KR960701650A - 에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods) - Google Patents

에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods)

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KR960701650A
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Abstract

[X", C] s1", des-Argl"] 및 [Cys1'8, des-Arg188] 유사체를 포함하는 사람 에리트로포이에 틴의 유사체, 상기 유사체를 사용하기 위한 및 제조하기 위한 방법 및 그를 함유하는 약제학적 조성물.

Description

에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Erythropoietin analog compositions and methods)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 실시예 1에서 제작된 플라즈미드 pEPOW 5의 개략도이다.
제2도는 실시예 1에서 서술된 플라즈미드 pEPOW 5(수정됨) 및 플라즈미드 SV2dhfrSVdeltaSJneo로부터 천연 사람 에리트로포이에틴을 제조하기 위해 배양액중 포유동물 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있는 발현 벡터 SV2dhrfSVdeltaSJneoEPO을 제조하기 위해 사용되는 방법의 개략도이다.
제3도는 천연 "비-재조합"사람 에리트로포이에틴(hEPO 표준물), 발현벡터 SV2dfrSVdeltaSJneoEPO(rEPO)로 형질전환된 dhfr-중국 햄스터 난소 세포에 의해 생성된 천연 "재조합"사람 에리트로포이에틴, 및 천연 사람 에리트로포이에틴의 프리프로형 보다는 오히려 상기 유사체의 프리프로형을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터 SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO의 유사체로 형질전환시킨 dhrf-중국 햄스터 난소 세포에 의해 배양액에서 생성된, 33번 프롤린 잔기 및 139번 시스테인 잔기를 가진(pm25) "재조합"사람 에리트로포이에틴 유사체 pm25의 활성도를 나타내는 그래프이다.
제4도는 천연 사람 에리트로포이에틴 및 pm25 모두의 개략도이다.

Claims (32)

  1. [X33,Cys139]-사람 에리트로포이에틴 및 [X33,Cys139,des-Arg366]-사람 에리트로포이에틴(여기서, X33은 20개의 천연 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된의)의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 사람 에리트로포이에틴의 유사체.
  2. 제1항에 있어서, des-Arg166인 유사체.
  3. 제2항에 있어서, X33이 Pro인 유사체.
  4. 제2항에 있어서, X33이 Cys인 유사체.
  5. [X33,Cys139]-사람 에리트로포이에틴의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 사람 에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는 서열중 498개의 뉴클레오타이드 단편 또는 [X33, Cys139,des-Arg168]-사람 에리트로포이에틴의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 사람 에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는 서열중 495개의 뉴클레오타이드 단편(여기서, X33은 20개의 천연 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하는 이중-가닥 DNA.
  6. 제5항에 있어서, X33이 Pro인 이중-가닥 DNA.
  7. 제5항에 있어서, X33이 Cys인 이중-가닥 DNA.
  8. 제6항에 있어서, 단편이 498개의 뉴클레오타이드 단편인 이중-가닥 DNA.
  9. 제7항에 있어서, 단편이 498개의 뉴클레오타이드 단편인 이중-가닥 DNA.
  10. 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 498 또는 495개의 뉴클레오타이드 단편이, 2개의 인접한 서브단편중 하나이고; 다른 서브단편은 포유동물 프리프로에리트로포이에틴의 리더 펩티드를 암호화하고, 인접한 서브단편이 암호화하는 폴리펩티드중, 리더 펩티드의 카복시-말단이 에리트로포이에틴 유사체의 아미노-말단에 인접하도록 498-뉴클레오타이드 또는 495-뉴클레오타이드 서브단편에 결합되는 이중-가닥 DNA.
  11. 제10항에 있어서, 리더-펩티드를 암호화하는 서브단편이 암호화하는 리더 펩티드가 서열 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X3Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val X4Gly(여기서, X3는 Leu 및 Val으로 이루어지는 그룹으로부티 선택되고, X4는 Leu 및 Pro으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다)을 갗는 이중-가닥 DNA.
  12. 제11항에 있어서, X3및 X4가 각각 Leu인 이중-가닥 DNA.
  13. 제10항에 있어서, 그의 카복시 말단이 사람 에리트로포이에틴 유사체 서열의 아미노 말단에 연결된 리더펩티드의 서열로 이루어진 서열을 갖는 프리프로에리트로포이에틴 유사체를, 배양액중 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터인 이중-가닥 DNA.
  14. 제11항에 있어서, 그의 카복시 말단이 사람 에리트로포이에틴 유사체 서열의 아미노 말단에 연결된 리더펩티드의 서열로 이루어진 서열을 갖는 프리프로에리트로포이에틴 유사체를, 배양액중 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터인 이중-가닥 DNA.
  15. 제12항에 있어서, 그의 카복시 말단이 사람 에리트로포이에틴 유사체 서열의 아미노 말단에 연결된 리더펩티드의 서열로 이루어진 서열을 갖는 프리프로에리트포이에틴 유사체를, 배양액중 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 발현벡터인 이중-가닥 DNA.
  16. 제15항에 있어서, 프리프로에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는 단편을 포함하는 이중-가닥 DNA를가진, 프리프로에리트로포이에틴 유사체의 발현을 위해 작동가능하게 발현 벡터의 Xba I 위치에 삽입된 SV2dhfrSVdeltaSJneo로 이루어지는 발현 벡터.
  17. 발현 벡터 SV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro33, Cys139]hEPO).
  18. 발현 벡터 SV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys139]hEPO).
  19. 포유동물 세포에서 전구체 폴리펩티드를 함께 암호화하는 2개의 인접한 단편으로 이루어진 DNA를 발현하기 위한 발현 벡터를 포함하는데, 이매 상기 전구체 폴리펩티드가 그의 카복시말단이 사람 에리트로포이에틴 유사체의 아미노 말단에 연결된 포유동물 프리프로에리트로포이에틴의 리더 펩티드로 이루어지고, 상기 단편중 하나가 상기 리더 펩티드를 암호화하고 상기 단편중 다른 하나가 498개의 염기 쌍을 가지고 [X33,Cys139]-사람 에리트로포이에틴의 서열(여기서, X33은 2O개의 천연 아미노산으로 이루어진 그룹으로부티 선택된다)로 이루어진 그룹으로부티 선택되는 서열을 가진 상기 에리트로포이에틴 유사체를 암호화하는, 배양액중 포유동물 세포.
  20. 제19항에 있어서, 프리프로에리트로포이에틴의 발현을 위해 작동가능하게 발현의 벡터의 XbaI 위치에 삽입된, 2개의 인접한 단편으로 이루어진 상기 DNA를 가진 SV2dhfrSVdeltaSJneo로 이루어진 발현 벡터를 가진 dhfr-인 포유동물 세포.
  21. 제20항에 있어서, SV2dfrSVdeltaSJneo([X33,Cys139]hEPO) 및 SV2dhfrSVdeltaSJno([Cys139]hEPO)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 발현 벡터를 가진 중국산 햄스터 난소 세포인 포유동물 세포.
  22. (a) [X33,Cys139,des-Arg186]-사람 에리트로포리에틴의 서열(여기서, X33은 20개의 천연아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 치료학적 유효량의 사람 에리트로포이에틴 유사체 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 적혈구 생성을 유도하는데 유용한 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, X33이 pro이 약제학적 조성물.
  24. 제22항에 있어서, X33이 Cys인 약제학적 조성물.
  25. (a) [X33,Cys139, des-Arg168]-사람 에리트로포리에틴의 서열(여기서, X33은 20개의 천연 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 치료학적 유효량의 사람 에리트로포이에틴 유사체 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 빈혈증을 치료하는데 유용한 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, X33이 pro인 약제학적 조성물.
  27. 제25항에 있어서, X33이 Cys인 약제학적 조성물.
  28. 적혈구 생성에서의 특이 활성인 천연 사람 에리트로포이에틴 보다 상당히 낮고 아미노산 서열이 천연사람 에리트로포이에틴의 아미노산 서열과 동일하고 제1 또는 제2위치를 제외하고 제2유사체와 동일한 수 및 서열의 아미노산을 갖는 제1유사체의 적혈구 생성에서의 특이 활성보다는 상당히 큰, 서열중 제1 및 제2위치를 제외하고는 천연 사람 에리트로포이에틴과 동일한 수 및 서열의 아미노산을 갖고 쳔연 사람 에리트로포이에틴 서열중 동일 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산을 갖는 사람 에리트로포이에틴의 제2유사체.
  29. 제28항에 있어서, 천연 사람 에리트로포이에틴의 적혈구 생성 활성과 실질적으로 동일하거나 더 큰 적혈구 생성 활성을 갖고, 이에 대한 제1유사체가 적혈구 생성 활성이 없거나 실질적으로-감소된 제2유사체.
  30. (a) (i)천연 사람 프리프로에리트로포이에틴의 이중 돌연변이체를 암호화하고 (ii) 적혈구 생성 활성이 없거나 감소되었고 천연 사람 에리트로포이에틴중 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산을 그 서열중 한 위치에 가지는 것을 제외하고 천연 사람 에리트로포이에틴과 동일한 수의 아미노산을 가지는, 천연 사람 에리트로포이에틴의 제1유사체의 아미노산을 암호화하는 삼중 코돈을 포함하고 (iii) 천연 프리프로에리트로포이에틴의 리더 펩티드 중 어느 부분도 암호화하지 않고 상기 제1유사체의 아미노산을 암호화하는 상기 삼중코돈을 포함하지 않는 단편에 무작위 돌연변이를 포함하는, 각각 포유동물 세포에서 발현하기 위해 작동가능함 cDNA를 포함하는 진핵 세포 발현 벡터의 라이브러리를 제조하는 단계, (b) 발현 벡터의 라이브러리를 발현을 위해 포유동물 세포내로 형질감염시키는 단계, 및 (c) 제2유사체를 분비하는 세포를 분비하는 단계를 포함하는, 제29항에 따른 에리트로포이에틴의 제2유사체의 제조방법.
  31. 천연 사람 에리트로포이에틴의 상응하는 위치에서의 아미노산에 대해 천연 사람 에리트로포이에틴에는 존재하지 않으나 제1유사체에는 존재하는 제2유사체중 아미노산을 변화시킴을 포함하는 천연 사람 에리트로포이에틴 보다 생계내 적혈구 생성 활성이 큰 에리트로포이에틴의 제3유사체를 제조하기 위한, 제29항에 따른 제2유사체의 사용 방법.
  32. 서열중 한 위치의 한 아미노산이 상이한 것을 제외하고는 천연 사람 에리트로포이에틴과 동일한 수 및 서열의 아미노산을 가지고, 천연 사람 에리트로포이에틴 보다 적혈구 생성 활성이 더욱 크고, 제29항에 따른 제2유사체를 사용하여 제31항에 따른 방법으로 제조한, 사람 에리트로포이에틴의 제3유사체.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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