselin. Standardní hydrolýza byla prováděna s použitím přibližně 50 až 300 pmol proteinu po dobu 2h při 155 °C ve vakuu přístrojem Pico Tag Work station (Waters, Milford, Massachusetts, USA). Čištěný standard byl skladován při -80 °C a pro standardní křivku každé radioimunoanalýzy byl použit čerstvý alikvot. Čištěný standard při použití v koncentracích od 0,25 do 2,0 ng/ml vytvářel lineární odpověď (log koncentrace proti počtům). Při 2 ng/ml standardu byl pozorován počet přibližně 1050, při 1 ng/ml přibližně 2000, při 0,5 ng/ml přibližně 3200 a při 0,25 ng/ml přibližně 4250. Pak byla rutinně vypočtena specifická aktivita in vitro rEPO a pm25 ze supematantů kultur transfikovaných buněk CHO a pohybovala se od 90.000 do 130.000 jednotek/mg.

Příklad 6

Biologická aktivita exprimovaných proteinů in vivo

A. Chromatografie s pšeničným kličkovým aglutininem

Kondicionovaná produkční média z buněk, transfikovaných buď rEPO, pm25, nebo HbSAg (jako negativní kontrola), byla vnesena na sloupec pšeničný kličkový aglutinin-Sepharose za účelem částečného přečištění (asi desetkrát) a koncentrace erythropoietinové aktivity. 30 ml kondicionovaného média procházelo jednorázovou minikolonou (Spektrum Medical Industries, lne., Houston, Texas, USA), obsahující 1 ml Sepharosy s pšeničným kličkovým aglutininem (Sigma), předem ekvilibrované fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS). Průtok byl jímán a přiveden na sloupec podruhé, pak byl sloupec promyt devíti objemy sloupce PBS a erythropoietická aktivita byla eluována 1,5 objemu sloupce Ν,Ν-diacetylchitibiosy (J. L. Spivak a d.,

-14CZ 286046 B6

Blood 52:1178-1188 (1978)). Eluovaný materiál byl před použitím v biotestu in vivo uchováván při -80 °C. Aktivita rEPO nebo pm25 z chromatografie s pšeničným kličkovým aglutininem in vitro byla nerozlišitelná od hodnot získaných z kondicionovaného produkčního média.

B. Biotest rEPO a pm25 in vivo na vyhladovělých krysách

Aktivita rEPO a pm25 in vivo byla zjišťována v modifikovaném biotestu na vyhladovělých krysách (W. Fried a d., Proč. Soc. Exp. Med. 94:237-241 (1957)). V tomto testu byly místo zabudování radioaktivního železa sledovány počty retikulocytů. Skupiny po čtyřech nebo pěti zvířatech byly ošetřeny rEPO nebo pm25, částečně čištěným výše popsanou chromatografií s pšeničným kličkovým aglutininem. Negativní kontrolní zvířata byla ošetřena eluátem pšeničných klíčků, připraveným z kondiciovaného produkčního média z buněk transfikovaných HbSAg. V typickém provedení krysy od pondělí do pátku hladověly a v úterý, ve středu a ve čtvrtek jim byl intravenózně injekčně vpraven rEPO nebo pm25. V pondělí a v úterý byly zjištěny počty retikulocytů (viz níže) a průměr zobou hodnot byl vzat jako výchozí počet retikulocytů. Z počtů retikulocytů, zjištěných v pátek, bylo vypočteno procento zbývajících retikulocytů pro každé zvíře a průměr pro každou skupinu. Negativní kontrolní krysy si rutinně uchovaly přibližně 50 % svých výchozích retikulocytů. Výsledky pro krysy, ošetřené buď rEPO, nebo pm25, jsou vyjádřeny jako poměr průměru pro ošetřenou skupinu k negativní kontrole; krysy ošetřené 60 nebo 100 ng rEPO nebo pm25 vykázaly vzrůst počtu retikulocytů, závislý na dávce (viz tabulka 1).

Tabulka 1. Výsledky biotestu in vivo

vzorek	ošetření	% retikulocytů	ošetř./kontrola
kontrola	út, st, čt	53	_
EPO 60 ng,	út, st, čt	81	1,54
EPO lOOng,	út, st, čt	102	1,94
pm25 60 ng,	út, st, čt	108	2,05
pm25 100 ng,	út, st, čt	132	2,50

Krysy, ošetřené ekvivalentními dávkami (stanoveno radioimunoanalýzou), vykazují u pm25 odpověď v závislosti na dávce významně vyšší než v případě rEPO. Krysy byly rovněž ošetřeny pm25 nebo rEPO v ekvivalentních dávkách, stanovených jednotkami in vitro. Zvířata ošetřená pm25 vykázala zlepšenou odpověď v porovnání se zvířaty ošetřenými ekvivalentními dávkami rEPO (viz tabulka 2).

Tabulka 2. Výsledky biotestu in vivo

vzorek	ošetření	% retikulocytů	ošetř./kontrola
kontrola	út, st, čt	36	_
EPO 1,75 u,	út, st, čt	75	2,08
EPO 5,25 u,	út, st, čt	89	2,45
EPO 8,75 u,	út, st, čt	116	3,20
pm25 1,25 u,	út, st, čt	85	2,35
pm25 5,25 u,	út, st, čt	119	3,29
pm25 8,75 u,	út, st, čt	133	3,66

-15CZ 286046 B6

Zvýšená účinnost pm25 byla patrná rovněž u zvířat, ošetřených jedinou dávkou pm25. Krysy, ošetřené jednou dávkou pm25, podanou v úterý, vykázaly v podstatě ekvivalentní odpověď jako krysy ošetřené třemi dávkami rEPO (viz tabulka 3).

Tabulka 3. Výsledky biotestu in vivo

vzorek	ošetření	% retikulocytů	ošetř./kontrola
kontrola	út, st, čt	54	_
EPO 20 ng,	út, st, čt	78	1,45
EPO 60 ng,	út, st, čt	80	1,48
EPO 100 ng,	út, st, čt	106	1,97
pm25 100 ng,	pouze út	92	1,71

Krysy, ošetřené jednou dávkou rEPO v úterý, ve středu nebo ve čtvrtek, v porovnání se zvířaty, ošetřenými třemi dávkami rEPO (každý den jednou), takovouto ekvivalenci nevykazovaly (viz tabulka 4).

Tabulka 4. Výsledky biotestu in vivo

vzorek	ošetření	% retikulocytů	ošetř./kontrola
kontrola	út, st, čt	38	_
EPO 20 ng,	út, st, čt	69	1,83
EPO 60 ng,	út, st, čt	80	2,11
EPO 100 ng,	út, st, čt	106	2,78
EPO 100 ng,	pouze út	59	1,55
EPO 100 ng,	pouze st	62	1,64
EPO 100 ng,	pouze čt	56	1,46

Získané údaje ukazují, že pm25 zvyšuje účinnost in vivo a současně je účinným erythropoietickým prostředkem při podávání v jedné dávce (tj. je účinný bez opakovaného podávání).

C. Stanovení retikulocytů průtokovou cytometrií

Počty retikulocytů byly stanoveny průtokovou cytometrickou analýzou retikulocytů v periferní krvi s barvením thiazolovou oranží (L. G. Lee a d., Cytometry 7:508-517 (1986)). Heparinizovaná celá krysí krev byla pro průtokovou cytometrii připravena barvením thiazolovou oranží 25 Retic-COUNT® (Becton Dickinson, San Jose, Califomia, USA) podle doporučení výrobce.

Každý 5 μΐ vzorek krve byl smísen s 1 ml thiazolové oranže a inkubován 45 min v temnu při teplotě místnosti. Nebarvené kontroly byly připraveny podobným způsobem, avšak bez thiazolové oranže, a obsahovaly PBS. Analýza byla dokončena do 90 min po inkubaci barveného vzorku, protože prodloužené barvení poskytuje abnormálně vysoké hodnoty.

Vzorky byly analyzovány průtokovým cytometrem EPICS ELITE (Coulter Electronics, Hialeah, Florida, USA), vybaveným argonovým iontovým laserem s vlnovou délkou 488 nm a výkonem 15 MW. Byly shromažďovány parametry log dopředného úhlu rozptylu světla, log bočního rozptylu (90 °) a log zelené fluorescence. Byly používány standardní filtry ELITE; neutrální 35 hustoty 1 pro rozptyl vpřed, dichroická propust 488 pro boční rozptyl a pásmová propust 525 pro zelenou fluorescenci.

-16CZ 286046 B6

Průtokový cytometr byl denně seřizován s použitím fluorosfér Immuno-Check (Coulter Electronics) a standardizován pomocí fluorosfét Immuno-Brite Level II (Coulter Electronics). Standardizací se kompenzovaly změny v nastavení zařízení den ode dne. Byl vytvořen počítačový protokol k sestavení tří histogramů; dvouparametrových log bočního rozptylu vs. log dopředného rozptylu, log fluorescence vs. log dopředného rozptylu a jednoparametrového log zelené fluorescence.

K vytvoření hradla pro zahrnutí pouze erythroidových buněk byl analyzován barvený vzorek. Na grafu log dopředného rozptylu vs. log bočního rozptylu bylo nakresleno amorfní hradlo kolem populace, obsahující lymfoidové a erythroidové buňky, čímž se vyloučily destičky a zlomky z pozadí. Tato hradlovaná populace pak byla znázorněna na histogramu log fluorescence vs. log dopředného rozptylu. Bylo nakresleno pravoúhlé hradlo kolem negativní erythroidové populace a pozitivně barvící rertikulocytové populace, ale vylučující silně barvící lymfoidovou populaci. Hradlovaná erythroidová populace byla znázorněna na jednoparametrovém histogramu log zelené fluorescence. Na zařízení byl analyzován nebarvený kontrolní vzorek a bylo zaznamenáno 25.000 jevů. Kurzor byl umístěn tak, aby zahrnoval 0,1 % autofluoreskujících buněk, a barvené vzorky byly analyzovány. Retikulocyty byly vyjádřeny jako procentický podíl erythroidových buněk.

Příklad 7

Čištění exprimovaných proteinů

A. Čištění rEPO

Protein rEPO byl čištěn z kondiciovaného produkčního média kombinací iontovýměnné chromatografie, chromatografie s lektinem pšeničného klíčku a chromatografie s reverzními fázemi. V typickém provedení bylo 10 1 kondicionovaného média vyčiřeno odstředěním a pak desetinásobně zkoncentrováno v rotačním koncentrátoru Benchmark (Membrex, Garfield, New Jersey, USA) s membránou dělící při molekulové hmotnosti 10.000 dalton při 4 °C. Koncentrovaná sklizeň byla 30 min centrifugována při 15.000 g, pak zředěna stejným objemem studené destilované vody, obsahujícím 25 klU (tisíc mezinárodních jednotek) aprotininu na ml, načež bylo v případě potřeby pH upraveno na 7,3 až 7,4. Zředěný koncentrát byl podroben průchodu dvěma iontovýměnnými sloupci spojenými v sérii. Jednalo se jednak o sloupec pryskyřice SSepharose Fast Flow (Pharmacia-LKB, Inc., Piscattaway, New Jersey, USA) a jednak o sloupec pryskyřice DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia-LKB). Oba sloupce měly rozměr 1,6 x 33 cm a byly ekvilibrovány 20 mM NaH₂PO₄, pH 7,4, 20 mM NaCl. Za těchto podmínek se rEPO nevázal ani na jeden sloupec; bylo však dosaženo podstatného přečištění, protože se navázalo mnoho jiných proteinů. Proteklé množství a 200 ml z promytí bylo vneseno na sloupec 20 ml Sepharosy s pšeničným kličkovým aglutininem (Sigma), předem ekvilibrovaný 20 mM NaH₂PO₄, pH 7,4, 20 mM NaCl a důkladně promytý pufrem s obsahem 10 mM N,Ndiacetylchitibiosy (J. L. Spivac a d., viz výše). Byly jímány frakce (3,5 ml), každá byla upravena na obsah 25 klU aprotininu na ml a v každé byl pomocí SDS-PAGE (alektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným, U. K. Laemmli, Nátuře 227:680-685 (1970), H. Schagger a G. von Jagow, Anal. Biochem. 166:368-379 (1987)) zjišťován rEPO.

Frakce, které po barvení Coomasie Blue³ obsahovaly nejvyšší hladiny rEPO, byly spojeny, okyseleny 5% TFA (trifluoroctová kyselina, 30 pg/ml) a chromatografovány na sloupci POROS R2/H (2,1 x 100 mm, reverzní fáze, PerSeptive Biosystems, Cambridge, Massachusetts, USA). Ekvilibračním pufrem byla 0,1% TFA v 5% CHjCN a elučním pufrem 0,08% TFA v 80% CH₃CN. 6 min po vnesení byla provedena gradientová eluce (0 až 100 % pufru) po dobu 15 min.

-17CZ 286046 B6

Frakce byly jímány manuálně a čistota byla zjišťována pomocí SDS-PAGE. rEPO byl skladován při -80 °C.

Na SDS-PAGE rEPO migroval mezi markéry 31.000 a 43.000 dalton a měl zdánlivou 5 molekulovou hmotnost 36.000 dalton. Následující digescí s proteasou Lys-C a analýzou sekvence aminokyselin (viz dále) byla potvrzena přítomnost rEPO a nebyl zjištěn žádný další protein.

B. Čištění pm25

Protein pm25, získaný z kondiciovaného produkčního média, byl čištěn stejným postupem, jaký je popsán pro rEPO. Na rozdíl od rEPO však byla elektroforézou SDS-PAGE zjištěna přítomnost vysokomolekulámího proteinu nebo proteinů s elektroforetickou mobilitou přibližně 60.000 dalton, který se čistil souběžně s pm25. Aby bylo možno tuto vysokomolekulámí příměs 15 oddělit od pm25, byl aplikován pozměněný postup čištění. Po výše popsaném stupni chromatografie na Sepharose s pšeničným kličkovým aglutininem byl eluovaný materiál okyselen 10% TFA v 5% CH₃CN (100 μΐ/ml). Vzorek byl podroben vysokoúčinné kapalinové chromatografií v systému SMART³ (Pharmacia) s automatizovaným jímáním frakcí obsahujících produkt na základě absorbance s použitím kolony. Pharmacia URPC C2/C18 (2,1x100 mm) a průtoku 20 2 00 μΐ/min. Počáteční pufr byl 0,1% TFA v 5% CH₃CN a eluční pufr byl 0,08% TFA v 80%

CH₃CN. Po 5 min po vnesení byla koncentrace elučního pufru během 1 min zvýšena z 0 % na 40 %. Eluce pm25 byla prováděna po dobu 30 min s gradientem elučního pufru od 40 do 70 %. Frakce byly jímány s použitím funkce „peak detection“ systému SMART a k identifikaci pm25 byla použita SDS-PAGE. Částečně přečištěný pm25 byl vysušen k suchu a znovu rozpuštěn ve 25 1 00 mM CH₃CO₂NH₄, pH 4,1, 6 M močoviny. Vzorek byl vnesen na sloupec měniče kationtů

Mono-S (Pharmacia, 1,6 x 50 mm), ekvilibrovaný ve stejném pufru, a chromatografován při teplotě místnosti s použitím systému SMART. Průtok vnášeného vzorku byl ΙΟΟμΙ/min a chromatografie probíhala se 150 μΐ/min. Po 5 min po vnesení byla provedena eluce s 20 min gradientem od 0 do 50% pufru (100 mM CH₃CO₂NH4, pH4,l, 1 M NaCl, 6M močoviny). 30 Frakce byly jímány s použitím funkce „peak detection“ systému SMART a k identifikaci pm25 byla použita SDS-PAGE. Eluovaný pm25 pak byl rechromatografován na výše uvedené koloně URPC C2/C18 (2,1 x 100 mm). Vzorek byl okyselen 5% TFA a vnesen na sloupec v množství 200 μΐ/min. Počáteční pufr byl 0,1% TFA v 5% CH₃CN a eluční pufr byl 0,08% TFA v 80% CH₃CN. Po 5 min po vnesení byla po dobu 25 min provedena gradientová eluce (od 0 do 100 % 35 pufru). Funkce „peak detection“ systému SMART byla použita kjímání frakcí a k lokalizaci a stanovení čistoty byla provedena SDS-PAGE. Elektroforetickou analýzou byl zjištěn jediný pás, migrující mezi markéry 29.000 a 43.000 dalton, s molekulovou hmotností přibližně 36.000 dalton. Následující proteasovou digescí s Lys-C a sekvenční analýzou byla zjištěna přítomnost pm25 a žádných jiných proteinů.

Příklad 8

Biologická aktivita čištěných proteinů

A. Aktivita rEPO a pm25 in vivo v modelovém pokusu s neanemickými krysami

Biologická aktivita čištěného rEPO a pm25 byla porovnávána v dlouhodobém modelovém pokusu s neanemickými krysami měřením hematokritu ošetřených a kontrolních krys. Skupiny 50 po pěti krysách byly ošetřovány třikrát týdně rEPO nebo pm25 nebo v případě kontrolních krys pouze vehikulem (PBS s obsahem 0,2 % BSA) celkem po dobu čtyř týdnů. Čtyřem skupinám zvířat byly podávány intravenózní injekce 150, 300, 450 nebo 600 ng rEPO ve vehikulu a dvěma skupinám bylo stejným způsobem podáváno 150 nebo 300 ng pm25 ve vehikulu. Jedna skupina

-18CZ 286046 B6 zvířat sloužila jako kontrolní a bylo jí podáváno třikrát týdně po dobu čtyř týdnů intravenózně vehikulum. Na konci čtyřtýdenního období byl u každého zvířete stanoven hematokrit a pro každou skupinu byla vypočtena průměrná hodnota hematokritu. Zvířata ošetřená 150 ng pm25 vykázala v podstatě ekvivalentní odpověď jako zvířata ošetřená 300 ng rEPO. Podobně zvířata ošetřená 300 ng pm25 vykázala v podstatě ekvivalentní odpověď jako zvířata ošetřená 600 ng rEPO. V tomto dlouhodobém modelovém pokusu byl tedy pm25 přibližně dvakrát účinnější při zvyšování hematokritu ošetřovaných zvířat než nativní rekombinovaný erythropoietin (viz tabulka 5).

Tabulka 5. Výsledky dlouhodobého biotestu in vivo

vzorek	ošetření	hematokrit (konečný)
kontrola	po, st, pá	52,3
EPO 150 ng,	po, st, pá	53,3
EPO 300 ng,	po, st, pá	58,0
EPO 450 ng,	po, st, pá	60,2
EPO 600 ng,	po, st, pá	62,6
pm25 150 ng,	po, st, pá	58,3
pm25 300 ng,	po, st, pá	65,8

V podobném experimentu byla jediná týdenní dávka pm25 porovnávána se třemi dávkami rEPO týdně. Jedna skupina zvířat byla ošetřována čtyři týdny třikrát týdně 300 ng rEPO. Dvě skupiny zvířat byly ošetřovány jednou týdně buď 450 nebo 600 ng pm25. Jedna skupina zvířat byla ošetřována třikrát týdně vehikulem a sloužila jako kontrola. Na konci čtyřtýdenního rozvrhu byl u každého zvířete stanoven hematokrit a pro každou skupinu byla vypočtena průměrná hodnota hematokritu. Zvířata, ošetřovaná jednou týdně pm25, vykazovala odpověď v podstatě ekvivalentní jako zvířata ošetřovaná 300 ng rEPO třikrát týdně. Z výsledků vyplývá, že pm25 nabízí výhodu snížené frekvence dávkování v porovnání s erythropoietinem (viz tabulka 6).

Tabulka 6. Výsledky dlouhodobého biotestu in vivo

vzorek	ošetření	hematokrit (konečný)
kontrola	po, st, pá	52,8
EPO 300 ng,	po, st, pá	58,4
pm25 450 ng,	pouze st	56,2
pm25 600 ng,	pouze st	58,8

V dalším příbuzném experimentu bylo testováno podávání rEPO v jediné dávce týdně v dlouhodobém modelovém pokusu na neanemických krysách porovnáváním hematokritu kontrolních a ošetřovaných zvířat. Skupiny po pěti zvířatech byly po celkovou dobu čtyř týdnů ošetřovány buď vehikulem (PBS s obsahem 0,2 % BSA), nebo třikrát týdně rEPO nebo jednou týdně rEPO.

Jedna skupina zvířat byla ošetřována po dobu čtyř týdnů třikrát týdně samotným vehikulem a sloužila jako kontrolní. Tři skupiny zvířat byly ošetřovány po dobu čtyř týdnů třikrát týdně 150, 300 nebo 450 ng rEPO ve vehikulu. Další tři skupiny zvířat byly ošetřovány po dobu čtyř týdnů jednou týdně 300, 600 nebo 900 ng rEPO ve vehikulu.

Zvířata ošetřovaná třikrát týdně vykazovala v závislosti na dávce vzrůst hematokritu v rozmezí

55,3 až 60,8 % (viz tabulka 7). Zvířata ošetřovaná rEPO v dávce 300 nebo 600 ng jednou týdně nevykazovala pozorovatelný vzrůst hematokritu oproti kontrolním zvířatům ošetřovaným

-19CZ 286046 B6 vehikulem, avšak zvířata ošetřovaná 900 ng jednou týdně vykazovala pouze mírný vzrůst hematokritu v porovnání se zvířaty ošetřovanými vehikulem a významně nižší vzrůst hematokritu, než k jakému dochází u zvířat ošetřovaných nejnižší dávkou rEPO, podávanou třikrát týdně. Z těchto údajů v porovnání s údaji o podávání pm25 jednou týdně, uvedenými v tabulce 6, vyplývá, že analogy podle vynálezu mají při podávání jednou týdně vyšší erythropoietický účinek in vivo než nativní erythropoietin.

Tabulka 7. Výsledky dlouhodobého biotestu in vivo

vzorek	ošetření	hematokrit (konečný)
kontrola	3x týdně	51,0
EPO 150 ng,	3xt.	55,3
EPO 300 ng,	3xt.	57,0
EPO 450 ng,	3xt.	60,8
EPO 300 ng,	lxt.	51,3
EPO 600 ng,	lxt.	50,5
EPO 900 ng,	lxt.	53,0

B. Aktivita rEPO a pm25 in vivo v modelovém pokusu s neanemickými opicemi Cynomolgus

Biologická aktivita čištěného rEPO a pm25 byla porovnávána v dlouhodobém modelovém pokusu s neanemickými opicemi Cynomolgus měřením hematokritu a koncentrace hemoglobinu u opic Cynomolgus, ošetřovaných třikrát týdně rEPO nebo jednou týdně pm25. Samci byli rozděleni do dvou skupin po pěti. Hematokrit a koncentrace hemoglobinu byly stanoveny třikrát během týdně, předcházejícího ošetření, odebráním 0,5 ml krve pro každé ze stanovení v intervalech 48 g. Průměr z těchto tří hodnot byl vzat jako předběžná hodnota pro každou skupinu zvířat.

Jedna skupina zvířat byla ošetřována po celkovou dobu čtyř týdnů třikrát týdně 2 pg/kg rEPO. Druhá skupina zvířat byla ošetřována po celkovou dobu čtyř týdnů třikrát týdně 4 pg/kg pm25. Je známo, že ošetřování erythropoietinem snižuje železo v oběhu a účinnost drogy může být limitována dostupným železem (J. Eschbach a d., New Eng. J. ofMed. 316:73-78 (1987)); proto bylo oběma skupinám opic Cynomolgus podáváno dvakrát týdně 10 mg peptonizovaného železa (Rogenic, Forest Pharmaceuticals, St. Louis, Missouri, USA) k eliminaci případného nedostatku železa, který by mohl nastat v důsledku působení rEPO nebo pm25 nebo toto působení limitovat.

Po skončení ošetřování byl dvakrát v intervalu 72 h změřen hematokrit a koncentrace hemoglobinu. Konečné hodnoty hematokritu a koncentrace hemoglobinu byly vypočteny jako průměr z těchto hodnot; bylo zjištěno, že hodnoty hematokritu a hemoglobinu u zvířat, ošetřovaných třikrát týdně rEPO, a u zvířat, ošetřovaných jednou týdně pm25, byly v podstatě shodné (viz tabulka 8).

Tabulka 8. Výsledky dlouhodobého biotestu in vivo

vzorek	ošetření	hematokrit	hemoglobin (g/dl)
předběžný	konečný	předběžný	konečný
EPO 200j/kg,	3xt.	37,8	41,5	10,3	11,5
pm25 240j/kg,	lxt.	37,7	40,8	10,2	11,2

-20CZ 286046 B6

Příklad 9

Strukturní charakterizace exprimovaných proteinů

A. Digesce čištěného rEPO a pm25 s proteasou Lys-C rEPO a pm25 byly digerovány s Lys-C (K. L. Stone a d., A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencin, str. 31-471, ed. P. L. Maztsudaira, Academie Press (1989)) a vzniklé peptidy byly analyzovány za účelem zmapování lokalizace disulfídických vazeb. Podle typického postupu bylo 100 pg čištěného proteinu vysušeno v nádobce mikrocentrifugy a protein byl rozpuštěn s 50 μΐ 400 mM NH4HCO3, pH 8,2, 2 mM EDTA, 8 M močoviny (deionizováno). Druhý vzorek byl vždy před digescí Lys-C redukován. Redukce byla prováděna 4,5 mM dithiothreitolem (DTT) při 37 °C po dobu 30 min pod dusíkem; po redukci byl vzorek ekvilibrován na teplotu místnosti a alkylován 1 h pod dusíkem v temnu při teplotě místnosti 10 mM jodoctovou kyselinou. Redukované i neredukované vzorky byly zředěny destilovanou vodou k úpravě koncentrace močoviny na 2 M. Proteiny byly digerovány 1,5 pg Lys-C pod dusíkem při 37 °C po dobu 2 až 3 h, pak bylo přidáno dalších 1,5 pg enzymu a digesce pokračovala 15 h. Digesce byla ukončena přídavkem TFA do 0,5%. Peptidy byly izolovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzními fázemi (HPLC) s použitím kolony uRPC C2/C18 (2,1 x 100 mm) a systému SMART (Pharmacia). Ekvilibrační pufr byl 0,1% TFA v 5% CH₃CN a eluční pufr byl 0,08% TFA v 80% CH₃CN. Průtok byl 200 pl/min. Po 5 min po vnesení byla provedena gradientová eluce (od 0 do 100% pufru) po dobu 55 min. Eluované píky byly jímány pomocí funkce „peak detection“ systému SMART. Frakce byly před sekvenováním aminokyselin uchovávány při -20 °C. Identita Lys-C peptidů byla stanovena sekvenováním aminokyselin (R. M. Hewick a d., J. Biol. Chem. 256:7990-7997 (1981)) s použitím sekvenátoru ABI model 470A nebo 477A, vybaveného analyzátorem ABI model 120A PTH (Applied Biosystems, lne., Poster City, Califomia, USA). Data byla shromažďována a analyzována pomocí softwarového systému PE Nelson pro analýzu sekvence aminokyselin (Access*Chrom, Micro Vax 2000, Cupertino, Califomia, USA) se softwarovým vybavením pro zpracování chromatografických dat.

B. Identifikace polohy disulfidické vazby v rEPO a pm25

Dedukovaná aminokyselinová sekvence erythropoietinu předpokládá osm lysinových zbytků v molekule. Konstrukcí pm25, popsanou v příkladu 1, se počet ani umístění lysinových zbytků nemění. Proto by obě tyto molekuly měly mít velmi podobné Lys-C peptidy s rozdíly vyplývajícími pouze ze změn aminokyselin ve zbytcích 33 a 139 vpm25. Z aminokyselinové sekvence vyplývá, že při digesci Lys-C proteasou by jak z rEPO, tak z pm25 mělo vzniknout devět Lys-C peptidů. Poloha Lys-C fragmentů obou molekul je znázorněna na obr. 4. Fragmenty jsou označeny K1 až K9 s uvedením zbytků erythropoietinu, obsažených v každém fragmentu, v závorce. Jsou znázorněny i polohy disulfídických vazeb, o nichž je známo, že existují v erythropoietinu (P. H. Lai a d., J. Biol. Chem. 261:3116-3121 (1986)), i pravděpodobný nový disulfidický můstek spojující v pm25 cysteiny v polohách 29 a 139.

Chromatografíe Lys-C digestů rEPO s reverzními fázemi odhalila schéma velmi podobné již dříve publikovaným údajům pro nerekombinovaný erythropoietin (hEPO) (M. A. Recny a d., J. Biol. Chem. 262:17156-17163 (1967)) a konzistentní se schematickým znázorněním podle obr. 4. Přiřazení peptidů z chromatografíe bylo založeno na sekvenování aminokyselin peptidických fragmentů. Porovnání peptidických map redukovaného a neredukovaného rEPO ukázalo, že peptidy K1 a K9 jsou v neredukovaném vzorku chromatografovány společně a v redukovaných vzorcích se vymývají s rozdílnými retenčními časy. To je považováno za jasný důkaz disulfídické vazby mezi peptidy K1 a K9 v rEPO (a hEPO). Studiem peptidických profilů redukovaného a neredukovaného pm25 bylo nalezeno shodné schéma pro peptidy K1 a K9. Odlišné retenční

-21CZ 286046 B6 časy v redukovaných a neredukovaných vzorcích však vykazovaly i peptidy K2 a K.6. Peptid K2 byl v neredukovaném pm25 chromatografován společně s K6 a měl zřetelně odlišný retenční čas v redukovaném vzorku pm25. To je považováno za jasný důkaz toho, že peptidy K2 a K6 jsou spojeny disulfidickou vazbou, jak je znázorněno na obr. 4.

Příklad 10

Příprava dvojitých mutantů erythropoietinu

Dvojití mutanti savčího erythropoietinu, v nichž je mutace (změna aminokyseliny) v první poloze, která způsobuje významný úbytek aktivity, kompenzována mutací v druhé poloze, která je v primární struktuře proteinu vzdálena od první polohy, tak, že aktivita dvojitého mutanta je významně vyšší než u mutanta s mutací snižující aktivitu v první poloze, se připravují dále popsaným způsobem. V kontextu tohoto příkladu se, jak odborník pochopí, není-li uvedeno jinak, „aktivita“ vztahuje na specifickou aktivitu při erythropoiese in vivo.

Prvním takovým dvojitým mutantem lidského erythropoietinu je pm25, v němž první mutace v poloze 33 v podstatě odstraňuje erythropoietickou aktivitu a druhá mutace, záměna Arg v poloze 139 za Cys, úplně obnovuje a pravděpodobně dokonce zlepšuje erythropoietickou aktivitu oproti glykohormonu divokého typu. Tato demonstrace skutečnosti, že v savčích erythropoietinech jsou možné intramolekulámí kompenzační mutace, zpřístupňuje velké množství dvojitých mutantů tohoto glykohormonu včetně takových, kteří mají podstatně zlepšenou eiythropoietickou aktivitu oproti odpovídajícímu glykohormonu divokého typu.

Vycházeje z první cDNA, kódující prvního mutanta, který má sníženou (a v typickém případě v podstatě žádnou) aktivitu v důsledku změny aminokyseliny v jedné poloze, může zkušený praktik snadno vytvořit velký počet druhých mutantů, které se od prvního liší jednou nebo více změnami aminokyselin v druhé nebo následujících polohách, a může pak provádět expresní screening cDNA kódujících tyto druhé mutanty na mutanty, kteří mají požadovanou úroveň erythrotropní aktivity.

Postup bude objasněn na lidském erythropoietinu a pro typický případ, kdy první mutant nemá žádnou erythropoietickou aktivitu in vitro. Je však zřejmé, že tento postup je možno aplikovat na kterýkoli savčí erythropoietin a na případy, kdy první mutant má aktivitu, který je oproti divokému typu snížena, avšak ne eliminována.

Postup má čtyři stupně a vychází z první cDNA, která kóduje pre-pro-formu prvního mutanta lidského erythropoietinu. V typickém případě bude segment cDNA, kódující vedoucí peptid, kódovat vedoucí peptid pre-pro-formy lidského erythropoietinu. V prvním stupni se v první cDNA vytvoří velké množství náhodných mutací v takových místech, aby každá z toho vyplývající změna aminokyseliny byla v primární sekvenci zralého glykoproteinu v místě, které je vzdáleno od polohy změny aminokyseliny v prvním mutantovi. Dokonce i když jsou mutace v podstatě náhodně rozmístěny po celé cDNA kódující pre-pro-formu prvního mutanta, bude jich většina v nukleotidových tripletech (kodonech), které jsou vně segmentu první cDNA kódujícího vedoucí peptid a které odpovídají aminokyselinám v polohách, které jsou v primární sekvenci zralého proteinu vzdáleny od polohy změny aminokyseliny v prvním neaktivním mutovaném glykohormonu. Výrazem „vzdálený“ se rozumí odstup o alespoň 1 a nejčastěji o alespoň 10 poloh aminokyselin.

Ve druhém stupni se repertoár náhodně mutovaných druhých cDNA z prvního stupně liguje pro klonování do eukaryotního expresního vektoru a vzniklá knihovna („náhodná knihovna“) vektorů, uchovávajících náhodně mutované druhé cDNA, se klonuje do vhodného hostitele za účelem přípravy vyhovujícího množství vektorů z knihovny.

-22CZ 286046 B6

Ve třetím stupni se náhodná knihovna transfikuje do eukaryotních buněk (například buněk CHO nebo jiných vhodných savčích buněk), v nichž jsou náhodně mutované druhé cDNA v expresních vektorech knihovny schopny být exprimovány a vylučovat maturované druhé mutanty. Buňky se pak kultivují a vzniklá populace buněk se podrobí screeningu za účelem izolace jednobuňkových klonů, které v testu aktivity in vitro produkují erythropoietinovou aktivitu. Klony s touto aktivitou jsou ty, které produkují analog erythropoietinu, který je druhým mutantem, kde druhá mutace kompenzuje úbytek aktivity v prvním mutantovi.

Ve čtvrtém stupni se druhá cDNA, kódující erythropoietinového druhého mutanta z klonu, který ho produkuje, amplifikuje například polymerasovou reakcí („PCR“) nebo jinou metodou amplifikace nukleových kyselin a amplifikovaná nukleová kyselina se sekvenuje za účelem zjištění polohy a změny aminokyseliny v druhé kompenzující mutaci. Je sice možné, že „kompenzující mutace“, provedená právě popsaným postupem náhodné mutace cDNA kódující pre-pro-formu prvního mutanta, může vyvolat změny aminokyselin ve více než jedné poloze nebo přídavek nebo vynechání aminokyseliny, avšak je pravděpodobné, že taková mutace vyvolává změnu aminokyseliny pouze v jedné poloze.

Vzniklá nově identifikovaná cDNA, kódující dvojitě mutovaný erythropoietin, se pak ve vhodném eukaryotním expresním vektoru použije k produkci dvojitě mutovaného glykohormonu kultivací savčích buněk transformovaných tímto vektorem a takto produkovaný dvojitý mutant se testuje na specifickou aktivitu in vivo na vhodném zvířecím modelu, jak například pro pm25 popsáno výše.

Proces mutagenese PCR je jedním z postupů, jimiž je možno zavést druhou mutaci, která vede ke kompenzující změně aminokyseliny, do místa vzdáleného od místa první mutace v nativním proteinu. Při tomto postupu 3'-konce dvou PCR primerů vymezují segment cDNA, v němž má být zavedena druhá mutace, a jeden z PCR primerů se napojuje na segment, který zahrnuje první mutaci, a v důsledku toho chrání první mutaci před další mutací během PCR procesu. První segmenty cDNA, kjejímuž jednomu vláknu se při nastavování primerů primery napojují, jsou chráněny před mutací. Mutace jsou zavedeny náhodně do toho segmentu první cDNA, který je vymezen 3'-konci primerů. Čím větší je vzdálenost mezi primery, tím větší je oblast první cDNA (kódující první mutant, který je inaktivní nebo má sníženou aktivitu), která je vystavena mutaci, kterou bude zavedena kompenzující intramolekulámí mutace aminokyseliny v glykohormonu. Každý z primerů buď zahrnuje jedno vlákno restrikčního místa, nebo se napojuje na segment první cDNA, která zahrnuje jedno vlákno restrikčního místa, což usnadňuje zavedení PCRamplifikováných fragmentů do expresních vektorů pro expresi veškerých pre-pro-dvojitých mutantů erythropoietinu. Proces PCR se provádí za podmínek, které favorizují chyby při zabudovávání nukleotidů. Tyto podmínky zahrnují použití tří 2'-deoxyribonukleosid-5'trifosfátů v koncentraci 1 mM a čtvrtého z nich v koncentraci 200 μΜ spolu s 0,5 mM Mn²⁺, 6 mM Mg²⁺ a Taq polymerasou v reakční směsi pro PCR amplifikaci.

Konkrétně se postup s ohledem na dvojitého mutanta pm25 provádí takto: První cDNA, kódující inaktivní nebo snížené aktivní analog erythropoietinu, například s mutací Cys na Pro v poloze 33, se použije jako templát pro zahájení mutagenese pomocí PCR. Jedna taková cDNA má sekvenci, která se liší od sekvence č. 1 pouze přítomností CC v polohách 199 a 200. Použije-li se tato cDNA pro ilustraci, používá se první primer PCR, který hybridizuje k segmentu vlákna cDNA, obsahující CC v polohách 199 a 200 a jinak mající sekvenci znázorněnou jako sekvence č. 1. Dále se používá druhý primer, který hybridizuje ktomu vláknu cDNA, k němuž se nenapojuje první primer. Druhý primer se napojuje k segmentu tohoto vlákna, který má 3'-konec spárován se 3'-koncem báze 517 v sekvenci č. 1. V procesu PCR mutagenese je pak možné, aby pár bází první cDNA, odpovídající bázi 517 v sekvenci č. 1, byl mutagenován na T, čímž se triplet 57-519 změní na triplet kódující Cys.

-23CZ 286046 B6

PCR-mutagenovaný produkty, které zahrnují některé sekvence s náhodnými mutacemi mezi primery definujícími konce amplifikovaného produktu, se pak digerují s restrikčními enzymy s použitím míst, zavedených do PCR produktu výše popsaným způsobem. Fragmenty z digesce, mající takovou velikost, že zahrnují náhodné mutace, se pak ligují do vhodného eukaryotního expresního vektoru operativně pro expresi a sekreci dvojitě mutovaných analogů erythropoietinu ze savčí buňky v kultuře. Tento expresní vektor vytvoří na aminoterminálním konci zralých dvojitých mutantů vedoucí peptid savčího (v tomto případě přednostně lidského) erythropoietinu, který umožňuje jejich glykosylaci a sekreci, a samozřejmě vytvoří příslušné signály pro transkripci a další kroky nezbytné pro expresi dvojitých mutantů pre-pro-erythropoietinu v savčí buňce. Vektor bude rovněž vhodný pro klonování k získání dostatečných kvalit vektoru pro transfekci savčích buněk a jiná použití. Například PCR-amplifikované fragmenty mohou být nejprve ligovány k fragmentům, které kódují části pre-pro-erythropoietinu, a tak se získají fragmenty s cDNA, kódující dvojité mutanty pre-pro-erythropoietinu plné délky. Tyto fragmenty, kódující protein plné délky, mohou pak být ligovány do vektoru, jako je SV2dhfrSVdeltaSJneo, k získání vhodných expresních vektorů pro dvojité mutanty.

Vzniklá knihovna expresních vektorů se zabudovanými dvojitě mutovanými cDNA se pak klonuje ve vhodném hostiteli, jako je E. coli, k získání dostatečné velikosti knihovny pro další práci.

Knihovna expresních vektorů s dvojitě mutovanými cDNA se postupem podle příkladu 2 transfikuje do savčích buněk (například buněk CHO). Buňky se kultivují jako jednobuněčné klony nebo kolonie o malém počtu (například asi 10) buněk. Každá kultura se pak podrobí screeningu na erythropoietickou aktivitu in vitro. Pouze v kulturách s pozitivním výsledkem screeningu (na takovouto aktivitu in vitro) je exprimován analog erythropoietinu, který má druhou, náhodnou mutaci kompenzující snížení aktivity, způsobené první mutací (například Cys³³ na Pro³³). Kultury, které vykazují aktivitu, ale byly pěstovány zvíce než jedné buňky, mohou být subkultivovány jako jednobuněčné klony za účelem izolace buněk, které produkují dvojitě mutované aktivní analogy.

cDNA, kódující analogy, mohou být izolovány z buněk produkujících biologicky aktivní glykohormon a pak standardními metodami sekvenovány k identifikaci druhých, kompenzačních mutací v erythropoietinech z těchto buněk.

Buňky produkující biologicky aktivní glykohormon mohou být kultivovány a z kultivačního média může být izolován a čištěn glykohormon, který pak může být testován na erythropoietickou aktivitu in vivo na vhodném zvířecím modelu, jak uveden výše. Je tedy možno nalézt dvojitě mutované analogy, které mají rozšířené farmaceutické použití díky zvýšené účinnosti, prodloužené životnosti apod.

Je samozřejmé, že dvojitý mutant erythropoietinu, který má kompenzační mutaci, obnovující erythropoietickou aktivitu in vivo oproti prvnímu inaktivnímu mutantovi, může být eliminací první inaktivující mutace přeměněn na ještě účinnějšího mutanta. Vynález tedy poskytuje také jednonásobně mutované analogy savčího (přednostně lidského) erythropoietinu, které mají erythropoietickou aktivitu in vivo. Tyto jednonásobně mutované analogy podle vynálezu obsahují jedinou, první změnu aminokyseliny oproti sekvenci zralého glykohormonu divokého typu, přičemž tato první změna, je-li provedena v analogu, který má jedinou, druhou změnu aminokyseliny oproti sekvenci glykohormonu divokého typu a erythropoietickou aktivitu in vivo oproti němu nižší, zvyšuje erythropoietickou aktivitu in vivo jednonásobně mutovaného analogu s jedinou, druhou změnou aminokyseliny. Příkladem takového jednonásobně mutovaného analogu podle vynálezu je anallog [Cys¹³⁹] lidského erythropoietinu.

-24CZ 286046 B6

Přestože příklady provedení vynálezu byly popsány konkrétně, je rozsah vynálezu zamýšlen tak, že modifikace a obměny toho, co bylo popsáno, snadno zřejmé odborníkům v příslušných oblastech, spadají do myšlenky vynálezu, a tudíž do jeho rozsahu, který je definován v dále uvedených patentových nárocích.

Seznam sekvencí (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: Okasinski, Gregory F.

DeVries, Peter J.

Mellovitz, Barry S.

Meuth, Joseph L. Schaefer, Verlyn G.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Přípravky a způsoby na bázi analogů erythropoietinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 15 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Abbott Laboratories (B) ULICE: Dept. 377 - AP6D One Abbott Park Road (C) MĚSTO: North Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: Spojené státy (F) POŠTOVNÍ KÓD: 60064-3500 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: MS-DOS ver. 5,0 ASCII Text Editor (vi) ÚDAJE O DANÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/055,076 (B) DATUM PODÁNÍ: 29. 04. 1993 (C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI (A) JMÉNO: Weinstock, Steven W.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 30,117 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5282.US.01 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: (708) 937-2341 (B) TELEFAX: (708) 938-2623

-25CZ 286046 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 625 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

-26CZ 286046 B6

GGATCCCCGC CAGGCGCCAC C ATG GGG GTG CAC GAA

TGT CCT GCC Cys Pro Ala -20

45

Met Gly

val -25

His Glu

TGG

CTG

TGG

CTT

CTC

CTG

TCC

CTG

CTG

TCG

CTC

CCT

CTG

GGC

87

Trp

Leu

Trp

Leu

Leu -15

Leu

ser

Leu

Leu

Ser -10

Leu

Pro

Leu

Gly

CTC

CCA

GTA

CTG

GGC

GCC

CCA

CCA

CGC

CTC

ATA

TGT

GAC

TCG

129

Leu -5

Pro

val

Leu

Gly

Ala 1

Pro

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys Asp

Ser

CGA

GTC

CTC

GAG

AGG

TAC

CTC

TTG

GAG

GCC

AAG

GAG

GCC

GAG

171

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Leu

Glu

Ala

Lys 20

Glu

Ala

Glu

AAT

ATT

ACG

ACG

GGC

TGT

GCT

GAG

CAC

TGC

AGC

TTG

AAT

GAG

213

Asn

Ile 25

Thr

Thr

Gly

Cys

Ala 30

G1U

His

Cys

ser

Leu 35

Asn

G1U

AAT

ATC

ACT

GTC

CCA

GAC

ACC

AAA

GTT

AAC

TTC

TAT

GCA

TGG

255

Asn

Ile

Thr 40

Val

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala 50

Trp

AAG

AGA

ATG

GAG

GTC

GGG

CAG

CAG

GCC

GTA

GAA

GTC

TGG

CAG

297

Lys

Arg

Met

Glu 55

Val

Gly Gin

Gin

Ala 60

Val

Glu

Val

Trp

Gin 65

GGC

CTG

GCC

CTG

CTG

TCG

GAA

GCT

GTT

CTG

CGG

GGC

CAG

GCC

339

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu 70

Ser

G1U

Ala

Val

Leu 75

Arg

Gly

Gin

Ala

CTG

TTG-GTC

AAT

TCC

TCC

CAG

CCG

TGG

GAG

CCC

CTG

CAG

CTG

381

Leu 80

Leu

Val

Asn

ser

Ser 85

Gin

Pro

Trp

Glu.

pro 90

Leu

Gin

Leu

CAT

GTG

GAT

AAA

GCC

GTC AGT

GGC

CTT

CGC

AGC

CTC

ACC

ACT

423

His

Val 95

Asp Lys

Ala

Val

Ser 100

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 105

Thr

Thr

CTG

CTT

CGA

GCT

CTG

GGG

GCC

CAG

AAG

GAA

GCC

ATC

TCC

CCT

465

Leu

Leu

Arg 110

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin 115

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser 120

Pro

CCA

GAT

GCG

GCC

TCA

-GCT

GCT CCA

CTC

CGA

ACA

ATC

ACT

GCT

507

Pro

Asp

Ala

Ala 125

Ser

Ala

Ala

Pro

Leu 130

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala 135

GAC

ACT

TTC

CGC

AAA

CTC

TTC

CGA

GTC

TAC

TCC

AAT

TTC

CTC

549

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys 140

Leu

Phe

Arg

Val

Tyr 145

Ser

Asn

Phe

Leu

CGC

GGA

AAG

CTG

AAG

CTT

TAC

ACA

GGG

GAG

GCA

. TGC

AGG ACA

591

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala Cys

Arg Thr

150 155 160

GGG GAC AGA TGATGACCAG GTGTTACCTG GATCC 625

Gly Asn Arg

165

-27CZ 286046 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

CCCTGTTGGT CAATTCCTCC CAGCCGTG 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:3:

CCTGCAGCTG CATGTGGATA AAGCCGTCAG 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:4:

GCTGTGCTGA GCACCCCAGC TTGAATGAGA AT 32 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-28CZ 286046 B6 (i i) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5

ACTGCTGACA CTTTCTGCAA ACTCTTCCGA GT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu

10

Ser Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

20 25 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu

10

Ser Leu Val Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Pro Gly

20 25 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:8:

-29CZ 286046 B6

AGCTTGTGTG GATCCCCGCC AGGCGCCACC ATGGGGGTGC ACGAATGTCC 50 TGCCTGGCTG TGGCTTCTCC TGTCCCTGCT GTCGC 85 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 82 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:9:

TCGCTCCCTC TGGGCCTCCC AGTACTGGGC GCCCCACCAC GCCTCATATG 50 TGACTCGCGA GTCCTCGAGA GGTACCTCTT GG 82 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATTACG ACGGGCTGTG CTGAGCACTG 50 CAGCTTGAAT GAGAATATCA CTGTCCCAGA CACCA 85 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 82 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

ACCAAAGTTA ACTTCTATGC ATGGAAGAGA ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC 50 CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GT 82

-30CZ 286046 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

CTGTCGGAAG CTGTTCGGCG GGGCCAGGCC CTGTTGGTCA ATCTCTCCCA 50 GCCGTGGGAG CCCCTGCAGC TGCATCTAG 79 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 88 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:13:

CTAGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC CTCACCACTC TGCTTCGAGC 50 TCTGGGGGCC CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATG 88 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 82 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:14:

GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA ATCACTGCTG ACACTTTCCG 50 CAAACTCTTC CGAGTCTACT CCAATTTCCT CC 82 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 bází (B) TYP: nukleová kyselina

-31CZ 286046 B6 (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: syntetická DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

CTCCGCGGAA AGCTGAAGCT TTACACAGGG GAGGCATGCA GGACAGGGGA 50 CAGATGATGA CCAGGTGTTA CCTGGATCCT GAATT 85

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Analog lidského erythropoietinu, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³,Cys¹³⁹]-lidského erythropoietinu a [X³³,Cys¹³⁹,des-Arg¹⁶⁶]-lidského erythropoietinu, kde X³³ je vybráno ze skupiny tvořené 20 běžně se vyskytujícími aminokyselinami a sekvence lidského erythropoietinu je znázorněna jako SEQ ID NO: 1.
2. 2. Analog podle nároku 1, který je X³³,Cys¹³⁹,des-Arg¹⁶⁶.
3. 3. Analog podle nároku 2, kde X³³ je Pro.
4. 4. Analog podle nároku 2, kde X³³ je Cys.
5. 5. Dvouvláknová DNA, která zahrnuje segment 498 nukleotidů v sekvenci, která kóduje analog lidského erythropoietinu podle nároku 1, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³,Cys¹³⁹]-lidského erythropoietinu, nebo segment 495 nukleotidů v sekvenci, která kóduje analog lidského erythropoietinu, který má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny tvořené sekvencemi [X³³,Cys¹³⁹,des-Arg^l66]-lidského erythropoietinu, kde X³³ je vybráno ze skupiny tvořené 20 běžně se vyskytujícími aminokyselinami.
6. 6. Dvouvláknová DNA podle nároku 5, kde X³³ je Pro.
7. 7. Dvouvláknová DNA podle nároku 5, kde X³³ je Cys.
8. 8. Dvouvláknová DNA podle nároku 6, kde segmentem je segment o 498 nukleotidech.
9. 9. Dvouvláknová DNA podle nároku 7, kde segmentem je segment o 498 nukleotidech.
10. 10. Dvouvláknová DNA podle kteréhokoli z nároků 5 až 9, kde segment o 498 nebo 495 nukleotidech je jedním ze dvou spolu souvisejících subsegmentů a druhý subsegment kóduje vedoucí peptid savčího pre-pro-erythropoietinu a je spojen se subsegmentem o 498 nebo 495 nukleotidech tak, že v polypeptidu, kódovaném těmito souvisejícími subsegmenty, sousedí karboxyterminální konec vedoucího peptidu s aminoterminálním koncem analogu erythropoietinu.
11. 11. Dvouvláknová DNA podle nároku 10, kde vedoucí peptid, kódovaný subsegmentem kódujícím vedoucí peptid, má sekvenci Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X³ Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val X⁴ Gly, kde X³ je vybráno ze skupiny tvořené Leu a Val a X⁴ je vybráno ze skupiny tvořené Leu a Pro.

    -32CZ 286046 B6
12. 12. Dvouvláknová DNA podle nároku 11, kde X³ i X⁴ je Leu.
13. 13. Expresní vektor, který zahrnuje DNA podle nároku 10.

    5
14. 14. Expresní vektor, který zahrnuje DNA podle nároku 11.
15. 15. Expresní vektor, který zahrnuje DNA podle nároku 12.
16. 16. Expresní vektor podle nároku 15, tvořený SV2dhfrSVdeltaSJneo, v němž je v místě Xbal 10 tohoto vektoru operativně pro expresi analogu pre-pro-erythropoietinu vložena dvouvláknová

    DNA, zahrnující segment, který kóduje analog pre-pro-erythropoietinu.
17. 17. Expresní vektor podle nároku 16, tvořený SV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro³³,Cys^l29]hEPO).

    15
18. 18. Expresní vektor podle nároku 16, tvořený SV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys¹³⁹]hEPO).
19. 19. Savčí buňka v kultuře, která zahrnuje expresní vektor podle nároku 13 až 18.
20. 20. Savčí buňka podle nároku 19, která má deficit dihydrofolát reduktasy, kde expresní vektor 20 je tvořen SV2dhfrSVdeltaSJneo, v němž je v místě Xbal tohoto vektoru operativně pro expresi pre-pro-erythropoietinu vložena uvedená DNA, tvořená dvěma spolu souvisejícími segmenty.
21. 21. Savčí buňka podle nároku 20, kterou je ovariální buňka čínského křečka, která zahrnuje expresní vektor podle nároku 17 nebo 18.
22. 22. Farmaceutický přípravek kvyvolání erythropoiesy, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) terapeuticky účinné množství analogu lidského erythropoietinu podle nároku 1 v kombinaci s (b) farmaceuticky přijatelným nosičem.

    30
23. 23. Farmaceutický přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že obsahuje analog lidského erythropoietinu podle nároku 1, kde X³³ je Pro.
24. 24. Farmaceutický přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že obsahuje analog lidského erythropoietinu podle nároku 1, kde X³³ je Cys.
25. 25. Farmaceutický přípravek vhodný k ošetřování anemie, vyznačující se tím, že obsahuje (a) terapeuticky účinné množství analogu lidského erythropoietinu podle nároku 1 v kombinaci s (b) farmaceuticky přijatelným nosičem.

    40
26. 26. Farmaceutický přípravek podle nároku 25, vyznačující se tím, že obsahuje analog lidského erythropoietinu podle nároku 1, kde X³³ je Pro.
27. 27. Farmaceutický přípravek podle nároku 25, vyznačující se tím, že obsahuje analog lidského erythropoietinu podle nároku 1, kde X³³ je Cys.