KR20060019501A - 응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산 - Google Patents

Abstract

재조합 조직 보호 사이토카인 같은 에리트로포이에틴 수용체 활성 조정제를 전신 또는 국부 투여함으로써, 인간을 비롯한 포유동물의 응답 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 기능 또는 생존을 생체 내에서, 원위치에서 또는 생체 외에서 보호 또는 향상시키는 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기 위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산{RECOMBINANT TISSUE PROTECTIVE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACIDS THEREOF FOR PROTECTION, RESTORATION, AND ENHANCEMENT OF RESPONSIVE CELLS, TISSUES, AND ORGANS}

본 발명은 하나 이상의 아미노산이 치환된 뮤테인(mutein) 재조합 조직 보호 사이토카인, 응답 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존(viability)을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키기 위한, 이들 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이는 신경 독소, 저산소증 및 다른 유해한 자극으로부터의 흥분성 조직(예: 신경 조직 및 심조직)의 보호, 및 학습 및 기억을 촉진시키기 위한 것과 같은 흥분성 조직 기능의 향상을 포함한다. 본 발명은 또한 뮤테인 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 내피 세포 장벽을 가로지르는 세포간 수송(transcytosis)에 의해 분자를 수송하거나 분자의 수송을 촉진시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은, 각각 본원에 참고로 인용된, 2002년 7월 1일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 60/392,455 호 및 2002년 7월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 60/393,423 호에 기초한 우선권을 주장한다.

수년동안, 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 유일한 명백한 생리학적 역할은 적혈구 세포의 생성을 조절하는 것이었다. 최근, 몇 가지 계열의 증거에 의해, 사이토카인 상과(superfamily)의 일원으로서의 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 수용체(에리트로포이에틴-R)와의 상호작용을 통해 매개될 수 있는 다른 중요한 생리 기능을 수행함이 암시되고 있다. 이러한 작용은 마이토지네시스(mitogenesis), 평활근 세포 및 신경 세포로의 칼슘 유입 조절, 혈관 활성 작용, 즉 혈관 수축/혈관 팽창, 혈소판의 과활성화 및 중간 대사에 대한 효과를 포함한다. 에리트로포이에틴이 세포의 저산소성 환경을 개선시킬뿐만 아니라 대사 스트레스에 의해 야기되는 프로그래밍된 세포 사멸을 조절하는 역할을 하는 보상 반응(compensatory response)을 제공하는 것으로 생각된다. 연구 결과, 두개내로 주사된 에리트로포이에틴이 저산소성 신경 손상으로부터 신경 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌지만, 두개내 투여는 치료 용도의 경우, 특히 보통의 환자에게는 비현실적이고 허용불가능한 투여 경로이다. 뿐만 아니라, 에리트로포이에틴을 투여받은 빈혈 환자에 대한 이전의 연구에서는 말초 혈관에 투여된 에리트로포이에틴이 뇌로 수송되지 않는 것으로 결론을 내렸다(마티(Marti) 등, 1997, Kidney Int. 51:416-8; 쥴(Juul) 둥, 1999, Pediatr. Res. 46:543-547; 부에미(Buemi) 등, 2000, Nephrol. Dial. Transplant. 15:422-433).

미국 특허 제 5,457,089 호 및 제 4,835,260 호에 기재되어 있는 카복시 말단에 변화된 아미노산을 갖는 것; 미국 특허 제 5,856,298 호에 기재되어 있는 것 과 같은 분자 1개당 다양한 수의 시알산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴 이소폼(isoform); 미국 특허 제 4,703,008 호에 기재되어 있는 폴리펩타이드; 미국 특허 제 5,767,078 호에 기재되어 있는 작용제; 미국 특허 제 5,773,569 호 및 제 5,830,851 호에 기재되어 있는, 에리트로포이에틴 수용체에 결합하는 펩타이드; 및 미국 특허 제 5,835,382 호에 기재되어 있는 작은-분자 의사 화합물(mimetic) 등의, 분자의 적혈구 조혈 활성을 개선시키고자 하는 활성을 갖는 에리트로포이에틴의 다양한 개질된 형태가 기재되어 있다.

본 발명은 응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관을 원위치에서(in situ) 및 생체 외에서 보호, 유지, 향상 또는 회복시키거나, 혈관으로부터 먼 응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관을 보호 및 향상시킬 목적으로 내피 세포 장벽을 가로질러 재조합 조직 보호 사이토카인을 전달하거나, 또는 결합된 분자를 옮기기 위한, 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다.

발명의 개요

한 양태에서, 본 발명은 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 약학 조성물을 제조하기 위한 다양한 형태의 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 한 가지 구체적인 양태에서, 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 세포, 조직 또는 기관은 치밀 내피 세포 장벽으로 인해 혈관으로부터 멀다. 다른 구체적인 양태에서, 이식을 위한 것과 같은 세포, 조직, 기관 또는 다른 신체부위는 포유동물 신체로부터 단리된다. 비제한적인 예로서, 응답 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근 육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있다. 또한, 응답 세포의 비제한적인 예는 광수용체(막대 및 원뿔) 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러(Muller) 세포, 퍼킨지(Purkinje) 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 결합 조직 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 혈관사이 세포, 신장 상피 세포, 요세관 사이질 세포, 술잔 세포, 창자샘(움) 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히(Leydig) 세포, 서톨리(Sertoli) 세포, 정자 세포, 그라피안(Graffian) 난포 세포, 원시 난포 세포, 랑게르한스섬 세포, α-세포, β-세포, γ-세포, F-세포, 골원세포(osteoprogenitor), 파골세포, 조골세포, 자궁내막 버팀질 세포, 자궁내막 세포, 줄기 세포 및 내피 세포를 포함한다. 이들 응답 세포의 예는 예시하기 위한 것이다. 한 양태에서, 응답 세포 또는 이들에 결합된 세포, 조직, 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나 또는 흥분성 세포 또는 조직을 주로 포함하지 않는다. 구체적인 실시태양에서, 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인이 사용되는 포유동물 세포, 조직 또는 기관은 소진된 것이거나 또는 세포, 조직 또는 기관의 생존에 불리한 하나 이상의 조건하에서 시간에 따라 소진되게 된다. 특정 실시태양에서, 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인이 사용되는 포유동물 세포, 조직 또는 기관은 EPO 수용체를 발현한다. 이러한 조건은 원위치에서의 외상성 저산소증 또는 대사 기능장애, 수술에 의해 유도된 원위치에서의 저산소증 또는 대사 기능장 애, 또는 원위치에서의 독소 노출을 포함하며, 원위치에서의 독소 노출은 화학요법 또는 방사선 요법에 수반될 수 있다. 한 실시태양에서, 불리한 조건은 특정 수술 절차를 위해 이용되는 심폐 회로술(인공 심폐기)의 결과이다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 주로 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계 질환, 및 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장, 비뇨생식기 질환, 위장관 질환 및 내분비 및 대사 이상을 치료 또는 예방하는데 유용하다.

본 발명은 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 특정의 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 경구, 비강내 또는 비경구 투여를 위해, 또는 생체 외에서 세포, 조직 또는 기관의 생존을 유지하기 위한 관류액의 형태로 제형화될 수 있다.

전술한 목적에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인은 뮤테인 또는 유전자-변화된 에리트로포이에틴, 즉 천연 분자의 아미노산 주쇄의 하나 이상의 변화가 존재하는 에리트로포이에틴일 수 있다. "변이 단백질", "변형 단백질" 또는 "뮤테인"은 변화된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 의미하며, 아미노산 결실, 치환 또는 둘 다에 의해 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 서열과는 상이한 폴리펩타이드를 포함한다. "천연 서열"은 유전자 또는 단백질의 야생형 또는 천연 형태와 동일한 아미노산 또는 핵산 서열을 일컫는다. 또한, 한 실시태양에서는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인이 세포 보호 활성을 가질 뿐만 아니라, 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과, 즉 증가되는 적혈구용적율(적혈구 생성), 혈관 활성 작 용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판의 과활성화, 증가되는 혈소판 생성 및 전응고 활성중 하나 이상도 갖는다. 또 다른 실시태양에서는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인이 세포 보호 활성은 갖지만, 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과, 즉 증가되는 적혈구용적율(적혈구 생성), 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판의 과활성화, 증가되는 혈소판 생성 및 전응고 활성중 하나 이상은 갖지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 보호 재조합 조직 보호 사이토카인은 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과중 하나 이상을 갖지 않으며; 더욱 바람직하게는 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈 활성을 갖지 않고; 가장 바람직하게는 재조합 조직 보호 사이토카인이 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과를 모두 갖지 않는다.

비제한적인 예로서, 천연 에리트로포이에틴 분자에서 하나 이상의 아미노산을 변화시킬 수 있거나 또는 결실 또는 첨가시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 다음 영역중 하나 이상에서 하나 이상의 변화를 갖는다: VLQRY(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 11 내지 15; 서열 번호: 1) 및/또는 TKVNFYAW(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 44 내지 51; 서열 번호: 2) 및/또는 SGLRSLTTL(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 100 내지 108; 서열 번호: 3) 및/또는 SNFLRG(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 146 내지 151; 서열 번호: 4). 서열 번호: 10의 아미노산 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 및 161에 다른 변이가 제공될 수 있다. 이들 다른 변이는 단독일 수 있거나, 또는 상기 언급 된 영역중 하나 이상에서의 하나 이상의 변이와 함께일 수 있다. 특정 실시태양에서는, TKVNFYAW(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 44 내지 51; 서열 번호: 2)의 하나 이상의 아미노산에서의 변화에 의해 부분 기능을 갖는, 즉 rhu-EPO보다 낮은 적혈구 조혈 활성을 갖는 변화된 에리트로포이에틴 분자가 생성된다. 다른 실시태양에서는, SGLRSLTTL(인간의 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 100 내지 108; 서열 번호: 3)의 하나 이상의 아미노산에서의 변화로 인해 부분 기능을 갖는, 즉 rhu-EPO보다 낮은 적혈구 조혈 활성을 갖는 재조합 조직 보호 사이토카인이 생성된다. 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인은 조직 보호 활성 또는 세포 보호 활성을 나타낸다. 적혈구 조혈 활성과 관련하여, 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않거나 또는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성의 감소를 나타낸다. 적혈구 조혈 활성의 예는 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판의 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성을 포함한다. 당해 분야의 표준 기법에 의해 적혈구 조혈 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 6.17 부분에 기재되어 있는 UT-7 세포 분석을 이용하여, 또는 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Physicians' Desk Reference, Medical Economics Company, Inc., 뉴저지주 몬트베일, 2000]에 기재되어 있는 기법을 이용하여 적혈구용적율을 측정할 수 있다. 구체적으로, 페이지 519 내지 525 및 2125 내지 2131에는 적혈구용적율 수준을 측정하는데 이용될 수 있는 방법이 개시되어 있으며, 독성을 피하기 위한 표적으로서 사용될 수 있는 상이한 적혈구용적율 범위가 개시되어 있다. 예를 들어, 만성 신부전증을 앓는 환자의 경우, 상기 문헌(PDR)은 환자에서 30% 내지 36%의 비독성 표적 적혈구용적율을 달성하기 위해 에리트로포이에틴 투여를 권장한다(예를 들어, 문헌[PDR, p. 523, 제1칼럼, 11. 17-96 및 p. 2129, 제1칼럼, 11. 8-93 및 제2칼럼과 제3칼럼의 첨부 표] 참조). PDR은 적혈구용적율을 조심스럽게 모니터링하고, 적혈구용적율이 표적 범위의 최고점(이 환자군의 경우 36%)에 도달하거나 임의의 2주 기간에 네 지점보다 더 많은 지점에서 증가되면 적혈구용적율이 제안된 표적 범위(이 환자군의 경우 30% 내지 36%; 문헌[PDR, p. 523, 제1칼럼 및 p. 2129, 제1칼럼, "투여량 조절" 표제 하에] 참조)로 되돌아올 때까지 에리트로포이에틴을 억제하면서 EPO의 투여량을 조정함으로써, 적혈구증가증(순환되는 적혈구 세포 수의 비정상적인 증가를 특징으로 하는 질병) 형태의 독성을 피할 수 있는 것으로 기재하고 있다. 대조적으로, 화학요법을 받는 암 환자의 경우, PDR은 상이한 적혈구용적율 수준에서, 즉 적혈구용적율이 40%를 초과하면 투여량을 조절하라고 교시하고 있다(p. 2129, 제2칼럼, "투여량 조정" 표제 하에, 참조). 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 유해한 효과, 즉 재조합 조직 보호 사이토카인의 세포 보호 활성의 치료 이점보다 더 비중이 큰 효과를 야기하기에 충분하지 않은 수준으로 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는다. 한 실시태양에서는, 적혈구 조혈 활성 수준이 측정된다면, 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는 재조합 조직 보호 사이토카인을 여전히 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는 실시태양에서는, 적혈구 조혈 활성을 측정할 수 있으며, 사이토카인의 투여량 및/또는 투여 계획을 조정하여 재조합 조직 보호 사이토카인이 독성을 나타내지 않도록 할 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는 실시태양에서는, 적혈구 조혈 활성을 측정할 수 있고, 사이토카인의 투여량 및/또는 투여 계획을 조정하여 재조합 조직 보호 사이토카인이 낮은 독성을 갖도록 할 수 있다. 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 재조합 Epo와 비교하여 하나 이상의 적혈구 조혈 활성에서 약 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 감소를 나타낸다.

본 발명은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판의 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 재조합 조직 보호 사이토카인을 제공한다. 사이토카인은 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 포함한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 서열 번호: 10의 위치 11 내지 15에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 1], 서열 번호: 10의 위치 44 내지 51에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 2], 서열 번호: 10의 위치 100 내지 108에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 3] 또는 서열 번호: 10의 위치 146 내지 151에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함한다[서열 번호: 4].

다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 서열 번호: 10의 위치 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 또는 161중 하나 이상에 변화된 아미노산 잔기를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하기 변화중 하나 이상을 갖는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다(각 변화된 서열에는 별도의 서열 식별 번호가 부여되었음): 서열 번호: 10의 잔기 6의 알라닌(서열 번호: 15); 서열 번호: 10의 잔기 7의 알라닌(서열 번호: 16); 서열 번호: 10의 잔기 7의 세린(서열 번호: 17); 서열번호 10의 잔기 10의 아이소류신(서열 번호: 18); 서열 번호: 10의 잔기 11의 세린(서열 번호: 19); 서열 번호: 10의 잔기 12의 알라닌(서열 번호: 20); 서열 번호: 10의 잔기 13의 알라닌(서열 번호: 21); 서열 번호: 10의 잔기 14의 알라닌(서열 번호: 22); 서열 번호: 10의 잔기 14의 글루탐산(서열 번호: 23); 서열 번호: 10의 잔기 14의 글루타민(서열 번호: 24); 서열 번호: 10의 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 25); 서열 번호: 10의 잔기 15의 페닐알라닌(서열 번호: 26); 서열 번호: 10의 잔기 15의 아이소류신(서열 번호: 27); 서열 번호: 10의 잔기 20의 글루탐산(서열 번호: 28); 서열 번호: 10의 잔기 20의 알라닌(서열 번호: 29); 서열 번호: 10의 잔기 21의 알라닌(서열 번호: 30); 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신(서열 번호: 31); 서열 번호: 10의 잔기 29의 세린(서열 번호: 32); 서열 번호: 10의 잔기 29의 티로신(서열 번호: 33); 서열 번호: 10의 잔기 30의 아스파라긴(서열 번호: 34); 서열 번호: 10의 잔기 32의 트레오닌(서열 번호: 35); 서열 번호: 10의 잔기 33의 세린(서열 번호: 36); 서열 번호: 10의 잔기 33의 티로신(서열 번호: 37); 서열 번호: 10의 잔기 38의 리신(서열 번호: 38); 서열 번호: 10의 잔기 83의 리신(서열 번호: 39); 서열 번호: 10의 잔기 42의 아스파라긴(서열 번호: 40); 서열 번호: 10의 잔기 42의 알라닌(서열 번호: 41); 서열 번호: 10의 잔기 43의 알라닌(서열 번호: 42); 서열 번호: 10의 잔기 44의 아이소류신(서열 번호: 43); 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산(서열 번호: 44); 서열 번호: 10의 잔기 45의 알라닌(서열 번호: 45); 서열 번호: 10의 잔기 46의 알라닌(서열 번호: 46); 서열 번호: 10의 잔기 47의 알라닌(서열 번호: 47); 서열 번호: 10의 잔기 48의 아이소류신(서열 번호: 48); 서열 번호: 10의 잔기 48의 알라닌(서열 번호: 49); 서열 번호: 10의 잔기 49의 알라닌(서열 번호: 50); 서열 번호: 10의 잔기 49의 세린(서열 번호: 51); 서열 번호: 10의 잔기 51의 페닐알라닌(서열 번호: 52); 서열 번호: 10의 잔기 51의 아스파라긴(서열 번호: 53); 서열 번호: 10의 잔기 52의 알라닌(서열 번호: 54); 서열 번호: 10의 잔기 59의 아스파라긴(서열 번호: 55); 서열 번호: 10의 잔기 62의 트레오닌(서열 번호: 56); 서열 번호: 10의 잔기 67의 세린(서열 번호: 57); 서열 번호: 10의 잔기 70의 알라닌(서열 번호: 58); 서열 번호: 10의 잔기 96의 아르기닌(서열 번호: 59); 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌(서열 번호: 60); 서열 번호: 10의 잔기 100의 아르기닌(서열 번호: 61); 서열 번호: 10의 잔기 100의 글루탐산(서열 번호: 62); 서열 번호: 10의 잔기 100의 알라닌(서열 번호: 63); 서열 번호: 10의 잔기 100의 트레오닌(서열 번호: 64); 서열 번호: 10의 잔기 101의 알라닌(서열 번호: 65); 서열 번호: 10의 잔기 101의 아이소류신(서열 번호: 66); 서열 번호: 10의 잔기 102의 알라닌(서열 번호: 67); 서열 번호: 10의 잔기 103의 알라닌(서열 번호: 68); 서열 번호: 10의 잔기 103의 글루탐산(서열 번호: 69); 서열 번호: 10의 잔기 104의 알라닌(서열 번호: 70); 서열 번호: 10의 잔기 104의 아이소류신(서열 번호: 71); 서열 번호: 10의 잔기 105의 알라닌(서열 번호: 72); 서열 번호: 10의 잔기 106의 알라닌(서열 번호: 73); 서열 번호: 10의 잔기 106의 아이소류신(서열 번호: 74); 서열 번호: 10의 잔기 107의 알라닌(서열 번호: 75); 서열 번호: 10의 잔기 107의 류신(서열 번호: 76); 서열 번호: 10의 잔기 108의 리신(서열 번호: 77); 서열 번호: 10의 잔기 108의 알라닌(서열 번호: 78); 서열 번호: 10의 잔기 108의 세린(서열 번호: 79); 서열 번호: 10의 잔기 116의 알라닌(서열 번호: 80); 서열 번호: 10의 잔기 126의 알라닌(서열 번호: 81); 서열 번호: 10의 잔기 132의 알라닌(서열 번호: 82); 서열 번호: 10의 잔기 133의 알라닌(서열 번호: 83); 서열 번호: 10의 잔기 134의 알라닌(서열 번호: 84); 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌(서열 번호: 85); 서열 번호: 10의 잔기 142의 아이소류신(서열 번호: 86); 서열 번호: 10의 잔기 143의 알라닌(서열 번호: 87); 서열 번호: 10의 잔기 146의 알라닌(서열 번호: 88); 서열 번호: 10의 잔기 147의 리신(서열 번호: 89); 서열 번호: 10의 잔기 147의 알라닌(서열 번호: 90); 서열 번호: 10의 잔기 148의 티로신(서열 번호: 91); 서열 번호: 10의 잔기 148의 알라닌(서열 번호: 92); 서열 번호: 10의 잔기 149의 알라닌(서열 번호: 93); 서열 번호: 10의 잔기 150의 알라닌(서열 번호: 94); 서열 번호: 10의 잔기 150의 글루탐산(서열 번호: 95); 서열 번호: 10의 잔기 151의 알라닌(서열 번호: 96); 서열 번호: 10의 잔기 152의 알라닌(서열 번호: 97); 서열 번호: 10의 잔기 152의 트립토판(서열 번호: 98); 서열 번호: 10의 잔기 153의 알라닌(서열 번호: 99); 서열 번호: 10의 잔기 154의 알라닌(서열 번호: 100); 서열 번호: 10의 잔기 155의 알라닌(서열 번호: 101); 서열 번호: 10의 잔기 158의 알라닌(서열 번호: 102); 서열 번호: 10의 잔기 160의 세린(서열 번호: 103); 서열 번호: 10의 잔기 161의 알라닌(서열 번호: 104); 서열 번호: 10의 잔기 162의 알라닌(서열 번호: 105). 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다(서열 번호: 15 내지 105 및 119).

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 서열 번호: 10의 아미노산 잔기 44 내지 49가 결실된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하기 변화중 하나 이상을 갖는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다(각각의 변화된 서열에는 별도의 서열 식별 번호가 부여되었음): i) 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산 및 잔기 100의 글루탐산(서열 번호: 106); ii) 서열 번호: 10의 잔기 30의 아스파라긴 및 잔기 32의 트레오닌(서열 번호: 107); iii) 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산 및 잔기 150의 글루탐산(서열 번호: 108); iv) 서열 번호: 10의 잔기 103의 글루탐산 및 잔기 108의 세린(서열 번호: 109); v) 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌 및 잔기 52의 알라닌(서열 번호: 110); vi) 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 잔기 45의 알라닌(서열 번호: 111); vii) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌 및 잔기 152의 알라닌(서열 번호: 112); iix) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌(서열 번호: 113); ix) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌 및 잔기 52의 알라닌(서열 번호: 114); x) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 및 잔기 140의 알라닌(서열 번호: 115); xi) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 잔기 140의 알라닌, 잔기 154의 알라닌, 잔기 24의 리신, 잔기 38의 리신, 잔기 83의 리신, 잔기 24의 리신 및 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 116); xii) 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신, 잔기 38의 리신 및 잔기 83의 리신(서열 번호: 117); xiv) 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신 및 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 118). 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 아미노산 잔기중 하나 이상이 치환된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다(서열 번호: 106 내지 118).

본 발명의 한 실시태양은 하나 이상의 아미노산의 화학적 개질을 추가로 포함하는, 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 화학적 개질은 재조합 조직 보호 사이토카인의 전하 변화를 포함한다. 또 다른 실시태양에서는, 전하를 갖는 아미노산 잔기를 전하를 갖지 않는 잔기로 개질시키는 경우, 양전하 또는 음전하를 아미노산 잔기에 화학적으로 첨가한다.

또한, 하기 동시 계류중인 특허원에 기재되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 아미노산을 화학적으로 개질시킴으로써 이러한 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 추가로 개질시킬 수 있다: 각각 본원에 참고로 인용되어 있는, 2001년 12월 28일자로 출원된 PCT 특허원 제 PCT/US01/49479 호, 2000년 12월 29일자로 출원된 미국 특허원 제 09/753,132 호 및 2002년 7월 3일자로 출원된 미국 특허원(사건 번 호 KW00-009C02-US). 이들 추가적인 화학적 개질을 이용하여 재조합 조직 보호 사이토카인의 조직 보호 활성을 향상시키거나, 또는 재조합 조직 보호 사이토카인이 골수에 대해 가질 수 있는 임의의 효과를 억제할 수 있다. 추가의 실시태양에서는, 추가적인 화학적 개질(예컨대, 전하를 갖는 아미노산 잔기를 전하를 갖지 않는 잔기로 개질시키는 경우, 양전하 또는 음전하를 분자에 화학적으로 첨가함)을 제공하여, 전술한 유전자 변화의 결과로서 감소될 수 있는 분자의 용해도를 회복시킨다.

비제한적인 예로서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 인간의 에리트로포이에틴 뮤테인 S100E(서열 번호: 5), 인간의 에리트로포이에틴 뮤테인 K45D(서열 번호: 6), 및 적혈구 조혈 활성을 갖지는 않지만 세포 보호성인 재조합 조직 보호 사이토카인, 또는 하기 문헌에 기재된, 응답 세포, 조직 또는 기관에 이로울 수 있는 것을 포함한다: 본원에 참고로 인용되어 있는 엘리엇(Elliott) 등의 문헌[Blood 89:493-502]; 보이셀(Boissel) 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, vol. 268, No. 21, pp. 15983-15993 (1993)]; 웬(Wen) 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, vol. 269, No. 36, pp. 22839-22846 (1994)]; 및 셰드(Syed) 등의 문헌[Nature, vol. 395, pp. 511-516 (1998)]. 본 발명은 응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기 위한 전술한 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 재조합 조직 보호 사이토카인은 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 추가적인 아미노산의 다른 변화 또는 에리트로포이에틴 분자의 하나 이 상의 탄수화물의 개질일 수 있는 하나 이상의 추가적인 변화와 함께 하나 이상의 유전자 변화된 아미노산을 포함하는 전술한 에리트로포이에틴을 포함한다. 유전자 변화된 아미노산(들)은 추가로 개질된 것이거나 또는 다른 개질된 것 중에 포함될 수 있다. 물론, 본원의 목적에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자는 천연 에리트로포이에틴 분자와 비교하여 다수의 변화(예컨대, 분자의 아미노산 부분의 다수의 변화, 분자의 탄수화물 부분의 다수의 변화, 또는 분자의 아미노산 부분의 적어도 두번째 변화 및 분자의 탄수화물 부분의 적어도 첫번째 변화)를 가질 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인 분자는 응답 포유동물 세포의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 능력을 보유하지만, 전술한 바람직한 특징과 무관한 재조합 조직 보호 사이토카인의 다른 특성은 천연 분자와 비교하여 갖지 않을 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈성이 아니다.

또 다른 실시태양에서는, 푸코실화에 의해 당단백의 당화 패턴을 변화시키도록 재조합 조직 보호 사이토카인을 변화시킬 수 있다.

본 발명의 한 양태는 인간의 에리트로포이에틴 뮤테인인 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인에 관한 것이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 인간의 페닐글라이옥살 에리트로포이에틴 뮤테인이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴(asialoerythropoietin) 뮤테인이다.

한 실시태양에서는, 상기 본원에 기재된 바와 같이, 재조합 조직 보호 사이 토카인이 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 포함한다. 이러한 실시태양에서, 응답 포유동물 세포는 신경, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관, 내피, 고환, 난소, 자궁내막 또는 줄기 세포를 포함한다. 다른 실시태양에서, 세포는 광수용체 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼 세포, 혈관사이 세포, 술잔 세포, 창자샘 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히 세포, 서톨리 세포, 정자 세포, 그라피안 난포 세포, 원시 난포 세포, 자궁내막 버팀질 세포 또는 자궁내막 세포를 포함한다.

본 발명의 다른 요지에 따라, 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인은 내피 세포 장벽을 횡단할 수 있다. 관련 실시태양에서, 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽, 혈액-태반 장벽, 혈액-심장 장벽, 혈액-신장 장벽 및 혈액-자궁 장벽을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인이 추가로 변화된다. 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 i) 시알산 잔기의 수가 감소되거나 시알산 잔기를 갖지 않는 사이토카인; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물의 수가 감소되거나 이들 탄수화물을 갖지 않는 사이토카인; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 사이토카 인을 처리함으로써 적어도 탄수화물 함량이 감소된 사이토카인; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 사이토카인; v) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖고 화학적으로 환원된 사이토카인; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 사이토카인; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 사이토카인 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 사이토카인; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 사이토카인; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 사이토카인; x) 개질된 트립토판 잔기를 갖는 사이토카인; xi) 하나 이상의 아미노산 기가 제거된 사이토카인; xii) 사이토카인 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 사이토카인; xiii) 말단 절단된(truncated) 사이토카인; xiv) 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 분자가 부착된 사이토카인; xv) 하나 이상의 지방산이 부착된 사이토카인; xvi) 포유동물 세포가 아닌 세포에서 재조합 사이토카인을 발현시킴으로써 포유동물의 당화 패턴이 아닌 당화 패턴을 갖는 사이토카인; 및 xvi) 정제를 촉진시키기 위해 하나 이상의 히스티딘 택(tag)을 붙인 아미노산을 갖는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 감소된 수의 시알산 잔기를 갖거나 또는 시알산 잔기를 갖지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 에리트로포이에틴의 무-시알산 형태이고(즉, 시알산 잔기를 갖지 않고), 가장 바람직하게는 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 갖는다. 시알릴화에 이용가능한 부위의 수 는 재조합 조직 보호 사이토카인중 하나 이상의 변화되거나 개질된 아미노산의 존재에 의해 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명은 재조합 조직 보호 사이토카인이 저시알릴화되거나 또는 과시알릴화된 실시태양을 포괄한다. 바람직한 요지에서, 에리트로포이에틴 뮤테인은 천연 에리트로포이에틴에 존재하는 14개의 시알산 잔기보다 더 많이 갖는다.

한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 N-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 감소된 수의 N-결합된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴이다. 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 감소된 수의 O-결합된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴이다.

다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 푸코실화에 의해 당당백의 당화 패턴을 변화시키도록 개질될 수 있다.

또 다른 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인을 하나 이상의 글라이코시다제로 처리한다. 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 글라이코시다제로 재조합 조직 보호 사이토카인을 처리함으로써 적어도 감소된 탄수화물 함량을 갖는다.

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인의 탄수화물 부분은 포유동물 세포가 아닌 세포에서 재조합 에리트로포이에틴을 발현시킴으로써 적어도 포유동물의 당화 패턴이 아닌 당화 패턴을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 재조 합 조직 보호 사이토카인은 곤충 세포, 식물 세포, 세균 세포 또는 효모 세포에서 발현된다.

다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 또한 화학적으로 환원될 수도 있는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 퍼아이오데이트(periodate)-산화된 에리트로포이에틴이다. 특정 실시태양에서, 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴은 소듐 사이아노보로하이드라이드로 화학적으로 환원된다.

또 다른 실시태양에서, 전술한 용도를 위한 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는다. 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살 잔기(여기에서, R은 아릴 또는 알킬 잔기임)를 포함한다. 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 아르기닌 잔기가 2,3-부테인다이온 또는 사이클로헥세인다이온과 같은(그러나, 이들로 한정되지는 않음) 인접한 다이케톤과 반응함으로써 개질된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 아르기닌 잔기가 3-데옥시글루코손과 반응된 에리트로포이에틴이다.

또 다른 실시태양에서, 개질된 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질되는데, 예컨대 리신 잔기의 반응에 의해 개질되거나, 또는 N-말단 아미노기와 아미노기-개질제의 반응에 의해 개질된다. 개질된 리신 잔기는 또한 화학적으로 환원될 수 있 다. 한 가지 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 리신기를 통해 바이오틴일화 또는 카밤일화 또는 아실화된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 리신은 알데하이드 또는 환원당과 반응하여 이민을 형성하고, 이를 소듐 사이아노보로하이드라이드로 환원시켜 글루시톨릴 리신과 같은 N-알킬화된 리신을 형성함으로써 안정화시킬 수 있거나, 또는 환원당의 경우, 아마도리(Amadori) 또는 헤인즈(Heyns) 전위에 의해 알파-데옥시-알파-프럭토실리신과 같은 알파-데옥시 알파-아미노 당을 형성함으로써 안정화시킬 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서는, 리신기를 예컨대 사이아네이트 이온과 반응시킴에 의해 카밤일화(카밤오일화)시키거나; 각각 알킬-아이소사이아네이트, 아릴-아이소사이아네이트 또는 아릴-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 알킬-카밤일화, 아릴-카밤일화 또는 아릴-티오카밤일화시키거나, 또는 리신기를 반응성 알킬카복실산 또는 아릴카복실산 유도체에 의해 아실화시킬 수 있다(예컨대, 아세트산 무수물, 석신산 무수물 또는 프탈산 무수물과의 반응에 의해). 하나 이상의 리신기는 또한 트라이나이트로벤젠설폰산 또는 바람직하게는 그의 염과의 반응에 의해 개질된 트라이나이트로페닐일 수 있다. 다른 실시태양에서는, 리신 잔기를 글라이옥살 유도체(예컨대, 글라이옥살, 메틸글라이옥살 또는 3-데옥시글루코손)와 반응시켜 상응하는 알파-카복시알킬 유도체를 생성시킴으로써 개질시킬 수 있다. 관련 실시태양에서, 카밤밀화된 사이토카인은 알파-N-카밤오일에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N- 엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일하이포(hypo)시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함한다. 관련 실시태양에서, 아세틸화 사이토카인은 알파-N-아세틸에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이퍼(hyper)시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이퍼시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, 및 N-엡실론-아세틸하이퍼시알로에리트로포이에틴을 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 석신일화된 리신 잔기를 갖는다. 관련 실시태양에서, 석신일화된 사이토카인은 알파-N-석신일에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일하이퍼시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일하이퍼시알로에리트로포이에틴; 및 N-엡실론-석신일하이퍼시알로에리트로포이에틴을 포함한다.

한 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인의 하나 이상의 티로신 잔기가 친핵성 시약에 의해 방향족 고리 위치에서 개질될 수 있다(예: 질화 또는 요오드화). 관련 실시태양에서, 본원에 상기 개시된 재조합 조직 보호 사이토카인은 2, 4, 6개의 트라이나이트로벤젠설폰에이트 소듐 또는 그의 다른 염에 의해 개질된 하나 이상의 리신 잔기를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 질화 또는 요오드화된 티로신 잔기를 포함한다.

다른 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인이 카보다이이미드와 반응한 후 아민과 반응한 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 포함한다. 관련 실시태양에서, 아민은 글라이신아마이드이다.

한 실시태양에서는, 예컨대 n-브로모석신이미드 또는 n-클로로석신이미드와 반응시킴으로써 재조합 조직 보호 사이토카인의 적어도 트립토판 잔기를 개질시킨다.

다른 실시태양에서는, 예를 들어 닌하이드린과 반응시킨 다음 생성된 카본일기를 보로하이드라이드와 반응시켜 환원시킴으로써 하나 이상의 에리트로포이에틴 아미노기가 제거된 재조합 조직 보호 사이토카인이 제공된다.

또 다른 실시태양에서는, 다이티오트레이톨과 같은 환원제와 반응시킨 후 설프하이드릴을 아이오도아세트아마이드, 아이오도아세트산 또는 다른 친전자체와 반응시켜 다이설파이드 결합의 재형성을 방지함으로써, 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 적어도 결손된 재조합 조직 보호 사이토카인이 제공된다.

다른 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인에 대해 특정 잔기를 표적으로 하는(예를 들어, 트립토판 잔기 뒤를 절단하는) 제한된 화학적 단백질 분해를 수행한다. 이렇게 하여 생성된 재조합 조직 보호 사이토카인 분절은 본원에 포함된다.

상기 나타낸 바와 같이, 본원의 목적에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인은 유전자 변화된 아미노산(들)에 덧붙여 상기와 같은 화학적 개질을 하나 이상 가질 수도 있고, 그보다 더 많이 개질될 수도 있다. 분자의 탄수화물 부분이 한 가지 개질되고 아미노산 부분이 한 가지 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인의 예로서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 바이오틴일화, 아실화(예컨대, 아세틸화) 또는 카밤일화된 리신 잔기를 갖는 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 지방산 쇄를 첨가함으로써, 재조합 조직 보호 사이토카인을 또한 개질할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 페갈화(pegalation)에 의해 재조합 조직 보호 사이토카인을 개질시켜, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)의 첨가에 의해 페길화된 조직 보호 사이토카인을 생성시킨다.

본 발명의 한 요지에 따라, 상기 본원에 기재된 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 한 실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 208의 벡터 구조물의 뉴클레오타이드 잔기 5461 내지 6041, 서열 번호: 209의 뉴클레오타이드 잔기 5461 내지 6041, 서열 번호: 210의 뉴클레오타이드 잔기 5461 내지 6041, 서열 번호: 211의 뉴클레오타이드 잔기 5461 내지 6041, 또는 서열 번호: 212의 뉴클레오타이드 잔기 5461 내지 6041의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 한 실시태양에서는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하거나 상기 사이토카인으로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(즉, cDNA, 인트론에 의해 차단되거나 인트론에 의해 차단되지 않은 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공되나, 단 핵산 분자는 하기 아미노산 치환중 하나 이상을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인은 코딩하지 않는다: I6A, C7A, K20A, P42A, D43A, K45D, K45A, F48A, Y49A, K52A, K49A, S100E, R103A, K116A, T132A, I133A, K140A, N147K, N147A, R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A 또는 R162A. 관련 실시태양에서는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공되지만, 단 핵산 분자는 임의의 치환 조합 N24K/N38K/N83K 또는 A30N/H32T를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인은 코딩하지 않는다. 한 실시태양에서는, 특정 숙주 세포에서 용이하게 최적 발현되도록 하는 바람직한 코돈을 사용하여, 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 합성한다. 이러한 바람직한 코돈은 식물, 세균, 효모, 포유동물, 진균 또는 곤충의 종의 세포에서 발현하기에 최적일 수 있다.

본 발명은 또한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 핵산 분자 및 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 한 실시태양에서, 벡터는 pCiNeo 벡터이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시태양에서는, 핵산 분자를 포함하는 유전공학에 의해 생성된 세포가 제공된다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 비롯한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 사이토카인은 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 포함한다. 약학 조성물의 재조합 조직 보호 사이토카인은 하기 변화, 즉 치환중 하나 이상을 갖는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다(나열된 각각의 변화 또는 변화의 조합에는 별도의 서열 식별 번호가 부여되었음): i) 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산 및 잔기 100의 글루탐산(서열 번호: 106); ii) 서열 번호: 10의 잔기 30의 아스파라긴 및 잔기 32의 트레오닌(서열 번호: 107); iii) 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산 및 잔기 150의 글루탐산(서열 번호: 108); iv) 서열 번호: 10의 잔기 103의 글루탐산 및 잔기 108의 세린(서열 번호: 109); v) 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌 및 잔기 52의 알라닌(서열 번호: 110); vi) 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 잔기 45의 알라닌(서열 번호: 111); vii) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌 및 잔기 152의 알라닌(서열 번호: 112); iix) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌(서열 번호: 113); ix) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌 및 잔기 52의 알라닌(서열 번호: 114); x) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 및 잔기 140의 알라닌(서열 번호: 115); xi) 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌, 잔기 152의 알라닌, 잔기 45의 알라닌, 잔기 52의 알라닌, 잔기 140의 알라닌, 잔기 154의 알라닌, 잔기 24의 리신, 잔기 38의 리신, 잔기 83의 리신, 잔기 24의 리신 및 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 116); xii) 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신, 잔기 38의 리신 및 잔기 83의 리신(서열 번호: 117); 또는 xiv) 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신 및 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 118).

본 발명의 다른 요지에 따라, 하기 아미노산 잔기 치환(나열된 각각의 변화 또는 변화의 조합에는 별도의 서열 식별 번호가 부여되었음)중 하나 이상을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인 치료 효과량을 포함하는, 응답 포유동물 세포, 및 이에 결합된 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키기 위한 약학 조성물이 제공된다: 서열 번호: 10의 잔기 152의 트립토판(서열 번호: 98); 서열번호 10의 잔기 14의 알라닌 및 잔기 15의 알라닌(서열 번호: 119); 서열 번호: 10의 잔기 6의 알라닌(서열 번호: 15); 서열 번호: 10의 잔기 7의 알라닌(서열 번호: 16); 서열 번호: 10의 잔기 43의 알라닌(서열 번호: 42); 서열 번호: 10의 잔기 42의 알라닌(서열 번호: 41); 서열 번호: 10의 잔기 48의 알라닌(서열 번호: 49); 서열 번호: 10의 잔기 49의 알라닌(서열 번호: 50); 서열 번호: 10의 잔기 32의 트레오닌(서열 번호: 35); 서열 번호: 10의 잔기 133의 알라닌(서열 번호: 83); 서열 번호: 10의 잔기 134의 알라닌(서열 번호: 84); 서열 번호: 10의 잔기 147의 알라닌(서열 번호: 90); 서열 번호: 10의 잔기 148의 알라닌(서열 번호: 92); 서열 번호: 10의 잔기 150의 알라닌(서열 번호: 94); 서열 번호: 10의 잔기 151의 알라닌(서열 번호: 96); 서열 번호: 10의 잔기 158의 알라닌(서열 번호: 102); 서열 번호: 10의 잔기 161의 알라닌(서열 번호: 104); 서열 번호: 10의 잔기 162의 알라닌(서열 번호: 105).

한 실시태양에서, 상기 본원에 기재된 약학 조성물은 경구, 비강내 또는 비경구 투여를 위해 제형화된다. 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 관류액의 형태로 제형화된다.

특정 실시태양에서, 응답 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키기 위한 본 발명의 약학 조성물은 인간의 천연 에리트로포이에틴 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 하나 이상 치환된 재조합 조직 보호 사이토카인을 치료 효과량으로 포함한다.

다른 실시태양에서, 응답 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키기 위한 본 발명의 약학 조성물은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성 같은 하나 이상의 적혈구 조혈 활성 또는 효과를 갖지 않을 수 있는 세포 보호 활성을 갖는 재조합 조직 보호 사이토카인을 치료 효과량으로 포함한다.

다른 실시태양에서, 응답 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키기 위한 본 발명의 약학 조성물은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성 같은 하나 이상의 적혈구 조혈 활성 또는 효과도 갖는 세포 보호 활성을 갖는 재조합 조직 보호 사이토카인을 치료 효과량으로 포함한다.

본 발명의 한 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성 같은 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 에리트로포이에틴으로 이루어진 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 포유동물 신체로부터 단리된 세포, 조직 또는 기관을 노출시킴을 포함하는, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 보호, 유지 또는 향상시키는 방법이 제공된다. 특정 실시태양에서는, 골수에 대해 보호하지 않는다.

본 발명은 또한 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 포유동물 신체로부터 단리된 세포, 조직 또는 기관을 노출시킴을 포함하는, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 보호, 유지 또는 향상시키는 방법도 제공한다.

본 발명은 포유동물에서 조직이 손상되지 않도록 보호하고 조직 손상을 방지할 뿐만 아니라 조직 및 조직 기능을 회복 및 복원시키는 약학 조성물을 제조하기 위한, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도를 추가로 제공한다. 한 실시태양에서, 손상은 발작 질환, 다발성 경화증, 중풍, 저혈압, 심장정지, 허혈, 심근 경색, 염증, 연령 관련 인지 기능 상실, 방사선 손상, 뇌성마비, 신경변성 질환, 알쯔하이머(Alzheimer's)병, 파킨슨(Parkinson's)병, 레이(Leigh's)병, AIDS 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 알콜 중독, 기분 장애, 불안 장애, 주의력 결핍 장애, 과다활동, 자폐증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 뇌 또는 척수 외상 또는 허혈, 심폐회로술, 만성 심장 부전, 황반 변성, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 허혈 또는 망막 외상에 의해 야기된다.

본 발명의 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 증가되는 혈압, 혈소 판 과활성화 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인에 결합된 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 이 결합은 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 본 발명의 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 증가되는 혈압, 혈소판 과활성화 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성을 갖는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 이 결합은 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합이다. 다른 실시태양에서, 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽, 혈액-심장 장벽, 혈액-신장 장벽 및 혈액-태반 장벽으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 분자는 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 항바이러스제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물이다.

본 발명의 또 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 상기 본 원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는, 내피 세포 장벽을 가로지르는 세포간 수송을 통해 상기 분자를 수송하기 위한 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 요지에 따라, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는, 내피 세포 장벽을 가로지르는 세포간 수송을 통해 상기 분자를 수송하기 위한 조성물이 제공된다. 한 실시태양에서, 이 결합은 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 다른 실시태양에서, 분자는 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물이다.

본 발명은 또한 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않는 본원에 상기 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도를 제공한다. 한 실시태양에서, 이 결합은 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합이다. 다른 실시태양에서, 분자는 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물이다.

따라서, 본 발명은 천연 에리트로포이에틴의 하나 이상의 아미노산이 변화 된, 상기 기재된 바와 같은 세포 보호 활성을 갖는 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인의 세포 보호 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 응답 세포, 조직 또는 기관을 치료함에 있어서, 특히 이러한 응답 세포, 조직 또는 기관에 관련된 질병 또는 질환을 치료함에 있어서의, 상기 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖는다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 바람직하게는 천연 에리트로포이에틴의 3차원 형상을 유지한다. 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 HisTag(6×His 잔기)의 N 말단 융합을 갖는 재조합 단백질로서 생성된다. 특정 실시태양에서는, 추가적인 아미노산 서열을 스페이서로서 첨가할 수 있다. 특수한 실시태양에서, 본 발명의 히스테인-택이 붙여진 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 K45D-6×His 및 S100E-6×His를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명의 또다른 양태에서, 응답 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키고자 하는 목적으로 세포, 조직 또는 기관을 생체 외에서 처리하기 위한 약학 조성물을 제조하는데, 전술한 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 이러한 생체외 처리는 예를 들어 이식(자가 이식 또는 외래 이식(xenotransplant))을 위한 세포, 조직 또는 기관의 보존에 유용하다. 세포, 조직 또는 기관이 공여자 또는 수령자의 혈관과 결합되지 않은 기간동안 세포 기능을 유지하기 위하여, 혈관 또는 다른 수단을 통해 기관 내로 스며들게 하는 관류액 또는 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 용액에 세포, 조직 또는 기관을 담가둘 수 있다. 기관을 떼어내기 전의 공여자, 및 떼어낸 기관 및 수령자에게 관류액을 투여할 수 있다. 또한, 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인의 전술한 용도는 세포, 조직 또는 기관이 개인의 혈관으로부터 단리되어 일정 기간동안 본질적으로 생체 외에서 존재할 경우에 유용하며, 이 때 용어 단리된이란 구체적으로 심폐 회로술과 같은 수술 동안; 혈관이 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 우회하는 동안; 포유동물 신체로부터 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 제거(이는 외래 이식에 앞서 또는 자가이식 전에 또한 자가이식 동안 수행될 수 있음)하는 동안; 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 외상성 절단 동안 수행될 수 있는 것처럼, 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위로의 혈관을 제한시키거나 클램프로 죄는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이 양태는 원위치에서 또한 생체 외에서 에리트로포이에틴 뮤테인을 사용한 관류에 적합하다. 생체 외에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 세포, 조직 또는 기관 보존 용액에 제공될 수 있다. 어느 양태에서나, 노출은 연속 관류, 박동성 관류, 주입, 침지, 주사 또는 카테터 삽입에 의해 이루어질 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 신체로부터 단리된, 응답 세포 또는 조직을 포함하는 포유동물 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 단리된 포유동물 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를, 전술한 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는데 효과적인 시간동안 소정량의 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인에 적어도 노출시킴을 포함한다. 비제한적인 예에서, 단리된이란 특히 심폐 회로술과 같은 수술 동안; 혈관이 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 우회하는 동안; 포유동물 신체로부터 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 제거(이는 외래이식에 앞서 또는 자가이식 전에 또한 자가이식 동안 수행될 수 있음)하는 동안; 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위가 외상에 의해 절단되어 있는 동안 수행될 수 있는 것처럼, 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위로의 혈관을 제한시키거나 클램프로 죄는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이 양태는 원위치에서 또한 생체 외에서 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용한 관류에 적합하다. 생체 외에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 세포, 조직 또는 기관 보존 용액에 제공될 수 있다. 어느 양태에서나, 노출은 연속 관류, 박동성 관류, 주입, 침지, 주사 또는 카테터 삽입에 의해 이루어질 수 있다.

비제한적인 예로서, 전술한 생체외 응답 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 골수, 피부, 제대혈 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있거나 상기 세포 또는 조직을 포함할 수 있다. 응답 세포의 이들 예는 단지 예일 뿐이다.

전술한 방법 및 용도는 모두 인간에게 바람직하게 적용될 수 있지만, 애완동 물, 집안에서 키우는 동물, 가축 및 동물원 동물과 같은(그러나 이들로 국한되지는 않음) 임의의 동물에도 마찬가지로 유용하다. 전술한 약학 조성물의 투여 경로는 경구, 정맥내, 비강내, 국부, 관강내, 흡입 또는 비경구 투여를 포함하며, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 복강내, 점막하 또는 피내 투여를 포함한다. 생체외 용도의 경우, 관류액 또는 침지 용액이 바람직하다. 이는 혈관의 단리된 부분을 원위치에서 관류시킴을 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에서, 전술한 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인은, 기능장애에 책임이 있는 질환 또는 증상의 개시 후에 투여될 때, 기능장애 세포, 조직 또는 기관을 회복시키는 약학 조성물을 제조하는데 유용하다. 비제한적인 예로서, 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 투여하면, 외상이 진전된지 한참(예컨대 1일, 3일, 5일, 1주일, 한 달 이상) 지난 뒤에 투여될 때에도, 이미 뇌 외상을 받은 동물의 인지 기능이 회복된다. 본 발명은 최초의 외상으로부터 연속적으로 야기되는 세포 및 조직의 후속 손상을 치료(즉, 이러한 손상의 증상 또는 효과를 경감시키거나 역전시킴) 및 예방(즉, 후속 손상의 개시를 지연, 억제 또는 중지시킴)하기 위한 약학 조성물을 포함한다. 이러한 용도에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인은 전술한 임의의 특정 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 응답 세포에게 유리하게 작용할 수 있는 재조합 조직 보호 사이토카인의 임의의 형태는 본 발명의 이 요지에 포함된다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 기능장애에 책임이 있는 질환 또는 증상이 개시된 후에 투여될 때 기능장애 세포, 조직 또는 기관을 회복시키기 위해 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하는 방법을 제공한다. 비제한적인 예로서, 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 방법은, 외상이 진정된지 한참(예컨대, 3일, 5일, 1주일, 한 달 이상) 후에 투여될 때에도, 이미 뇌 외상을 가진 동물의 인지 기능을 회복시킨다. 재조합 조직 보호 사이토카인 및 그의 추가의 개질체는 상기 본원에 기재된 바와 같다. 응답 세포에게 유리하게 작용할 수 있는 재조합 조직 보호 사이토카인의 임의의 형태는 본 발명의 이 요지에 포함된다.

본 발명의 다른 요지에서는, 본원에서 이전에 기재된 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자의 조성물을 투여함으로써, 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 방법이 제공된다.

수송될 분자와 재조합 조직 보호 사이토카인 사이의 결합은 예를 들어 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인과 수송될 단백질은 융합 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-심장 장벽, 혈액-신장 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-태반 장벽일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수송하는데 적합한 분자는 성장 호르몬과 같은 호르몬, 항생제 및 항암제를 포함한다.

본 발명의 다른 요지는, 상기 기재된 것과 같은 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는, 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 상기 분자 의 세포간 수송을 촉진하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 요지에서는, 포유동물에서 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키기 위한 약학 조성물(이는 상기 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 상기 분자를 포함함)을 제조하는데 전술한 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인이 유용하다.

결합은 예를 들어 불안정한 공유 결합, 융합 폴리펩타이드, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-태반 장벽일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수송하는데 적합한 분자는 예를 들어 성장 호르몬과 같은 호르몬, 항신경성 인자, 항생제, 항바이러스제, 또는 뇌 및 다른 차단된 기관으로부터 통상 배제되는 것과 같은 항진균제, 펩타이드 방사성 의약품, 안티센스 약물, 생물학적-활성제에 대한 항체, 약제, 염료, 마커 및 항암제를 포함한다.

본 발명의 이러한 요지 및 다른 요지는 하기 도면 및 상세한 설명을 참조하여 더욱 잘 이해할 수 있다.

도 1은 항-에리트로포이에틴 항체로 염색된 얇은 박편에서, 정상적인 인간의 뇌에서의 에리트로포이에틴 수용체의 분포를 도시한다.

도 2는 도 1의 고배율 확대도이다.

도 3은 금-라벨링된 2차 항체를 사용한, 에리트로포이에틴 수용체의 한외현 미경에 의한 분포를 도시한다.

도 4는 도 3과 유사하게 제작되었으며, 인간의 뇌 모세혈관의 관 표면 및 항-관 표면에서의 고밀도 에리트로포이에틴 수용체를 도시한다.

도 5는 뇌척수액 내로의 비경구-투여된 에리트로포이에틴의 이동을 도시한다.

도 6A 및 도 6B는 K45D 및 S100E 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용한, 에리트로포이에틴 및 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 SK-N-SH 신경할구 세포 신경보호 분석(로테논에 대해) 결과를 나타낸다. 그래프에서 y-축은 흡광도 측정치를 나타내고, 데이터는 2회 측정시의 평균±범위이다. 도 6A의 그래프는 K45D 및 S100E 샘플 내에서 세포의 생존이 유지됨을 명백히 보여주어, 이들의 세포 보호 효과를 입증한다. 도 6B는 hEPO-6×HisTag-PCiNeo의 플라스미드 맵(map)을 보여준다.

도 7은 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 비교한다.

도 8은 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 비교하는 다른 실험이다.

도 9는 래트의 국소성 대뇌 허혈 모델에서의 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 보호능을 도시한다.

도 10은 허혈성 발작 모델에서 중대뇌 동맥 폐색시 인간의 에리트로포이에틴 및 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴의 효능을 비교하는 투여량 반응을 도시한 다.

도 11은 P19 분석에서 요오드화된 에리트로포이에틴의 활성을 도시한다.

도 12는 P19 분석에서 바이오틴일화 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 효과를 도시한다.

도 13은 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 페닐글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 에리트로포이에틴의 시험관내 효능과 비교한다.

도 14는 물 중독 시험에서 조직 보호 사이토카인의 효과를 도시한다.

도 15는 에리트로포이에틴에 의한, 이식을 위해 준비된 심장 기능의 유지를 보여준다.

도 16은 일시적인 혈관 폐색 후 에리트로포이에틴에 의해 심근이 허혈 손상을 받지 않도록 보호됨을 보여준다.

도 17A, 도 17B, 도 17C 및 도 17D는 래트 녹내장 모델에서 에리트로포이에틴 치료의 효과를 보여준다.

도 18은 래트 녹내장 모델에서 에리트로포이에틴에 의한 망막 기능 보존 정도를 도시한다.

도 19는 외상을 입은지 5일 후에 시작되는 에리트로포이에틴의 투여에 의한, 뇌 외상 후 인지 기능의 회복을 도시한다.

도 20은 외상을 입은지 30일 후에 시작되는 에리트로포이에틴의 투여에 의한, 뇌 외상 후 인지 기능의 회복을 도시한다.

도 21은 대뇌 독성의 카이네이트(kainate) 모델에서 인간의 무-시알산 에리 트로포이에틴의 효능을 도시한다.

도 22는 래트 척수 손상 모델에서 조직 보호 사이토카인의 효능을 도시한다.

도 23은 래빗 척수 손상 모델 내에서 조직 보호 사이토카인의 효능을 도시한다.

도 24A, 도 24B 및 도 24C는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.

도 25A, 도 25B 및 도 25C는 GFAP 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 전방 피질의 관상 박편을 도시한다.

도 26A 및 도 26B는 OX-42 항체에 의해 염색된 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.

도 27A 및 도 27B는 OX-42 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.

도 28은 EAE 모델에서 염증에 대한 에리트로포이에틴의 효능을 도시한다.

도 29는 EAE 모델에서 염증에 대한 덱사메타손의 효과와 에리트로포이에틴의 효과를 비교한다.

도 30A 및 도 30B는 에리트로포이에틴이 신경세포 사멸에 관련된 염증을 억제함을 보여준다.

도 31은 인간의 에리트로포이에틴 및 재조합 조직 보호 사이토카인 R130E 및 R150E가 NMDA 처리 전 1차 해마 신경 세포 배양액에 첨가될 때 NMDA에 의해 유도되는 세포 사멸을 효과적으로 감소시킴을 보여준다. R103E(5nM)로 처리된 세포는 비 히클 대조용 세포(p=0.01)에 비해 상당히 적은 세포 사멸을 나타내었다. R103E(5nM)로 처리된 세포는 비히클 대조용 세포(p=0.01)에 비해 격감된 세포 사멸을 나타내었다. R150E(5nM)로 처리된 세포는 용매 대조용 세포(p=0.001)에 비해 약 20%의 세포 사멸 감소를 나타내었다. (Statistics: ANOVA plus Tukey's post-hoc test).

도 32는 P19 세포에서 혈청 회수로부터의 신경세포 보호를 보여준다. Epo, EpoWT 및 재조합 조직 보호 사이토카인 S100E로 전처리된 세포의 경우에는 세포자멸사하는 세포의 백분율이 감소되었다. Epo로 처리된 세포는 처리되지 않은 대조용 세포와 비교하여 세포자멸사하는 세포 사멸이 약 20% 감소되었다. EpoWT 및 S100E 둘 다로 처리된 세포는 처리되지 않은 대조용 세포와 비교하여 세포자멸사하는 세포 사멸의 약 10% 감소를 나타내었다.

도 33A 및 도 33B는 2회의 독립적인 실험에서 NGF 회수된 분화된 PC12 세포에서 S100E로 미리 배양한 효과를 도시한다. 분화된 PC12 세포를 소정 농도의 S100E로 24시간동안 전처리하였다(도 33A(3pM) 및 도 33B(0.00003pM-3pM)). MTT 분석에서 생존을 측정하였다. 양성 대조용으로서 NGF(100ng/ml)를 사용하고, NGF-비함유 매질(-NGF)을 음성 대조용으로서 사용하였다. 도 33에 제시된 데이터는 양성 대조용(+NGF)의 % 생존으로서 표현된다(두 실험에서 n=8). 일방적인 ANOVA 및 Bonferroni post-hoc 시험을 이용함으로써 음성 대조용 세포(-NGF)와 비교한 S100E 처리된 세포의 생존에서 통계학적으로 유의한 증가가 있다. ^***p<0.001, ^*p<0.05. S100E를 사용하여 관찰된 효과는 역가 및 효능 면에서 이 시험 시스템에서의 Epo의 효과와 유사하였다.

도 34A, 도 34B 및 도 34C는 NGF 회수된 분화된 PC12 세포에서 Epo로 예비 배양한 효과를 도시한다. 분화된 PC12 세포를 Epo, S100E 또는 카밤일화된 Epo(30pM-30nM)로 24시간동안 전처리하였다. 화학적으로 개질된 Epo 분자 AA24496은 UT-7 세포 분석에서 EPO보다 10000배 더 낮은 활성을 갖는다. MTT 분석에서 생존을 측정하였다. NGF(100ng/ml)를 양성 대조용으로서 사용하고, NGF-비함유 매질(-NGF)을 음성 대조용으로서 사용하였다.

도 35는 UT-7 세포에서 Epo, K45D 및 S100E의 농도-반응 곡선을 도시한다. 상이한 농도의 Epo, EpoWT, K45D 및 S100E를 UT-7 세포에 첨가하였다. 48시간 후에 WST-1 분석에서 생존을 측정하였다. 데이터는 각각 2회씩 수행된 3가지 다른 실험에서의 평균±SD이다. 곡선은 비선형 회귀 곡선 핏(fit)이다.

도 36은 UT-7 세포에서의 Epo, R103E 및 R150E의 투여량 반응 곡선을 도시한다. 상이한 농도의 Epo, EpoWT, R103E 및 R150E를 UT-7 세포에 첨가하였다. 48 시간 후에 WST-1 분석에서 생존을 측정하였다. 데이터는 각각 2회씩 수행된 3가지 다른 실험의 평균±SD이다. 곡선은 비선형 회귀 곡선 핏이다.

도 37은 42시간에 걸쳐 척수 외상으로부터 회복되는 래트의 운동 등급을 보여주는 그래프이다. 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, S100E가 투여된 래트는 더욱 용이하게 손상으로부터 회복되었으며, 대조용 래트 및 메틸프레드니솔론이 투여된 래트보다 더욱 우수한 전반적인 회복을 보여주었다.

도 38은 다양한 치료 계획에서 정상 눈 잠복기에 대한 손상된 눈 잠복기의 비를 도시한다. EPO로 처리된 래트는 1.2의 잠복기를 나타내었으며, 이는 염수로 치료된 래트보다 더 우수하다. 4가지 재조합 조직 보호 사이토카인 각각은 EPO와 동일하거나 그보다 더 우수한 잠복기 결과를 나타내었으며, R103E, R150E 및 S100E는 EPO에 비해 통계학상의 개선을 보여주었다.

본 발명은 뮤테인 재조합 조직 보호 사이토카인에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 코딩하는 단리된 핵산, 및 단리된 세포 및/또는 재조합 세포 및 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않고, 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 갖는 뮤테인 재조합 조직 보호 사이토카인의 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 포유동물 신체로부터 단리된 세포, 조직 또는 기관의 생존을 보호, 유지 또는 향상시키는 방법, 및 질환 및 질병의 치료 및 예방에서의 이들 뮤테인의 용도를 포함한다.

"응답 세포"는 에리트로포이에틴에 노출됨으로써 그의 기능 또는 생존이 유 지, 촉진, 향상, 재생 또는 다른 방식으로 유리해질 수 있는 포유동물 세포를 일컫는다. 이러한 세포의 비제한적인 예는 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 및 자궁내막 세포를 포함한다. 특히, 응답 세포는 신경 세포; 퍼킨지 세포; 망막 세포; 광수용체(막대 및 원뿔) 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포; 근육 세포; 심장 세포; 심근세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포 및 결합 조직 세포(방실결절, 방실 다발); 폐 세포; 간 세포; 간세포, 별세포 및 쿠퍼 세포; 신장 세포; 혈관사이 세포, 신장 상피 세포, 및 요세관 사이질 세포; 소장 세포; 술잔 세포, 창자샘(움) 세포 및 소화관 내분비 세포; 부신피질 세포; 사구체 세포, 다발 세포 및 그물 세포; 부신수질 세포; 크롬 친화 세포; 모세혈관 세포; 혈관주위세포; 고환 세포; 레이디히 세포, 서톨리 세포 및 정자 세포 및 이들의 전구체; 난소 세포; 그라피안 난포 세포 및 원시 난포 세포; 췌장 세포; 랑게르한스섬, α-세포, β-세포, γ-세포, F-세포; 골 세포; 골원세포, 파골세포 및 조골세포; 피부 세포; 자궁내막 세포; 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포; 및 상기 나열된 기관에 존재하는 줄기 세포 및 내피 세포를 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 응답 세포 및 재조합 조직 보호 사이토카인에 의해 이들에게 주어지는 이점은, 직접 응답성이지는 않은 다른 세포 또는 이러한 응답세포가 아닌 세포를 함유하는 조직 또는 기관을 간접적으로 보호 또는 향상시키도록 확장될 수 있다. 응답 세포의 향상에 의해 간접적으로 이점을 갖는 이들 다른 세포, 조직 또는 기관은 "결합된" 세포, 조직 및 기관으로서 상기 세포, 조직 또는 기관의 일부로 존재한다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인의 이점은 조직 또는 기관의 소수 또는 소량의 응답 세포, 예를 들어 이들 조직에 존재하는 흥분성 조직 또는 신경 조직 또는 테스토스테론을 생성시키는 고환의 레이디히 세포가 존재함으로써 제공될 수 있다. 한 요지에서, 응답 세포 또는 이들에 결합된 세포, 조직 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나, 또는 흥분성 세포 또는 조직을 주로 포함하지 않는다.

본 발명의 방법은 매우 다양한 정상적인 조건 및 불리한 조건 하에서 포유동물 신체 내의 세포, 조직 및 기관을 국부적으로 또는 전신적으로 보호 또는 향상시키거나, 또는 다른 포유동물 신체에 이식하기로 예정된 세포, 조직 및 기관을 보호한다. 또한, 기능장애를 회복 또는 재생시킬 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, 치밀 내피 세포 장벽을 가로지르고 혈관에서 먼 응답 세포(및 다른 유형의 세포)에 긍정적인 효과를 나타내도록 하는 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인의 능력으로 인해, 인간을 비롯한 동물에 상당한 세포 및 조직 손상을 야기하게 되는 다양한 증상 및 질환을 예방 및 치료할 수 있는 가능성이 생기고, 더욱이 전통적으로 위험이 이점보다 커서 이전에는 시도할 수 없었던 수술 절차가 성공할 수 있게 되었다. 높은 투여량의 화학요법, 방사선 요법, 장기간의 생체외 이식 생존 및 장기간의 수술로 인해 유도되는 허혈과 같은, 궁극적으로 이점을 달성하기 위해 유도되는 소정 지속기간 및 소정 정도의 의도적인 불리한 조건이 본원 발명의 이점을 취함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이로 한정되는 것은 아니며, 하나의 요지로서 내피-세포 장벽 또는 내피의 치밀 이음부로 인해 표적 응답 세포가 혈관으로부터 먼 방법 또는 조성물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명은 재조합 조직 보호 사이토카인에 노출됨으로써 이점을 취할 수 있는 임의의 응답 세포 및 결합된 세포, 조직 및 기관에 관한 것이다. 또한, 단기간의 불리한 사건(예컨대, 외상) 후 재조합 조직 보호 사이토카인에 노출시킴으로써 세포, 조직 또는 기관 기능장애를 회복 또는 재생시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 일반적으로 세포 기능을 유지, 촉진, 향상, 재생 또는 다른 방식으로 세포 기능에 유리하게 작용하는 전술한 목적을 위한 약학 조성물을 제조하기 위한, 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인 효과량을 포유동물에게 투여함으로써 세포 기능을 유지, 향상, 촉진 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 조직 보호 사이토카인에 세포, 조직 또는 기관을 노출시킴으로써 생체 외에서 세포 기능을 유지, 촉진, 향상 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기관 또는 조직 보존에 사용하기 위한, 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 관류 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다양한 방법은 포유동물 신체 내의 또는 포유동물 신체로부터 제거된 응답 세포에 긍정적인 효과 또는 이점을 주기 위하여 적어도 재조합 조직 보호 사이토카인을 효과적인 양으로 포함하는 약학 조성물을 특정 경로 및 노출 지속기간으로 이용한다. 치료하고자 하는 표적 세포, 조직 또는 기관이, 재조합 조직 보호 사이토카인이 내피 세포 장벽을 가로질러야 할 것으로 요구하는 경우, 약학 조성물은 내피 세포 장벽을 가로지른 후 응답 세포에 그의 목적하는 효과를 줄 수 있는 농도로 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 에리트로포이에틴 수용체와 상호작용할 수 있고 세포 내에서 세포 보호 활성을 조절할 수 있는 분자가 본 발명에서 유용하다.

5.1. 본 발명의 핵산

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 핵산 분자는 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않거나 이들 활성이 감소된 에리트로포이에틴 뮤테인을 포함하고, 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 갖는 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 포함하는 핵산 분자는 상기 기재된 활성을 갖고, 서열 번호: 10의 위치 11 내지 15 사이에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 1], 서열 번호: 10의 위치 44 내지 51 사이에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 2], 서열 번호: 10의 위치 100 내지 108 사이에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 3] 또는 서열 번호: 10의 위치 146 내지 151 사이에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하는[서열 번호: 4] 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 포함하는 핵산 분자는 서열 번호: 10의 위치 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 또는 161중 하나 이 상에 변화된 아미노산 잔기를 포함하는, 상기 기재된 활성을 갖는 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 포함하는 핵산 분자는 하기 변화중 하나 이상을 갖는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 기재된 활성을 갖는 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 핵산을 포함한다: 서열 번호: 10의 잔기 6의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 7의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 7의 세린; 서열번호 10의 잔기 10의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 11의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 12의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 13의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 14의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 14의 글루탐산; 서열 번호: 10의 잔기 14의 글루타민; 서열 번호: 10의 잔기 15의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 15의 페닐알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 15의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 20의 글루탐산; 서열 번호: 10의 잔기 20의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 21의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 24의 리신; 서열 번호: 10의 잔기 29의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 29의 티로신; 서열 번호: 10의 잔기 30의 아스파라긴; 서열 번호: 10의 잔기 32의 트레오닌; 서열 번호: 10의 잔기 33의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 33의 티로신; 서열 번호: 10의 잔기 38의 리신; 서열 번호: 10의 잔기 83의 리신; 서열 번호: 10의 잔기 42의 아스파라긴; 서열 번호: 10의 잔기 42의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 43의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 44의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 45의 아스파트산; 서열 번호: 10의 잔기 45의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 46의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 47의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 48의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 48의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 49의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 49의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 51의 페닐알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 51의 아스파라긴; 서열 번호: 10의 잔기 52의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 59의 아스파라긴; 서열 번호: 10의 잔기 62의 트레오닌; 서열 번호: 10의 잔기 67의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 70의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 96의 아르기닌; 서열 번호: 10의 잔기 97의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 100의 아르기닌; 서열 번호: 10의 잔기 100의 글루탐산; 서열 번호: 10의 잔기 100의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 100의 트레오닌; 서열 번호: 10의 잔기 101의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 101의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 102의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 103의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 103의 글루탐산; 서열 번호: 10의 잔기 104의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 104의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 105의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 106의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 106의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 107의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 107의 류신; 서열 번호: 10의 잔기 108의 리신; 서열 번호: 10의 잔기 108의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 108의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 116의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 126의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 132의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 133의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 134의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 140의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 142의 아이소류신; 서열 번호: 10의 잔기 143의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 146의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 147의 리신; 서열 번호: 10의 잔기 147의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 148의 티로신; 서열 번호: 10의 잔기 148의 알라닌; 서열 번호: 10 의 잔기 149의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 150의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 150의 글루탐산; 서열 번호: 10의 잔기 151의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 152의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 152의 트립토판; 서열 번호: 10의 잔기 153의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 154의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 155의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 158의 알라닌; 서열 번호: 10의 잔기 160의 세린; 서열 번호: 10의 잔기 161의 알라닌; 또는 서열 번호: 10의 잔기 162의 알라닌.

본 발명의 핵산 분자는 상기 기재된 에리트로포이에틴 뮤테인중 하나와 아미노산 서열이 30% 이상, 35% 이상, 40%, 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 동일한 재조합 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 % 동일성을 결정하기 위하여, 최적 비교를 위해 서열을 정렬시킨다(예를 들어, 두번째 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 최적으로 정렬시키기 위하여 제 1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 간격을 도입할 수 있다). 이어, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 첫번째 서열의 위치를 두번째 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 점유하는 경우에는, 이 위치에서 분자는 동일하다. 두 서열 사이의 % 동일성은 서열에서 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성=동일한 중첩 위치의 수/중첩 위치의 총수×100%). 한 실시태양에서, 두 서열은 길이가 동일하다.

본 발명의 핵산 분자는 상기 기재된 치환, 결실 또는 개질중 하나 이상에 의해 변화된 에리트로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열이 서열 번호: 7과 30% 이상, 35% 이상, 40%, 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상의 서열 동일성을 갖는, 재조합 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 상기 기재된 치환, 결실 또는 개질중 하나 이상에 의해 변화된 에리트로포이에틴 코딩 핵산 서열이 비-인간 에리트로포이에틴 코딩 핵산인, 재조합 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

수학적 연산을 이용하여, 두 서열 사이의 % 동일성을 결정할 수 있다. 두 서열을 비교하는데 사용되는 수학적 연산의 바람직한 비제한적인 예는 칼린(Karlin) 및 알츠슐(Altschul)의 연산[1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268](1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서와 같이 변형됨)이다. 이러한 연산은 알츠슐 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다[1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]. NBLAST 프로그램(등급=100, 단어 길이=12)을 사용하여 BLAST 뉴클레오타이드 검색을 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램(등급=50, 단어 길이=3)을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교하기 위하여 간격을 도입한 정렬을 수득하기 위해서는, 알츠슐 등의 문헌[1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재되어 있는 바와 같이 갭드(Gapped) BLAST를 사용할 수 있다. 다르게는, PSI-Blast를 사용하여 분자 사이에서 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다(알츠슐 등의 상기 문헌, 1997). BLAST, 갭드 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 개별 프로그램의 애초 변수(default parameter)(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)를 이용할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열 비교에 사용되는 수학적 연산의 다른 바람직한 비한정적인 예는 마이어스(Myers) 및 밀러(Miller)[1988, CABIOS 4:11-17]의 연산이다. 이 연산은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 웨이트 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 이용할 수 있다.

간격을 허용하거나 허용하지 않고서 상기 기재된 것과 유사한 기법을 이용하여 두 서열 사이의 % 동일성을 결정할 수 있다. % 동일성을 계산함에 있어서는, 전형적으로 정확하게 일치하는 것만 계수한다.

본 발명의 핵산 분자는 (a) 엄격한 조건하에서, 예를 들어 약 45℃에서 6×염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 필터-결합된 DNA와 하이브리드를 형성한 후 약 50 내지 65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세척하거나, 또는 (b) 고도로 엄격한 조건하에서, 예를 들어 약 45℃에서 6×SSC에서 필터-결합된 핵산과 하이브리드 형성한 후 약 68℃에서 0.1×SSC/0.2% SDS에서 1회 이상 세척하거나, 또는 당해 분야의 숙련자에게 숙지되어 있는 다른 하이브리드 형성 조건(예를 들어 오스벨(Ausubel F.M.) 등 편집, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & sons, Inc., 뉴욕, pp. 6.3.1-6.3.6 및 2.10.3 참조)하에서, 상기 기재된 본 발명의 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인 코딩 핵산 서열과 하이브리드 형성하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 (a) 및 (b)에 기재된 조건하에서 하이브리드 형성하는 에리트로포이에틴 뮤테인 코딩 핵산 분자는 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 핵산 분자의 상보물을 포함하는 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조건 (a) 및 (b)하에 하이브리드 형성하는 핵산 분자는 단백질 생성물, 예컨대 에리트로포이에틴 뮤테인에 대해 기능 면에서의 동일한(즉, 상기 기재된 에리트로포이에틴의 활성중 하나 이상을 갖는) 단백질 생성물을 코딩한다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 인간의 핵산이다.

본 발명의 핵산 분자는 추가로 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용(혈관 수축/혈관 팽창), 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 적혈구 조혈 활성을 갖지 않거나 감소된 이들 활성을 나타내며 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 갖는 상기 기재된 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인과 하이브리드 형성하는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 감소는 에리트로포이에틴 활성중 하나가 약간 줄어들거나 또는 이를 거의 갖지 않는 것일 수 있다. 이러한 감소는 당해 분야에 공지되어 있는 표준 기법에 의해 측정될 수 있다(그루버(Gruber) 등[2002, J. Biol Chem., 277(81):27581-27584]; 페 이지(Page) 등[1996, Cytokine 8(1):66-69]; 파크(Park) 등[1997, Mol. Cells 7(6):699-704]; 울프(Wolf) 등[1997, Thromb Haemost 78:1505-1509]; 및 데일(Dale) 등[2002, Nature 415:175-179]). 6.17 부분에 기재되어 있는 UT-7 세포는 감소되거나 줄어든 적혈구 조혈 활성을 측정하는 기법의 한가지 비한정적인 예이다.

본 발명의 핵산 분자는 추가로 상기 기재된 핵산의 상보물을 포함한다.

에리트로포이에틴 뮤테인 핵산 분자의 분절은 길이가 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 1000개 이상, 1050개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드일 수 있는 상기 기재된 에리트로포이에틴 뮤테인 핵산 서열을 일컫는다. 다르게는, 이 분절은 에리트로포이에틴 뮤테인의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 에리트로포이에틴 뮤테인 핵산 분자는 상응하는 에리트로포이에틴 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을 나타내는 유전자 생성물을 코딩한다. 에리트로포이에틴 뮤테인 핵산 분자의 분절은 또한 성숙 에리트로포이에틴 뮤테인의 도메인 또는 성숙 에리트로포이에틴 뮤테인을 코딩하는 에리트로포이에틴 뮤테인 코딩 영역의 일부를 일컫는다.

다른 생물체로부터 유도된 에리트로포이에틴을 사용하여 본 발명의 에리트로 포이에틴 뮤테인을 생성시킬 수 있다. 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인 핵산의 변이체 및 다른 종으로부터의 동족체 및 특이 유전자(ortholog)의 클로닝과 관련하여, 본원에 개시된 단리된 에리트로포이에틴 뮤테인 핵산 서열을 가벨링하고, 이를 사용하여 흥미있는 생물체로부터 유도된 적절한 세포 또는 조직으로부터 수득된 mRNA로부터 제작된 cDNA 라이브러리를 검색할 수 있다. 사용되는 하이브리드 형성 조건은 일반적으로 라벨링된 서열이 유도된 생물체의 유형과 다른 생물체로부터 cDNA 라이브러리가 유도되는 경우 보다 덜 엄격해야 하며, 예컨대 표적 생물체와 기준 생물체의 상대적인 관련성에 기초하여 통상적으로 결정될 수 있다.

다르게는, 다시 적절하게 엄격한 조건하에서, 라벨링된 분절을 사용하여, 흥미있는 생물체로부터 유도되는 게놈 라이브러리를 검색할 수 있다. 적절한 엄격성 조건은 상기 논의된 바와 같이 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 라이브러리 및 라벨링된 서열이 유도되는 특정 생물체에 따라 예측가능하게 변화한다. 이러한 조건과 관련된 지침에 대해서는, 예를 들어 본원에 참고로 인용되어 있는 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Press, N.Y.] 및 오스벨 등의 문헌[1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, N.Y.]을 참조한다.

바람직한 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인을 제조하기 위하여, 관련 재조합 조직 보호 사이토카인 또는 동종 재조합 조직 보호 사이토카인으로부 터 디자인된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 게놈 또는 cDNA(즉, 서열 번호: 7)로부터 DNA를 증폭시킬 수 있다. 선택하기 전에 PCR을 이용하여 DNA 클론 또는 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 목적하는 서열을 증폭시킨다. 예를 들어 열 순환기 및 Taq 폴리머라제(진 앰프(Gene Amp^?))를 사용함으로써 PCR을 수행할 수 있다. 흥미 있는 유전자 또는 유전자 분절을 수득하기 위하여 통상 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한다. 예를 들어, 개방 판독 프레임을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 접하는 PCR 프라이머를 사용하여 임의의 목적하는 길이의 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성시킬 수 있다. 다르게는, 적절한 부위를 이용할 수 있는 경우, 적절한 부위에서 제한 엔도뉴클레아제(들)에 의해 재조합 조직 보호 사이토카인 유전자 서열을 절단하여, 재조합 조직 보호 사이토카인 유전자를 코딩하는 DNA의 분절을 방출시킬 수 있다. 편리한 제한 부위를 입수할 수 없는 경우에는, 당해 분야에 공지되어 있는 부위-유도 변이 발생 및/또는 DNA 증폭 방법에 의해 적절한 위치에서 이들을 생성시킬 수 있다(예컨대, 쉥카라파(Shankarappa) 등, 1992, PCR Method Appl. 1:277-278 참조). 이어, 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 DNA 분절을 단리하고, 적절한 번역 판독 프레임이 유지되도록 주의를 기울이면서 적절한 발현 벡터 내로 결합시킨다.

발현되는 펩타이드 서열의 아미노산(들)을 치환시키거나 또는 추가의 조작을 용이하게 하기 위해 제한 부위를 생성/결실시키기 위한 목적으로, 당해 분야에 공 지되어 있는 임의의 변이 발생 기법을 이용하여 DNA 서열의 개별 뉴클레오타이드를 변화시킬 수 있다. 이러한 기법은 화학적 변이 발생, 시험관내 부위-유도 변이 발생(헛친슨(Hutchinson) 등, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), 올리고뉴클레오타이드-유도 변이 발생(스미스(Smith), 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; 힐(Hill) 등, 1987, Methods Enzymol. 155:558-568), 및 6.3 부분에 기재되어 있는 바와 같이 PCR-기초한 중첩 확장(호(Ho) 등, 1989, Gene 77:51-59), PCR-기초한 메가프라이머 변이 발생(사커(Sarkar) 등, 1990, Biotechniques 8:404-407) 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들어 이중 가닥 다이데옥시뉴클레오타이드 DNA 서열 결정에 의해 개질을 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 앞 단락의 뉴클레오타이드 서열의 상보물인 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 이종(예컨대, 벡터, 발현 벡터 또는 융합 단백질) 서열을 함유하거나 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자의 일부로서 존재한다.

5.2. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈 활성을 일부 또는 전부 유지하는 에리트로포이에틴 뮤테인을 포함한다. 에리트로포이에틴은 인간에 있어서 분자량이 약 34kDa인 당단백 호르몬이다. 성숙 단백질은 165개의 아미노산을 포함하고, 글라이코실 잔기가 분자의 약 40중량%를 구성한다. 본 발명을 실행하는데 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인의 형태는 하기 인간 및 다른 포유동물의 에리트로포이에틴-관련 분자의 천연, 합성 및 재조합 형태에서의 하나 이상의 아미노산 변화를 포함한다: 에리트로포이에틴, 무-시알산 에리트로포이에틴, 탈당화 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 유사체, 에리트로포이에틴 의사 화합물, 에리트로포이에틴 분절, 혼성(hybrid) 에리트로포이에틴 분자, 에리트로포이에틴 수용체-결합 분자, 에리트로포이에틴 작용제, 신장 에리트로포이에틴, 뇌 에리트로포이에틴, 이들의 올리고머, 이들의 다합체 및 이들의 동류물. 이러한 등가의 재조합 조직 보호 사이토카인은 변이 에리트로포이에틴을 포함하는데, 이는 치환, 내부 결실을 비롯한 결실, 융합 단백질을 생성시키는 첨가를 비롯한 첨가, 또는 아미노산 서열 내의 및/또는 아미노산 서열에 인접한 아미노산 잔기의 보수적인 치환을 함유할 수 있지만, 이러한 변화가 기능면에서 동일한 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시킨다는 점에서 "표시나지 않는" 변화를 야기한다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈성이 아니다(즉, 적혈구 조혈 활성을 갖지 않거나 감소된 활성을 나타낸다). 보수적인 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 다르게는, 보수적이지 않은 아미노산 변화 및 보다 큰 삽입 및 결실을 이용하여 기능면에서 변화된 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시킬 수 있다. 이러한 변이체는 에리트로포이에틴 특성을 목적하는 방식으로 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명을 실행하는데 유용한 에리트로포이에틴은 수용체 결합에 영향을 끼치는 에리트로포이에틴의 네가지 기능 도메인(VLQRY(서열 번호: 1) 및/또는 TKVNFYAW(서열 번호: 2) 및/또는 SGLRSLTTL(서열 번호: 3) 및/또는 SNFLRG(서열 번호: 4)) 내의 아미노산을 하나 이상 변화시킨 재조합 조직 보호 사이토카인일 수 있다. 다른 실시태양에서는, 분자의 동역학 또는 수용체-결합 특성에 영향을 끼치는 분자의 주변 영역에서의 변이를 함유하는 에리트로포이에틴을 사용할 수 있다. 표준 방법을 이용하여, 어느 변화가 또는 도메인의 어느 위치가 결합에 참여하는지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 쌍 방식의 알라닌 변이(ala-주사 변이 발생)에 의해 도메인을 변화시킨 후 변이체의 결합 동역학을 측정함으로써 수용체로의 결합에 대한 효과를 조사할 수 있다(버냇(Bernat) 등, 2003, PNAS 100:952-957; 웰즈(Wells) 등, 1989, Science 244:1081-1085).

용어 "재조합 조직 보호 사이토카인" 및 "하나의 재조합 조직 보호 사이토카인"은 호환적으로 또는 결합하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 및 재조합 조직 보호 사이토카인의 탈당화, 시알산 잔기 제거, 및 다른 부분 당화된 형태, 또는 아미노산의 화학적 개질 같은 그의 개질체를 포함한다. 이러한 변형체의 비제한적인 예는 본원에 참고로 인용되어 있는 쓰다(Tsuda) 등의 문헌[1990, Eur. J. Biochem. 188:405-411]에 기재되어 있다. 사이토카인은 매우 유연성이 있으며, 인간 성장 호르몬의 경우 활성화에 유연성이 필요한 것으로 공지되어 있다(웰즈 등, 1989, Science 244:1081-1085). 따라서, 사이토카인의 3차원 구조를 안정화시켜 에리트로포이에틴 수용체의 통상적인 활성화를 방지하는 변이가 본 발명에 포함된다. 또한, 세균, 효모, 곤충, 식물 및 인간을 비롯한 포유동물의 세포 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 다양한 숙주 시스템을 재조합 조직 보호 사이토카인의 발현 및 제조에 이용할 수 있다. 예를 들어, 생성물을 당화시키거나 시알릴화시키지 않는 세균 내에서 생성된 재조합 에리트로포이에틴을 사용하여 재조합 조직 보호 사이토카인의 당화되지 않은 형태를 생성시킬 수 있거나, 또는 단백질의 당화를 조정하기 위해 푸코실화를 이용하는 기법(미국 특허원 제 2003/0040037 A1 호 및 제 2003/0003529 호에 기재되어 있음) 같은(이들로 한정되지는 않음) 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 추가로 당화시킬 수 있다. 다르게는, 발현된 단백질을 당화시킬 수 있는 다른 시스템(예: 인간 세포를 포함하는 식물) 내에서 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시킬 수도 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 본원의 발명은 에리트로포이에틴과 분자의 임의의 구조적 관계에 상관없이 응답 세포에 대해 긍정적인 작용을 나타낼 수 있는 임의의 모든 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절제 분자를 포함한다.

또한, 재조합 조직 보호 사이토카인은 특정 조직 또는 조직들에 대한 그의 활성을 맞추도록 개질될 수 있다. 이러한 바람직한 조직 특이성을 달성하기 위해 수행될 수 있는 몇가지 비제한적인 방법은 순환 반감기를 단축시켜 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 전구체와 반응할 수 있는 시간을 감소시키는 개질, 또는 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인 분자의 주요 구조의 개질을 포함한다. 순환 반감기를 단축시키는 한 가지 방법은 에리트로포이에틴이 3개의 N-결합 및 1개의 O-결합을 갖는 당화 잔기를 제거하거나 개질시키는 것이다. 당화된 재조합 조직 보호 사이토카인의 이러한 변형체는 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 에리트로포이에틴의 주요 구조를 변화시켜 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 생성시키는 기법은 무수히 많으며, 하나 이상의 특정 아미노산의 치환(즉, N-결합 또는 O-결합된 당화 부위에서의 아미노산의 변이에 의해) 및/또는 아미노산의 화학적 개질, 또는 임의의 수용체와 에리트로포이에틴의 반응을 방해하는 다른 구조의 첨가를 포함한다. 재조합 조직 보호 사이토카인의 이러한 형태의 사용은 본원에 완전히 포함된다. 시알산을 당 쇄에 연결하는 화학적 결합에 따라 특이적인 시알리다제에 의해 당 쇄의 말단을 종결짓는 시알산을 제거할 수 있다. 다르게는, 특이적인 결합에서 절단시키는 다른 효소를 사용함으로써 상이한 방식으로 당화된 구조를 제거할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 본 발명의 적혈구 조혈성이 아닌 재조합 조직 보호 사이토카인의 반감기를 천연 에리트로포이에틴의 반감기에서 약 90%만큼 감소시킨다.

이러한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자중 일부는 다른 조직 또는 기관에서 에리트로포이에틴 자체의 작용을 모방한다. 예를 들어, 천연 에리트로포이에틴의 31 내지 47번째 아미노산 서열을 함유하는 17량체는 적혈구 생성에는 불활성이지만 시험관 내에서 신경세포에 대해서는 매우 활성이다(캠파나(Campana) & 오브라이언(O'Brien), 1998: Int. J. Mol. Med. 1:235-41).

또한, 구아니딘화, 아미드화, 카밤일화(카밤오일화), 트라이나이트로페닐화, 아세틸화 같은 아실화, 석신일화, 질화에 의해; 또는 제한된 단백질 분해, 아미노기의 제거 및/또는 분자생물학적 기법에 의한 아르기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기의 변이 치환과 같은 다른 절차 중에서도, 아르기닌, 아스파트산, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기 또는 카복실기의 개질에 의해, 특정 기관 및 조직에 대해 적절한 수준의 활성을 유지하지만 적혈구와 같은 다른 조직에 대해서는 그렇지 않은 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시킴으로써, 본원에 기재된 용도에 바람직한 재조합 조직 보호 사이토카인 유도체 분자를 제조할 수 있다(예컨대 사타케(Satake) 등; 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9; 본원에 참고로 인용됨). 아래에 기재되는 한 가지 비한정적인 예는 페닐글라이옥살과 같은 글라이옥살과 반응시킴으로써 에리트로포이에틴의 아르기닌 잔기를 개질시키는 것이다(다카하시(Takahashi)의 문헌[1977, J. Biochem. 81:395-402]에 따름). 아래에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자는 에리트로포이에틴의 향신경성 효과를 완전히 보유한다. 이러한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자는 본원에 기재된 다양한 용도 및 조성물에 포함된다. 또한, 이러한 화학적 개질을 추가로 이용하여 재조합 조직 보호 사이토카인의 보호 효과를 향상시키거나 또는 천연 에리트로포이에틴의 아미노산 변이로부터 생성된 분자의 전하에서의 임의의 변화를 중화시킬 수 있다. 이러한 개질은 모두 본원에 참고로 인용되어 있는 동시 계류중인 하기 출원에 기재되어 있다: 2001년 12월 28일자로 출원된 제 PCT/US01/49479 호; 2000년 12월 29일자로 출원된 제 09/753,132 호; 및 2002년 7월 3일자로 출원된 사건 번호 KW00-009C02-US.

뇌 에리트로포이에틴 및 신장 에리트로포이에틴, 포유동물의 에리트로포이에틴의 재조합 형태, 및 그의 천연, 암-유도된 및 재조합 이소폼(예: 재조합 기법에 의해 발현된 분자 및 동종 재조합에 의해 제조된 분자)과 같은 합성 및 재조합 분자가 본원에 제공된다. 또한, 본 발명은 에리트로포이에틴 수용체를 결합시키는 펩타이드를 포함하는 분자, 및 에리트로포이에틴의 구조적 및/또는 생물학적 특성을 일부 또는 모두 갖는 재조합 구조물 또는 다른 분자(에리트로포이에틴의 분절 및 다합체 또는 그의 분절 포함)를 포함한다. 당화 부위의 수가 증가되거나 감소된 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인이 본원에 포함된다. 상기 지적한 바와 같이, 용어 "에리트로포이에틴" 및 "의사 화합물" 및 다른 용어는 본원에서 에리트로포이에틴에 관련된 응답 세포를 보호하고 향상시키는 분자 및 내피 세포 장벽을 가로지를 수 있는 분자를 나타내기 위해 호환적으로 사용된다. 또한, 유전자 이전 동물에 의해 생성된 분자도 본원에 포함된다. 본원에 포함되는 에리트로포이에틴 분자는, 본원에 기재되는 바와 같은 에리트로포이에틴 수용체와 반응하는 능력 또는 에리트로포이에틴 수용체 활성을 변조하는 능력 또는 에리트로포이에틴-활성화되는 일련의 신호화 반응을 활성화시키는 능력을 제외하고는, 구조적으로 또는 임의의 다른 방식으로 반드시 에리트로포이에틴과 유사해야 하는 것은 아니다.

비제한적인 예로서, 본 발명을 실행하는데 유용한 재조합 조직 보호 사이토 카인의 형태는 미국 특허 제 5,457,089 호 및 제 4,835,260 호에 기재된, 카복시 말단에 변경된 아미노산을 갖는 것; 무-시알산 에리트로포이에틴 및 미국 특허 제 5,856,298 호에 기재되어 있는 것과 같은 분자 1개당 다양한 수의 시알산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴 이소폼; 미국 특허 제 4,703,008 호에 기재되어 있는 폴리펩타이드; 미국 특허 제 5,767,078 호에 기재되어 있는 작용제; 미국 특허 제 5,773,569 호 및 제 5,830,851 호에 기재되어 있는, 에리트로포이에틴 수용체에 결합하는 펩타이드; 미국 특허 제 5,835,382 호에 기재되어 있는 것과 같은 에리트로포이에틴 수용체를 활성화시키는 작은-분자 의사 화합물; 및 WO 9505465 호, WO 9718318 호 및 WO 9818926 호에 기재되어 있는 에리트로포이에틴 유사체 등의, 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 상기 인용된 것들은 모두, 이들 개시된 것들이 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 다양한 대체 형태 또는 이들 형태를 제조하는 방법을 나타내는 한도 내에서, 본원에 인용되어 있다.

에리트로포이에틴은 뉴저지주 래리턴 소재의 오르토 바이오테크 인코포레이티드(Ortho Biotech Inc.)에서 상표명 프로크릿(PROCRIT)으로, 또한 캘리포니아주 싸우전드 오크스 소재의 암젠, 인코포레이티드(Amgen, Inc.)에서 상표명 에포젠(EPOGEN)으로 구입할 수 있다.

에리트로포이에틴(EPO) 및 에리트로포이에틴-유사 분자의 활성(U)은 전통적으로 설치류 모델에서 적혈구 생산을 촉진시키는 그의 효율에 기초하여(또한 에리트로포이에틴의 국제 기준에 의해 유도된 바와 같이) 정의된다. 정상적인 에리트로포이에틴(MW ∼30,000 내지 34,000) 1단위(U)는 단백질 ∼8ng이다(1mg 단백질은 약 125,000U이다). 그러나, 적혈구 조혈에 대한 효과가 본원에서 목적하는 활성에 부수적으로 일어나고 반드시 본 발명의 특정 재조합 조직 보호 사이토카인의 검출가능한 특성이 아닐 수도 있기 때문에, 적혈구 조혈 활성에 기초한 활성 정의는 적절하지 않다. 따라서, 본원에서는, 동일한 시스템에서 WHO 국제 기준 에리트로포이에틴에 의해 도출된 것과 같이, 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴-관련 분자의 활성 단위는 신경 세포 시스템 또는 다른 응답 세포 시스템에서 동일한 활성을 이끌어내는데 필요한 단백질의 양으로서 정의된다. 당해 분야의 숙련자는 본원에 기재된 지침에 따라 적혈구 조혈성이 아닌 재조합 조직 보호 사이토카인 또는 관련 분자의 단위를 용이하게 결정한다.

재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 6.3 부분에 기재되어 있는 에리트로포이에틴 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질 및 폴리펩타이드를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명은 6.3 부분에 기재된 에리트로포이에틴 유전자 생성물과 기능 면에서 동일한 뮤테인을 포함한다. 이러한 에리트로포이에틴 유전자 생성물은 에리트로포이에틴 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 내의 에리트로포이에틴 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실, 첨가 또는 치환(그러나, 이들은 표시나지 않는 변화를 야기시킴)을 포함하여, 기능 면에서 동일한 에리트로포이에틴 유전자 생성물을 생성시킬 수 있다. 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 변이 발생, 예컨대 별도 지점 변이 또는 말단 절단(truncation)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 천연 발생 형태의 세포 보호 생물학적 활성을 보유하지만, 단백질의 천연 발생 형태의 적혈구 조혈 활성중 하나 이상은 갖지 않을 수 있다. 따라서, 제한된 기능의 뮤테인을 첨가함으로써, 특이적인 생물학적 효과를 유도해낼 수 있다.

재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인의 구조 변화는 효능, 안정성 또는 번역후 변화(예컨대, 뮤테인의 포스포릴화 패턴 변화)를 향상시키기 위한 목적일 수 있다. 단백질의 천연 발생 형태의 하나 이상의 세포 보호 활성을 보유하거나 그의 특이적인 길항제를 형성시키도록 디자인되는 경우, 이러한 변화된 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인과 기능 면에서 동일하다고 생각된다. 이러한 변화된 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 예컨대 아미노산 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성될 수 있다.

예를 들어, 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루탐에이트로, 트레오닌을 세린으로 단독 대체시킬 것을 고려하는 것이 합당하거나, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사하게 대체시키면(즉, 등입체 및/또는 등전 변이), 생성된 분자의 생물학적 활성에 큰 효과를 갖지 않는다.

재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인의 아미노산 서열의 변화가 기능적 동족체를 생성시키는지 또는 비-동족체를 생성시키는지(즉, 변이되지 않은 사이토카인의 활성중 하나 이상을 갖지 않음)의 여부는, 야생형 사이토카인과 유사한 방식으로 세포에서 반응을 불러일크기거나 이러한 반응을 경쟁적으로 억제하는 변형 뮤테인의 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 하나 보다 많이 대체시킨 재 조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 동일한 방식으로 용이하게 시험할 수 있다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 변이체(예컨대, 말단 절단 변이체)의 조합 라이브러리를 목적하는 활성 또는 그의 결여에 대해 검색함으로써, 변화된 기능을 나타내는 본 발명의 뮤테인을 확인할 수 있다. 한 실시태양에서는, 핵산 수준에서의 조합 변이 발생에 의해 변형체의 변화된 라이브러리를 생성시키고, 변화된 유전자 라이브러리에 의해 상기 변형체를 코딩한다. 예를 들어, 가능한 단백질 서열의 변성 세트가 개별 폴리펩타이드로서 또는 다르게는 보다 큰 융합 단백질 세트로서(예컨대, 파지 표시를 위해) 발현될 수 있도록 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 효소에 의해 연결시켜 핵산 서열을 생성시킴으로써, 변이체의 변화된 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 변성 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 가능한 변형체의 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있는 방법이 다수 있다. 변성 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 나랑(Narang)의 문헌[1993, Tetrahedron 39:3]; 이타쿠라(Itakura) 등의 문헌[1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323]; 이타쿠라 등의 문헌[1984, Science 198:1056]; 이케(Ike) 등의 문헌[1983, Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).

또한, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 코딩 서열의 분절의 라이브러리를 사용하여, 뮤테인의 검색 및 후속 선택을 위해 재조합 조직 보호 사이토카인의 변화된 군을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 분자당 약 1회만 틈내기가 이루어지는 조건하에서 흥미 있는 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 분절을 뉴클레아제로 처 리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 복성(renaturing)시켜 상이한 틈 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 생성시킨 다음, S1 뉴클레아제로 처리함으로써 개질된 이중 가닥으로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 분절 라이브러리를 연결하여 발현 벡터를 생성시킴으로써, 코딩 서열 분절의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이 방법에 의해, 흥미 있는 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인의 다양한 크기의 N-말단 분절 및 내부 분절을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도해낼 수 있다.

지점 변이 또는 말단 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 검색하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대해 cDNA 라이브러리를 검색하기 위한 몇 가지 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 높은 처리량 분석이 가능한, 큰 유전자 라이브를 검색하기 위해 가장 널리 사용되는 기법은 전형적으로, 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터의 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시킨 다음, 목적하는 활성의 결실이 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시킴을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 변이체의 빈도를 향상시키는 기법인 반복적인 동시 변이 발생(REM)을 검색 분석과 함께 이용하여, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 뮤테인을 확인할 수 있다(아킨(Arkin) 및 유반(Yourvan)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815]; 델그레이브(Delgrave) 등의 문헌[1993, Protein Engineering 6(3):327-331]).

하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 코딩된 재조합 조직 보호 사 이토카인 내로 도입되도록, 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 에리트로포이에틴 뉴클레오타이드 서열 내로 도입함으로써, 뮤테인을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 생성시킬 수 있다. 부위-유도 변이 발생 및 PCR-매개된 변이 발생 같은 표준 기법에 의해 변이를 도입할 수 있다. 간단히, 변화되어야 하는 아미노산의 3개 뉴클레오타이드 코돈을 삭제하고 이를 포함되어야 하는 아미노산의 3개 뉴클레오타이드 코돈으로 교체하는 PCR 프라이머를 디자인한다. 흥미 있는 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 DNA의 PCR 증폭에 이 프라이머를 사용한다. 이어, 이 분절을 단리하고, 흥미 있는 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 전체 길이의 cDNA 내로 삽입한 후 재조합형으로 발현시킨다. 이제, 생성된 재조합 조직 보호 사이토카인의 아미노산은 대체되었다.

하나 이상의 아미노산 잔기에서 보수적이거나 보수적이지 않은 아미노산 치환을 이룰 수 있다. 보수적인 치환과 보수적이지 않은 치환을 둘 다 이룰 수도 있다. 보수적인 대체는 측쇄 면에서 관련된 아미노산 부류 내에서 이루어진다. 유전자에 코딩되는 아미노산은 4가지 부류로 나뉘어질 수 있다: (1) 산성=아스파테이트, 글루탐에이트; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성=알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; (4) 하전되지 않은 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 유사한 방식으로, 아미노산 목록을 다음과 같이 나눌 수도 있다: (1) 산성=아스파테이트, 글루탐에이트; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘, (3) 지방족=글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌(세린과 트레오닌은 임의적으로 별 도의 지방족-하이드록실 군으로 나뉘어질 수도 있음); (4) 방향족=페닐알라닌, 티로신, 트립토판; (5) 아마이드=아스파라긴, 글루타민; (6) 황-함유=시스테인 및 메티오닌(예컨대, 문헌[Biochemistry, 제4판, 스트라이어 편집, WH Freeman and Co.: 1995] 참조).

다르게는, 예컨대 포화 변이 발생에 의해 재조합 조직 보호 사이토카인의 코딩 서열 전체 또는 일부를 따라 무작위적으로 변이를 도입할 수 있으며, 생성된 변이체를 생물학적 활성에 대해 선별함으로써 활성을 보유하는 변이체를 확인할 수 있다. 변이 발생 후, 코딩된 단백질을 재조합형으로 발현시킬 수 있고, 재조합 조직 보호 사이토카인의 활성을 결정할 수 있다.

본원에 유용한 상기 언급된 에리트로포이에틴 개질에 덧붙여, 아래에서는 본 발명의 다양한 재조합 조직 보호 사이토카인으로 논의를 확장시킨다. 상기 언급된 엘리엇 등, 보이셀 등 및 웬 등의 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 에리트로포이에틴 뮤테인이 본원에 기재된 목적에 유용하며, 본원의 방법을 위한 약학 조성물에 제공될 수 있다. 본원 전체에서 사용된 뮤테인 명명법에서는, 먼저 천연 아미노산의 한 글자 코드, 뒤이어 에리트로포이에틴 분자에서의 그의 위치, 뒤이어 대체 아미노산의 한 글자 코드로 변화된 아미노산을 기재한다. 에를 들어, "인간의 에리트로포이에틴 S100E" 또는 "재조합 조직 보호 사이토카인 S100E"는 100번째 아미노산인 세린이 글루탐산으로 변화된 인간의 에리트로포이에틴 분자를 일컫는다. 본 발명을 실행하는데 유용한 이들 뮤테인은 하기 아미노산 변화중 하나 이상 을 갖는 인간의 에리트로포이에틴을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다:

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 재조합 조직 보호 사이토카인은 상기 치환중 하나 이상을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 에리트로포이에틴 뮤테인 또는 다른 재조합 조직 보호 사이토카인은 상기 치환중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인, 약학 조성물, 용도 및 치료방법은 상기 치환중 하나 이상을 포함하나, 단 하기 치환중 하나 이상은 포함하지 않는다: I6A, C7A, K20A, P42A, D43A, K45D, K45A, F48A, Y49A, K52A, K49A, S100E, R103A, K116A, T132A, I133A, K140A, N147K, N147A, R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A 또는 R162A. 본 발명의 관련된 실시태양에서는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인, 약학 조성물, 용도 및 치료 방법이 상기 치환중 하나 이상을 포함하지만, 단 치환의 조합 N24K/N38K/N83K 또는 A30N/H32T는 포함하지 않는다.

특정 실시태양에서는, 상기 아미노산 변화중 둘 이상을 조합하여 뮤테인을 제조할 수 있다. 이러한 조합의 예는 다음과 같은 것을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다: K45D/S100E, A30N/H32T, K45D/R150E, R103E/L108S, K140A/K52A, K140A/K52A/K45A, K97A/K152A, K97A/K152A/K45A, K97A/K152A/K45A/K52A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A, N24K/N38K/N83K 및 N24K/Y15A. 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 상기 다중 치환중 하나 이상을 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 상기 다중 치환을 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 사용하는 본 발명의 용도 및 치료 방법은 하나 이상의 상기 다중 치환을 포함하지 않는다.

특정 개질 또는 개질의 조합은 수용체(예: 에리트로포이에틴 수용체 또는 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 뮤테인이 결합하는 2차 수용체)에 결합되는 에리트로포이에틴 뮤테인에 유연성을 부여할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 이들 개질 또는 개질의 조합의 예는 K152W, R14A/Y15A, I6A, C7A, D43A, P42A, F48A, Y49A, T132A, I133A, T134A, N147A, P148A, R150A, G151A, G158A, C161A 및 R162A를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 상응하는 변이 발생은 인간 성장 호르몬에 유해한 것으로 알려져 있다(웰즈 등). 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인은 상기 치환중 하나 이상을 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 상기 치환을 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 뮤테인을 사용하는 용도 및 치료 방법은 상기 치환중 하나 이상을 포함하지 않는다.

전술한 아미노산 변화중 하나에 덧붙여, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 적어도 무시알산 잔기를 갖지 않을 수 있다(이는 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인으로 칭해짐). 바람직하게는, 본 발명의 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인은 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 가질 수 있다. 캘리포니아주 샌 린드로 소재의 프로자임 인코포레이티드(ProZyme Inc.) 제품인 시알리다제 A에 대한 제조업체의 패키지에 기재되어 있는 바와 같이, 시알리다제를 사용하여 재조합 조직 보호 사이토카인으로부터 시알산 잔기를 제거함으로써 이를 제조할 수 있다. 전형적으로는, 프로자 임(PROZYME^?) 글리코프로(GLYCOPRO^?) 서열 결정-등급 시알리다제 A(SIALYDASE A^TM)(N-아세틸뉴라미네이트 글리코하이드롤라제, EC 3.2.1.18)를 사용하여 에리트로포이에틴과 같은 탄수화물과 당단백 복합체로부터 비-환원성 말단 시알산 잔기를 모두 절단해낸다. 이는 또한 분지된 시알산(내부 잔기에 결합되어 있음)도 절단해낸다. 시알리다제 A는 아르트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens)의 클론으로부터 단리된다.

당펩타이드의 시알릴화의 비제한적인 예는, 포유동물 또는 세균의 시알릴트랜스퍼라제를 사용하는 시알릴화 방법을 개시하는 미국 특허원 제 2003/0040037 호에서 볼 수 있다. 당단백의 시알릴화 및 시알릴화 패턴의 변화 방법의 다른 비한정적인 예는 미국 특허원 제 2002/0160460 A1 호 및 미국 특허 제 6,399,336 B1 호에서 찾아볼 수 있다. 거기에는, 갈락토즈 또는 N-아세틸갈락토사민 수용체 잔기를 갖는 당단백과 시알산 공여 잔기를 합하는 재조합 당단백의 시험관내 시알릴화 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 수용체 및 공여체와 함께 시알릴트랜스퍼라제가 시알산을 사카라이드에 부착하였다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 적어도 감소된 수의 N-결합된 탄수화물을 가질 수 있다. N-결합된 탄수화물을 제거하기 위해, 예컨대 허멘틴(Hermentin) 등의 문헌[1996, Glycobiology 6(2):217-30]에 기재되어 있는 방법에 따라 재조합 조직 보호 사이토카인을 하이드라진으로 처리할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 에리트로포이에틴은 3개의 N-결합된 탄수화물 잔기를 갖고; 본 발명 은 N-결합된 탄수화물을 2개 또는 1개 갖거나 갖지 않은 에리트로포이에틴을 포함한다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 글라이코시다제로 재조합 조직 보호 사이토카인을 처리한 결과 적어도 감소된 탄수화물 함량을 가질 수 있다. 예를 들어, 첸(Chen) 및 에반젤리스타(Evangelista)[1998, Electrophoresis 19(15):2639-44]의 절차를 수행할 수 있다. 또한, 호크(Hokke) 등의 문헌[1995, Eur. J. Biochem. 228(3):981-1008]에 기재된 방법에 따라 O-결합된 탄수화물을 제거할 수 있다.

재조합 조직 보호 사이토카인 분자의 탄수화물 부분은 포유동물 세포가 아닌 세포에서 재조합 에리트로포이에틴을 발현시킨 결과 적어도 포유동물의 당화 패턴이 아닌 당화 패턴을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 곤충 또는 식물 세포에 발현시킨다. 비제한적인 예로서, 쿠엘(Quelle) 등의 문헌[1989, Blood 74(2):652-657]에 따라 바쿨로바이러스(baculovirus) 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 재조합 조직 보호 사이토카인을 발현시킬 수 있다. 다른 방법은 미국 특허 제 5,637,477 호에 기재되어 있다. 마쓰모토(Matsumoto) 등의 방법(1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57(8):1249-1252)에 따라 식물 시스템에서 발현시킬 수 있다. 다르게는, 세균에서 발현시키면 재조합 조직 보호 사이토카인의 당화되지 않은 형태가 생성된다. 이들은 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 제조에 유용한 예시적인 방법이며, 어떠한 방식으로도 한정하는 의미는 아니다.

당화 패턴을 변화시키는 비한정적인 예는 미국 특허원 제 2003/0040037 A1 호 및 미국 특허원 제 2003/0003529 A1 호에 개시되어 있는 바와 같이 푸코실화를 이용하는 것이다. 여기에는, 푸코실트랜스퍼라제에 대한 수용체 잔기를 갖는 당펩타이드를 푸코즈 공여 잔기를 갖는 반응 혼합물과 접촉시켜 당펩타이드의 당화 패턴을 변화시킴으로써, 당펩타이드의 당화 패턴을 변화시키는 방법이 개시되어 있다. 또한, 재조합 당펩타이드를 사용하여 당화 패턴을 변화시키는 방법도 개시되어 있다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 화학적으로 환원될 수 있는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 재조합 조직 보호 사이토카인은 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴 뮤테인일 수 있고; 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴 뮤테인은 소듐 보로하이드라이드 또는 소듐 사이아노보로하이드라이드로 화학적으로 환원될 수 있다. 예컨대, 린슬리(Linsley) 등의 문헌[1994, Anal. Biochem. 219(2):207-17]에 기재되어 있는 방법에 의해 에리트로포이에틴 뮤테인의 퍼아이오데이트 산화를 수행할 수 있다. 토넬리(Tonelli) 및 메인츠(Meints)의 방법(1978, J. Supramol. Struct. 8(1):67-78)에 따라, 퍼아이오데이트 산화에 후속하는 화학적 환원을 수행할 수 있다.

천연 분자의 화학적 개질을 위해 특정 표적 아미노산을 변화시켜 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시켰기 때문에, 천연 에리트로포이에틴의 전술한 아미노산 변화 및 하기 아미노산 변화중 특정한 변화는 불가능할 수도 있음에 주목해야 한다. 물론, 변화된 아미노산을 당연히 화학적으로 개질시킬 수 있으며, 본 발명은 이러한 분자를 모두 포괄한다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 이용가능한 아미노산 잔기 및 이에 이용가능한 변화(들)를 용이하게 결정한다.

전술한 용도를 위한 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살(이때, R은 아릴, 헤테로아릴, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 사이클로알킬기, 또는 알파-데옥시글리시톨릴기일 수 있음) 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 저급 "알킬"은 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 지방족 탄화수소기를 의미한다. 이들 대표적인 기는 메틸, 에틸, 아이소프로필, 아이소뷰틸, 뷰틸, 펜틸, 헥실 등이다. 용어 "알콕시"는 산소에 의해 분자의 나머지 부분에 결합된 상기 정의된 저급 알킬기를 의미한다. 알콕시의 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시 등이 있다. 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 약 8개의 탄소를 갖는 환상 알킬기를 일컬으며, 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로헥실 등이 있다. 용어 아릴은 페닐 및 나프틸기를 나타낸다. 용어 헤테로아릴은 4 내지 10개의 고리원 및 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 헤테로환상 기를 일컫는다. 예로는 아이속사졸릴, 페닐아이속사졸릴, 퓨릴, 피리미딘일, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 피리딜, 이미다졸릴, 피롤리딘일, 1,2,4-트라이아조일릴, 티아졸릴, 티에닐 등이 있으나 이들로 한정되지는 않는다. R 기는 3-데옥시글루코손의 2,3,4-트라이하이드록시뷰틸기에서와 같이 치환될 수 있다. R-글라이옥살 화합물의 전형적인 예는 글라이옥살, 메틸글라이옥살, 3-데옥시글루코손 및 페닐글라이옥살이다. 바람직한 R-글라이옥살 화합물은 메틸글라이옥살 또는 페닐글라이옥살이다. 페닐글라이옥살을 사용하는 이러한 개질 방법의 예는 워버(Werber) 등의 문헌[1975, Isr. J. Med. Sci. 11(11): 1169-70]에서 찾아볼 수 있다.

다른 예에서는, pH 8 내지 9의 보레이트 완충액 약 50밀리몰 중에서 2,3-뷰테인다이온 또는 사이클로헥세인다이온과 같은 인접한 다이케톤과 반응시킴으로써 하나 이상의 아르기닌 잔기를 개질시킬 수 있다. 2,3-뷰테인다이온을 사용한 개질 절차는 리올단(Riordan)의 문헌[1973, Biochemistry 12(20): 3915-3923]에 따라 수행될 수 있으며; 사이클로헥산온을 사용한 개질 절차는 패티(Patthy) 등의 문헌[1975, J. Biol. Chem 250(2):565-9]에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 포함할 수 있거나, 또는 리신 잔기를 아미노기-개질제와 반응시킴으로써 개질시키는 것과 같이 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기를 개질시킬 수 있다. 다른 실시태양에서는, 글라이옥살, 메틸글라이옥살 및 3-데옥시글루코손과 같은 글라이옥살 유도체와 반응시켜 알파-카복시알킬 유도체를 형성함으로써 리신 잔기를 개질시킬 수 있다. 예로는, 글롬(Glomb) 및 모니에르(Monnier)의 문헌[1995, J. Biol. Chem. 270(17):10017-26]에서와 같이 글라이옥살과 반응시켜 카복시메틸리신을 제조하는 것, 또는 데겐하르트(Degenhardt) 등의 문헌[1998, Cell. Mol. Biol.(Noisy-le-grand) 44(7):1139-45]에서와 같이 메틸글라이옥살과 반응시켜 (1- 카복시에틸)리신을 제조하는 것이 있다. 개질된 리신 잔기는 추가로 화학적으로 환원될 수 있다. 예를 들어, 워초우스키(Wojchowski) 및 카슬레이크(Caslake)의 문헌[1989, Blood 74(3):952-8]에 기재되어 있는 바와 같이, D-바이오틴일-ε-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스터를 에리트로포이에틴과 반응시킨 후 센트리콘(Centricon) 10 칼럼에서 겔 투과에 의해 반응되지 않은 바이오틴을 제거함으로써, 재조합 조직 보호 사이토카인을 리신기를 통해 바이오틴일화시킬 수 있다. 상기 문헌에서, 저자는 에리트로포이에틴을 바이오틴일화시키는 3가지 상이한 방법을 이용하는데, 이들중 임의의 방법을 이용하여 본원에 사용하기 위한 에리트로포이에틴을 제조할 수 있다. 바이오틴을 (1) 시알산 잔기, (2) 카복실레이트기 또는 (3) 아미노기에 첨가할 수 있다.

다른 바람직한 실시태양에서는, 리신을 알데하이드 또는 환원당과 반응시켜 아민을 제조할 수 있고, 이를 소듐 사이아노보로하이드라이드로 환원시켜 글루시톨릴 리신과 같은 N-알킬화된 리신을 제조함으로써 안정화시킬 수 있거나, 또는 환원당의 경우, 아마도리 또는 헤인즈 전위에 의해 알파-데옥시-알파-프럭토실리신과 같은 알파-데옥시 알파-아미노 당을 형성함으로써 안정화시킬 수 있다. 예로서, pH 7.4의 인산나트륨 완충액 중에서 0.5M 글루코즈를 사용하여 60일간 배양함으로써 프럭토실리신-개질된 단백질을 제조함이 마키타(Makita) 등의 문헌[1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138]에 기재되어 있다. 다른 예에서는, 예컨대 사이아네이트 이온과 반응시켜 카밤일화시킬 수 있거나, 또는 알킬- 또는 아릴-아이소사이아네이트 또는 -아이소티오사이아네이트와 반응시켜 알킬- 또는 아릴-카밤일화 또는 -티오카밤일화시킬 수 있거나, 또는 예컨대 아세트산 무수물, 석신산 무수물 또는 프탈산 무수물과 반응시키는 것과 같은 반응성 알킬- 또는 아릴카복실산 유도체에 의해 아실화시킬 수 있다. 예로는, 4-설포페닐아이소티오사이아네이트 또는 아세트산 무수물을 사용하여 리신기를 개질시키는 것이 있다(이들 방법은 둘다 가오(Gao) 등의 문헌[1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(25):12027-30]에 기재되어 있다). 리신기는 또한 트라이나이트로벤젠설폰산 또는 바람직하게는 그의 염과 반응시킴으로써 트라이나이트로페닐 개질될 수 있다.

예컨대 질화 또는 요오드화에서와 같은 친전자성 시약에 의해 재조합 조직 보호 사이토카인의 하나 이상의 티로신 잔기를 방향족 고리 위치에서 개질시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 에리트로포이에틴을 테트라나이트로메테인과 반응시키거나(네슬러(Nestler) 등, 1985, J. Biol. Chem. 260(12):7316-21) 또는 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 요오드화시킬 수 있다.

예컨대 카보다이이미드와 반응시킨 후 글라이신아마이드와 같은(그러나 이에 국한되지는 않음) 아민과 반응시킴으로써, 재조합 조직 보호 사이토카인의 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 개질시킬 수 있다.

다른 예에서는, 예컨대 요스(Josse) 등의 문헌[Chem Biol Interact 1999년 5월 14일:119-120]에 기재되어 있는 방법에 따라 n-브로모석신이미드 또는 n-클로로석신이미드와 반응시킴으로써 재조합 조직 보호 사이토카인의 트립토판 잔기를 개질시킬 수 있다.

또 다른 예에서는, 닌하이드린과 반응시킨 후, 보로하이드라이드와 반응시켜 카본일기를 후속 환원시킴으로써 획득할 수 있는 것과 같이, 하나 이상의 아미노기를 제거함으로써 재조합 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다.

여전히 다른 예에서는, 다이티오트레이톨과 같은 환원제와 반응시킨 후 아이오도아세트아마이드, 아이오도아세트산 또는 다른 친전자체와 후속 설프하이드릴을 반응시켜 다이설파이드 결합의 재형성을 방해함으로써, 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스테인 결합이 적어도 결손된 재조합 조직 보호 사이토카인이 제공된다. 상기 지적된 바와 같이, 다르게는 또한 함께, 실제 가교결합에 참여하는 시스테인 분자를 변화시키거나 또는 에리트로포이에틴 뮤테인을 무능력하게 만드는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기를 변화시켜, 천연 분자에 존재하는 다이설파이드 결합중 하나 이상을 형성함으로써, 다이설파이드 결합을 없앨 수 있다.

에리트로포이에틴에 대해, 특정 잔기를 표적으로 하는, 예를 들어 트립토판 잔기 뒤를 절단하는 제한된 화학적 단백질 분해를 수행함으로써 재조합 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다. 이렇게 생성된 재조합 조직 보호 사이토카인 분절은 본원에 포함된다.

상기 나타낸 바와 같이, 본원의 목적에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인은 전술한 바와 같이 하나 이상 개질될 수 있으나, 그보다 많이 개질될 수도 있다. 분자의 탄수화물 부분이 개질되고 아미노산 부분이 또한 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인의 예로서, 재조합 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴일 수 있으며, 위치 45의 리신 잔기가 아스파트산으로 변화될 수 있다.

따라서, 본원에 사용하기 위한 다양한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자 및 이를 함유하는 약학 조성물이 포함된다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 에리트로포이에틴 분자는 무-시알산 에리트로포이에틴, N-탈당화 에리트로포이에틴, O-탈당화 에리트로포이에틴, 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴, 변화된 당화 패턴을 갖는 에리트로포이에틴, 산화 후 환원된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴, 아릴글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴, 알킬글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴, 2,3-뷰테인다이온-개질된 에리트로포이에틴, 사이클로헥세인다이온-개질된 에리트로포이에틴, 바이오틴일화 에리트로포이에틴, N-알킬화된-리실-에리트로포이에틴, 글루시톨릴 리신 에리트로포이에틴, 알파-데옥시-알파-프럭토실리신-에리트로포이에틴, 카밤일화 에리트로포이에틴, 아세틸화 에리트로포이에틴, 석신일화 에리트로포이에틴, 알파-카복시알킬 에리트로포이에틴, 질화된 에리트로포이에틴, 요오드화된 에리트로포이에틴을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(본원의 교시내용에 기초하여 대표적이지만 비-제한적인 예를 명명함). 바람직한 것은 인간의 에리트로포이에틴을 기제로 하는 전술한 개질 형태이다.

또한, 본 발명은 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이 화합물을 포함하는 약학 조성물을 포괄한다. 비제한적인 예로서, 이러한 재조합 조직 보호 사이토카인은 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴 뮤테인, 글루시톨릴 리신 에리트로포이에틴 뮤테인, 프럭토실 리신 에리트로포이에틴 뮤테인, 3-데옥시글루코손 에리트로포이에틴 뮤테인 및 카밤일화 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인을 포함한다.

5.3. 발현 시스템

다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 에리트로포이에틴 뮤테인 분자를 비롯한 재조합 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 흥미 있는 재조합 조직 보호 사이토카인을 제조한 다음 정제할 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때 원위치에서 개질된 에리트로포이에틴 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 세포도 나타낸다. 이들은, 재조합 조직 보호 사이토카인 생성물 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 조직 보호 사이토카인 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예: 아데노바이러스 말기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 갖는 인간 세포 시스템을 비롯한 포유동물 세포 시스템(예: HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)과 같은(그러나, 이들로 한정되지는 않음) 세균, 곤충, 식물, 인간을 비롯한 포유동물 숙주 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

본원에 사용되는 발현 구조물은 적절한 숙주 세포에서 재조합 조직 보호 사이토카인을 발현시킬 수 있는 하나 이상의 조절 영역과 작동가능하게 연결된 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 일컫는다. "작동가능 하게 연결된"이란 발현되어야 하는 재조합 조직 보호 사이토카인 폴리펩타이드 서열과 조절 영역이, 전사를 허용하여 궁극적으로는 재조합 조직 보호 사이토카인 서열의 번역을 허용하도록 하는 방식으로 결합 및 위치하는 연결을 일컫는다. 플라스미드, 코스미드, 파지, 파지미드 또는 변형된 바이러스를 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 다양한 발현 벡터를 재조합 조직 보호 사이토카인의 발현에 이용할 수 있다. 예로는, 람다 유도체 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 같은 플라스미드, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터(스트라타진(Stratagene))를 포함한다. 전형적으로, 이러한 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에서 벡터를 전파하기 위한 기능적 복제 기점, 재조합 조직 보호 사이토카인 유전자 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 마커를 포함한다.

바람직한 실시태양에서는, pCI-neo 벡터를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 원래의 인간 EPO cDNA 클론에 어닐링하여 상기 기재된 바와 같은 변이를 도입한다. pCI-neo 벡터는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 즉 포유동물 세포에 대한 선택적인 마커를 함유한다. 항생제 G-418로 형질감염된 세포를 선택함으로써, 임시적인 발현 또는 안정한 발현에 pCI-neo 벡터를 사용할 수 있다(브론딕(Brondyk), 1995, New Mammalian Expression Vector with a selectable marker: pCI-neo. Promega Notes 51, 10-14).

포유동물 숙주 세포에서 재조합 조직 보호 사이토카인을 발현시키기 위하여, 다양한 조절 영역, 예를 들어 SV40 초기 및 말기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 중간 초기 프로모터 및 로우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복체(RSV-LTR) 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포에 유용할 수 있는 유도가능한 프로모터는 메탈로티오네인 II 유전자, 마우스 유방암 바이러스 글루코코르티코이드 응답성 긴 말단 반복체(MMTV-LTR), 및 α-인터페론 유전자와 관련된 것을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(윌리암스(Williams) 등, 1989, Cancer Res. 49:2735-42; 테일러(Taylor) 등, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:165-75).

SV40 바이러스, B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 면역 글로불린 유전자, 메탈로티오넨, α-액틴에서 발견되는 것과 같은 적절한 전사 향상 요소를 발현 벡터에 포함시킴으로써, 숙주 세포에서의 재조합 조직 보호 사이토카인의 발현 효율을 향상시킬 수 있다(비트너(Bittner) 등, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544; 고어맨(Gorman), 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47).

발현 벡터는 또한 하나보다 많은 유형의 숙주 세포에서 벡터의 유지 및 복제를 허용하거나 또는 숙주 염색체로의 벡터의 일체화를 허용하는 서열도 함유할 수 있다. 이러한 서열은 복제 기점, 자가 복제 서열(ARS), 중심절 DNA 및 텔로미어(telomere) DNA를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 또한, 둘 이상의 유형의 숙주 세포에서 복제 및 유지될 수 있는 셔틀 벡터를 사용하는 것도 유리할 수 있다.

또한, 발현 벡터는 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 DNA를 함유하는 숙주 세포를 처음으로 단리하거나 확인하기 위해 선택가능하거나 검색가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인을 장기간 고수율로 생성 시키기 위해서는, 포유동물, 식물, 세균 또는 진균 세포에서의 안정한 발현을 이용할 수 있다. 다수의 선택 시스템을 포유동물 세포에 사용할 수 있다(예를 들어(이들로 한정되는 것은 아님), 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(위글러(Wigler) 등, 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(자이발스키(Szybalski) 및 자이발스키, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48:2026) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(로위(Lowy) 등, 1980, Cell 22:817) 유전자를 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에 사용할 수 있다). 또한, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)(위글러 등, 1980, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567; 오하르(O'Hare) 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1527); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(멀리건(Mulligan) 및 버그(Berg), 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072); 아미노글라이코사이드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)(콜베르(Colberre)-가라핀(Garapin) 등, 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hyg)(산테레(Santerre) 등, 1984, Gene 30:147)에 대한 선택의 기준으로서 항대사물질 저항성을 이용할 수 있다. 히스티딘올 및 제오신(Zeocin^TM) 같은(이들로 국한되지는 않음) 다른 선택가능한 마커도 사용할 수 있다.

재조합 조직 보호 사이토카인 코딩 서열을 벡터의 클로닝 부위로 삽입하기 위하여, 프로모터 같은 조절 기능을 갖는 DNA 서열을 코딩 서열에 부착해야 한다. 이렇게 하기 위하여, 당해 분야에 공지되어 있는 기법에 의해, 적절한 양립가능한 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터를 재조합 조직 보호 사이토카인을 코딩하는 cDNA 또는 합성 DNA의 말단에 연결해야 한다(우(Wu) 등, 1987, Methods Enzymol. 152:343-349). 제한 효소로 절단한 후, 연결 시키기 전에 단일 가닥 DNA 말단에서 다시 소화시키거나 충전시킴으로써 둔단(blunt end)을 생성시키도록 개질시킬 수 있다. 다르게는, 목적하는 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 DNA를 증폭시킴으로써, DNA 분절 내로 목적하는 제한 효소 부위를 도입할 수 있다.

추가의 클로닝 없이 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 발현 및 생성시키기 위하여, 조절 영역과 작동가능하게 연결된 재조합 조직 보호 사이토카인-코딩 서열을 포함하는 발현 구조물을 직접 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다(미국 특허 제 5,580,859 호 참조). 발현 구조물은 또한 예컨대 상동 재조합을 통해 숙주 세포의 게놈 내로 코딩 서열을 일체화시킴을 용이하게 하는 DNA 서열도 함유할 수 있다. 이 경우, 숙주 세포에서 재조합 조직 보호 사이토카인을 전파 및 발현시키기 위하여 적절한 숙주 세포에 적합한 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용할 필요가 없다.

인산칼슘 매개된 형질감염(위글러 등, 1977, Cell 11:223-232), 리포좀-매개된 형질감염(샤퍼-리더(Schaefer-Ridder) 등, 1982, Science 215:166-168), 전기영동(월프(Wolff) 등, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3344) 및 현미주사(카페치(Cappechi), 1980, Cell 22:479-488)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 당해 분야에 공지된 다양한 기법에 의해, 클로닝된 재조합 조직 보호 사이토카인 코딩 서열을 함유하는 발현 구조물을 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 개질 및 처리하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 개질(예: 당화) 및 처리(예: 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 처리 및 개질에 특이적인 특징적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질을 확실히 올바르게 개질 및 처리하는데 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사, 당화 및 포스포릴화의 적절한 처리를 위한 세포 기관을 갖는 진핵 숙주 세포를 이용할 수 있다. 이러한 인간 숙주 세포를 비롯한 포유동물 숙주 세포는 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 재조합 조직 보호 사이토카인-관련 분자 유전자 생성물을 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스성 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 적절한 발현 제어 요소(예: 프로모터, 증진인자, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 풍부한 배지에서 1 내지 2일간 생육시킨 다음 선택적인 배지에 바꿔넣는다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하며, 세포가 플라스미드를 염색 체로 안정되게 통합하고 생육하도록 함으로써 다시 클로닝되어 세포주 내로 전개시킬 수 있는 포커스를 형성하도록 한다. 재조합 조직 보호 사이토카인 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 조작하는데 이 방법을 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 재조합 조직 보호 사이토카인 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 끼치는 화합물의 선별 및 평가에 특히 유용할 수 있다.

당해 분야에 널리 공지되어 있는 기법에 의해, 공지 DAN 서열로부터 본원에 기재된 임의의 클로닝 및 발현 벡터를 합성 및 조립할 수 있다. 조절 영역 및 증진 인자는 다양하게 유도될 수 있다(즉, 천연 또는 합성일 수 있다). 몇몇 벡터 및 숙주 세포는 시판되는 것을 구입할 수 있다. 유용한 벡터의 비제한적인 예가 본원에 참고로 인용된 문헌[Appendix 5 of Current Protocols in Molecular Biology, 1988, 오스벨 등 편집, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience] 및 클론테크 래보러토리즈(Clontech Laboratories), 스트라타진, 인코포레이티드 및 인비트로젠, 인코포레이티드(Invitrogen, Inc.) 같은 공급업체의 카탈로그에 기재되어 있다.

다르게는, 조직 보호 사이토카인의 재조합 발현을 위해, 포유동물 세포와 함께 다수의 바이러스계 발현 시스템도 사용할 수 있다. DNA 바이러스 체제를 사용하는 벡터가 원숭이 바이러스 40(SV40)(해머(Hamer) 등, 1979, Cell 17:725), 아데노바이러스(반 도렌(Van Doren) 등, 1984, Mol. Cell Biol. 4:1653), 아데노-관련 바이러스(맥로플린(McLaughlin) 등, 1988, J. Virol. 62: 1963) 및 소의 유두종 바이러스(진(Zinn) 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4897)로부터 유도되었다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우에는, 공여 DNA 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 영역, 예컨대 말기 프로모터 및 3자 구성의 선도 서열에 연결할 수 있다. 이 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비-본질 영역(예컨대, 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 살아 있고 감염된 숙주에서 이종 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다(예컨대 로건(Logan) 및 쉥크(Shenk)의 문헌[1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659] 참조).

다르게는, 유두 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다(예를 들어, 맥켓(Mackett) 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:7415-7419; 맥켓 등, 1984, J. Virol. 49:857-864; 파니칼리(Panicali) 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4927-4931). 인간 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 기점(OriP) 및 EBV 핵 항원 1(EBNA-1; 반대-작용 복제 인자)에 기초한 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터를 광범위한 인간 숙주 세포, 예를 들어 EBO-pCD(스피코프스키(Spickofsky) 등, 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:14-18), pDR2 및 αDR2(클론테크 래보러토리즈에서 구입)와 함께 사용할 수 있다.

레트로바이러스-계 발현 시스템에 의해서도 재조합 조직 보호 사이토카인 발현을 달성할 수 있다. 형질감염과는 대조적으로, 레트로바이러스는 유전자를 효과적으로 감염시키고 예컨대 일차 조혈 세포를 비롯한 광범위한 세포 유형으로 유전자를 옮길 수 있다. 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스 같은 레트로바이러스에서는, 바이러스 유전자 서열의 대부분을 제거하고, 재조합 조직 보호 사이토카 인 코딩 서열로 대체할 수 있으나, 상실되는 바이러스 기능을 역으로 공급할 수 있다. 벡터 포장에 사용되는 외피의 선택에 의해, 레트로바이러스 벡터에 의한 감염을 위한 숙주 범위를 조종할 수 있다.

예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 5' 긴 말단 반복체(LTR), 3' LTR, 포장 신호, 세균 복제 기점 및 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 5'LTR 프로모터로부터의 전사가 클로닝된 DNA를 전사하도록, 재조합 조직 보호 사이토카인 DNA를 5'LTR과 3'LTR 사이의 위치로 삽입한다. 5'LTR은 LTR 프로모터를 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는 프로모터, R 영역, U5 영역 및 프라이머 결합 부위를 이 순서대로 포함한다. 이들 LTR 요소의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이종 프로모터 및 다중 약물 선택 마커도 발현 벡터에 포함시켜, 감염된 세포의 선택을 용이하게 할 수 있다(맥로클린(McLauchlin) 등, 1990, Prog. Nucleic Acid Res. and Molec. Biol. 38:91-135; 모겐스턴(Morgenstern) 등, 1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596; 콜리카(Choulika) 등, 1996, J. Virol 70:1792-1798; 보센(Boesen) 등, 1994, Biotherapy 6:291-302; 샐먼즈(Salmons) 및 군즈버그(Gunzberg) 등, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; 및 그로스맨(Grossman) 및 윌슨(Wilson), 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114).

본 발명의 한 실시태양에서는, 시알산 잔기가 부족하거나 시알산 잔기가 완전히 결핍된 재조합 조직 보호 사이토카인을 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포에서 생성시킬 수 있다. 이러한 세포를 조작하여 시알산을 첨가시키는 효소, 즉 β-갈락토사이드 α 2,3 시알릴트랜스퍼라제("α 2,3 시알릴트랜스퍼라제") 및 β-갈 락토사이드 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제("α 2,6 시알릴트랜스퍼라제") 활성이 부족해지도록 하거나 결핍시킬 수 있다. 한 실시태양에서는, α 2,3 시알릴트랜스퍼라제 유전자 및/또는 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제 유전자중 하나 또는 둘 모두가 결실된 포유동물 세포를 이용한다. 당해 분야에 널리 공지되어 있는 유전자 결실(knock-out) 기법을 이용하여 이렇게 결실시킬 수 있다. 다른 실시태양에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시키기 위한 숙주 세포로서 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)가 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 이용한다. CHO 세포는 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 발현시키지 않으며, 따라서 이들 세포에서 생성된 당단백의 N-결합된 올리고사카라이드로의 2,6 결합에 시알산을 첨가하지 않는다. 그 결과, CHO 세포에서 생성된 재조합 단백질은 갈락토즈로의 2,6-결합에 시알산을 갖지 않는다(사사키(Sasaki) 등(1987); 다케우치(Takeuchi) 등, 상기 문헌; 무차스(Mutsaers) 등, Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); 다케우치 등, J. Chromotgr. 400, 207 (1987)). 한 실시태양에서는, 무-시알산 에리트로포이에틴을 생성시키기 위한 숙주 세포를 생성시키기 위해, CHO 세포의 α 2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 결실시킨다. 이러한 α2,3 시알릴트랜스퍼라제가 결실된 CHO 세포는 시알릴트랜스퍼라제 활성을 완전히 상실하고, 그 결과 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인의 재조합 발현 및 생성에 유용하다.

다른 실시태양에서는, 골지(Golgi) 장치 내로의 시알산 수송을 방해함으로써 무-시알산 당당백을 생성시킬 수 있다(예컨대, 에크하르트 등, 1998, J. Biol. Chem. 273:20189-95). 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법(예를 들 어, 올만(Oelmann) 등, 2001, J. Biol. Chem. 276:26291-300)을 이용하여, 뉴클레오타이드 당 CMP-시알산 수송인자의 변이를 유발시켜 차이니즈 햄스터 난소 세포의 변이체를 생성시킬 수 있다. 이들 세포는 재조합 조직 보호 사이토카인과 같은 당단백에 시알산 잔기를 첨가할 수 없으며, 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인만을 생성시킨다.

에리트로포이에틴 뮤테인을 생성시키는 형질감염된 포유동물 세포는 또한 세포질 시알리다제를 생성시키는데, 이 효소는 배양 매질 내로 흘러들어갈 경우 시알로에리트로포이에틴 뮤테인을 높은 효율로 분해시킨다(예를 들어, 그래머 등, 1995 Biotechnology 13:692-698). 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법(예컨대, 페라리(Ferrari) 등의 문헌[1994, Glycobiology 4:367-373]에 기재되어 있는 정보)을 이용하여, 구조적으로 시알리다제를 생성시키도록 세포주를 형질감염시키거나 변이시키거나 또는 다른 방식으로 유도할 수 있다. 이러한 방식으로, 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인의 제조동안 무-시알산 에리트로포이에틴 뮤테인을 생성시킬 수 있다.

온도, 배양 시간, 광학 밀도 및 배지 조성의 표준 조건하에서 재조합 세포를 배양할 수 있다. 다르게는, 변화된 배양 조건 및 배지를 사용하여 재조합 조직 보호 사이토카인의 생성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 유도성 재조합 조직 보호 사이토카인 발현을 촉진시키는 조건 하에서 재조합 세포를 생육시킬 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 기법을, 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시키는 최적 조건을 확립하는데 적용할 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함 하는 세포 용해질 또는 추출물을 추가로 정제하여 재조합 조직 보호 사이토카인을 단리할 수 있다.

재조합 조직 보호 사이토카인의 정제를 용이하게 하기 위하여, 마커 아미노산 서열은 특히 pQE 벡터에 제공되는 택 같은 헥사-히스트딘 펩타이드이며, 이들중 다수는 시판되고 있다(퀴아젠, 인코포레이티드(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 챗스워쓰, 이튼 애비뉴 9259). 예컨대, 겐츠(Gentz) 등의 문헌[1989, PNAS 86:821]에 기재되어 있는 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 택은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도되는 항원 결정기에 상응하는 헤마글루티닌 "HA" 택(윌슨 등, 1984, Cell 37:767) 및 "꼬리(flag)" 택을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 정제 방법을 이용할 수 있다(예컨대 국제 특허 공개 WO 93/21232 호; EP 439,095 호; 나라무라(Naramura) 등의 문헌[1994, Immunol. Lett. 39:91-99]; 미국 특허 제 5,474,981 호; 길리스(Gillies) 등의 문헌[1992, PNAS 89:1428-1432]; 및 펠(Fell) 등의 문헌[1991, J. Immunol. 146:2446-2452] 참조).

5.4. 재조합 조직 보호 사이토카인의 조직 보호 특성의 분석

재조합 조직 보호 사이토카인의 제조 후, 본 발명의 이러한 조직 보호 사이토카인의 추가적인 화학 개질 실시태양에서, 당해 분야의 숙련자는 널리 공지되어 있는 분석을 이용하여 사이토카인의 조직 보호 속성 및 골수에 대한 효과의 부재를 입증할 수 있다.

예를 들어, TF-1 분석의 사용을 통해 재조합 조직 보호 사이토카인의 비-절혈구 조혈 효과를 입증할 수 있다. 이 분석에서는, GM-CSF 5ng/ml 및 10% FCS가 보충된 완전 RPMI 배지에서 TF-1 세포를 37℃ 및 CO2 배양기에서 하룻동안 생육시킨다. 이어 세포를 기아 배지(GM-CSF 없이 5% FCS)에서 세척한 다음, 16시간동안 상기 기아 배지에 106개 세포/ml의 밀도로 현탁시킨다. (1) 외부 웰에 멸균수 100㎕를 첨가하여 수분을 유지시키고; (2) 배지(세포 또는 GM-CSF 없이 10% FCS)만 5개 웰에 첨가하고; (3) 10% FCS를 함유하는 배지 및 재조합 조직 보호 사이토카인으로 나머지 웰에 25,000개 세포/웰을 접종함으로써, 96개 웰 플레이트를 준비한다. 세포가 증식되면, 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈성일 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인으로 인한 적혈구용적율의 증가를 모니터링하는 생체내 분석으로 화합물의 생체내 효과를 시험해야 한다. 음성 결과-시험관내 분석에서 TF-1에서 세포가 증식하지 않고/않거나 생체내 분석에서 적혈구용적율이 증가하지 않음-는 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈성이 아님을 의미한다.

상기 기재된 TF-1 분석에 대한 대체 방법으로서, 당해 분야의 숙련자는 아래 실시예 부분에 기재되어 있는 것과 같은 UT-7 세포 분석을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는 당해 분야에 공지된 다른 적혈구 조혈 분석을 이용할 수 있다.

아래에 더욱 상세하게 그 개요가 기재되어 있는 P-19 시험관내 분석 또는 마우스에서의 물 중독 생체내 분석을 이용하여, 재조합 조직 보호 사이토카인의 조직 보호 특성을 입증할 수 있다. 다른 분석은 PC-12 같은 아래 실시예 부분에 개요가 기재된 추가적인 분석 및 하이포캠펄 슬라이스 분석을 포함하지만 이들로 국한되지 는 않는다. 상기 분석은 예로서 제공된 것이며, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 재조합 조직 보호 사이토카인의 조직 보호 효과 및/또는 골수 효과를 결정하는 다른 적합한 분석도 또한 고려된다.

5.5. 본 발명의 약학 조성물

본 발명의 한 요지를 실시하는데 있어서, 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 상기 기재된 약학 조성물은, 내피 세포 장벽을 가로질러 이동시키고 응답 세포에 유리한 효과를 제공하기에 충분한 수준의 재조합 조직 보호 사이토카인을 혈관에 제공하는 임의의 경로에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 조직 또는 기관에 관류시키기 위해 사용될 때에도 유사한 결과가 요구된다. 에리트로포이에틴 뮤테인을 생체외 관류에 사용하는 경우, 재조합 조직 보호 사이토카인은 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인과 같은 에리트로포이에틴 뮤테인의 임의의 형태일 수 있다. 세포 또는 조직이 혈관을 포함하지 않고/않거나 세포 또는 조직을 본 발명의 조성물에 침지시킴으로써 투여하는 경우, 약학 조성물은 응답 세포에 유리한 양의 재조합 조직 보호 사이토카인을 제공한다. 재조합 조직 보호 사이토카인이 가로질러 이동할 수 있는 내피 세포 장벽은 치밀 이음부, 관통된 이음부, 작은 구멍이 있는 이음부 및 포유동물에 존재하는 내피 장벽의 임의의 다른 유형을 포함한다. 바람직한 장벽은 내피 세포 치밀 이음부이지만, 본 발명은 그것으로만 한정되지는 않는다.

전술한 재조합 조직 보호 사이토카인은 일반적으로 주로 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 중추신경계 또는 말초신경계의 질환, 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장 질환, 비뇨생식기 질환, 위장관 질환 및 내분비 및 대사 이상을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특히, 이러한 증상 및 질병은 흥분성 조직, 예를 들어 뇌, 심장 또는 망막/눈과 같은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직, 또는 심조직 또는 망막 조직의 흥분성 조직에 불리한 영향을 끼치는 저산소증을 포함한다. 따라서, 다양한 조건 및 환경에서의 저산소 조건으로부터 야기되는 흥분성 조직의 손상을 치료 또는 예방하는데 본 발명을 이용할 수 있다. 이러한 조건 및 환경의 비제한적인 예가 하기 표에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 치료될 수 있는 신경조직 병증의 보호의 예에서, 이러한 병증은 신경 조직의 산소화 감소로 인해 야기된 것을 포함한다. 신경 조직의 산소 이용효율을 감소시키는 임의의 증상(이로 인해, 스트레스, 손상이 생기고, 최종적으로는 신경 세포가 사멸함)은 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 일반적으로 저산소증 및/또는 허혈로 일컬어지는 이들 증상은 중풍, 혈관 폐색, 출산 전 또는 출산 후 산소 차단, 질식, 기도폐색, 거의 익사할 뻔한 상태, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술 및 방사선치료를 비롯한 외상, 질식, 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄폐질환, 폐기종, 성인 호흡곤란 증후군, 고혈압 쇼크, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 인슐린 쇼크, 낫적혈구 뇌졸중, 심장정지, 율동장애, 질소 마취, 및 심폐 회로술에 의해 야기된 신경 결핍으로부터 일어나거나 이러한 질환을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

한 실시태양에서는, 예를 들어 종양 절제 또는 동맥류 치유와 같은 수술 과정동안의 손상 또는 조직 손상 위험으로부터 야기되는 손상 또는 조직 손상을 방지 하기 위해, 특정 재조합 조직 보호 사이토카인 조성물을 투여할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 저혈당증에 의해 야기되거나 발병되는 다른 병증은 원인불명 고인슐린혈증으로도 불리는 인슐린 과다투여, 인슐린종, 성장 호르몬 결핍, 저코티솔혈증, 약물 과다투여 및 특정 암을 포함한다.

흥분성 신경세포 손상으로부터 발병되는 다른 병증은 간질, 경련 또는 만성 발작 장애와 같은 발작 장애를 포함한다. 다른 치료가능한 증상 및 질환은 중풍, 다발성 경화증, 고혈압, 심장정지, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 연령-관련 인지 기능 상실, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 발작 장애, 알콜 중독, 망막 허혈, 녹내장으로 인한 시신경 손상 및 신경 손상과 같은 질환을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명의 특정 조성물 및 방법을 사용하여 질병 상태 또는 다양한 외상으로부터 야기된 염증(예컨대, 물리적으로 또는 화학적으로 유도된 염증)을 치료할 수 있다. 이러한 외상은 관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 관자동맥염, 뇌염, 수막염, 횡단 척수염, 피부근육염, 다발근육염, 괴사 근막염, 간염 및 괴사 신장결장염을 포함할 수 있다.

증거에 의해, 활성화된 별아교세포가 신경독소를 생성시킴으로써 신경세포에 대해 세포독성 작용을 할 수 있는 것으로 입증되었다. 대뇌 허혈에 응답하여 신경아교세포로부터 산화질소, 반응성 산소 부류 및 사이토카인이 방출된다(벡커(Becker, K.J.)의 문헌[2001, Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke. Curr Opinion Neurol 14:349-353] 및 매트슨 (Mattson, M.P.), 컴시(Culmsee, C.) 및 유(Yu, Z.F)의 문헌[2000, Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 301:173-187] 참조). 연구가 진행됨에 따라, 신경 변성 모델에서, 신경아교세포 활성화 및 염증성 사이토카인의 후속 생성이 1차 신경세포 손상에 달려있음이 추가로 임증되었다(비비아니(Viviani, B.), 콜시니(Corsini, E.), 갈리(Galli, C.L.), 파도바니(Padovani, A.), 시우사니(Ciusani, E.) 및 마리노비치(Marinovich, M.)의 문헌[2000, Dying neural cells activate glia through the release of a protease product, Glia 32:84-90] 및 라부페티(Rabuffetti, M.), 시오라티(Scioratti, C.), 타로조(Tarozzo, G.), 클레멘티(Clementi, E.), 만드레디(Manfredi, A.A.) 및 벨트라모(Beltramo, M.)의 문헌[2000, Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines, J Neurosci 20:4398-4404] 참조). 염증 및 신경아교세포 활성화는 에리트로포이에틴이 세포 보호 작용을 하는 대뇌 허혈, 뇌 외상 및 실험에 의한 알러지성 뇌척수염을 비롯한 신경 변성 질환의 상이한 형태에 공통적이다. 에리트로포이에틴에 의한 사이토카인 생성 억제가 적어도 부분적으로는 그의 보호 작용을 매개할 수 있다. 그러나, 종양 괴사 인자 생성을 직접적으로 억제하는 IL-10 및 IL-13 같은 "전통적인" 소염 사이토카인과는 달리, 에리트로포이에틴은 신경세포 사멸의 존재하에서만 활성인 것으로 보인다.

임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 몇 가지 비한정적인 이 론에 의해 이 소염 활성을 가설적으로 설명할 수 있다. 먼저, 에리트로포이에틴이 세포자멸사를 방지하기 때문에, 세포자멸사에 의해 촉발되는 염증이 방지된다. 또한, 에리트로포이에틴이 죽어가는 신경세포로부터의 분자 신호(이는 신경아교세포를 자극하거나 신경아교세포 상에 직접 작용하여 이들 생성물로의 반응을 감소시킴) 방출을 방지할 수 있다. 다른 가능성은 에리트로포이에틴이 세포자멸사 및 염증을 둘 다 촉발시키는 일련의 염증 반응의 보다 가까운 일원(예컨대, 카스파제 1, 반응성 산소 또는 질소 중간체)을 표적으로 한다는 것이다.

또한, 에리트로포이에틴은 덱사메타손 같은 다른 소염 화합물에는 전형적으로 수반되는 반발 효과 없이 소염 보호를 제공하는 것으로 보인다. 다시 한 번 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하지 않으면서, 이는 산화질소(NO) 같은 다목적 신경독소에 대한 에리트로포이에틴의 효과에 기인할 수 있는 것으로 보인다. 활성화된 별아교세포 및 미소신경아교세포가 다양한 외상에 응답하여 신경 독성량의 NO를 생성시킴에도 불구하고, NO는 본질적인 생리적 기능의 조종을 비롯하여 신체 내에서 여러 목적을 수행한다. 따라서, 소염제의 사용이 NO 또는 다른 신경독소를 억제함으로써 염증을 경감시킬 수는 있지만, 소염제가 지나치게 긴 반감기를 갖는 경우에는 염증으로 이어지는 외상에서 야기되는 손상을 회복함에 있어서의 이러한 화학적 역할을 방해할 수도 있다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 NO 같은 신경독소의 회복능을 방해하지 않으면서 염증을 경감시킬 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 특정 조성물 및 방법을 이용하여 망막 조직의 질환 및 손상을 치료할 수 있다. 이러한 질병은 망막 허혈, 황반 변성, 망막 박리, 망막 색소변성, 동맥경화성 망막병증, 고혈압 망막변증, 망막 동맥 폐색, 망막 정맥 폐색, 저혈압 및 당뇨성 망막병증을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

다른 실시태양에서는, 본 발명의 방법 원리를 이용하여 흥분성 조직의 방사선 손상으로부터 야기되는 손상을 보호하거나 치료할 수 있다. 본 발명의 방법은 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌(Guam)병과 같은 신경독 중독, 근위축성 측삭 경화증 및 파킨슨병을 치료하는 데에도 이용될 수 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 말초혈관에 투여함으로써 포유동물에서 흥분성 조직 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 질환 및 증상에 대해 이 방법을 이용하여 치료하고, 또한, 이 방법은 다른 증상 또는 질환이 없는 경우 인지 기능을 향상시키는데 유용한다. 본 발명의 이들 용도는 아래에 더욱 상세하게 기재되며, 인간 및 인간이 아닌 포유동물의 학습 및 훈련 향상을 포함한다.

중추신경계에 관련된 본 발명의 이러한 요지의 방법에 의해 치료될 수 있는 증상 및 질환은 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 결핍 과다운동 장애 및 인지 장애를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 신경세포 기능을 향상시키면 이들 증상에 유리하다. 본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 다른 질환은 수면 방해, 수면 무호흡증 및 여행-관련 질환; 거미막밑 및 동맥류 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕 손상, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 다양한 뇌염 및 수막염의 후유증 속발증, 예를 들면 루푸스와 같은 결합조직-관련 수막뇌염을 포함한다. 다른 용도는 신경 독소에 의한 중독(예컨대 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌병), 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 수술후 색전 또는 허혈 손상 치료; 전뇌 조사; 낫적혈구 발작; 및 자간의 예방 또는 보호를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 질병 군은 미토콘드리아 기능장애(선천성 또는 후천성)를 포함하며, 이는 신경세포 손상 및 사멸에 의해 대표되는 다양한 신경 질환의 원인이다. 예를 들어, 라이(Leigh)병(아급성 괴사뇌병증)은 신경 결실로 인한 점진적인 시력 상실 및 뇌병증, 및 근육병증을 그 특징으로 한다. 이들 경우, 불완전한 미토콘드리아 대사는 흥분성 세포의 대사에 연료를 공급하기에 충분히 높은 에너지 기질을 공급하지 못한다. 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절제는 다양한 미토콘드리아 질병의 기능 상실을 최적화시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 저산소증은 흥분성 조직에 불리한 영향을 끼친다. 흥분성 조직은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직 및 심장 조직을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 상기 기재된 증상에 덧붙여, 본 발명의 방법은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 기도 폐색 및 거의 익사할 뻔한 상태를 치료하는데 유용하다. 저산소 상태를 발생시키거나 또는 흥분성 조직 손상을 유도하는 다른 수단에 의한 다른 질병은 인슐린을 적절하게 투여하지 못할 경우 또는 인슐린-생성 종양(인슐린종)과 함께 발생될 수 있는 저혈당증을 포함한다.

흥분성 조직 손상으로부터 유래되는 것으로 생각되는 다양한 신경정신 질환을 본 방법에 의해 치료할 수 있다. 신경세포 손상이 포함되고 본 발명에 의해 치료되는 만성 질환은 연령-관련 인지 기능 상실 및 노인성 치매, 만성 발작 장애, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절 경화증, 윌슨(Wilson's)병, 뇌성마비, 진행성 핵상마비, 괌병, 루이 소체(Lewy body) 치매, 해면 뇌병증과 같은 프리온 질환, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅톤병, 근육긴장퇴행위축, 프리드리히(Freidrich's) 조화운동불능 및 다른 조화운동불능, 및 길 드 라 토렛(Gilles de la Tourette's) 증후군, 간질 및 만성 발작 장애와 같은 발작 장애, 중풍, 뇌 및 척수 외상, AIDS 치매, 알콜 중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면 장애와 같은 자율 기능 장애; 및 정신분열증, 정신분열정동장애, 주의력 결핍 장애, 과다운동, 기분저하 장애, 주요 우울 장애, 조증, 강박 장애, 정신작용 물질 사용 장애, 불안증, 공황 장애, 및 단극성 및 양극성 정동장애를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 신경정신병을 비롯한 중추신경계 및/또는 말초신경계에 관련된 질환을 포함한다. 추가의 신경정신병 및 신경퇴행성 질환은 예를 들어 미국 정신과 협회의 정신 질환 진단 통계 매뉴얼(DSM)에 나열된 것을 포함하며, 이들 매뉴얼의 가장 최근 버전(IV)이 본원에 참고로 인용된다.

다른 실시태양에서는, 암과 같은 증식성 질환, 또는 아급성 경화 범뇌염과 같은 바이러스성 질환을 치료하기 위한 독소의 치료용 전달에 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 재조합 키메라 독소 분자를 사용할 수 있다.

하기 표는 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인에 의해 치료될 수 있는 다양한 질병 및 질환에 대한 추가의 예시적이고 비제한적인 목록이다.

세포, 조직 또는 기관	기능장애 또는 병증	증상 또는 질환	유형
심장	허혈	관상동맥 질환	급성, 만성, 안정성, 불안정성
		심근경색	드레슬러(Dressler's) 증후군
		앙기나
		선천성 심장병	판막 심근병증
		프린즈메탈 앙기나
		심장 파열	동맥류 사이막 구멍
		관염
	부정맥	빠른 부정맥, 느린 부정맥, 심실위, 심실 전도 이상	안정성, 불안정성 과민 목동맥 굴 결절
	선천성 심장기능 상실	좌심실, 우심실, 이심실, 심장수축, 확장	특발성 가족성, 감염성, 대사성, 저장 질환, 결핍, 결합조직 장애, 침윤 및 육아종, 신경혈관성 등의 심근병증
		심근염	자가면역, 감염성, 특발성
		폐심장증
	둔기 위상 및 관통 외상
	독소	코카인 독성
혈관	고혈압	원발성, 속발성
	감압병
	섬유근육과다형성
	동맥류	박리, 파열, 확장
폐	폐색성	천식, 만성 기관지염, 기종 및 기도 폐색
	허혈성 폐 질환	폐 색전증, 폐 혈전증, 지방 색전증
	환경성 폐 질환
	허혈성 폐 질환	폐 색전증 폐 혈전증
	간질 폐병	특발성 폐 섬유증
	선천성	낭 섬유증
	폐 심장증
	외상
	허파염 및 폐렴	감염성, 기생형, 독성, 외상성, 화상, 흡인
	사르코이드

세포, 조직 또는 기관	기능 장애 또는 병증	증상 또는 질환	유형
췌장	내분비	당뇨병, 유형 I 및 II	베타 세포 기능상실, 기능장애 당뇨병성 신경병증
		췌장의 다른 내분비 세포 기능상실
	외분비	외분비 췌장 기능상실	췌장염
뼈	골감소증	원발성 속발성	생식샘 저하증 부동화 월경후 연령-관련 부갑상샘 항진증 갑상샘 과다증 칼슘, 마그네슘, 인 및/또는 비타민 D 결핍
	골수염
	무혈관 괴사
	외상
	파제트(Paget's)병
피부	탈모증	부분 전체	원발성 속발성 남성형 대머리
	백반증	국부 전신	원발성 속발성
	당뇨병성 궤양
	말초혈관 질환
	화상 손상
자가면역 질환	홍반 루푸스, 지오그렌(Sjiogren), 류마티스성 관절염, 사구체신염, 관염
	랑게르한스 조직구증

세포, 조직 또는 기관	기능장애 또는 병증	증상 또는 질환	유형
눈	시신경염
	둔기 손상 및 관통상, 감염증, 사르코이드, 낫적혈구병, 망막 박리, 관자 동맥염
	망막 허혈, 황반 변성, 망막 색소 변성, 동맥경화 망막병증, 고혈압성 망막병증, 망막 동맥 차단, 망막 정맥 차단, 저혈압, 당뇨병성 망막병증 및 황반 부종
배아 및 태아 질환	질식
	허혈
CNS	만성 피로 증후군, 급성 및 만성 저삼투압 및 고삼투압 증후군, AIDS 치매, 감전사
	뇌염	광견병, 헤르페스
	수막염
	경막하혈종
	니코틴 탐닉
	약물 남용 및 금단증상	코카인, 헤로인, 크랙(crack), 마리화나, LSD, PCP, 복합 약물 남용, 엑스터시, 아편, 진정성 수면제, 암페타민, 카페인
	강박 장애
	척주관 협착증, 척수염, 길리안 바레(Guillian Barre), 외상, 신경뿌리 압박, 종양 압박, 열사병
ENT	이명 뮤니에르(Meuniere's) 증후군 청각 상실
	외상성 손상, 압력 손상
신장	신부전	급성, 만성	혈관/허혈성, 사이질 질환, 당뇨병성 신장 질환, 콩팥증후군, 감염증, 손상, 콘트라스트-유발, 화학요법-유발, CPB-유발 또는 예방
	헤노흐 에스. 자색반(Henoch S. Purpura)

세포, 조직 또는 기관	기능장애 또는 병증	증상 또는 질환	유형
횡문근	자가면역 질환	중증 근무력증 피부근육염 다발 근육염
	근육병증	유전 대사, 내분비 및 독성
	열사병
	압궤 손상
	횡문근 용해
	미토콘드리아 질환
	감염증	괴사 근막염
성기능장애	중추 및 말초(예: 발기 부전)	투약(당뇨병)에 수반되는 발기불능
간	간염	바이러스성, 세균성, 기생형
	허혈성 질환
	경화, 지방간
	침윤성/대사성 질환
위장관	허혈성 장 질환
	염증성 장 질환
	괴사 소장결장염
기관 이식	공여자와 수령자의 처치
생식계	불임	혈관 자가면역 자궁 이상 이식 장애
내분비	샘 기능항진 및 기능저하

상기 언급한 바와 같이, 이들 질환, 장애 또는 증상은 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인에 의해 이점을 취할 수 있는 예시적인 범위일 뿐이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 기계적 외상의 결과 또는 인간 질환의 치료 또는 예방을 제공한다. CNS 및/또는 말초신경계의 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방하는 것이 바람직하다. 정신병적 요소가 있는 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방한다. 눈, 심혈관, 심폐, 호흡기, 신장, 비뇨기, 생식기, 소화관, 내분비 또는 대사적 요소가 있는 질환, 장애 또는 증상(이들로 한정되지는 않음)을 치료 또는 예방한다.

한 실시태양에서, 이들 재조합 조직 보호 사이토카인의 약학 조성물은 전신 투여되어 표적 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향상시킬 수 있다. 이러한 투여는 비경구, 흡입 또는 점막통과, 예를 들어 경구, 비강, 직장, 질내, 설하, 점막하 또는 경피 투여일 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비경구, 예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사이고, 또한 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여도 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

관류액 사용, 기관 내로의 주사 또는 다른 국부 투여와 같은 다른 투여 경로의 경우, 유사한 수준의 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 투여하는 약학 조성물이 제공된다. 약 0.01pM 내지 30nM의 양이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"이란, 동물, 더욱 특히 인간에 사용하는 것으로 연방정부 또는 주정부의 규제국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 통상적으로 인정되는 외국 약전에 기재되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 일컫는다. 이러한 약학 담체는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유를 비롯한 오일(예: 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등) 및 물중 염수 용액과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우에는, 염수 용액이 바람직한 담체이다. 염수 용액, 및 덱스트로즈 및 글라이세롤 수용액도 특히 주사 용액용 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 조성물은 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트라이글라이세라이드와 같은 담체를 사용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도되는 것과 같은 유리 카복실기로 형성된 것을 포함한다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 마틴(E.W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 화합물을 환자에게 적절하게 투여하기에 적합한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 화합물 치료 효과량을 함유한다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

경구 투여에 적합한 약학 조성물은 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체중)으로서; 식용 포움 또는 휩(whip)으로서; 또는 유화액으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토즈, 전분 또는 그의 유도체, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽 은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.

경구 투여에 의도되는 활성 약제는 위장관에서 활성 약제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질(예컨대, 글라이세릴 모노스테아레이트 또는 글라이세릴 다이스테아레이트 등을 사용할 수 있음)로 코팅되거나 상기 물질과 혼합될 수 있다. 이렇게 하여, 활성 약제가 수시간에 걸쳐 서서히 방출될 수 있고, 필요한 경우 활성 약제를 위 내에서 분해되지 않도록 보호할 수 있다. 경구 투여용 약학 조성물은 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해 위장관의 특정 위치에서 활성 약제의 방출을 촉진시키도록 제형화될 수 있다.

경피 투여에 적합한 약학 조성물은 장기간동안 수령자의 피부와 긴밀하게 접촉되어 유지되는 별도의 패치로서 제공될 수 있다. 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직으로의 국부 투여의 경우에는, 국부 연고 또는 크림을 바람직하게 사용한다. 연고로 제형화되는 경우에는, 활성성분을 파라핀 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용할 수 있다. 다르게는, 활성성분을 수중유적형 기제 또는 유중수적형 기제와 함께 크림으로 제형화시킬 수 있다. 눈으로의 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 점안액을 포함한다. 이들 조성물에서는, 활성성분이 적합한 담체, 예를 들어 수성 용매에 용해 또는 현탁될 수 있다. 구강내로의 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 로젠지, 향내나는 알약(pastille) 및 구강세정제를 포함한다.

비강 투여 및 폐로의 투여에 적합한 약학 조성물은 분말(바람직하게는 20 내 지 500μ의 입자 크기를 가짐)과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 코 가까이에 둔 분말의 용기로부터 코를 통해 빨리 흡입함으로써, 코로 들이마시는 방식으로 분말을 투여할 수 있다. 다르게는, 비강 투여에 적합한 조성물은 액체 담체를 포함할 수 있다(예컨대, 비강 스프레이 또는 비강 점적약제). 다르게는, 깊이 흡입하거나 또는 마우스피스를 통해 입인두 내로 넣음으로써 폐로 직접 흡입할 수 있다. 이들 조성물은 활성성분의 수용액 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물은 소정 투여량의 활성성분을 제공하기 위하여 제작될 수 있는 가압된 에어로졸, 연무기 또는 취입기를 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 특별하게 맞춤한 장치에 공급할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 본 발명의 약학 조성물을 비강내로 바로 또는 비강 또는 입인두를 통해 폐 내로 투여할 수 있다.

직장 투여에 적합한 약학 조성물은 좌약 또는 관장약으로서 제공될 수 있다. 질강 투여에 적합한 약학 조성물은 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 약학 조성물은, 산화방지제, 완충액, 정균제 및 고려되는 수령자의 혈액과 혼합될 때 조성물을 실질적으로 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 다른 성분은 예컨대 물, 알콜, 폴리올, 글라이세린 및 식물유를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 단위 투여량 용기 또는 다회 투여량 용기, 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 동결건조 조건에서 저장될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체(예: 주사용 멸균 염수 용액)만 첨가 하면 된다. 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 임시처방 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 한 실시태양에서는, 앰뷸런스, 응급실 및 전쟁상황에서 응급용으로, 또한 심지어는 집에서, 특히 잔디 깎는 기계를 부주의하게 사용함으로써 외상성 절단이 일어날 수 있는 경우 자가 투여용으로, 재조합 조직 보호 사이토카인의 주사 용액을 포함하는 자동주사기가 제공될 수 있다. 가능한 한 빨리, 심지어는 의료진이 사고 장소에 도착하거나 다친 사람이 절단된 발가락을 끌면서 응급실에 도착하기 전에, 절단된 부분의 여러 부위에 재조합 조직 보호 사이토카인을 투여하면, 재부착 후 절단된 발 또는 발가락의 세포 및 조직이 생존할 가능성이 높아질 수 있다.

바람직한 실시태양에서는, 통상적인 절차에 따라 조성물을 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 제형화시킨다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액중 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서의 통증을 경감하기 위하여 리도카인과 같은 국부 마취제 및 가용화제를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분을 별도로 공급하거나, 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어 활성 약제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀폐된 용기 내의 동결건조된 분말 또는 무수 농축제로서 함께 혼합하여 공급한다. 주입에 의해 조성물을 투여해야 하는 경우에는, 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입용 병을 사용하여 투여할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 멸균 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.

좌약은 일반적으로 0.5 내지 10중량%의 활성성분을 함유하고; 경구 제제는 바람직하게는 10 내지 95중량%의 활성성분을 함유한다.

이식 기관 욕에 사용하기 위해서, 원위치에서 관류시키기 위해서, 또는 기관을 떼어내기 전에 기관 공여자의 혈관에 투여하기 위해서 관류 용액을 제공할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 소정량의 재조합 조직 보호 사이토카인 또는 개별 환자로의 단기 또는 장기, 국부 또는 전신 투여에 적합하지 않은 재조합 조직 보호 사이토카인의 형태를 포함할 수 있으나, 처리된 기관 또는 조직을 일상적인 순환에 복귀시키거나 노출시키기 전에 이에 함유된 재조합 조직 보호 사이토카인의 양이 없어지거나 감소되기 전에 사체, 기관 침지액, 기관 관류액 또는 원위치에서의 관류액에서 본원에서 의도한 기능을 나타낸다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)에는 임의적으로 약학 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 고지문이 부착될 수 있으며, 이러한 고지문은 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매함에 대한 정부 기관의 승인을 반영한다.

다른 실시태양에서는, 예컨대 재조합 조직 보호 사이토카인을 조절된-방출 시스템으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 이용하여 이 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 한 실시태양에서는, 펌프를 사용할 수 있다(랑거(Langer), 상기 문헌; 세프톤(Sefton)의 문헌[1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201]; 부흐발트(Buchwald) 등의 문헌[1980, Surgery 88:507]; 소덱(Saudek) 등의 문헌[1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 다른 실시태양에서는, 화합물을 소포, 특히 리포좀에 전달할 수 있다(랑거의 문헌[Science 249:1527-1533 (1990)]; 트리트(Treat) 등의 문헌[Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cnacer, 로페즈-베레스타인 및 피들러(편집), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; WO 91/04014 호; 미국 특허 제 4,704,355 호; 로페즈-베레스타인(Lopez-Berestein)의 동일 문헌, pp. 317-327 참조). 다른 실시태양에서는, 중합체 물질을 사용할 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, 랑거 및 와이즈(Wise)(편집), CRC Press; 플로리다주 보카 레이튼, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 스몰렌(Smolen) 및 볼(Ball)(편집), Wiley: New York (1984); 랑거 및 페파스(Peppas), J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; 레비(Levy) 등, 1985, Science 228:190; 듀링(During) 등, 1989, Ann. Neurol. 25:351; 하워드(Howard) 등, 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조).

또 다른 실시태양에서는, 조절된 방출 시스템을 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관 근처에 위치시켜 전신 투여량의 일부만 필요로 할 수 있다(예컨대 굿선(Goodson), pp. 115-138, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, 상기 문헌, 1984 참조). 다른 조절된 방출 시스템이 랑거의 개설에 논의되어 있다(1990, Science 249:1527-1533).

다른 실시태양에서는, 적절한 제형화된 재조합 조직 보호 사이토카인을 비강, 경구, 직장, 질강 또는 설하 투여할 수 있다.

특정 실시태양에서는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 조성물을 치 료가 필요한 부분에만 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예컨대(한정하지는 않음) 수술시 국부 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부 투여, 주사, 카테터, 좌약 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 막, 예컨대 실라스틱(silastic) 막, 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.

바람직한 유효 투여량의 선택은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 몇가지 인자를 고려하여 숙련자가 결정한다. 이러한 인자는 재조합 조직 보호 사이토카인의 특정 형태, 및 생체내이용효율, 대사, 반감기 등과 같은 그의 약동학적 변수(이는 약제 화합물의 규제 승인을 받는데 전형적으로 이용되는 통상적인 개발 과정동안 얻어짐)를 포함한다. 투여량을 고려하는데 있어서의 다른 인자는 치료되는 증상 또는 질환 또는 정상적인 개인에게서 얻어지는 이점, 환자의 체질량, 투여 경로, 투여가 단기 투여인지 장기 투여인지의 여부, 동시 투약 여부, 및 투여되는 약제의 효능에 영향을 끼치는 것으로 잘 알려져 있는 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 표준 임상 기법에 따라, 개별 환자의 증상 및 면역 상태에 의존하는 각 환자의 환경 및 담당 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다.

본 발명의 다른 양태에서는, 관류 및 이식용 기관의 저장을 위해 관류액 또는 관류 용액을 제공하며, 이 때 관류 용액은 응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 또는 기관을 보호하는데 효과적인 양의 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 이식물은, 한 공여자로부터 기관(세포, 조직 또는 다른 신체 부위 포함)을 떼어내고 상이한 수령자에게 이식하는 외래 이식; 및 신체의 한 부분으로부터 기관을 제거하여 다른 부분에 대체하는 자가이식(기관을 제거하고, 생체 외에서 예컨대 종양 제거를 위해 절제, 치료 또는 달리 조작한 다음 원래 위치에 되돌려놓는 벤치 수술 절차 포함)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 한 실시태양에서, 관류 용액은 약 1 내지 약 25U/ml의 에리트로포이에틴, 5% 하이드록시에틸 전분(약 200,000 내지 약 300,000의 분자량을 갖고, 에틸렌 글라이콜, 에틸렌 클로로하이드린, 염화나트륨 및 아세톤을 실질적으로 함유하지 않음), 25mM KH₂PO₄, 3mM 글루타티온, 5mM 아데노신, 10mM 글루코즈, 10mM HEPES 완충액, 5mM 글루콘산마그네슘, 1.5mM CaCl₂, 105mM 글루콘산나트륨, 200,000단위 페니실린, 40단위 인슐린, 16mg 덱사메타손, 12mg 페놀 레드를 함유하고, 7.4 내지 7.5의 pH 및 약 320mOSm/l의 삼투압을 갖는 위스콘신 대학(UW) 용액(미국 특허 제 4,798,824 호)이다. 이 용액을 사용하여 이식하기 전에 사체의 신장 및 췌장을 유지시킨다. 이 용액을 사용하여, 사체 신장 보존을 위해 권장되는 30시간 한계를 넘어 보존을 연장시킬 수 있다. 이 특정 관류액은 재조합 조직 보호 사이토카인 효과량을 포함시킴으로써 현재 사용하는데 적합화시킬 수 있는 다수의 용액의 예일 뿐이다. 다른 실시태양에서, 관류 용액은 재조합 조직 보호 사이토카인 약 0.01pg/ml 내지 약 400ng/ml, 또는 재조합 조직 보호 사이토카인 약 40 내지 약 300ng/ml를 함유한다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 이 요지에 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인 형태를 사용할 수 있다.

본원 전반에 걸쳐 재조합 조직 보호 사이토카인의 바람직한 수령자는 인간이 지만, 본원의 방법은 다른 포유동물, 특히 집안에서 키우는 동물, 가축, 애완동물 및 동물원 동물에도 똑같이 적용된다. 그러나, 본 발명은 이들로 한정되지 않으며, 본 발명의 이점은 어느 포유동물에게나 주어질 수 있다.

5.6. 재조합 조직 보호 사이토카인의 치료 및 예방 용도

아래 실시예 1에서 지적하는 바와 같이, 뇌 모세혈관 인간 내피에 에리트로포이에틴 수용체가 존재한다는 것은, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 표적이 인간 뇌에 존재하고, 본 발명의 이들 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 동물 연구는 인간의 치료 또는 예방으로 바로 해석될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 다른 요지에서는, 내피 세포 장벽에 의해 혈관으로부터 단리되지 않은 세포, 조직 또는 기관을 직접 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 노출시키거나, 또는 재조합 조직 보호 사이토카인-함유 약학 조성물을 조직 또는 기관의 혈관에 투여하거나 이들을 접촉시킴으로써, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 향상시키는 방법 및 조성물이 제공된다. 처리된 조직 또는 기관에서의 응답 세포의 향상된 활성이 긍정적인 효과를 나타내도록 한다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 부분적으로는 에리트로포이에틴 분자가 내피 세포 치밀 이음부를 갖는 기관(예컨대 뇌, 망막 및 고환 포함)의 모세혈관의 내피 세포의 관 표면으로부터 기저막 표면으로 수송될 수 있다는 발견에 기초를 두고 있다. 따라서, 장벽을 가로지르는 응답 세포는 재조합 조직 보호 사이토카인의 유리한 효과에 대해 감수성인 표적이고, 완전히 또는 부분적으로 응답 세포를 함유하여 의존하는 다른 세포 유형 또는 조직 또는 기관은 본 발명의 방법의 표적이다. 특 정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 재조합 조직 보호 사이토카인의 세포간 수송 후, 재조합 조직 보호 사이토카인은 응답 세포, 예컨대 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 또는 자궁내막 세포 상에서 에리트로포이에틴 수용체와 반응할 수 있고, 수용체 결합이 일련의 신호 변환을 개시시켜 응답 세포 또는 조직 내에서 유전자 발현 프로그램을 활성화시킴으로써 예컨대 독소, 화학요법에 사용되는 약제, 방사선 요법, 저산소증 등에 의한 손상으로부터 세포 또는 조직 또는 기관을 보호할 수 있다. 따라서, 응답 세포-함유 조직을 손상 또는 저산소성 스트레스로부터 보호하고 이러한 조직의 기능을 향상시키는 방법을 아래에 상세히 기재한다. 상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 방법은 인간 및 다른 동물에게 동등하게 적용될 수 있다.

본 발명의 한 실시태양을 실행함에 있어서, 포유동물 환자는 암 치료를 위한 전신 화학요법(방사선 요법 포함)을 받게 되는데, 이는 신경, 폐, 심장, 난소 또는 고환 손상과 같은 역효과를 갖는다. 전술한 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물은 화학요법 및/또는 방사선요법 전에 또한 상기 요법 동안에 투여되어, 화학요법에 사용되는 약제에 의한 손상으로부터 다양한 조직 및 기관을 보호한다(예를 들어, 고환을 보호한다). 화학요법의 약제의 순환 수준이 포유동물 신체에 위험을 야기할 수 있는 수준 미만으로 떨어질 때까지 계속 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양을 실행함에 있어서는, 자동차 사고로 사망한 인간으로부터 다수의 수령자에게 이식하기 위해 다양한 기관을 떼어낼 예정이었으며, 이중 일부에서는 먼 거리 및 긴 시간동안의 수송이 필요하였다. 기관을 떼어내기 전에, 사망자에게 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 주입하였다. 선적을 위해 떼어낸 기관을 전술한 바와 같은 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 관류액으로 관류시키고 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 침지액에 저장하였다. 본 발명에 따라 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 관류액을 사용하여 박동형 관류 장치로 특정 기관을 연속적으로 관류시켰다. 수송하는 동안, 이식할 때 또한 원위치에서 기관을 재관류시키는 동안 기관 기능의 열화는 최소한으로만 일어났다.

본 발명의 다른 실시태양에서는, 심장 판막을 치료하는 수술에서 일시적인 심장마비 및 동맥 폐색이 필요하였다. 수술하기 전에, 환자에게 체중 1kg당 4㎍의재조합 조직 보호 사이토카인을 주입하였다. 이러한 처치로 인해, 특히 재관류 후 저산소성 허혈에 의한 세포 손상이 방지되었다.

본 발명의 다른 실시태양에서는, 심폐 회로술과 같은 임의의 수술 절차에 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 한 실시태양에서는, 회로술 전에, 회로술 동안 및/또는 그 후에 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 약학 조성물을 투여하여, 뇌, 심장 및 다른 기관의 기능을 보호한다.

생체외 용도로 또는 신경 조직, 망막 조직, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소 또는 자궁내막 세포 또는 조직과 같은 응답 세포를 처리하는데 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하는 전술한 예에서, 본 발명은 혈관으로부터 먼 응답 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향 상시키는데 적합화된 단위 투여 형태의 약학 조성물을 제공하며, 이 약학 조성물은 단위 투여량당 약 0.01pg 내지 5mg, 1pg 내지 5mg, 500pg 내지 5mg, 1ng 내지 5mg, 500ng 내지 5mg, 1㎍ 내지 5mg, 500㎍ 내지 5mg 또는 1mg 내지 5mg의 효과적인 비독성 양의 재조합 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 재조합 조직 보호 사이토카인의 양은 약 1ng 내지 5mg이다. 바람직한 실시태양에서, 전술한 조성물의 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈성이 아니다.

본 발명의 다른 양태에서는, EPO 투여가 뇌 외상을 입은 동물의 인지 기능을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 EPO와 동일한 세포 보호 효과를 가질 것으로 예상된다. 5일 또는 30일간 지연시킨 후, EPO는 위약-치료된 동물과 비교하여 여전히 기능을 회복시킬 수 있었던 바, 뇌 활성을 재생 또는 회복시키는 EPO의 활성을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 또한 뇌 외상 및 다른 인지 기능장애를 치료(손상받은지 상당한 시간(예를 들어 3일, 5일, 1주일, 한달 이상)이 지난 뒤에 이루어지는 치료 포함)하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 조직 보호 사이토카인 효과량을 투여함으로써 손상 후 인지 기능장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재되어 있는 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인을 본 발명의 이 요지에 사용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 회복 요지는 기능장애를 유발한 최초의 손상을 받은 후에, 또한 그로부터 상당한 시간이 지난 후에 치료를 시작하는, 세포, 조 직 또는 기관 기능장애를 회복시키는 약학 조성물을 제조하기 위한, 본원의 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하는 치료는 질환 또는 증상이 급성 상태일 때와 만성 상태일 때의 사이에 걸쳐질 수 있다.

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈 활성을 갖는 경우, 바람직한 예에서는, 1회 투여당 체중 1kg당 약 0.01pg 내지 약 100㎍, 바람직하게는 약 1 내지 50㎍, 가장 바람직하게는 약 5 내지 30㎍의 투여량으로 재조합 조직 보호 사이토카인을 전신 투여할 수 있다. 이러한 유효 투여량은 재조합 조직 보호 사이토카인 투여 후 혈정 1ml당 약 10,000, 15,000 또는 20,000mU 이상의 혈중 재조합 조직 보호 사이토카인 수준을 획득하기에 충분해야 한다. 이러한 혈중 농도는 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 후에 달성될 수 있다. 필요한 경우, 이러한 투여량을 반복할 수 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요하다면, 매일 반복해서 투여할 수 있거나, 또는 적절한 간격 후, 예를 들어 매 1 내지 12주마다, 바람직하게는 매 1 내지 3주마다 반복해서 투여할 수 있다. 한 실시태양에서는, 효과량의 재조합 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 단일 투여 바이알 또는 다른 용기에 포장할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본원의 목적에 유용한 재조합 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈성이 아니다. 즉, 이 재조합 조직 보호 사이토카인은 본원에 기재된 활성을 나타낼 수는 하지만 헤모글로빈 농도 또는 적혈구용적율을 증가시키지는 않는다. 재조합 조직 보호 사이토카인의 이러한 적혈구 조혈성이 아닌 형태는 본 발명의 방법을 장기간 이용해야 하는 경우에 바람직하다. 다른 실시태양에서는, 적혈구 조혈 작용을 최대한으로 촉진하기 위해 필요한 것보다 더 많은 투여량으로 재조합 조직 보호 사이토카인을 투여한다. 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 반드시 적혈구 조혈 활성을 가질 필요는 없으며, 따라서 단위로 표현된 상기 투여량은 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 예로서 기재한 것일 뿐이며; 임의의 재조합 조직 보호 사이토카인에 적용될 수 있는 상기 투여량보다 더 큰 몰당량으로 제공한다.

본 발명은 또한 전술한 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 특정 분자를 함유하는 조성물을 투여함으로써 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 수송을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 신체의 특정 기관의 내피 세포 사이에 있는 치밀 이음부는 특정 분자가 들어가지 못하게 하는 장벽이 된다. 장벽이 있는 기관 내의 다양한 증상을 치료하기 위해서는, 약제의 통과를 용이하게 하는 수단이 필요하다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 혈액-뇌 장벽 및 다른 유사한 장벽을 가로질러 다른 분자를 전달하는 담체로서 유용하다. 재조합 조직 보호 사이토카인과 함께 장벽을 가로질러야 하는 분자를 포함하는 조성물을 제조하고, 이 조성물을 말초혈관에 투여하면 조성물이 장벽을 가로질러 세포간 수송을 달성한다. 장벽을 가로질러 수송될 분자와 재조합 조직 보호 사이토카인 사이의 결합은 불안정한 공유 결합이고, 이 경우 분자는 장벽을 가로지른 후 재조합 조직 보호 사이토카인과의 결합으로부터 유리된다. 재조합 조직 보호 사이토카인과의 결합에 의해 분자의 목적하는 약리학적 활성이 유지되거나 영향을 받지 않는다면, 이러한 복합체를 투여할 수 있다.

당해 분야의 숙련자는 공유 결합, 비-공유 결합 및 다른 수단에 의해 분자를 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 및 전술한 다른 약제와 결합시키는 다양한 수단을 알 것이며; 실험 시스템에서 조성물의 효능을 용이하게 평가할 수 있다. 불안정한 공유 결합, 가교결합 등을 비롯한 다수의 수단에 의해 분자를 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합시킬 수 있다. 바이오틴/아비딘 상호작용을 이용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 예컨대 목적하는 약리학적 활성을 갖는 분자의 도메인과 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절을 담당하는 도메인을 둘 다 포함하는 재조합 또는 합성 수단에 의해 혼성 분자를 제조할 수 있다.

다작용성 분자, 즉 다작용성 가교결합제를 통해 분자를 재조합 조직 보호 사이토카인에 접합시킬 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "다작용성 분자"는 2회 이상 연속해서 반응할 수 있는 작용기 하나(예: 폼알데하이드)를 갖는 분자, 및 하나보다 많은 반응기를 갖는 분자를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "반응기"는 가교결합제와 분자 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 분자(예: 내피 세포 장벽을 가로질러 전달되어야 하는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 특히 호르몬, 항생제, 또는 항암제)상의 작용기와 반응하는 가교결합제상의 작용기를 일컫는다. 용어 "작용기"는 유기 화학에서의 그의 표준적인 의미를 갖는다. 사용될 수 있는 다작용성 분자는 바람직하게는 생체적합성 결합기이다. 즉, 이들은 생체내에서 발암성이 아니고 독성이 없으며 실질적으로 면역원성이 아니다. 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 것과 같은 다작용성 가교결합제의 생체적합성을 결정하기 위해 상기 가교결합제를 동물 모델에서 용이하게 시험할 수 있다. 다작용성 분자는 바람직하게는 이작용성이다. 본원에 사용되는 용어 "이작용성 분자"란 2개의 반응기를 갖는 분자를 일컫는다. 이작용성 분자는 이종 이작용성 또는 동종 이작용성일 수 있다. 이종 이작용성 가교결합제는 벡터같은 접합을 허용한다. pH 6 내지 8로 완충된 수용액과 같은 수용액에서 가교-결합 반응이 이루어지도록 다작용성 분자가 충분히 수용성이고, 또한 보다 효과적인 생체내 분배를 위해 생성된 접합체를 수용성으로 유지하는 것이 특히 바람직하다. 전형적으로, 다작용성 분자는 아미노 또는 설프하이드릴 작용기와 공유 결합한다. 그러나, 다른 작용기(예: 카복실산 또는 하이드록실기)와 반응성인 다작용성 분자도 본 발명에서 고려된다.

동종 이작용성 분자는 둘 이상의 동일한 반응성 작용기를 갖는다. 동종 이작용성 분자상의 반응성 작용기는 예컨대 알데하이드기 및 활성 에스터기를 포함한다. 알데하이드기를 갖는 동종 이작용성 분자는 예를 들어 글루타르알데하이드 및 수바르알데하이드를 포함한다. 가교결합제로서의 글루타르알데하이드의 용도는 포즈난스키(Poznansky) 등의 문헌[Science 223, 1304-1306 (1984)]에 개시되어 있다. 둘 이상의 활성 에스터 단위를 갖는 동종 이작용성 분자는 다이카복실산과 N-하이드록시석신이미드의 에스터를 포함한다. 이러한 N-석신이미딜 에스터의 몇몇 예는 다이석신이미딜 수베레이트 및 다이티오-비스(석신이미딜 프로피온에이트), 및 이들의 가용성 비스-설폰산 및 비스-설폰에이트 염(예: 이들의 나트륨 및 칼륨 염)을 포함한다. 이들 동종 이작용성 시약은 다수의 시판업체(일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce))에서 구입할 수 있다.

이종 이작용성 분자는 둘 이상의 상이한 반응기를 갖는다. 반응기는 예컨대 에리트로포이에틴 뮤테인 및 분자상에 존재하는 상이한 작용기와 반응한다. 이종 이작용성 가교결합제상의 반응기와 반응하는 이들 두 상이한 작용기는 통상 아미노기, 예를 들어 리신의 엡실론-아미노기; 설프하이드릴기, 예를 들어 시스테인의 티올기; 카복실산, 예컨대 아스파트산의 카복실레이트; 또는 하이드록실기, 예컨대 세린의 하이드록실기이다. 물론, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인은 천연 에리트로포이에틴의 가교결합을 촉진하는 특정 아미노산 잔기를 갖지 않을 수도 있지만, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 뮤테인, 따라서 가교결합에 이용가능한 잔기를 알 것이다.

또한, 본 발명의 다양한 재조합 조직 보호 사이토카인 분자가 특정 가교결합제와 함께 사용할 수 있는 적합한 반응기를 가질 수는 없지만, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 에리트로포이에틴의 가교결합에 이용될 수 있는 기에 기초하여 가교결합제를 충분히 선택할 수 있을 것이다.

이종 이작용성 분자의 반응기가 아미노기와 공유 결합을 형성하는 경우, 공유 결합은 통상 아미도 또는 이미도 결합이다. 아미노기와 공유 결합을 형성하는 반응기는 예컨대 활성화된 카복실레이트기, 할로카본일기 또는 에스터기일 수 있다. 바람직한 할로카본일기는 클로로카본일기이다. 에스터기는 바람직하게는 N-하이드록시-석신이미드 에스터기와 같은 반응성 에스터기이다.

다른 작용기는 전형적으로 티올기, 티올기로 전환될 수 있는 기, 또는 티올기와 공유 결합을 형성하는 기이다. 공유 결합은 통상 티오에터 결합 또는 다이설파이드이다. 티올기와 공유 결합을 형성하는 반응기는 예를 들어 티올기와 반응하 는 이중결합 또는 활성화된 다이설파이드일 수 있다. 티올기와 반응할 수 있는 이중결합을 함유하는 반응기는 말레이미도기이지만, 아크릴로나이트릴과 같은 다른 기도 가능하다. 반응성 다이설파이드 기는 예컨대 2-피리딜다이티오기 또는 5,5'-다이티오-비스-(2-나이트로벤조산)기일 수 있다. 반응성 다이설파이드 결합을 함유하는 이종 이작용성 시약의 몇몇 예는 N-석신이미딜 3-(2-피리딜-다이티오)프로피온에이트(칼슨(Carlsson) 등, 1978, Biochem J., 173:723-737), 소듐 S-4-석신이미딜옥시카본일-알파-메틸벤질티오설페이트 및 4-석신이미딜옥시카본일-알파-메틸-(2-피리딜다이티오)톨루엔을 포함한다. N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)피로피온에이트가 바람직하다. 티올기와 반응하는 이중결합을 갖는 반응기를 포함하는 이종 이작용성 시약의 몇몇 예는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트 및 석신이미딜 m-말레이미도벤조에이트를 포함한다.

다른 이종 이작용성 분자는 석신이미딜 3-(말레이미도)프로피온에이트, 설포석신이미딜 4-(p-말레이미도-페닐)부티레이트, 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸-사이클로헥세인)-1-카복실레이트, 말레이미도벤조일-N-하이드록시-석신이미드 에스터를 포함한다. 석신이미딜 m-말레이미도벤조에이트의 설폰산나트륨 염이 바람직하다. 상기 언급된 이종 이작용성 시약 및 이들의 설폰에이트 염 다수는 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.)에서 구입할 수 있다.

가역적이거나 불안정한 상기 기재된 접합의 필요성은 당해 분야의 숙련자가 용이하게 결정할 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인 활성 및 목적하는 약리학 적 활성에 대해 시험관내에서 접합체를 시험할 수 있다. 접합체가 두 특성을 모두 보유하는 경우, 그의 적합성을 생체내에서 시험할 수 있다. 접합 분자가 활성을 위해 재조합 조직 보호 사이토카인으로부터 분리될 필요가 있는 경우에는, 재조합 조직 보호 사이토카인과의 불안정한 결합 또는 가역적인 결합이 바람직하다. 생체내 시험 전에 표준 시험관내 절차를 이용하여 불안정성을 시험할 수 있다.

이들 다작용성 시약 및 다른 다작용성 시약을 제조 및 사용하는 방법에 대한 추가적인 정보는 하기 문헌 또는 당해 분야에서 입수할 수 있는 다른 문헌으로부터 얻을 수 있다:

1. 칼슨 등, 1978, Biochem. J. 173:723-737.

2. 컴버(Cumber, J.A.) 등, 1985, Methods in Enzymology 112:207-224.

3. 쥬(Jue, R.) 등, 1978, Biochem 17:5399-5405.

4. 썬(Sun, T.T.) 등, 1974, Biochem. 13:2334-2340.

5. 블래틀러(Blattler, W.A.) 등, 1985, Biochem. 24:1517-152.

6. 리우(Liu, F.T.) 등, 1979, Biochem. 18:690-697.

7. 율(Youle, R.J.) 및 네빌(Neville, D.M. Jr.), 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486.

8. 러너(Lerner, R.A.) 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407.

9. 정(Jung, S.M.) 및 모로이(Moroi, M.), 1983, Biochem. Biophys. Acta 761:162.

10. 콜필드(Caulfield, M.P.) 등, 1984, Biochem. 81:7772-7776.

11. 스타로스(Staros, J.V.), 1982, Biochem. 21:3950-3955.

12. 요시타케(Yoshitake, S.) 등, 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399.

13. 요시타케 등, 1982, J. Biochem. 92:1413-1424.

14. 필치(Pilch, P.F.) 및 제크(Czech, M.P.), 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381.

15. 노빅(Novick, D.) 등, 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487.

16. 로만트(Lomant, A.J.) 및 페어뱅크스(Fairbanks, G.), 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261.

17. 하마다(Hamada, H.) 및 쓰루오(Tsuruo, T.), 1987, Anal. Biochem. 160:483-488.

18. 하시다(Hashida, S.) 등, 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63.

또한, 가교결합 방법은 민즈(Means) 및 피니(Feeney)의 문헌[1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12]에 개괄되어 있다.

본 발명의 전술한 방법 및 조성물이 가로지르는 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽, 혈액-심장 장벽, 혈액-신장 장벽 및 혈액-자궁 장벽을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

내피 세포 장벽을 가로질러 수송하고자 하는 분자는 예를 들어 호르몬(예: 성장 호르몬), 향신경성 인자, 항생제, 항바이러스제 또는 항진균제(예: 뇌 및 다른 장벽을 갖는 기관으로부터 통상 배제되는 것), 펩티드 방사성 의약품, 안티센스 약물, 생물학적으로 활성인 약제에 대한 항체 및 항바이러스제, 의약, 및 항암제를 포함한다. 이러한 분자의 비제한적인 예는 성장 호르몬 같은 호르몬, 신경성장인 자(NGF), 뇌-유도된 향신경성 인자(BDNF), 섬모체 향신경성 인자(CNTF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ1), 형질전환 성장 인자 β2(TGFβ2), 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3), 인터류킨 1, 인터류킨 2, 인터류킨 3 및 인터류킨 6, AZT, 종양괴사인자에 대한 항체, 및 사이클로스포린과 같은 면역억제제를 포함한다. 또한, 진단 목적으로 뇌 및 다른 차단된 기관 내의 세포, 조직 또는 기관을 가시화시키기 위하여, 에리트로포이에틴 또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인중 하나에 염료 또는 마커를 부착시킬 수 있다. 예로서, 환자에서 알쯔하이머 질병의 진행을 결정하기 위하여, 뇌 내에서 플라크를 가시화시키는데 사용되는 마커를 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인에 부착할 수 있다.

본 발명은 또한 내피 세포 치밀 이음부 장벽을 가로지르는 세포간 수송을 통해 수송되는 분자 및 상기 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 장벽을 가로질러 분자를 전달하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 상기 기재된 재조합 조직 보호 사이토카인과 분자 사이의 접합체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은, 본 발명의 예로서 제공되는 하기 비제한적인 실시예를 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 더욱 자세히 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 넓은 영역을 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.

6.1. 실시예 1: 인간 뇌에서 에리트로포이에틴 수용체의 분포

수술 과정 동안 제거된 통상적인 인간의 뇌(예컨대, 종양 절제시 종양이 없는 여분을 제공하기 위하여)를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.4)중 5% 아크롤레인중에서 즉시 고착시켰다. 진동 마이크로톰으로 40㎛ 두께의 박편을 절단해내었다. 자유-부유 박편, 및 에리트로포이에틴 수용체 항혈청(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서 수득함)의 1:500 희석액을 사용하는 간접적인 항체 퍼옥시다제-항퍼옥시다제 방법을 이용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 조직 박편을 과산화수소(메탄올중 3%, 30분간)로 전처리함으로써, 내인성 퍼옥시다재 활성을 정지시켰다. 1차 항체는 누락시키고 적절한 차단 펩타이드(산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 수득함)를 사용함으로써 조직 대조용을 수행하여, 염색이 에리트로포이에틴(EPO) 수용체에 특이적이었음을 확인하였다.

도 1은 특이적인 항-EPO 수용체 항체를 사용하는 면역 조직 화학에 의해 결정될 때 인간의 뇌의 모세혈관이 매우 높은 수준의 EPO를 나타냄을 보여준다. 이는 혈액 뇌 장벽에도 불구하고 EPO가 전신 순환계로부터 뇌 내로 침투할 수 있는 메카니즘을 제공한다.

도 2는 EPO 수용체가 인간 뇌에서 혈액 뇌 장벽을 형성하는 모세혈관 내에 또한 모세혈관 둘레에 밀집되어 편재되어 있음을 보여준다.

10㎛ 박편을 파라핀으로부터 절단해내고, 매립된 박편을 4% 파라폼알데하이드에 침지시킴으로써 고착시킨 것을 제외하고는, 도 1 및 도 2에서와 유사한 방법 을 도 3에 대해서 수행하였다. 도 3은 인간 뇌 모세혈관의 관내강 표면 및 항-관내강 표면에 고밀도의 EPO 수용체가 있어서, 순환계로부터 뇌 내로 EPO를 수송하기 위한 해부학적 기초를 형성함을 보여준다.

전자현미경용 울트라마이크로톰 상에서 조직을 절개하고 콜로이드성 금 입자로 2차 항체를 라벨링한 것을 제외하고는, 도 3에서와 유사한 방법을 수행하여 도 4를 수득하였다. 이 도면은 EPO 수용체가 인간 뇌의 내피 표면(^*) 상에서, 세포질 소포(화살표) 내에서 또한 아교세포 말단(+) 상에서 관찰되어, 순환계 내로부터 뇌로 EPO를 수송하기 위한 해부학적 기초를 제공함을 보여준다.

6.2. 실시예 2: 혈액-뇌척수액 치밀 장벽을 가로지르는 에리트로포이에틴

다 큰 수컷 스프라그-돌리 래트를 마취시키고 재조합 인간 에리트로포이에틴을 5000U/kg 체중으로 복강내 투여하였다. 뇌척수액 샘플을 4시간까지 30분 간격으로 소뇌숨뇌수조로부터 채취하고, 민감성의 특이적 효소-결합 면역분석법을 이용하여 에리트로포이에틴 농도를 결정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, CSF중 기준 에리트로포이에틴 농도는 8mU/ml이다. 수시간 지연시킨 후, CSF에서 측정한 에리트로포이에틴의 농도가 증가하기 시작하여, 2.5시간 이후부터는 p<0.01 수준에서 기준 농도로부터 크게 다르다. 약 100mU/ml의 피크 농도는 시험관 내에서 보호 효과를 나타내는 것으로 알려진 범위(0.1 내지 100mU/ml) 내에 있다. 피크까지의 시간은 약 3.5시간이며, 이는 피크 혈청 농도(1시간 미만)로부터 상당히 지연된 것이다. 이 실험의 결과는 에리트로포이에틴을 적절한 농도로 비경구 투여함으로써 상 당한 농도의 에리트로포이에틴이 치밀한 세포 이음부를 가로질렀음을 설명한다.

6.3. 실시예 3: 재조합 조직 보호 사이토카인

하기 절차를 이용하여, 하기 인간의 에리트로포이에틴 구조물을 제조하였다. 공개된 인간 cDNA 서열(접수번호 NM_000799)에 기초한 프라이머를 사용함으로써 인간의 뇌 cDNA로부터 PCR에 의해 인간 에리트로포이에틴의 cDNA를 클로닝하였다. cDNA의 5' 말단에 Xho I 부위를 도입하고 3' 말단에 Xba I 부위를 도입하도록 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:

HEPO-5-Xho I 5'-AGCTCTCGAGGCGCGGAGATGGGGGTGCACGAATG-3'(서열 번호: 8)

HEPO-3-Xba I 5'-ATGCTCTAGACACACCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3'(서열 번호: 9).

pCiNeo 포유동물 발현 벡터(프로메가(Promega))에서 Xho I 및 Xba I 부위 사이에 PCR 생성물을 클로닝시켰다. 클론의 서열을 결정하였으며, 이 서열은 염기 하나만 제외하고는 NM_000799의 서열과 일치되는 것으로 입증되었다. 코딩 서열의 염기 418(ATG로부터 번호 시작)은 G 대신 C여서, 제 1 메티오닌으로부터 출발하는 전체 길이 EPO 서열의 아미노산 140을 Arg로부터 Gly로 변화시켰다. 그러나, 이는 원래 서열로부터의 통상적인 서열 변화이며, 에리트로포이에틴의 대부분의 형태에 존재한다.

에리트로포이에틴 cDNA로부터의 코딩 서열은 다음과 같다:

이 cDNA는 아래와 같은 에리트로포이에틴의 전체 길이 아미노산 서열을 코딩한다:

서열 번호: 10의 첫번째 아미노산 잔기 27개는 선도 서열을 구성한다.

하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전체 길이 서열의 Asp 192에 히스티딘 6개가 결합되도록 신규 올리고뉴클레오타이드를 디자인함으로써, 6×His 택을 인간 EPO 단백질의 C-말단에 도입하였다:

3'-6×his-hEPO 5'-GGTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-3'(서열 번호: 134)

HEPO-5-Xho I 올리고와 6×His-Tag 올리고를 사용하는 PCR에 의해 EPO cDNA를 증폭시키고, pCiNeo 포유동물 발현 벡터의 Xho I 및 Xba I 부위 사이에 클로닝 시켰다. 다시 삽입물의 서열을 결정하고, 서열을 확인하였다.

상기 5.2 부분에 기재된, C-말단 6×His 택을 사용하는 인간 EPO cDNA 서열에 대한 변이를, 이 부분에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 올리고 유도된 변이 발생에 의해 도입하였다. 변이 클론의 서열을 결정하여 변이를 확인하였다.

본 발명의 히스티딘 택이 부착된 재조합 발현된 조직 보호 사이토카인과 함께 사용되는 하기 방법을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는, 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 여러 정제 방법을 이용할 수 있다. 재조합 세포(CHO-K1) 상청액(예를 들어, (Ni-CAM HC RESIN: High Capacity Nickel Chelate Affinity Matrix, Sigma, 카탈로그 번호 N 3158)로부터의 수지)을 온화하게 뒤섞으면서 완전히 재현탁시켰다. 이어, 수지 현탁액(팩킹된 수지 50㎕에 상응함) 100㎕를 미소원심분리 관(1.7ml 크기)에 첨가하였다. 혼합물을 4℃ 및 8,000rpm에서 5분간 원심분리시켜 수지를 펠렛화시키고, 상청액을 따라내 버렸다. 미소원심분리기는 메가퓨지(Megafuge) 1.0R(헤라유스 인스트루먼츠(Heraeus Instruments))이었다. 혼합물을 탈이온수(0.2㎛ 여과됨) 1ml로 2회 세척하여 에탄올을 제거하였다. 수지를 평형상태 완충액(50mM 인산나트륨, pH 8.0, 0.3M NaCl, 10mM 이미다졸) 500㎕에 재현탁시킨 다음, 혼합물을 50ml들이 원뿔형 관으로 옮겼다. 미소원심분리 관을 평형상태 완충액 500㎕로 세정한 후, 이 양을 50ml들이 원뿔형 관의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 3,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켜 수지를 펠렛화시켰다. 상청액을 제거하고 따라내 버렸다. 결합시키기 전에, 샘플(CHO-KI 상청액)을 3,800rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켰다. 세포 상청액을 수지에 첨가하였다. 샘플 첨가 완충액(50mM 인산나트륨, pH 8.0, 3M NaCl, 100mM 이미다졸)을 1X에 첨가하고, 회전 플랫폼에서 4℃에서 1시간동안 온화하게 혼합하였다. 사용된 이러한 플랫폼의 예는 뉴테이터(Nutator)(회전 플랫폼)(클레이 아담스(Clay Adams) 브랜드)이다. 혼합물을 3,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, SDS-PAGE 분석 및 ELISA(비결합)를 위해 저장하였다. 수지를 세척 완충액 500㎕에 재현탁시키고, 이어 혼합물을 미소원심분리 관으로 옮겼다. 50ml들이 원뿔형 관을 평형상태 완충액 500㎕로 세정한 다음, 이 양을 미소원심분리 관의 혼합물에 첨가하였다. 이어, 수지 현탁액을 회전 플랫폼에서 4℃에서 10분간 혼합하였다. 현탁액을 8,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켰다(제 1 세척액을 ELISA를 위해 저장할 수 있다). 수지를 세척 완충액 1ml에 재현탁시키고, 수지 현탁액을 다시 회전 플랫폼에서 4℃에서 10분간 혼합하여, 수지를 1회 더 세척하였다. 세척액을 버렸다. 이어, 용리 완충액(50mM 인산나트륨, pH 8.0, 0.3M NaCl, 500mM 이미다졸) 75㎕를 첨가하였다. 수지를 회전 플랫폼에서 4℃에서 10분간 혼합하였다. 혼합물을 8,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고 저장하였다. 히스티딘 택을 붙인 단백질은 이 분획에 있었다. 더욱 많은 단백질을 용리시키기 위하여, 용리 완충액(50mM 인산나트륨, pH 8.0, 0.3M NaCl, 500mM 이미다졸)을 다시 첨가하였다. 수지를 다시 회전 플랫폼에서 4℃에서 10분간 혼합하였다. 혼합물을 다시 8,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켰다. 용리된 분획을 단일 풀(pool)로서 또는 별도의 분획으로서 저장하였다.

다르게는, 하기 절차를 이용하여 정제된 히스티딘-택이 붙여진 사이토카인을 단리하였다. 컨디셔닝된 매질을 수거하고 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. 20mM 인산나트륨(pH 7.4)으로 평형화되고 2.5ml 100mM NiSO₄로 활성화된 5ml 하이트랩(HiTrap) 킬레이트화 칼럼(애머샴 바이오사이언시즈(Amersham biosciences))에 50ml 분취량을 첨가하였다. 칼럼을 20mM 인산나트륨(pH 7.4)으로 세척하고, 칼럼 부피의 25배에 걸쳐 20mM 인산나트륨(pH 7.4)중 0M 내지 0.5M 이미다졸의 구배로 용리시켰다. 유속은 5ml/분이었고, 분획 크기는 5ml였다.

SDS-PAGE 및 EPO ELISA에 의해, 재조합 조직 보호 사이토카인의 존재에 대해 분획을 분석하였다. 양성 분획을 모으고 10mM Tris(pH 7.0)에 대해 투석하였다. 풀을 10mM Tris(pH 7.0)로 평형화시킨 1ml 하이트랩 Q HP(애머샴 바이오사이언시즈)에 가하였다. 평형화 완충액으로 세척한 다음, 샘플을 1ml/분의 유속에서 칼럼 부피 10배에 걸쳐 0.5M까지의 NaCl 구배로 용리시켰다. 1ml 분획을 수거하고, SDS-PAGE, EPO ELISA 및 헥사-his 택에 대한 항체(Anti-His₆, 로슈(ROCHE))를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 분획을 모으고, 10kDa의 컷오프 크기를 갖는 센트리콘(아미콘(Amicon))을 사용하여 1 내지 2ml의 최종 부피로 농축시켰다.

재조합 조직 보호 사이토카인의 마지막 풀을 SDS-PAGE(뉴페이지(NuPage) 4-12%; 인비트로젠(Invitrogen))에 의해 분석하고, 제조업체에서 권장하는 방법에 의해 노벡스 콜로이달 블루(NOVEX Colloidal Blue)(인비트로젠)를 사용하여 가시화시 켰다. 생성된 겔로부터 재조합 조직 보호 사이토카인의 순도를 판정하였다. 당화된 재조합 조직 보호 사이토카인에 상응하는 밴드 하나만이 겔의 각 레인에 존재하여, 단리된 사이토카인의 높은 순도를 나타내었다.

리포펙타민을 사용함으로써 모든 플라스미드를 CHO-1 세포 또는 COS-7 세포에 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 내지 72시간 후에 세포로부터의 배지를 수거하였다. ELISA 분석에 의해 이 배지를 EPO에 대해 시험하고, 바로 또는 정제한 후에 조혈 분석 또는 신경세포 분석에 사용하였다.

하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 올리고 유도 변이 발생에 의해, 인간의 EPO cDNA 서열에 변이 K45D, S100E 및 A30N/H32T를 도입하였다:

다른 에리트로포이에틴 뮤테인 및 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 올리고 유도 변이 발생에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함한다:

다음은 제조된 구조물의 예이다: 인간 EPO(hEPO)-6×HisTag-pCiNeo 서열(서열 번호: 208); hEPO-6×HisTag-A30N/H32T-pCiNeo(서열 번호: 209); hEPO-6×HisTag-K45D-pCiNeo 서열(서열 번호: 210); hEPO-6×HisTag-S100E-pCiNeo 서열(서열 번호: 211); 및 hEPO-6×HisTag-K45D/S100E-pCiNeo 서열(서열 번호: 212). pCI-neo 포유동물 발현 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 증진 인자/프로모터 영역을 가져, 포유동물 세포에서의 클로닝된 DNA 삽입물의 구조 발현을 촉진시킨다.

이들 올리고뉴클레오타이드를 pCiNeo의 원래 인간 에리트로포이에틴 cDNA 클론에 어닐링시켜, 변이를 도입하였다. 변이 클론의 서열을 결정하여 변이를 확인하였다. 리포펙타민을 사용함으로써 모든 플라스미드를 CHO-1 세포 또는 COS-7 세포에 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 내지 72시간 후, 세포로부터의 배지를 수거하였다. ELISA 분석에 의해 이 배지를 에리트로포이에틴에 대해 시험하고, 바 로 또는 정제 후에 조혈 분석 또는 신경세포 분석에 사용하였다.

이어, 신경세포 분석에서 K45D 및 S100E 재조합 조직 보호 사이토카인을 둘 다 시험하였다. 구체적으로는, SK-N-SH 신경모세포종 세포를 사용하는 시험관내 신경 보호 분석을 이용하였다. SK-N-SH 세포를 24개 웰 플레이트에 40,000개 세포/웰의 밀도로 24시간동안 평판 배양시켰다. 이어, 재조합 조직 보호 사이토카인을 추가 24시간동안 3nM의 농도로 첨가하였다(에리트로포이에틴=시판 제제; EPO=CHO 세포에 발현된 에리트로포이에틴 및 재조합 조직 보호 사이토카인; 순수한 벡터=Epo 구조물 없이 벡터로 형질감염된 CHO 세포로부터의 세포 상청액). 이 전배양후, 세포를 로테논(5μM)에 4시간동안 노출시키고 세척한 다음, 정치시켜 24시간동안 회수하였다. 표시된 EPO 변이가 이들 단계 모두 동안에 존재하였다. 실험이 끝난 후 테트라졸륨 염료 WST-1으로 세포를 2시간 동안 배양함으로써 세포 생존을 정량하고(제조업체의 지시에 따라: 로슈 #1644807), 생존을 흡광도 판독치로서 표시하였다.

도 6A 및 도 6B는 K45D 및 S100E 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하는 에리트로포이에틴 및 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 SK-N-SH 신경모세포종 세포 신경 보호 분석(로테논에 대해)의 결과를 나타낸다. 그래프의 y-축은 흡광도 판독치를 나타내고, 데이터는 2회 결정의 평균±범위이다. 도 6A의 그래프는 K45D 및 S100E 샘플 내에서 세포가 생존을 유지하여 이들의 세포 보호 효과를 입증함을 명확히 보여준다. 도 6B는 hEPO-6×HisTag-PCiNeo의 플라스미드 맵을 보여준다.

6.4. 실시예 4: 조직 보호 사이토카인

본원에 기재된 용도에 바람직한 재조합 조직 보호 사이토카인을 특히 시알산 제거, 구아니딘화, 카밤일화, 아마이드화, 트라이나이트로페닐화, 아세틸화, 석신일화, 질화 또는 아르기닌 잔기 또는 카복실기의 개질에 의해 추가로 개질시킬 수 있다. 다르게는, 재조합 조직 보호 사이토카인으로 변이시키기 전에 천연 에리트로포이에틴 또는 시알산 제거, 구아니딘화, 카밤일화, 아마이드화, 트라이나이트로페닐화, 아세틸화, 석신일화 또는 질화된 에리트로포이에틴을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 에리트로포이에틴의 유도체에 이러한 개질을 가할 수도 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 추가적인 개질의 몇몇 예가 아래에 기재되어 있다. 당해 분야의 숙련자는 아래 기재된 절차를 이용하여, 천연 에리트로포이에틴 또는 그의 유도체에 변이를 도입하여 재조합 조직 보호 사이토카인을 생성시키기 전에, 이들 에리트로포이에틴 또는 그의 유도체를 화학적으로 개질시킬 수 있음을 알 것이다.

6.4.1. 재조합 조직 보호 사이토카인의 시알산 제거

하기 예시적인 절차에 의해 재조합 조직 보호 사이토카인에서 시알산을 제거할 수 있다. 세이카가쿠 아메리카(SEIKAGAKU AMERICA)(코드 번호 120050)에서 시알리다제(스트렙토코커스 종 6646K로부터 단리함)를 수득한다. 37℃에서 3시간동안 재조합 조직 보호 사이토카인을 시알리다제(0.025U/mg EPO)로 시알산 제거시킨다. 울트라프리 원심 필터 장치(Ultrafree Centrifugal Filter Unit)에 의해 반응 혼합물을 탈염 및 농축시킨다. 악타프라임(AKTAprime^TM) 시스템의 이온 교환 칼럼 에 샘플을 가한다. 선택된 완충액으로 단백질을 용리시킨다. 상당량의 단백질을 함유하는 용리된 분획의 IEF 겔 분석을 수행한다. 상부 2개의 밴드(IEF 겔 상에서 pI ∼8.5 및 ∼7.9에서 이동함)만을 함유하는 분획을 모은다. 단백질 함량을 결정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 시알산 함량을 결정한다. 유의한 시알산 함량이 검출되지 않는다.

도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, 무-시알산 에리트로포이에틴은 신경세포에 대해 천연 에리트로포이에틴만큼 효과적이었다. 혈청 회수시 세포자멸사하는 신경-유사 배아 육종 세포(P19)를 사용하여 시험관내 시험을 수행하였다. 혈청을 제거하기 24시간 전에, 에리트로포이에틴 또는 개질된 에리트로포이에틴 1 내지 1000ng/ml를 배양액에 첨가하였다. 그 다음 날, 배지를 제거하고, 혈청을 함유하지 않는 새로운 배지로 세포를 세척하고, 시험 성분(혈청 없음)을 함유하는 배지를 다시 48시간동안 배양액에 첨가하였다. 살아있는 세포의 수를 결정하기 위하여, 테트라졸륨 환원 시험을 수행하였다(셀타이터(CellTiter) 96; 프로메가, 인코포레이티드(Promega, Inc.)). 도 7 및 도 8에 도시되어 있듯이, 무-시알산 에리트로포이에틴은 세포 사멸을 방지함에 있어서 에리트로포이에틴 자체와 동일한 효능을 나타내는 것으로 보인다.

상기 기재된 바와 같이(브린즈(Brines) 등, 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97:10526-31) 중간대뇌동맥의 분포의 가역적인 손상을 수행하는 래트 국소 허혈 모델을 사용하여 생체내에서 신경 보호 활성을 보유함을 확인하였다. 동맥 폐색 개시시에 다 큰 수컷 스프라그-돌리 래트에게 무-시알산 에리트로포이에틴 또 는 에리트로포이에틴(5000U/kgBW, 복강내) 또는 비히클을 투여하였다. 24시간 후, 동물을 죽이고 그의 뇌를 연구하기 위해 제거하였다. 연속 박편을 절단해내고 테트라졸륨 염으로 염색하여 뇌의 생존 영역을 확인하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 무-시알산 에리트로포이에틴은 1시간동안의 허혈로부터 신경을 보호하는데 있어서(즉, 경색 부피를 감소시키는데 있어서) 천연 에리트로포이에틴만큼 효과적이었다. 도 10은 에리트로포이에틴과 무-시알산 에리트로포이에틴을 사용하여 투여량-반응을 비교한 다른 국소 허혈 모델의 결과를 나타낸다. 4㎍/kg의 가장 낮은 투여량에서, 개질되지 않은 에리트로포이에틴은 보호를 나타내지 않은 반면, 무-시알산 에리트로포이에틴은 보호 효과를 제공하였다. 각 군의 래트의 수 n은 4 이상이었다.

본 발명의 무-시알산 재조합 조직 보호 사이토카인으로부터도 유사한 결과가 예상된다.

6.4.2. 재조합 조직 보호 사이토카인의 카밤일화

진 젱(Jin Zeng)의 문헌[(1991) Lysine modification of metallothionein by carbamylation and guanidination, Methods in Enzymology 205:433-437]에 기재된 바와 같은 하기 절차에 따라, 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 개별적인 카밤일화 분자를 제조할 수 있다. 시안산칼륨을 재결정시킨다. 1M 보레이트 완충액(pH 8.8)을 제조한다. 재조합 조직 보호 사이토카인 용액을 동부피의 보레이트 완충액과 혼합한다. 시안산칼륨을 직접 반응 관에 0.5M의 최종 농도로 첨가한다. 잘 혼합하고 37℃에서 6 내지 16시간동안 배양한다. 완전히 투석시킨다. 투석 관 으로부터 생성물을 제거하고, 새 관에 수거한다. 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.

6.4.3. 재조합 조직 보호 사이토카인의 석신일화

알칼드(Alcalde) 등의 문헌[(2001), Succinylation of cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacter sp. 501 enhances its transferase activity using starch as donor, J. Biotechnology 86:71-80]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라, 개별적인 석신일화 분자를 제조하는데 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 0.5M NaHCO3(pH 8.0)중 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 석신산 무수물 15몰 과량으로 15℃에서 1시간동안 배양하였다. 증류수에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시켰다.

석신산 무수물을 무수 아세톤에 27mg/ml로 용해시킨다. 에펜도르프 관에서 10mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에서 반응시킨다. 재조합 조직 보호 사이토카인 단백질 및 석신산 무수물 50배 몰을 관에 첨가한다. 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간동안 관을 회전시킨다. 투석 카셋트(Slide-A-Laze 7K, Pierce 66373)를 사용하여, 10mM 인산나트륨 완충액에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시킨다. 생성물을 투석 카셋트로부터 제거하고 새 관에 수집한다. 부피를 측정하고 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고, 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.

6.4.4. 재조합 조직 보호 사이토카인의 아세틸화

사타케(Satake) 등의 문헌[(1990), Chemical Modification of erythropoietin: an increase in in-vitro activity by guanidination, Biochimica et Biophysica Acta. 1038:125-129]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 개별적인 아세틸화 분자를 제조할 수 있다.

에펜도르프 관에서 80mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에서 반응을 수행한다. 재조합 조직 보호 사이토카인 및 동몰의 아세트산 무수물을 첨가한다. 잘 혼합하고, 얼음상에서 1시간동안 관을 배양시킨다. 투석 카셋트(Slide-A-Laze 7K, Pierce 66373)를 사용하여, 물에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시킨다. 생성물을 투석 카셋트로부터 제거하고 새 관에 수집한다. 부피를 측정하고 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고, 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.

6.4.5. 재조합 조직 보호 사이토카인의 리신의 카복시메틸화

액타(Akhtar) 등의 문헌[(1999) Conformational study of N□-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystalline. Current Eye Research, 18:270-276]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 개별적인 N□-(카복시메틸)리신(CML) 개질된 분자(여 기에서는, 재조합 조직 보호 사이토카인의 하나 이상의 리실 잔기가 개질됨)를 제조할 수 있다.

글라이옥실산 200mM 및 NaBH3CN 120mM을 인산나트륨 완충액(50mM, pH 7.5)중에서 새롭게 제조한다. 에펜도르프 관에서, 재조합 조직 보호 사이토카인(포스페이트 완충액중)을 첨가하고; 용액중 리신 당량을 계산한다(약 8개 리신 잔기/몰). 3배 더 큰 NaBH3CN 및 5 또는 10배 더 큰 글라이옥실산을 관에 첨가한다. 각 관을 진탕시키고 37℃에서 5시간동안 배양시킨다. 샘플을 4℃에서 하룻밤동안 포스페이트 완충액에 대해 투석시킨다. 투석 후 각 생성물의 부피를 측정한다. 단백질 농도를 결정하고 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.

6.4.6. 재조합 조직 보호 사이토카인의 요오드화

아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관(IODO-Gen Pre-Coated Iodination Tubes)(제품 #28601)에 대한 피어스 케미칼 캄파니(일리노이주 록포드 소재)의 지침에 기재되어 있는 바와 같이 하기 절차에 따라, 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 개별적인 요오드화 분자를 제조할 수 있다.

NaI 0.1M을 제조하고, 인산나트륨 완충액(40mM, pH 7.4)에서 0.1ml/관의 총 반응 부피로 아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관(피어스, 28601)에서 요오드화를 수행한다. 인산나트륨 완충액과 단백질 기질(재조합 조직 보호 사이토카인)을 혼합하고, 이어 아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관으로 옮긴다. NaI를 1 내지 2mM의 최종 농도로 첨가하여, 14 내지 20의 NaI/단백질 몰비를 만든다. 잘 혼합하 고 온화하게 교반하면서 15분간 실온에서 배양한다. 반응 혼합물을 제거함으로써 반응을 중단시키고, 인산나트륨 완충액 3.9ml를 함유하는 관에 첨가한다(즉, 40배 희석). 예비-습윤 울트라프리 원심 필터 장치에 의해 생성물을 농축시킨다. 농축액의 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 농도를 결정하고 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.

다르게는, 하기 절차를 이용하여 재조합 조직 보호 사이토카인을 요오드화시킬 수 있다. 1mCi의 유리 Na125I를 함유하는 100ul PBS(20mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 아이오도 비이드(피어스, 일리노이주 록포드 소재) 하나를 5분간 항온처리하였다. 이어, 100ul PBS중 재조합 조직 보호 사이토카인 100㎍을 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 10분간 배양한 후, 반응 용기로부터 200ul 용액을 제거함으로써(아이오도 비이드는 남겨둠) 반응을 중단시켰다. 센트리콘 10 칼럼상에서 겔 여과시킴으로써 과량의 요오드를 제거하였다. 도 11에 도시되어 있는 바와 같이, 이러한 방식으로 제조된 아이오도-에리트로포이에틴은 혈청 회수로부터 P19 세포를 보호하는데 효율적이다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 요오드화로부터 유사한 결과를 예상할 수 있음을 알 것이다.

재조합 조직 보호 사이토카인을 요오드화시키는 또 다른 방법이 아래에 개략적으로 기재된다. 100ul PBS중 재조합 조직 보호 사이토카인 100㎍을 500uCi Na125I에 첨가하고 에펜도르프 관에서 함께 혼합하였다. 클로라민 T(2mg/ml) 25㎕를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1분동안 항온처리하였다. 클로라민 T 중지 완충 액(PBS 중 2.4mg/ml 소듐 메타바이설파이트, 10mg/ml 티로신, 10% 글라이세롤, 0.1% 자일렌) 50㎕를 첨가하였다. 이어, 센트리콘 10 칼럼 상에서 겔 여과시킴으로써 아이오도티로신 및 요오드화된 재조합 조직 보호 사이토카인을 분리하였다.

6.4.7. 재조합 조직 보호 사이토카인의 바이오틴일화

EZ-링크 NHS-LC-바이오틴(제품 #21336)에 대한 피어스 케미칼 캄파니(일리노이주 록포드 소재)의 지침에 기재되어 있는 바와 같이 하기 절차에 따라, 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 개별적인 바이오틴일화 분자를 제조할 수 있다.

반응 직전에, EZ-링크 NHS-LC-바이오틴(피어스, 21336)을 DMSO에 2mg/ml로 용해시킨다. 50mM 중탄산나트륨(pH 8.3)을 함유하는 총 1ml 부피로 관(17×100mm)에서 반응을 수행한다. ∼20의 바이오틴/단백질 몰비로 재조합 조직 보호 사이토카인 및 <10%의 EZ-링크 NHS-LC-바이오틴을 첨가한다. 잘 혼합하고 얼음상에서 2시간동안 배양한다. 울트라프리 원심 필터 장치에 의해 반응 생성물을 탈염 및 농축시킨다. 생성물을 새 관에 모은다. 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 분석한다.

재조합 조직 보호 사이토카인의 유리 아미노기를 바이오틴일화시키는 방법이 아래에 개시되어 있다. D-바이오틴오일-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스터(베링거 만하임(Boehringer Mannheim) #1418165) 0.2mg을 100ul DMSO에 용해시켰다. 호일로 덮인 관에서 약 0.2mg 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하는 400ul PBS와 이 용액을 합하였다. 실온에서 4시간동안 배양한 후, 센트리콘 10 칼럼 상에서의 겔 여과에 의해 미반응 바이오틴을 분리하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 바이오틴일화 에리트로포이에틴은 p19 세포를 혈청 회수로부터 보호한다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 바이오틴일화에 의해서도 유사한 결과가 예상됨을 알 것이다.

마지막으로, 워초우스키 등의 문헌["Biotinylated recombinant human erythropoietins: Bioactivity and Utility as a receptor ligand", Blood, 1989, 74(3):952-8]에서, 저자들은 에리트로포이에틴을 바이오틴일시키는 3가지 상이한 방법을 이용한다. 바이오틴을 (1) 시알산 잔기; (2) 카복실레이트기; 및 (3) 아미노기에 첨가한다. 저자들은 마우스 비장 세포 증식 분석을 이용하여, (1) 시알산 잔기에 바이오틴 잔기를 첨가하면 에리트로포이에틴의 생물학적 활성을 불활성화시키지 않고; (2) 카복실레이트기에 바이오틴을 첨가하면 에리트로포이에틴의 생물학적 활성을 실질적으로 불활성화시키며; (3) 아미노기에 바이오틴을 첨가하면 에리트로포이에틴이 생물학적으로 완전히 불활성화됨을 입증한다. 이들 방법 및 개질체는 본원에 완전히 포함된다. 도 12는 혈청-결핍된 P19 분석에서 바이오틴일화 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 활성을 보여준다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 요오드화에 의해 유사한 결과가 예상됨을 알 것이다. 6.15. 부분 참조.

6.5. 실시예 5: 다른 방법에 의한 재조합 조직 보호 사이토카인의 개질

6.5.1. 트라이나이트로페닐화

플랩 등의 문헌["Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups", 1971, J. Biol. Chem. 246, 939-845]에 기재되어 있는 바와 같이 2,4,6-트라이나트로벤젠설폰에이트로 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 개질시켰다.

6.5.2. 아르기닌 개질

리올단의 문헌["Functional arginyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione", Riordan JF, Biochemistry 1973, 12(20):3915-3923]에 기재된 바와 같이 2,3-부테인다이온으로 재조합 조직 보호 사이토카인을 개질시켰다.

에리트로포이에틴의 아미노산 잔기를 개질시키는 다른 개질법에서는, 실온에서 0.5 내지 3시간의 다양한 시간동안 수행되는 다카하시(Takahashi)의 문헌[1977, J. Biochem. 81:395-402]에 기재되어 있는 방법에 따라 페닐글라이옥살을 사용함으로써 아르기닌 잔기를 개질시켰다. 반응 혼합물을 물에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시켰다. 에리트로포이에틴의 이러한 개질된 형태의 용도는 본원에 포함된다. 상기 기재된 신경-유사 P19 세포 분석을 이용하여 페닐글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴을 시험하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 이 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴은 그의 신경 보호 효과를 완전히 보유한다. 본 발명의 유사하게 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인에서도 유사한 결과가 얻어진다.

패티 등의 문헌["Identification of functional arginine residues in ribonuclease A and lysozyme", Patthy, L, Smith EL, J. Biol. Chem 1975, 250(2):565-9]에 기재된 바와 같이 사이클로헥산온으로 재조합 조직 보호 사이토카인을 개질시켰다.

워버 등의 문헌["Proceedings: Carboxypeptidase B: modification of functional arginyl residues" Werber, MM, Sokolovsky M, Isr. J. Med. Sci. 1975 11(11):1169-70]에 기재되어 있는 바와 같이 페닐글라이옥살로 재조합 조직 보호 사이토카인을 개질시켰다.

6.5.3. 티로신 개질

네슬러(Nestler) 등의 문헌["Stimulation of rat ovarian cellsteroidogenesis by high density lipoproteins modified with tetranitromethane", Nestler JE, Chacko GK, Strauss JF 3rd., J. Biol. Chem. 1985년 6월 25일; 260(12):7316-21]에 기재되어 있는 바와 같이 테트라나이트로메테인을 사용하여 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 배양하였다.

6.5.4. 글루탐산(및 아스파트산) 개질

카복실기를 개질시키기 위하여, 캐러웨이(Carraway) 등의 문헌["Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen." Carraway KL, Spoerl P, Koshland DE Jr., J. Mol. Biol. 1969년 5월 28일; 42(1):133-7]에 기재되어 있는 바와 같이 1M 글라이신아마이드중 0.02M EDC를 사용하여 pH 4.5 및 실온에서 재조합 조직 보호 사이토카인(100μg)을 60분간 배양하였다.

6.5.5. 트립토판 잔기 개질

알리(Ali) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 1995년 3월 3일; 270(9):4570-4]에 기 재되어 있는 바와 같이 20mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5)중 20uM n-브로모석신이미드를 사용하여 실온에서 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 배양하였다. 코로치키나(Korotchkina)의 문헌[Korotchkina, LG 등, Protein Expr Purif. 1995년 2월; 6(1):79-90]에 기재되어 있는 방법에 의해 산화된 트립토판 잔기의 수를 결정하였다.

6.5.6. 아미노기의 제거

재조합 조직 보호 사이토카인의 아미노기를 제거하기 위하여, 코키니(Kokkini, G.) 등의 문헌["Modification of hemoglobin by ninhydrin", Blood, Vol. 556, No. 4 1980:701-705]에 기재되어 있는 바와 같이 20mM 닌하이드린(일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 제품)을 함유하는 PBS(pH 7.4) 중에서 37℃에서 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 2시간동안 배양시켰다. 생성물을 소듐 보로하이드라이드 또는 리튬 알루미늄 하이드라이드와 반응시킴으로써, 생성된 알데하이드를 환원시켰다. 구체적으로는, 실온에서 PBS중 0.1M 소듐 보로하이드라이드를 사용하여 에리트로포이에틴(100ug)을 30분간 배양시켰다. 샘플을 얼음상에서 10분간 냉각시키고, 이를 PBS에 대해 하룻밤동안 3회 투석시킴으로써 환원을 종결시켰다. (코키니, Blood, Vol. 556, No. 4, 1980:701-705). PBS중 0.1M 리튬 알루미늄 하이드라이드를 사용하여 실온에서 30분간 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 배양시킴으로써 리튬 알루미늄 하이드라이드에 의해 환원시켰다. 샘플을 얼음상에서 10분간 냉각시키고 이를 PBS에 대해 하룻밤동안 3회 투석시킴으로써 환원을 종결시켰다.

6.5.7. 다이설파이드 환원 및 안정화

500mM DTT를 사용하여 재조합 조직 보호 사이토카인(100ug)을 60℃에서 15분간 배양하였다. 이어, 물중 20mM 아이오도아세트아마이드를 혼합물에 첨가하고, 어두운 곳에서 실온에서 25분간 배양하였다.

6.5.8. 제한된 단백질 분해

재조합 조직 보호 사이토카인에 대해 특정 잔기를 표적으로 하는 제한된 화학적 단백질 분해를 실시할 수 있다. 질소 압력하에 뚜껑을 막은 관에서, 50% 아세트산중 50배 과량의, 트립토판 잔기 뒤를 특이적으로 절단하는 2-(2-나이트로페닐설페닐)-3-메틸-3'-브로모인돌레닌과 재조합 조직 보호 사이토카인을 어두운 곳에서 실온에서 48시간동안 반응시켰다. 트립토판으로 급냉시키고 탈염시킴으로써 반응을 종결시켰다.

상기 나타낸 바와 같이, 재조합 조직 보호 사이토카인은 개질될 수 있으며, 본 발명의 원리로부터 벗어나지 않으면서 조직 보호 사이토카인 분자의 여러 개질 및 추가적인 개질을 수행할 수 있다.

6.6. 실시예 6: 신경 보호 효과를 갖는 조직 보호 사이토카인

맨리(Manley) 등의 문헌[2000, Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke, Nat Med 2000년 2월; 6(2):159-63]에 따라 물 중독 분석을 이용하여, 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴의 신경 보호 효과를 평가하였다. 암컷 C3H/HEN 마우스를 사용하였다. 마우스에게 400ng/kg bw DDAVP(데스모프레신)와 함께 물을 체중의 20%로 복강내 투여하였 다. 마우스에게 에리트로포이에틴(A) 또는 조직 보호 사이토카인:무-시알산 에리트로포이에틴(B), 카밤일화 무-시알산 에리트로포이에틴(C); 석신일화 무-시알산 에리트로포이에틴(D), 아세틸화 무-시알산 에리트로포이에틴(E); 요오드화 무-시알산 에리트로포이에틴(F); 카복시메틸화 무-시알산 에리트로포이에틴(G); 카밤일화 에리트로포이에틴(H); 아세틸화 에리트로포이에틴(I); 요오드화 에리트로포이에틴(J) 또는 N⁶-카복시 메틸 에리트로포이에틴(K)을 투여하였다. 물을 투여하기 24시간 전에 또한 물 투여시에 다시 에리트로포이에틴 또는 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴 100㎍/kg 투여량을 마우스에게 주었다. 맨리 등으로부터의 변형된 등급을 사용하여 마우스를 평가하였다. 변형된 등급은 아래 기재되어 있다:

우리/테이블을 돌아다님
예	0
아니오	1
눈으로 물체를 쫓음
예	0
아니오	1
수염 움직임
있음	0
없음	1
다리-꼬리 움직임
정상	0
경직	1
마비	2
통증 움츠림(발끝 쑤시기)
예	0
아니오	1
이동의 협조
정상	0
비정상	1
테이블 가장자리에서 멈춤
예	0
아니오	1
가능한 총 등급	8

15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 및 180분에 마우스의 등급을 매겼다. 도 14는 대조용 마우스가 경험하는 신경세포 결핍의 백분율로서, 에리트로포이에틴 또는 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴을 투여받은 마우스의 수행능력을 플롯팅한다. 도 14는 조직 보호 사이토카인이 물 중독에 의해 유도되는 신경 외상으로부터 마우스를 보호함을 보여준다. 유사하게 화학적으로 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인으로부터도 유사한 결과가 예측된다. 통계학적 의의도 결정하였다. 대조용과 비교하여 상당한 차이(p<0.05)를 갖는 투여 계획은 *로 나타내는 한편, 매우 상당한 차이(p<0.01)를 나타내는 것은 **로 나타낸다.

6.7. 실시예 7: 이식을 위해 준비된 심장의 기능 유지

델케이어(Delcayre) 등의 방법(1992, Amer. J. Physiol. 263:H1537-45)에 따라 수행되는 생체외 연구를 위하여 심장을 제거하기 24시간 전에, 체중 300 내지 330g의 위스타(Wistar) 수컷 래트에게 에리트로포이에틴(체중 1kg당 5000U) 또는 비히클을 투여한다. 펜토바비탈(0.3mL)로 동물을 죽이고, 정맥내로 헤파린(0.2mL)을 주사한다. 처음에는, 심장을 15분간 평형화시킨다. 이어, 8mmHg의 확장말기압을 나타내는 부피까지 좌심실 풍선을 팽창시킨다. 좌심실 풍선 부피를 0.02mL 분량만큼 증가시키면서 팽창시킴으로써 좌심실 압력-부피 곡선을 만든다. 부피가 0일 때를 좌심실의 확장말기압이 0인 시점으로 정의한다. 압력-부피 곡선을 완성한 후, 좌심실 풍선을 수축시켜 확장말기압을 다시 8mmHg로 만들고, 관상동맥의 흐름을 점검한 후 15분동안 조절기간을 둔다. 이어, 50mL 셀시어(Celsior)+분자로 심장을 정지시켜, 60cm H₂O의 압력하에 4℃에 둔다. 이어, 심장을 제거하고 동일한 용액으로 채워지고 얼음 조각으로 둘러싸인 플라스틱 용기에 넣어 4℃에서 4시간동안 저장한다.

저장기간이 끝난 후, 심장을 랑겐도르프(Langendorf) 장치로 옮긴다. 풍선 카테터를 좌심실에 다시 삽입하고 허혈전 기간동안과 동일한 부피로 다시 팽창시킨다. 심장을 37℃에서 2시간 이상동안 재관류시킨다. 15분동안의 재유동동안 재관류 압력을 50cm H₂O로 설정한 다음, 이후 2시간동안 100cm H₂O로 되돌린다. 다시 박동시킨다(1분당 320회 박동). 재관류시킨지 25, 45, 60 및 120분 후에 수축지수 및 확장기압을 3회씩 등용적 측정한다. 이 시점에서, 압력 부피 곡선을 만들고, 45분 재관류동안의 관상 동맥 유출물을 수거하여 크레아틴 키나제 누출을 측정한다. 쌍을 이루지 않은 t-시험을 이용하여 두 처리 군을 비교하고, 확장말기압 데이터를 사용하는 선형 복귀를 이용하여 순응성 곡선을 디자인한다. 도 15에 도시된 바와 같이, 에리트로포이에틴으로 처리한 후 좌심실 압력이 상당히 개선되었고 부피-압력 곡선이 개선되었으며, 좌심실 확장기압의 감소 및 크레아틴 키나제 누출의 감소가 일어났다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 처리함으로써 유사한 결과가 예상된다.

6.8. 실시예 8: 허혈성 손상으로부터 심근육을 보호하는 에리트로포이에틴

24시간 전에 미리 재조합 인간 에리트로포이에틴을 투여(체중 1kg당 5000U)한 다 큰 수컷 래트를 마취시키고, 관상 동맥 폐색을 위해 준비한다. 절차의 개시시 추가적으로 에리트로포이에틴을 투여하고, 좌측 주 관상 동맥을 30분간 폐색시 켰다가 푼다. 처치한 후 1주일동안 매일 동일한 투여량의 에리트로포이에틴을 투여한다. 이어, 동물의 심장 기능에 대해 연구한다. 도 16에 도시되어 있는 바와 같이, 모의시험 주사(염수)를 맞은 동물은 좌측 확장말기압의 큰 증가를 보여 심근 경색에 수반되는 확장된 강직 심장을 나타낸다. 대조적으로, 에리트로포이에틴을 투여한 동물은 모의시험 처리된 대조용과 비교하여 심장 기능의 저하를 나타내지 않는다(p<0.01 수준에서 유의한 차이). 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 처리할 때에도 유사한 결과가 예상된다.

6.9. 실시예 9: 말초혈관에 투여된 에리트로포이에틴에 의한 망막 허혈의 보호

허혈 스트레스를 받은 지 30분 후에 다수의 세포가 사멸할 정도로 망막 세포는 허혈에 대해 매우 민감하다. 또한, 당뇨병, 녹내장 및 황반 변성과 같은 다수의 통상적인 인간 질환에 수반되는 시력 저하에는 아급성 또는 만성 허혈이 잠재되어 있다. 현재, 허혈로부터 세포를 보호하는 효과적인 치료법이 없는 상태이다. 혈액과 망막 사이에는 대부분의 큰 분자를 차단하는 치밀 내피 세포 장벽이 존재한다. 말초 혈관을 통해 투여된 에리트로포이에틴이 허혈에 민감한 세포를 보호할 것인지의 여부를 시험하기 위하여, 로젠바움 등의 문헌[1997; Vis. Res. 37:3443-51]에 기재되어 있는 바와 같이 급성 가역성 녹내장 래트 모델을 이용하였다. 구체적으로, 다 큰 수컷 래트의 눈의 전실에 전신 동맥 혈압보다 높은 압력까지 염수를 주입한 다음 60분간 유지시켰다. 허혈을 유도하기 24시간 전에 동물에게 염수 또는 체중 1kg당 5000U의 에리트로포이에틴을 복강내 투여하고, 3일간 더 매일 계속 투여하였다. 처치한지 1주일 후에 어둠에 익숙해진 래트에 대해 망막전위도검 사를 수행하였다. 도 17 및 도 18은 염수로만 처리된 동물(도 17, 패널 C)(기능이 거의 유지되지 않음)과는 대조적으로, 에리트로포이에틴을 투여한 동물에서는 망막전위도(ERG)가 양호하게 보존됨을 보여준다(도 17, 패널 D). 도 18에서는 에리트로포이에틴으로 치료된 군과 염수로 처리한 군에 있어서 허혈이 발생된지 60분 후의 망막전위도 a- 및 b-파 진폭을 비교하고, 에리트로포이에틴에 의해 상당한 보호가 제공되었음을 보여준다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 처리함에 의해서도 유사한 결과가 얻어질 수 있다.

6.10. 실시예 10: 뇌 손상으로부터 야기되는 감소된 인지 기능에 대한 에리트로포이에틴의 회복 효과

뇌 외상을 입은 마우스의 감소된 인지 기능을 회복시키는 에리트로포이에틴의 능력을 입증하는 연구에서는, 브린즈 등의 문헌[PNAS 2000, 97:10295-10672]에 기재된 바와 같이 암컷 Balb/c 마우스에게 둔기 뇌 외상을 입히고, 5일 후에 체중 1kg당 5000U의 에리트로포이에틴을 매일 복강내로 투여하기 시작하였다. 손상을 받은 지 12일 후에, 매일 4회씩 모리스(Morris) 물 미로에서 동물의 인지 기능을 시험하였다. 치료된 동물과 치료되지 않은 동물이 이 시험에서 불량하게 행동하지만(가능한 90초 동안 약 80초간 수영함), 도 19는 손상받은지 5일째에 EPO 투여가 개시되는, 둔기에 의한 뇌 외상 후 각 마우스 군(n=16)에 대한 모리스 물 미로 시험의 결과를 보여준다. 첫번째 시험은 EPO 투여를 개시한지 1주일 후에 시작하였다(손상을 받은지 12일 후). 두 동물 군은 가능한 90초중 ∼80초동안 수영하는 등 불량하게 행동하였다. 에리트로포이에틴으로 치료된 동물은 보다 양호하게 행동하 였다(이 도면에서는, 마이너스 값이 더 우수한 것이다). 매일 평균 4회 시험하였다. 에리트로포이에틴 치료가 외상을 입은 지 30일 후까지 지연되는 경우에도(도 20), 인지 기능의 회복이 보인다. 도 20에서는, 손상을 받은지 1개월 후부터 시작하여 주말을 제외하고는 매일 5000U/kg EPO로 각 마우스 군(n=7)을 처리하였다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 처리함으로써도 유사한 결과를 얻을 수 있다.

6.11. 실시예 11: 카이네이트 모델

카이네이트 신경독성 모델에서는, 브린즈 등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97;10295-10672]에 기재된 방법에 따라, 25mg/kg 카이네이트를 투여하기 24시간 전에 체중 1kg당 5000U의 투여량으로 복강내 투여된 무-시알산 에리트로포이에틴이 사망까지의 시간에서 볼 수 있듯이 에리트로포이에틴만큼 효과적임을 보여준다(도 21). 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리하는 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있다.

6.12. 실시예 12: 척수 손상 모델

6.12.1. 래트 척수 압박 시험 에리트로포이에틴 및 조직 보호 사이토카인

이 연구에서는 체중 180 내지 300g의 위스타(Wistar) 래트(암컷)를 사용하였다. 수술하기 전 12시간동안 동물을 절식시키고, 인도적으로 감금한 후 티오펜탈 소듐을 복강내 주사(40mg/kg-bw)하여 마취시켰다. 피부 침투(부피바케인 0.25%) 후, 절개 현미경을 사용하여 2cm 절개함으로써, 완벽한 1회 수준(T-3)의 척추후궁절제술을 수행하였다. 척수에 0.6뉴튼(65g)의 폐쇄력을 가하는 일시적인 동맥류 클립을 1분동안 경막 외에서 가함으로써, 외상성 척수 손상을 유도하였다. 클립을 제거한 후, 피부 절개부를 닫고 동물을 마취에서 깨게 한 다음 우리로 돌려보냈다. 저절로 배뇨가 다시 시작될 때까지 매일 2회 이상 방광 촉진을 병행하면서 래트를 계속 모니터링하였다.

40마리의 동물을 무작위적으로 5개의 군으로 나누었다. 대조용 군(I)(n=8)의 동물은 절개부를 닫은 직후 통상적인 염수를 투여받았다(정맥내 주사를 통해). 군(II)(n=8)은 rhEPO를 16㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(III)은 본 발명의 무시알산 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 16㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(IV)는 무-시알산 조직 보호 사이토카인을 30㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(V)는 본 발명의 무-시알산 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 30㎍/kg-bw로 투여받았으며; 이들 투여는 모두 정맥류 클립을 제거한 직후 단일 알약의 정맥내 주사로서 제공되었다.

바소(Basso) 등의 운동 등급을 사용하여 래트의 운동 신경 기능을 평가한다. 이 등급에서는, 동물에게 0(뒷발 움직임이 관찰되지 않음) 내지 21(정상적인 보행)의 점수를 부여한다. 각 동물이 받은 처리에 대해 모르는 동일한 시험관에 의해, 손상된지 1, 12, 24, 48 및 72시간 후 및 1주일 후에 래트를 기능 결손에 대해 시험한다.

도 22는 30일간의 기간에 걸쳐 척수 외상으로부터 회복되는 래트의 운동 등급을 보여주는 그래프이다. 이 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 에리트로포이에틴(군 II) 또는 조직 보호 사이토카인(군 III 내지 V)을 투여받은 래트는 더욱 용이하게 손상으로부터 회복되었으며, 대조용 래트보다 손상으로부터 전반적으로 우수하게 회복됨을 보여주었다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 치료함으로써도 유사한 결과가 예상된다.

두번째의 관련 연구에서도, 유사한 방식으로 동물에게 손상을 가하였다. 40마리의 동물을 무작위로 3개의 군으로 나누었다. 대조용 군(n=8)의 동물은 절개부를 닫은 직후 통상적인 염수를 투여받았다(정맥내 주사에 의해). 두번째 군(n=8)은 메틸프레드니솔론(이는 척수 손상에 통상적인 치료제임)을 매일 3회씩 30mg/kg으로, 이어 1주일에 2회 투여받았으며; 세번째 군은 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 S100E를 손상 직후 10ug/kg의 투여량으로 투여받았는데, 이들 투여는 모두 정맥류 클립을 제거한 직후 단일 알약의 정맥내 주사로서 제공되었다.

바소 등의 운동 등급을 사용하여 래트의 운동 신경 기능을 평가한다. 이 등급에서는, 동물에게 0(뒷발 움직임이 관찰되지 않음) 내지 21(정상적인 보행)의 점수를 부여한다. 각 동물이 받은 처리에 대해 모르는 동일한 시험관에 의해, 손상된지 1, 12, 24, 48 및 72시간 후 및 1주일 후에 래트를 기능 결손에 대해 시험한다.

도 37은 42일간의 기간에 걸쳐 척수 외상으로부터 회복되는 래트의 운동 등급을 보여주는 그래프이다. 이 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, S100E를 투여받은 래트는 더욱 용이하게 손상으로부터 회복되었으며, 대조용 래트 및 메틸프레드니솔론이 투여된 래트보다 손상으로부터 전반적으로 우수하게 회복됨을 보여주었다.

6.12.2. 래빗 척수 허혈 시험 에리트로포이에틴 및 조직 보호 사이토카인

체중 1.5 내지 2.5kg의 뉴질랜드 화이트 래빗(8 내지 12월령, 수컷) 36마리를 이 연구에 사용하였다. 동물을 12시간동안 절식시킨 후 인도적으로 감금하였다. 100% 산소중 3% 할로테인을 통해 마취를 유도하고, 50% 산소 및 50% 공기의 혼합물중 0.5 내지 1.5% 할로테인으로 마취를 유지시켰다. 정맥내 카테터(22게이지)를 왼쪽 귀 정맥에 넣었다. 수술 절차 동안 링거 락테이트를 시간당 4ml/kg 체중(bw)의 속도로 주입시켰다. 감염을 예방하기 위하여, 수술 전에 세파졸린 10mg/kg-bw를 정맥내 투여하였다. 동물을 오른쪽 측면으로 누운 자세로 위치시키고, 피부를 포비돈 요오드로 준비한 다음, 부피바케인(0.25%)을 침투시키고, 12번째 갈비뼈 높이에서 척추에 평행하게 옆구리 피부를 절개하였다. 피부 및 피하 등허리 근막을 절개한 후, 가장 긴 허리근 및 엉덩갈비 허리근을 수축시켰다. 좌측 복막뒤로 접근하여 복부 대동맥을 노출시키고, 좌측 신장 동맥보다 덜 움직이도록 하였다. PE-60 관으로 좌측 신장 동맥으로부터 멀리 대동맥 주위에서 고리를 매고 양 말단을 보다 큰 고무관을 통해 통과시켰다. PE 관을 잡아당김으로써, 대동맥을 20분간 비-외상 방식으로 폐색시켰다. 대동맥 폐색 전에 헤파린(400IU)을 정맥내 알약으로서 투여하였다. 폐색시킨지 20분 후, 관 및 카테터를 제거하고, 절개부를 닫은 다음, 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링하고 신경 기능에 대해 연속적으로 평가하였다.

36마리의 동물을 무작위로 6개의 군으로 나누었다. 대조용 군(I)에서, 동물(n=6)은 대동맥 폐색을 푼 직후에 통상적인 염수를 정맥내 투여받았다. 군(II)는 rhEPO를 6.5㎍/kg-bw로 투여받았고; 군(III)은 조직 보호 사이토카인(카밤일화 에리트로포이에틴)을 6.5㎍/kg-bw로 투여받았으며; 군(IV)는 다른 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 6.5㎍/kg-bw로 투여받았고; 군(V)는 군(IV)와 동일한 조직 보호 사이토카인을 20㎍/kg-bw로 투여받았으며; 군(VI)은 또 다른 조직 보호 사이토카인(무-시알산 카밤일화 에리트로포이에틴)을 20㎍/kg-bw로 투여받았는데, 이들 투여는 모두 재관류 직후 정맥내로 제공되었다(각 군에 대해 n=6).

재관류한지 1, 24 및 48시간 후의 처리에 대해 알지 못하는 연구자가 드러몬드(Drummond) 및 무어(Moore)에 기준에 따라 운동 기능을 평가하였다. 다음과 같이 각 동물에게 0 내지 4의 점수를 부여했다: 0=뚜렷한 다리 운동 기능 없이 하반신 마비; 1=불량한 다리 운동 기능, 약한 반중력 움직임만; 2=적당한 다리 기능, 우수한 반중력 강도, 몸체 아래로 다리를 펼 수 없음; 3=탁월한 운동 기능, 몸체 아래로 다리를 펼 수 있고 정상적이지는 않지만 깡총 뛸 수 있음; 4=정상적인 운동 기능. 하반신 마비 동물의 경우 하루에 2회 수작업으로 방광을 비워주었다.

도 23은 회복하는 래빗의 운동 기능을 플롯팅하는 그래프이다. 그래프는 단 2일간의 기간에 걸쳐서도 에리트로포이에틴 및 본 발명의 조직 보호 사이토카인이 래빗을 척수 손상으로부터 더욱 완전하게 회복시킴을 보여준다. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 치료할 때에도 유사한 결과가 예상된다.

6.13. 실시예 13: 에리트로포이에틴의 소염 효과

생체내 연구:

래트에서 MCAO

이탈리아 칼코 소재의 챨스 리버(Charles River)로부터 체중 250 내지 280g의 수컷 Crl:CD(SD)BR 래트를 수득하였다. 브린즈, 게지(Ghezzi, P.), 키난(Keenan, S.), 아그넬로(Agnello, D.), 데라네롤(de Lanerolle, N.C.), 세라미(Cerami, C.), 이트리(Itri, L.M.) 및 세라미(Cerami, A.)의 문헌[2000 Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury, Proc Natl Acad Sci USA 97:10526-10531]의 교시내용에 따라, 이들 래트에서 수술을 수행하였다. 간단히, 래트를 클로랄 수화물(400mg/kg-bw, 복강내)로 마취시키고, 목동맥을 보이게 한 다음, 2회 봉합 및 절단에 의해 우측 목동맥을 폐색시켰다. 우측 안와에 인접하고 입쪽에 있는 천공 구멍에 의해 MCA를 볼 수 있었으며, 코동맥으로부터 멀리 카테터를 삽입하였다. 이 고정된 MCA 환부를 둘러싸는 반음영(경계구역)을 만들기 위하여, 미세한 겸자에 의해 끌어당김으로써 1시간동안 반대쪽 목동맥을 폐색시켰다가 풀어주었다. PBS 또는 rhEPO(5,000U/kg-bw, 복강내; 이 모델 (1)에서 보호성인 것으로 이미 밝혀짐)를 MCAO 직후 투여하였다. 지시가 있는 경우에는, 앞서 기재된 바와 같이(8) 대뇌 피질 균질물에서 TNF 및 IL-6을 정량하였다. 시판중인 ELISA 키트(캘리포니아주 카마릴로 소재의 바이오소스(biosource))를 사용하여 균질물에서 MCP-1을 측정하였다.

MCAO한지 24시간 후에, 래트를 상기 기재된 바와 같이 마취시키고, 염수 100ml, 이어 인산나트륨 완충된 4% 파라폼알데하이드 용액 250ml로 심장 통과 방식으로 관류시켰다. 뇌를 신속하게 제거하고, 인산나트륨 완충된 4% 파라폼알데하이 드 용액에 2시간동안 고착시킨 다음, PBS중 20% 슈크로즈 용액으로 옮겨 하룻밤동안 둔 다음, 가라앉을 때까지 30% 슈크로즈 용액으로 옮겨 두었다가, -45℃에서 2-메틸뷰테인 중에서 냉동시켰다. -20℃의 냉동미세절단기(HM 500 OM, 마이크롬)에서 뇌의 횡단면에서 박편(30㎛)을 절단하고, 상이한 항원 또는 헤마톡실린-에오신 염색에 대한 조직 화학을 위해 각 15개의 박편을 선택하였다. 각각 하우저 등의 문헌에 기재된 방법 및 제조업체의 방법에 따라, 면역 반응성을 측정하기 위하여 항-아교세포 세동 산 단백질(GFAP) 마우스 모노클론 항체(1:250, 베링거 만하임, 이탈리아 몬자 소재) 및 항-cd11b(MRC OX-42) 마우스 모노클론 항체(1:50, 세로텍(Serotec), 영국)로 자유 부유 절편을 처리하였다. 절편을 모두 광현미경용의 코팅된 슬라이드 상에서 염수에 놓고, 등급이 매겨진 알콜을 통해 탈수시키고, 자일렌 중에 고착시킨 후, DPX 마운트앤트(BDH, 영국 풀 소재)를 사용하여 커버글래스로 덮었다. (10)에 기재된 바와 같이 인접 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다.

도 24는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. 대조용 래트(A), PBS로 처리된 허혈 래트(B), rhEPO(5,000U/kg-bw, 복강내, MCAO 직후)로 처리된 허혈 래트(C). 절편(B)는 대조용(A)과 비교하여 신경 세포 성분의 손실에 수반되는 염증에 일치되는 조직 염색의 현저한 감소를 보인다. rhEPO 전신 투여는 허혈 손상을 크게 감소시켜, 세포 사멸 또는 손상을 제한된 구역에 편재화시킨다(C). (배율 2.5×. 크기 바=800㎛).

도 25는 GFAP 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 전방 피질의 관상 절 편을 도시한다. 대조용 래트(A), PBS로 처리한 허혈 래트(B), rhEPO로 처리한 허혈 래트(C). GFAP-양성 공정에 의해 활성화된 별아교세포를 가시화시킨다(패널 B). 대표적인 rHEPO-처리된 동물에서의 현저한 수 감소 및 염색 강도 감소에 주목한다(패널 C). (배율 10×. 크기 바=200㎛).

도 26은 OX-42 항체로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. PBS로 처리된 허혈 래트(A) 및 rhEPO로 처리된 허혈 래트(B). 허혈 대뇌 반구에서는, 두 처리 군 모두에서 경색된 조직 둘레의 세포 염색이 특히 현저하지만, 염수 처리된 군에서 훨씬 더 진하고 더 넓다. (배율 20×; 크기 바=100㎛).

도 27은 OX-42 항체로 염색된 경색 영역에 인접한 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. rhEPO로 처리된 허혈 래트(B)에 비해 PBS로 처리된 허혈 래트(A)로부터 훨씬 더 높은 밀도의 단핵 염증 세포가 관찰된다. 전형적인 둥근 형상을 갖는 침투 백혈구가 경색의 부피를 확장시킬 것이다. (배율 10×; 크기 바=200㎛).

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 치료할 때에도 유사한 결과가 예상된다.

루이스(Lewis) 래트에서의 급성 실험 알러지성 뇌척수염(EAE)

6 내지 8주령의 암컷 루이스 래트를 챨스 리버로부터 구입하였다(이탈리아 칼코 소재). 열에 의해 죽인 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) H37Ra(디프코(Difco), 미시간주 디트로이트 소재) 7mg/ml가 첨가된 동 부피의 완전 프로인트(Freund's) 보조제(CFA, 시그마(Sigma))에 유화된 물중 기니아피그 MBP(시그마, 미주리주 세이트 루이스 소재) 50㎍을 100μ의 최종 부피로 약한 에터 마취하에 두 뒷발바닥에 주사함으로써, EAE를 래트에 유발시켰다. EAE의 징후에 대해 무작위적인 방식으로 래트를 조사하고, 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 질병이 없음; 1, 이완된 꼬리; 2, 조화운동불능; 3, 뇨실금과 함께 완전한 뒷다리 마비. 면역화시킨지 3일 후로부터 시작하여, 래트에게 r-Hu-EPO(EPOetin alfa, Procrit, 올쏘 바이오테크(Ortho Biotech), 뉴저지주 라리탄 소재)를 PBS중 지시된 투여량으로 1일 1회 복강내(i.p.) 투여하였다. 임상-등급 EPO가 인간의 혈청 알부민을 함유하였기 때문에, 대조용 동물에게도 항상 동량의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS를 투여하였다. EPO 5,000U/kg-bw를 매일 투여하면, 적혈구용적율이 30%까지 증가하였다. 지시될 때, PBS에 용해된, 덱사메타손(DEX) 1mg/kg-bw에 상응하는 1.3mg/kg-bw DEX 포스페이트 다이소듐 염(시그마)을 3일째부터 18일째까지 1일 1회 래트에게 피하 주사하였다. 지시가 있는 경우, 이미 기재된 바와 같이[아그넬로, 2000 #10] 뇌 및 척수 균질물에서 TNF 및 IL-6을 정량하였다.

도 28은 MBP로 면역화시킨지 3일 후부터 18일째까지 투여한, 상이한 투여량의 EPO의 EAE의 임상 징후에 대한 보호 효과를 도시한다. 표 1에 요약되어 있는 바와 같이, EPO는 투여량-의존 방식으로 질병의 개시를 지연시키고 질병의 심각도를 감소시켰지만, 최대 심각도까지의 시간을 지연시키지는 못하였다. 이 표에서 보는 바와 같이, 2,500 및 5,000U/kg-bw의 투여량에서 EPO는 평균 누적 점수를 상당히 감소시켰다.

질병이 수그러진 후 EPO 치료를 중단하고 래트를 2개월까지 모니터링하는 실험에서는, 투여 중단 후 질병 악화가 나타나는 DEX와는 대조적으로, 재발이 발견되 지 않았다(도 29). 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인을 사용하여 치료함으로써도 유사한 결과가 예측된다.

시험관내 연구:

1 내지 2일령의 신생 스프라그-돌리 래트로부터 신경아교세포의 1차 배양액을 준비하였다. 대뇌 반구의 수막을 제거하고 기계적으로 파괴시켰다. 세포를 트립신 2.5%와 DNA아제 1%의 용액에 분산시키고, 100㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과한 다음 10% 태아 송아지 혈청, 0.6% 글루코즈, 스트렙토마이신(0.1mg/ml) 및 페니실린(100Ul/ml)이 보충된 이글(Eagle's) 최소 필수 배지에 평판 배양시켰다(35mm 디쉬 1개당 140,000개 세포). 5% CO2가 있는 습윤화 배양기에 신경아교세포 배양액을 1주일에 2회 공급하고 37℃에서 생육시켰다. GFAP 및 그리포니아(Griffonia) 심플리시폴리아 아이소렉틴 B4의 면역 화학에 의해 평가되는 바와 같이, 97% 별아교세포 및 3% 미세아교세포를 갖는 2 내지 3주일 된 아교세포 배양액 상에서 모든 실험을 수행하였다. 18일된 래트 태아의 해마로부터 신경세포 배양액을 수득하였다. 뇌를 제거하고 수막을 제거한 다음, 해마를 단리하였다. 2.5% 트립신 용액 중에서 37℃에서 15 내지 20분간 배양함으로써 세포를 분산시킨 후 적정하였다. 신경아교세포에 사용되는 배지에 세포 현탁액을 희석시키고, 폴리오르니틴-코팅된 커버글래스 상에 160,000개 세포/커버글래스의 밀도로 평판 배양시켰다. 배양한 다음날, 사이토신 아라비노사이드 5μM로 보충된 신경세포 유지 배지(5㎍/ml 인슐린, 100㎍/ml 트랜스페린, 100㎍/ml 퍼트레신, 30nM Na 셀레나이트, 20nM 프로게스테론 및 페니실린 100U/ml로 보충된 덜베코(Dulbecco's) 변형 이글 배지 및 햄 (Ham's) 영양 믹스)중에 신경아교세포 단일층을 함유하는 접시로 커버글래스를 옮겼다. 해마 신경 세포가 신경아교세포 단일층에 대향하도록 커버글래스를 뒤집었다. 커버글래스에 부착되는 파라핀 점이 커버글래스를 신경아교세포 위로 지지하여, 두 세포 유형이 서로 접촉하지 않도록 하면서 가용성 성분은 확산될 수 있도록 하는 좁은 틈을 형성시켰다. 이러한 배양 조건에 의해, 미세관-결합된 단백질 2 및 GFAP의 면역 화학에 의해 평가되는 바와 같이, 분화된 신경 세포 배양액이 >98%의 동질성을 가지면서 생육할 수 있었다. rhEPO(10U/ml)의 존재 또는 부재하에 1μM 트라이메틸 틴(TMT)으로 세포를 24시간동안 처리하고, 상청액을 TNF 분석에 사용하였으며, 아래 기재된 바와 같이 세포 생존을 평가하였다. 지시될 때에는, 신경아교세포를 LPS의 존재하에 rhEPO와 함께 또는 없이 배양하고, 배양된 상청액에서 TNF를 측정하였다. 3-(4,5-다이메틸-티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석에 의해 세포 생존을 평가하였다(데니조트(Denizot, F.) 및 랑(Lang, R.)의 문헌[1986, Rapid colorimetric assay for cell growth and survival]). 테트라졸륨 염료 절차를 변형시켜 민감성 및 신뢰성을 개선시켰다(J. Immunol Methods 89:271-277). 간단하게, MTT 테트라졸륨 염을 무혈청 배지에 0.75mg/ml의 최종 농도로 용해시킨 다음, 37℃에서 3시간동안 처리한 후 세포에 첨가하였다. 이어, 배지를 제거하고 1N HCl:아이소프로판올(1:24)로 포마잔을 추출하였다. 560nm에서의 흡광도를 미소평판 판독기에서 판독하였다.

도 30은 rhEPO가 혼합된 신경세포-신경아교세포 배양액에서 신경세포 사멸-유도되는 TNF 생성을 방지함을 보여준다. 패널 A: rhEPO(10U/ml)로 처리되거나 처 리되지 않은, TMT 1μM에 의해 유도된 신경세포 사멸의 백분율. 패널 B: rhEPO(10U/ml)와 함께 또는 없이 신경세포의 존재(빗금친 막대) 또는 부재(검게 칠한 막대)하에 TMT 1μM에 노출된 신경아교세포로부터의 TNF-α 방출. 본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인으로 치료함에 의해서도 유사한 결과가 예상된다.

6.14. 실시예 14: NMDA 유도된 세포 사멸 분석

흥분 독성은 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 같은 글루타메이트 수용체의 과도한 활성화로서 정의될 수 있다. NMDA 수용체는 허혈 및 다른 외상에 반응하여 증가된 활성을 나타낸다(파우치(Fauci) 등의 문헌[1998, Harrison's Principles of Internal Medicine], 니시자와(Nishizawa)의 문헌[2001, Life Sci. 69, 369-381], 화이트(White) 등의 문헌[2000, J. Neurol. Sci. 179, 1-33]). 따라서, 본 분석은 세포 손상 및 사멸에 대한 화합물의 효과를 평가하는 모델로서의 역할을 한다.

1차 해마 신경세포에서 NMDA 흥분 독성의 방법

크론(Krohn) 등의 문헌(1998)에 이미 기재되어 있는 바와 같이, 본질적으로 신생 마우스(태어난지 24시간 미만)로부터 1차 해마 신경세포 배양액을 제조하였다. 간단히, 0.02% BSA를 함유하는 DMEM에서 해마를 절단해내었다. 조직을 0.1% 파파인 함유 DMEM으로 옮기고 37℃에서 20분간 배양하였다. 파파인 함유 배지의 흡인 및 MEMII의 첨가에 의해 소화를 중단시키고, 1000㎕ 피펫 끝으로 적정함으로써 해마 세포를 분리시켰다. 조직 조각을 참강시키고, 단일 세포들을 함유하는 상청액을 1% 트립신 저해제(유형 II-O) 및 1% BSA를 함유하는 MEMII 내로 옮겼다. 적정 단계를 3회 반복한 다음, 단일 세포들을 600U/분에서 10분간 원심분리하고, 생육 배지(MEMII, 20mM D-글루코즈, 100U/ml 페니실린, 100㎍ 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10% Nu-혈청(소), 2% B27 보충제, 26.2mM NaHCO3)에 재현탁시켰다. 24개 웰 플레이트에 해마 10개로부터의 세포를 접종하였다. 접종한지 1일 후, 세포를 사이토신-아라비노-푸라노사이드(1μM)로 처리하였다. 2일째에, 배지를 바꾸고 사이토신-아라비노-푸라노사이드(1μM)를 첨가하였다.

흥분 독성 분석

12일 된 배양액을 시험 화합물(비히클, R103E, R150E 또는 EPO) 5nM로 24시간동안 미리 배양시켰다. 13일째에, 배지를 세포로부터 제거하고, 배양액을 실온에서 300μM NMDA로 5분간 처리하면서 유지시켰다. 흥분 독성 손상 후, 미리 컨디셔닝시킨 배지를 배양액에 다시 넣어주고, 배양한지 24시간 후 트립신 블루 배제에 의해 손상을 정량하였다. 적어도 4개의 별도의 웰에서 각 조건당 약 300개의 신경세포를 계수하고, 실험을 2회 이상 반복하였다(크론, 프레이스(Preis, E.) 및 프렌(Prehn, J.H.M.)의 문헌[(1998) J. Neurosci. 18(20):8186-8197]).

도 31은 인간의 에리트로포이에틴 및 재조합 조직 보호 사이토카인 R130E 및 R150E가, NMDA 처리 전에 1차 해마 신경세포 배양액에 첨가될 때, NMDA에 의해 유도되는 세포 사멸을 효과적으로 감소시킴을 보여준다. R103E(5nM)로 처리된 세포는 비히클 대조용 세포(p=0.01)와 비교하여 상당히 적은 세포 사멸을 나타내었다. R103E(5nM)로 처리된 세포는 비히클 대조용 세포(p=0.01)와 비교하여 상당히 적은 세포 사멸을 나타내었다. R150E(5nM)로 처리된 세포는 용매 대조용 세포(p=0.001) 에 비해 세포 사멸을 약 20% 감소시켰다. (Statistics: ANOVA plus Tukey's post-hoc 시험).

6.15. 실시예 15: P19 세포에서 혈청 회수의 신경세포 보호

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 신경세포 보호 효과를 시험하기 위하여, PC19 세포 배양액으로부터의 혈청 회수를 모델로서 사용하였다. 피셔(W.H. Fischer) 박사가 클론 P19S1801A1을 제공하였다. 공기중 7% CO₂의 대기하에 습윤화된 배양기에서, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트, 및 1.2g/l NaHCO₃, 10mM Hepes 완충액(카를로 에르바(Carlo Erba), 이탈리아 밀라노 소재)을 갖는 10% 태아 송아지 혈청(FCS; 모두 영국 스코틀랜드 페이슬리 소재의 깁코(Gibco) 제품)이 보충된 덜베코 변형 이글 배지(DMEM)(이후, 완전 배지라고 함)에 세포를 유지시켰다. 무혈청 배지(N2)는 혈청이 제거되고 하기 성분이 첨가된 상기와 동일한 구성성분을 갖는다: 5㎍/ml 인슐린, 100㎍/ml 트랜스페린, 20nM 프로게스테론, 100μM 푸트레사인 및 30nM Na₂SeO₃(모두 시그마 제품). 사멸 실험을 위해, 10% 판크레아틴(깁코)으로 세포를 분리시키고, 완전 배지로 1회 세척한 다음, N2 배지로 2회 세척하고, 달리 지시되지 않는 한 25cm² 조직 배양 플레이크(팔콘 벡턴 디킨슨(Falcon Becton Dickinson), 뉴저지주 링컨 파크 소재)에 무혈청 배지 5ml중 104개 세포/cm²의 최종 밀도로 평판 배양하였다. 보호를 제공하여 혈청을 박탈한지 24시간 후에 세포자멸사 핵의 50%를 감소시키는 양성 대조용으로서 L 아세틸카니틴(100μM)을 취한다. 혈청을 박탈한지 24시간 후에, 플라스크(트립신 없음) 상에서 톡톡 침으로써 세포를 분리하고, 600rpm에서 10분간 사이토스핀(cytospin) 원심분리(미국 쉔던 써던)시킴으로써 현미경 슬라이드상에 접종한 다음, 카노이(Carnoy) 용액(메탄올:아세트산, 3:1)에 10분간 고착시키고, 훽스트(Hoechst) 33258(0.1㎍/ml PBS)로 37℃에서 1시간동안 염색시킨 후, 수도물로 15분간 세척하고 공기 건조시킨 후 정치시켰다. 여기 파장 365nm에서 형광 현미경(독일 자이스)으로 슬라이드를 관찰하였다. 5회 이상 실험하면서, 총 100개의 세포를 무작위로 계수함으로써, 세포자멸사 핵의 백분율을 결정하였다.

3nM Epo 또는 재조합 조직 보호 사이토카인 S100E를 사용하여 P19 세포를 24시간동안 미리 배양하였다. 이 처리에 의해, 혈청 회수에 의해 촉발되는 세포자멸사로부터 상당히 보호할 수 있었다(p<0.001). 데이터는 한 실험에서 3회 결정치의 평균이다. 실험을 2회 수행하였는데, 결과가 유사하였다.

도 32는 P19 세포에서 혈청 회수로부터의 신경 세포 보호를 보여준다. Epo, EpoWT 및 재조합 조직 보호 사이토카인 S100E로 전처리한 세포에서는 세포자별사한 세포의 백분율이 감소되었다. Epo로 처리된 세포는 미처리 대조용 세포에 비해 세포자멸사한 세포 사멸이 약 20% 감소하였다. EpoWT 및 S100E로 처리된 세포는 둘 다 미처리 대조용 세포에 비해 세포자멸사한 세포 사멸에서 약 10%의 감소를 나타내었다.

6.16. 실시예 16: 분화된 PC12 세포에서의 NGF 회수

본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인의 신경 세포 보호 효과를 시험하기 위하여, 모델로서 분화된 PC12 세포에서의 NGF 회수를 이용하였다. 이 분석은 세포자멸사의 잘 확립된 모델이다. 이 PC12 래트 세포주는 부신수질 크롬친화세포종으로부터 유도하였으며, NGF의 존재하에 신경세포-유사 세포로 분화될 수 있다(마스다 등, 1993, J Biol Chem 268, 11208-11216). PC12 세포주는 신경내분비 세포주이며, NGF의 존재하에 분화되어 신경세포-유사 표현형을 발현할 수 있다(보드리(Vaudry) 등, 2002, Science 296, 1648-1649). 세포를 완전히 분화시키면, 이들은 NGF-의존성이 되며, NGF를 회수하면 세포자멸사가 유도된다.

10% 열 불활성화된 말 혈청, 5% 열 불활성화된 태아 송아지 혈청, 1% 피루브산나트륨 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)(인비트로젠, 미국 칼스바드 소재)이 보충된 덜베코 변형 이글 배지(DMEM)에 PC12 세포를 유지시켰다.

실험을 위해, 콜라겐 G-코팅된 48개 웰 플레이트에서 1% 열 불활성화된 말 혈청, 1% 피루브산나트륨, 1% P/S 및 100ng/ml NGF(7S 신경 성장 인자, 마우스 상악하 샘, 칼비오켐(Calbiochem)에서 구입, 카탈로그 번호 480354)가 보충된 DMEM 중에서 웰당 24,000개 세포의 밀도로 세포를 7일간 분화시키는데, 매 2 내지 3일마다 배지를 바꿔주었다. 6일째에, 아미노산 100에서의 Epo 변이체(=S100E)를 지시된 농도로 24시간동안 세포에 첨가한 다음, 배지를 RPMI1640, 1% P/S로 교체하여 모든 세포로부터 NGF를 제거하였다. S100E를 재첨가하고, 양성 대조용(+NGF)으로서의 NGF(100ng/ml)도 재첨가하였다. 24시간 후, 테트라졸륨(MTT)-환원 시험에 의해 생존을 측정하였다.

도 33A 및 도 33B는 2개의 독립적인 실험에서 NGF를 회수한 분화된 PC12 세 포에서 S100E를 사용하여 예비 배양한 효과를 보여준다. 분화된 PC12 세포를 지시된 농도의 S100E로 24시간동안 전처리하였다(도 33A: 3pM, 도 33B: 0.00003pM-3pM). MTT 분석에서 생존을 측정하였다. NGF(100ng/ml)를 양성 대조용으로서 사용하였고, 무-NGF 배지(-NGF)를 음성 대조용으로서 사용하였다. 도 33에 제시된 데이터는 양성 대조용(+NGF)의 % 생존으로서 제시된다(두 실험에서 n=8). 일방 ANOVA 및 Bonferroni post-hoc 시험을 이용하여 음성 대조용 세포(-NGF)와 비교된 S100E 처리된 세포는 통계학적으로 유의한 생존 증가를 나타낸다. ^***p<0.001, ^*p<0.05. S100E에서 관찰된 효과는 역가 및 효능 면에서 이 시험 시스템에서의 Epo 효과와 유사하였다.

도 34는 NGF가 회수된 분화된 PC12 세포에서 Epo를 사용한 예비-배양의 효과를 보여준다. 분화된 PC12 세포를 Epo, S100E, 또는 카밤일화 Epo(30pM-30nM)로 24시간동안 전처리하였다. 화학적으로 개질된 Epo 분자인 AA24496은 UT-7 세포 분석에서 EPO보다 10000배나 활성이 낮다. MTT 분석에서 생존을 측정하였다. NGF(100ng/ml)를 양성 대조용으로서 사용하였고, 무-NGF 배지(-NGF)를 음성 대조용으로서 사용하였다.

6.17. 실시예 17: EPO 생체-분석 UT-7 세포 증식

UT-7은 K45D 같은 재조합 조직 보호 사이토카인의 적혈구 효과를 결정하는데 사용되는 백혈병 Epo-의존 세포주이다. UT-7 세포(도이췌 잠룽 본 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ), 카탈로그 번호 ACC 363)를 10% FBS 및 5ng/ml Epo의 존재하에 통상적으로 생육시켰다. Epo에 노출된 세포의 증식/생존(=생존 증가) 반응은 전통적인 말초-유형 Epo 수용체에 의해 매개된다. 증식 반응은 전통적인 Epo 수용체를 자극하는 Epo-변이체의 능력의 정량적인 척도이며, 이러한 능력과 관련되어 있다.

UT-7 세포 생존 분석 방법

인간 백혈병 세포주 UT7을 Epo 의존성으로 만들고, 첨가된 Epo/재조합 조직 보호 사이토카인에 대한 증식 반응을 이들의 생물학적 활성의 척도로서 사용하였다. 분석의 첫째날에, 10% 혈청 함유 Epo(5ng/ml)를 갖는 새로운 완전 RPMI 1640 배지(10% 공여 송아지 혈청, 4mM L-글루타민, rhuEPO 5ng/ml로 보충됨)로 세포를 옮겼다. 플라스크 1개당 배양액 20ml를 갖는 75cm² 플라스크에서 세포를 생육시켰다. 분석의 둘째날에는, 플라스크(들)로부터 50ml들이 원뿔형 관으로 세포를 옮기고, 1,000rpm 및 실온에서 5분간 원심분리시켰다. 사용한 배지는 버리고, 세포를 기아 배지(3% 공여 송아지 혈청, 4mM L-글루타민) 10ml로 2회 세척하였다. 상하 피펫 작용을 이용하여 세포를 기아 배지에 재현탁시킴으로써, 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포 밀도를 결정하기 위하여, 재현탁된 세포를 기아 배지로 4×10⁵개 세포/ml의 밀도까지 희석시키고(총 배양액 부피 10ml) 25cm² 플라스크에 넣었다. 5% CO₂가 있는 습윤화된 배양기에서 37℃에서 4시간동안 혼합물을 배양하였다. 배양이 끝날 무렵, 96개 웰 플레이트를 준비하였다. 4시간의 배양이 끝나면, 세포 배양액을 배양기로부터 제거하고, 세포를 플라스크에서 50ml들이 원뿔형 관으로 옮겼다. 내용물을 손으로 혼합하여 세포를 현탁된 상태로 유지시켰다. 기아 배지 50ml를 세포 없는 배지 블랭크로서 첨가하였다. 5개의 웰은 시약을 갖지 않는 대조용 세포였다. 다음 인접 웰 열은 최저 농도의 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유하였다. 그 이후의 인접 열 각각에는 연속적으로 더 커지는 농도의 재조합 조직 보호 사이토카인을 채웠다. 3% 혈청을 갖고 Epo를 갖지 않는 배지에서 배양된 세포 배양액을 96개 웰 플레이트의 각 웰에 200,000개 세포/ml로 100㎕를 평판 배양시켰다. 교반 플레이트 위에 놓인 궤도 진동 플랫폼을 이용하여, 내용물을 잠시 조심스럽게 혼합하였다. 5% CO₂를 갖는 습윤화된 배양기에서 37℃에서 3% 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 48시간동안 상이한 농도의 Epo 변이체(0.2pM 내지 20nM)를 갖는 플레이트를 배양하였다. 분석 4일째에, 96개 웰 플레이트를 배양기로부터 꺼내고, 층류 후드에서 실온에 정치시켰다. 즉시, 테트라졸륨 염료 WST1의 세포 대사동안 생성된 포마잔 생성물을 측정함으로써(이는 세포의 생존/세포의 수와 관련되어 있음) 생존을 정량하였다(450nm에서 분광광도측정 흡광도, 620nm에서의 배경 흡광도로부터 제함).

결과

UT7 세포는 Epo 함유 배지에서 3개월동안 안정하고 신뢰성있는 생육을 나타내었다.

K45D는 투여량 의존 방식으로 Epo-의존성 UT-7 세포의 생존 증가를 유도하였 다(EC₅₀ 294.0). 대조적으로, Epo의 경우의 EC₅₀은 58.13이었고(도 35), His-택을 갖는 Epo(EpoWT)의 경우는 608이었다. S100E는 <50nM(즉, 측정가능한 범위 내)의 농도에서 Epo-의존성 UT-7 세포의 생존을 증가시키지 않았다(50% 이상). 따라서, K45D는 Epo와 동일한 정도의 역가를 나타낸 반면, S100E는 Epo에 비해 1000배 이상 더 낮은 역가를 보여주었다.

R103E는 20nM 이하의 농도에서 Epo-의존성 UT-7 세포의 생존을 증가시키지 않았다. 즉, 그의 역가는 Epo에 비해 4배 이상 더 낮았다. R150E는 투여량 의존 방식으로 Epo-의존성 UT-7 세포의 생존을 유도하였다(EC₅₀ 20nM). 대조적으로, Epo(Epo#4)의 경우 EC₅₀은 66.5였다(도 36). 그러므로, R150E는 Epo에 비해 3배 더 낮은 역가를 보여주었다.

도 35는 UT-7 세포에서의 Epo, K45D 및 S100E의 농도-반응 곡선을 도시한다. 상이한 농도의 Epo, EpoWT, K45D 및 S100E를 UT-7 세포에 첨가하였다. WST-1 분석에서 48시간 후에 생존을 측정하였다. 데이터는 각각 2회 실시된 3가지 다른 실험의 평균±SD이다. 곡선은 비선형 회귀 곡선 핏이다.

도 36은 UT-7 세포에서의 Epo, R103E 및 R150E의 투여량 반응 곡선을 도시한다. 상이한 농도의 Epo, EpoWT, R103E 및 R150E를 UT-7 세포에 첨가하였다. WST-1 분석에서 48시간 후에 생존을 측정하였다. 데이터는 각각 2회씩 실시된 3가지 다른 실험의 평균±SD이다. 곡선은 비선형 회귀 곡선 핏이다.

6.18. 실시예 18: 말초혈관을 통해 투여된 재조합 조직 보호 사이토카인에 의한 망 막 허혈의 보호

6.9 부분에 기재되어 있는 바와 같이, 망막 세포는 허혈 스트레스를 받은지 30분이 지나면 다수가 사멸할 정도로 허혈에 대해 민감하다. 이 실험에서는, 로젠바움 등의 문헌[1997; Vis. Res. 37:3443-51]에 기재되어 있는 바와 같은 래트의 가역적인 녹내장 모델을 다시 이용하였다. 허혈 스트레스에 대한 재조합 조직 보호 사이토카인의 효과를 조사하였다.

다 큰 수컷 래트의 눈의 전방에 염수를 주입하기 위하여, 6.9 부분에 제시된 실시예에 개략적으로 기재된 방법에 따라 각 래트의 한쪽 눈을 손상시켰다. 재관류시, 즉 눈의 전방에서의 압박을 풀 때, 래트에게 Epo, 네가지 재조합 조직 보호 사이토카인(R103E, R150E, S100E 및 S100E/K45D)중 하나, 또는 염수 10㎍/kg을 정맥내 투여하였다. 손상시킨지 1, 3, 5 및 6일 후, 각 래트의 손상된 눈과 정상 눈에 대해 망막전위도를 수행하였다. 각 래트의 손상된 눈의 잠복기를 동일한 래트의 정상 눈의 잠복기와 비교하였다. 데이터는 정상 눈의 잠복기에 대한 손상된 눈의 잠복기의 비(따라서, 손상된 눈이 정상적인 기능을 갖는 래트의 비)로서 기록하였다. 손상 결과에는 두 가지 요소가 있다: 진폭(도 17, 패널 A에서 'b'로 표시된, 피크에서 저점까지의 차이) 및 잠복기(자극에 대한 반응이 피크에 도달하는데 걸리는 시간).

도 38은 다양한 치료 방법에서의 정상적인 눈의 잠복기에 대한 손상된 눈의 잠복기의 비를 도시한다. EPO로 치료된 래트는 염수로 처리한 래트보다 훨씬 우수한 1.2의 잠복기를 나타내었다. 네가지 재조합 조직 보호 사이토카인 각각은 EPO 와 동일하거나 그보다 우수한 잠복기를 나타내었으며, R103E, R150E 및 S100E는 염수에 비해 통계학적인 개선을 보여주었다.

본 발명은 본 발명의 개별 요지의 일례로서 기재된 특정 실시태양에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 영역에 속한다. 실제로, 당해 분야의 숙련자는 상기 상세한 설명 및 첨부 도면으로부터 본원에 기재되고 도시된 것에 덧붙여 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있음을 명확히 알 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 영역에 속한다.

본원에 인용된 모든 참조문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The Kenneth S. Warren Institute, Inc. H. Lundbeck A/S <120> RECOMBINANT TISSUE PROTECTIVE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACIDS THEREOF FOR PROTECTION, RESTORATION, AND ENHANCEMENT OF RESPONSIVE CELLS, TISSUES AND ORGANS <130> 10165-022-228 <140> PCT/US2003/020964 <141> 2003-07-01 <150> 60/392,455 <151> 2002-07-01 <150> 60/393,423 <151> 2002-07-03 <160> 212 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Gln Arg Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Phe Leu Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: mutein <400> 5 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 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Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 132 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 133 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 133 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 134 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 134 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 135 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 135 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 136 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 136 ctccggggaa agctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 137 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 137 tcccctgtgt acagcgccag ctttccccgg ag 32 <210> 138 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 138 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 139 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 139 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 140 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 140 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 141 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 141 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 142 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 142 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 143 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 143 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 144 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 144 ctctgggagc ccaggcggaa gccatctccc ct 32 <210> 145 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 145 aggggagatg gcttccgcct gggctcccag ag 32 <210> 146 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 146 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 147 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 147 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 148 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 148 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 149 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 149 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 150 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 150 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 151 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 151 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 152 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 152 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 153 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 153 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 154 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 154 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 155 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 155 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 156 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 156 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 157 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 157 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 158 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 158 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 159 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 159 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 160 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 160 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 161 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 161 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 162 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 162 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 163 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 163 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 164 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 164 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 165 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<400> 171 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 172 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 172 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 173 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 173 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 174 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 174 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 175 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 175 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 176 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 176 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 177 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 177 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 178 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 178 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 179 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 179 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 180 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 180 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 181 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 181 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 182 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 182 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 183 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 183 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 184 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 184 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 185 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 185 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 186 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 186 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 187 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 187 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 188 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 188 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 189 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 189 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 190 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 190 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 191 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 191 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 192 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 192 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 193 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 193 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 194 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 194 ctccggggag cgctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 195 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 195 tcccctgtgt acagcgccag cgctccccgg ag 32 <210> 196 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 196 caaggaggcc gagaaaatca cgacgggctg t 31 <210> 197 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 197 acagcccgtc gtgattttct cggcctcctt g 31 <210> 198 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 198 actgcagctt gaatgagaaa atcactgtcc cagacac 37 <210> 199 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 199 gtgtctggga cagtgatttt ctcattcaag ctgcagt 37 <210> 200 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 200 aggccctgtt ggtcaaatct tcccagccgt g 31 <210> 201 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 201 cacggctggg aagatttgac caacagggcc t 31 <210> 202 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 202 atttcctccg gggatggctg aagctgtaca cag 33 <210> 203 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 203 ctgtgtacag cttcagccat ccccggagga aat 33 <210> 204 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 204 agccgagtcc tggaggcggc cctcttggag gccaa 35 <210> 205 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 205 ttggcctcca agagggccgc ctccaggact cggct 35 <210> 206 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 206 agccgagtcc tggagagggc cctcttggag gccaa 35 <210> 207 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 207 ttggcctcca agagggccct ctccaggact cggct 35 <210> 208 <211> 6059 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid <400> 208 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt 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900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 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cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 211 <211> 6059 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid <400> 211 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 212 <211> 6059 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid <400> 212 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat 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gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059

Claims (68)

1. 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존(viability)의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 포함하고, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는, 뮤테인(mutein) 재조합 조직 보호 사이토카인(cytokine).
2. 제 1 항에 있어서,

   서열 번호: 10의 위치 11 내지 15에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 1], 서열 번호: 10의 위치 44 내지 51에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 2], 서열 번호: 10의 위치 100 내지 108에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하거나[서열 번호: 3] 또는 서열 번호: 10의 위치 146 내지 151에 하나 이상의 변화된 아미노산 잔기를 포함하는[서열 번호: 4] 재조합 조직 보호 사이토카인.
3. 제 1 항에 있어서,

   서열 번호: 10의 위치 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 또는 161중 하나 이상에 변화된 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
4. 제 1 항에 있어서,

   하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는[서열 번호: 15 내지 105 및 119] 재조합 조직 보호 사이토카인.
5. 제 1 항에 있어서,

   서열 번호: 10의 아미노산 잔기 44 내지 49가 결실된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
6. 제 1 항에 있어서,

   하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는[서열 번호: 106 내지 118] 재조합 조직 보호 사이토카인.
7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

   하나 이상의 아미노산이 추가로 화학적으로 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인.
8. 제 7 항에 있어서,

   화학적 개질이 재조합 조직 보호 사이토카인의 전하를 변화시킴을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
9. 제 8 항에 있어서,

   전하를 갖는 아미노산 잔기를 전하를 갖지 않는 잔기로 개질시키는 경우, 아미노산 잔기에 양전하 또는 음전하를 화학적으로 첨가하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
10. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

    인간 에리트로포이에틴 뮤테인인 재조합 조직 보호 사이토카인.
11. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

    인간 페닐글라이옥살 에리트로포이에틴 뮤테인인 재조합 조직 보호 사이토카인.
12. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

    응답 포유동물 세포가 신경, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관, 내피, 고환, 난소, 자궁내막 또는 줄기 세포를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
13. 광수용체 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러(Muieller) 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 혈관사이 세포, 술잔세포, 창자샘 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히(Leydig) 세포, 서톨리(Sertoli) 세포, 정자 세 포, 그라피안(Graffian) 난포 세포, 원시 난포 세포, 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포를 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인 응답 포유동물 세포.
14. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

    내피 세포 장벽을 가로지를 수 있는 재조합 조직 보호 사이토카인.
15. 제 14 항에 있어서,

    내피 세포 장벽이 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
16. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

    하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 조직 보호 사이토카인:

    i. 시알산 잔기의 수가 감소되거나 시알산 잔기를 갖지 않는 사이토카인;

    ii. N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물의 수가 감소되거나 이들을 갖지 않는 사이토카인;

    iii. 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 사이토카인을 처리함으로써 적어도 감소된 탄수화물 함량을 갖는 사이토카인;

    iv. 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 사이토카인;

    v. 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖고 화학적으로 환원된 사이토카인;

    vi. 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 사이토카인;

    vii. 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 사이토카인 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 사이토카인;

    viii. 적어도 개질된 티로신 잔기를 갖는 사이토카인;

    ix. 적어도 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 사이토카인;

    x. 개질된 트립토판 잔기를 갖는 사이토카인;

    xi. 하나 이상의 아미노산기가 제거된 사이토카인;

    xii. 사이토카인 분자의 시스틴 결합이 하나 이상 결실된 사이토카인;

    xiii. 말단 절단된(truncated) 사이토카인;

    xiv. 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 분자가 부착된 사이토카인;

    xv. 하나 이상의 지방산이 부착된 사이토카인;

    xvi. 포유동물 세포가 아닌 세포에서 재조합 사이토카인을 발현시킴으로써 포유동물 당화 패턴이 아닌 당화 패턴을 갖는 사이토카인; 및

    xvii. 정제를 촉진시키기 위하여 하나 이상의 히스티딘 택(tag)을 붙인 아미노산을 갖는 사이토카인.
17. 제 16 항에 있어서,

    무-시알산 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
18. 제 17 항에 있어서,

    무-시알산 에리트로포이에틴이 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
19. 제 16 항에 있어서,

    저시알릴화되거나 과시알릴화된 재조합 조직 보호 사이토카인.
20. 제 16 항에 있어서,

    1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
21. 제 16 항에 있어서,

    천연 에리트로포이에틴에 존재하는 14개의 시알산 잔기보다 더 많이 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
22. 제 16 항에 있어서,

    N-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
23. 제 22 항에 있어서,

    O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
24. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 글라이코시다제로 처리되는 재조합 조직 보호 사이토카인.
25. 제 16 항에 있어서,

    퍼아이오데이트(periodate)-산화된 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
26. 제 25 항에 있어서,

    퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴이 소듐 사이아노보로하이드라이드로 화학적으로 환원되는 재조합 조직 보호 사이토카인.
27. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 아르기닌 잔기상에 R-글라이옥살(여기에서, R은 아릴 또는 알킬 잔기임) 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
28. 제 27 항에 있어서,

    페닐글라이옥살-에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
29. 제 16 항에 있어서,

    2,3-뷰테인다이온 및 사이클로헥세인다이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인 접 다이케톤과의 반응에 의해 아르기닌 잔기가 개질된 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
30. 제 16 항에 있어서,

    아르기닌 잔기가 3-데옥시글루코손과 반응한 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
31. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 바이오틴일화 리신 또는 N-말단 아미노기를 갖는 분자인 재조합 조직 보호 사이토카인.
32. 제 16 항에 있어서,

    글루시톨릴 리신 에리트로포이에틴 또는 프럭토실 리신 에리트로포이에틴인 재조합 조직 보호 사이토카인.
33. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 카밤일화 리신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
34. 제 33 항에 있어서,

    카밤일화된 사이토카인이 알파-N-카밤오일에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일에 리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일하이포(hypo)시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
35. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
36. 제 35 항에 있어서,

    하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
37. 제 36 항에 있어서,

    하나 이상의 아실화된 리신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
38. 제 37 항에 있어서,

    아세틸화된 사이토카인이 알파-N-아세틸에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
39. 제 35 항에 있어서,

    사이토카인의 리신 잔기가 석신일화된 재조합 조직 보호 사이토카인.
40. 제 39 항에 있어서,

    석신일화된 사이토카인이 알파-N-석신일에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
41. 제 16 항에 있어서,

    2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰에이트 소듐 또는 그의 다른 염으로 개질된 하나 이상의 리신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
42. 제 16 항에 있어서,

    하나 이상의 질화된 티로신 잔기 또는 요오드화된 티로신 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
43. 제 16 항에 있어서,

    카보다이이미드와 반응된 후 아민과 반응된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 포함하는 재조합 조직 보호 사이토카인.
44. 제 16 항에 있어서,

    아민이 글라이신아마이드인 재조합 조직 보호 사이토카인.
45. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
46. 제 45 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
47. 제 45 항에 따른 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 발현 벡터.
48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,

    pCiNeo 벡터인 벡터.
49. 제 45 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 유전공학에 의해 생성된 세포.
50. 제 45 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포.
51. 응답 포유동물 세포, 조직 또는 기관의 기능 또는 생존의 보호, 유지, 향상 또는 회복으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응답 세포 보호 활성을 갖고, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물.
52. 제 51 항에 있어서,

    경구, 비강내 또는 비경구 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
53. 제 51 항에 있어서,

    관류 용액으로 제형화된 약학 조성물.
54. 포유동물 신체로부터 단리된 세포, 조직 또는 기관을 뮤테인 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 노출시킴을 포함하는, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 보호, 유지 또는 향상시키는 방법.
55. 제 54 항에 있어서,

    골수에 대해 보호하지 않는 방법.
56. 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에, 포유동물 신체로부터 단리된 세포, 조직 또는 기관을 노출시킴을 포함하는, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 보호, 유지 또는 향상시키는 방법.
57. 조직 손상으로부터의 보호, 조직 손상의 방지, 및 포유동물의 조직 및 조직 기능의 회복 및 복원을 위한 약학 조성물을 제조하기 위한, 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도.
58. 제 57 항에 있어서,

    손상이 발작 질환, 다발성 경화증, 중풍, 저혈압, 심장정지, 허혈, 심근 경색, 염 증, 연령 관련 인지 기능 상실, 방사선 손상, 뇌성마비, 신경변성 질환, 알쯔하이머(Alzheimer's)병, 파킨슨(Parkinson's)병, 레이(Leigh's)병, AIDS 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 알콜 중독, 기분 장애, 불안 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 뇌 또는 척수 외상 또는 허혈, 심폐회로술, 만성 심장 부전, 황반 변성, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 허혈 또는 망막 외상에 의해 야기되는 용도.
59. 증가되는 적혈구용적율, 증가되는 혈압, 혈소판 과활성화 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송(transcytosis)을 촉진시키는 방법.
60. 제 59 항에 있어서,

    결합이 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 상기 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합인 방법.
61. 제 59 항에 있어서,

    내피 세포 장벽이 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽, 혈액-심장 장벽, 혈액-신장 장벽 및 혈액-태반 장벽으로 이루어진 군으로부터 선택 되는 방법.
62. 제 59 항에 있어서,

    분자가 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 항바이러스제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물인 방법.
63. 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는, 내피 세포 장벽을 가로지르는 세포간 수송을 통해 상기 분자를 수송하기 위한 조성물.
64. 제 63 항에 있어서,

    결합이 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 상기 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합인 조성물.
65. 제 63 항에 있어서,

    분자가 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물인 조성물.
66. 증가되는 적혈구용적율, 혈관 활성 작용, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 재조합 조직 보호 사이토카인의 용도.
67. 제 66 항에 있어서,

    결합이 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 상기 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합인 용도.
68. 제 66 항에 있어서,

    분자가 수용체 작용제 또는 길항제 호르몬, 향신경성 인자, 항균제, 방사성의약품, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 면역억제제, 염료, 마커 또는 항암 약물인 용도.

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