MXPA05000063A

MXPA05000063A - Citocinas recombinantes protectoras de tejido y acidos nucleicos que las codifican para la proteccion, restauracion y mejora de celulas, tejidos y organos respondedores.

Info

Publication number: MXPA05000063A
Application number: MXPA05000063A
Authority: MX
Inventors: Michael Brines
Original assignee: Kenneth S Warren Inst Inc
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2005-04-08
Also published as: EP1552298A2; CA2491567A1; WO2004003176A3; IL166066A0; EP1552298A4; JP2006507228A; KR20060019501A; EA200500120A1; AU2003251770B9; EA010200B1; PL374580A1; IS7604A; AU2003251770B2; WO2004003176A2; NZ537306A; US20040122216A1; WO2004003176A9; NO20050504L; AU2003251770A1; BR0312395A

Abstract

Se proporcionan metodos y composiciones para la proteccion o mejora de la funcion o viabilidad de celulas, tejidos, organos o partes del cuerpo respondedores in vivo, in situ o ex vivo en mamiferos, incluyendo seres humanos, por medio de la administracion sistemica o local de un modulador de la actividad de receptor para eritropoyetina, como por ejemplo una citocina recombinante protectora de tejido.

Description

CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN PARA LA PROTECCIÓN, RESTAURACIÓN Y MEJORA DE CÉLULAS , TEJIDOS Y ÓRGANOS RESPONDEDORES Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/392,455 presentada el día Io de julio de 2002 y de solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/383,423 presentada el día 3 de julio de 2002 cuyos contenidos enteros se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a muteínas, citocinas recombinantes protectoras de tejido que tienen una o varias sustituciones de aminoácidos, composiciones farmacéuticas que comprenden tales citocinas para la protección, el mantenimiento, la mejora o la restauración de la función o viabilidad de las células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados. Incluye la protección de tejido excitable como por ejemplo tejido neuronal y cardiaco, a partir de neurotoxinas, ipoxia, y otros estímulos adversos, y la mejora de la función de tejido excitable por ejemplo para facilitar el aprendizaje y la memoria. La presente invención se refiere además a composiciones para transportar o facilitar el transporte de una molécula por medio de transcitosis a través de una berrera 'de células endoteliales utilizando muteínas, citocinas recombinantes protectoras de tejidos. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante muchos años, la única función fisiológica clara de la eritropoyetina había sido el control de la producción de eritrocitos. Recientemente, varias líneas de evidencia sugieren que la eritropoyetina, un miembro de la superfamilia de las citocinas, desempeña otras funciones fisiológicas importantes que pueden ser mediadas a través de la interacción con el receptor para eritropoyetina (eritropoyetina-R) . Estas acciones incluyen la mitogénesis, modulación del influjo de calcio en células de músculo liso y células neurales, acción vasoactiva, es - decir, vasoconstricción/vasodilatación, hiperactivación de plaquetas y efectos sobre el metabolismo" intermedio. Se cree que la eritropoyetina proporciona respuestas compensatorias que sirven para mejorar los microentornos celulares hipóxicos así como para modular la muerte programada de las células causada por estrés metabólico. Aún cuando estudios han establecido que la eritropoyetina inyectada en forma intracraneal protege las neuronas contra una lesión neuronal hipóxica, la administración intracraneal es una vía de administración impráctica, y en general inaceptable para uso terapéutico, especialmente en el caso de individuales normales. Además, estudios previos de pacientes anémicos que recibieron eritropoyetina han llegado a la conclusión que la eritropoyetina administrada periféricamente no es transportada al cerebro (Marti y colaboradores, 1997, Kidney Int. 51:416-8; Juul y colaboradores, 1999, Pediatr. Res. 46:543-547; Buemi .y colaboradores, 2000, Nephrol . Dial. Transplant. 15:422-433). Varias formas modificadas de eritropoyetina han sido descritas con actividades enfocadas hacia la mejora de la actividad eritropoyética de la molécula, tales como las que alteran los aminoácidos en el extremo carboxi descrito en la patente norteamericana No. 5,457,089 y., en la patente -norteamericana No. 4,835,260; isoformas de eritropoyetina con varios números de residuos de ácido siálico por molécula, tales como las descritas en la patente norteamericana No. 5,856,298; polipéptidos descritos en la patente norteamericana No. 4,703,008; agonistas descritos en la patente norteamericana No. 5,767,078; péptidos que se unen al receptor para eritropoyetina de conformidad con lo descrito en las patentes US 5,773,569 y 5,830,581; y miméticos de moléculas pequeñas de conformidad con lo descrito en la patente norteamericana No. 5,835,382. La presente invención se enfoca al uso de una citocina recombinante protectora de tejido para la protección, mantenimiento, mejora o restauración de células respondedoras asi como de células, tejidos y órganos asociados in situ, asi como ex vivo, y para suministrar una citocina recombinante protectora de tejido a través de una barrera de células endoteliales con el objeto de proteger y mejorar las células respondedoras así como células, tejidos y órganos asociados distantes de la vasculatura, o bien para transportar moléculas asociadas. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se enfoca al uso de varias formas de citocinas recombinantes protectoras de tejido para la preparación de composiciones farmacéuticas para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras, sus células, tejidos y órganos asociados. En un aspecto particular, las células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos u órganos asociados están distantes de la vasculatura en virtud de una barrera hermética de células endoteliales. En otro aspecto particular, las células, tejidos, órganos u otras partes corporales están aislados del cuerpo de un mamífero como por ejemplo los elementos contemplados para transplante. A título de ejemplos no limitativos, una célula o tejido respondedor puede ser células o tejidos neuronales, retínales, musculares, cardiacos, pulmonares, hepáticos, renales, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endoteliales capilares, de testículos, de ovario, de páncreas, de hueso, de piel, o endometríales . Además, ejemplos no limitativos de células respondedoras incluyen células de fotoreceptores (varillas y conos) , ganglios, bipolares, horizontales, amacrina, de Müller, de Pukinje, de miocardio, marcapaso, de nodo sinoatrial, nodo sinusal, tejido de unión, nodo atrioventricular, fascículo de His, hepatocitos, células estelladas, Kupffer, mesangial, epitelial renal, intersticial tubular, Goblet, glándula intestinal (criptas), endocrino entérico, glomerulosa, fasciculada, reticularis, cromafina, pericito, Leydig, Sertoli, esperma, folículo Grafiano, folículo primordial, isletas de Langerhans, células oc, células ,ß, célula ?, células F, osteoprogenitor, osteoclastos, osteoblastos, estroma endometrial, endometrial, células progenitoras y células endoteliales . Estos ejemplos de células respondedoras son simplemente ilustrativos. En un aspecto, la célula respondedora o sus células, tejidos u órganos · asociados no son células, tejidos u órganos excitables ni tampoco comprenden predominantemente células o tejidos excitables. En una modalidad particular, la célula, tejido u órgano de mamífero para el cual se utiliza una citocina recombinante protectora de tejido son los que han estado sometidos durante un período de tiempo o bien estarán sometidos durante un período de tiempo bajo por lo menos una condición adversa a la viabilidad de la célula, tejido u órgano. En una modalidad particular, la célula, tejido u órgano de mamífero para el cual se' 'utiliza una citocina recombinante -protectora de tejido mencionada arriba expresa el receptor EPO. Tales condiciones incluyen hipoxia traumática in situ o disfunción metabólica, hipoxia in sit inducida quirúrgicamente o disfunción metabólica o bien exposición a toxina in situ, ésta última asociándose con quimioterapia o terapia con radiación. En una modalidad, las condiciones adversas son el resultado de un desvío cardiopulmonar (máquina corazón-pulmón) como se utiliza en el caso de algunos procedimientos quirúrgicos . Las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención son útiles para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades humanas del sistema nervioso central (CNS) o sistema nervioso periférico que tienen síntomas primariamente neurológicos o psiquiátricos, así como enfermedades oftálmicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiopulmonares, enfermedades respiratorias, enfermedades renales, urinarias y de la reproducción, así como enfermedades gastrointestinales y anormalidades metabólicas y endocrinas. . . La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden citocinas recombinantes protectoras de tejido particulares · mencionadas arriba para la administración a un animal mamífero, preferentemente a un ser humano, tales composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas para administración oral, intranasal o parenteral, o bien en forma de una solución perfusada para el mantenimiento de la viabilidad de células, tejidos u órganos ex vivo. Citocinas recombinantes protectoras de tejido útiles para los propósitos mencionados arriba pueden ser una muteina, o bien eritropoyetina modificada genéticamente, es decir, una eritropoyetina para la cual existe por lo menos una modificación de la estructura de aminoácidos de la molécula nativa. Una "proteína mutante", "proteína variante" o "muteina" se refiere a una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos mutante e incluye polipéptidos que difieren de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina nativa debido a deleciones de aminoácidos, sustituciones de aminoácidos, o ambas cosas. Una "secuencia nativa" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que es idéntica a una forma nativa o de tipo silvestre de un gen o una proteína. Además, en una modalidad, las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención — tienen una actividad de protección celular, pero tienen también uno o varios efectos de eritropoyetina sobre la médula ósea, es decir, hematócritos incrementados (eritropoyesis) , acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , . hiperactivación plaqu'etaria, producción incrementada de trombocitos, y actividades pro-coagulantes. En otra modalidad, las citocinas recombinantes protectoras ' de tejido de la presente invención tienen una actividad de' protección celular, pero no tienen uno o varios de los efectos de la eritropoyetina sobre la médula ósea, es decir, hematócritos incrementados (eritropoyesis) acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, producción incrementada de trombocitos, y actividades pro-coagulantes. Preferentemente, una citocina recombinante protectora de tejido protectora de células de la presente invención por lo menos no tiene uno de los efectos de la eritropoyetina sobre la médula ósea; con mayor preferencia, la citocina recombinante protectora de tejido no tiene actividad eritropoyética; y con mayor preferencia la citocina recombinante protectora de tejido no tiene ninguno de los efectos de la eritropoyetina sobre la médula ósea. A titulo de ejemplos no limitativos, cambios en uno o varios aminoácidos pueden efectuarse, o bien se pueden proporcionar deleciones o adiciones, a una molécula de eritropoyetina nativa. En una modalidad preferida, la citocina recombinante protectora de tejido tiene una o varias modificaciones en una o varias de las regiones siguientes: VLQRY (aminoácidos " 11-15 de eritropoyetina humana nativa; SEQ ID NO: 1) y/o TKVNFYAW (aminoácidos 44-51 de eritropoyetina humana nativa; SEQ ID NO: 2) y/o SGLRSLTTL (aminoácidos 100-108 de eritropoyetina humana nativa; SEQ ID NO: 3) y/o SNFLRG (aminoácidos 146-151 de eritropoyetina humana nativa; SEQ ID NO: 4) . Otras mutaciones pueden proporcionarse en los aminoácidos 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 y 161 de SEQ ID NO: 10. Estas otras mutaciones pueden presentarse solas o bien además de por lo menos una mutación en por lo menos una de las regiones mencionadas arriba. En ciertas modalidades, cambios en uno o varios aminoácidos de TKVNFYAW (aminoácidos 44-51 de eritropoyetina humana, nativa; - SEQ ID NO: 2) resultan en una molécula de eritropoyetina modificada con función parcial, es decir, que tiene menos actividad eritropoyética que rhu-EPO. En otras modalidades, cambios en uno ?·. arios aminoácidos de SGLRSLTTL (aminoácidos 100-108 de eritropoyetina humana, nativa; SEQ ID NO: 3) resulta en una citocina recombinante protectora de te ido con función parcial, es decir, que tiene una actividad eritropoyética menor que rhu-EPO. Las citocinas recombinantes protectoras de tejido descritas arriba presentan una actividad de protección tisular o protección celular. Con relación a actividades eritropoyéticas, las citocinas recombinantes protectoras de tejido descritas arriba no tienen una o varias de las ' actividades eritropoyéticas o bien presentan una disminución de una o varias de las actividades eritropoyéticas. Ejemplos de actividades eritropoyéticas incluyen hematócritos incrementados, vasoconstricción, hiperactivas plaquetaria, actividades pro-coagulantes, - asi como producción incrementada de trombocitos . Las actividades eritropoyéticas pueden medirse por técnicas estándares. Por ejemplo, el hematócrito puede ser -medido utilizando los ensayos de células UT-7 descritos en la Sección 6.17 o bien utilizando las técnicas descritas en el Physicians' Desk Reference (Medical Economics ¦ Company, Inc., Montvale, NJ, 2000) que se incorpora por referencia aquí en su totalidad. En particular, en las páginas 519-525 y 2125-2131 se divulgan métodos que pueden ser empleados para medir los niveles" de hematócritos y divulgan rangos de hematócritos diferentes que pueden ser utilizados como blancos para evitar la toxicidad. Por ejemplo, en pacientes con insuficiencia renal crónica, el PDR ' recomienda administración de eritropoyetina para lograr niveles de hematócritos blanco no tóxicos dentro de un rango de 30% a 36% en un paciente (por ejemplo, véase PDR, página 523, col. 1, 11. 17-96 y p. 2129, col, 1, 11. 89-93, asi como tabla adjunta en columnas 2. y 3) . El PDR hace notar que la toxicidad en forma de policitemia (una condición marcada por un incremento anormal del número de eritrocitos en circulación) puede evitarse mediante el monitoreo cauteloso del nivel de hematócritos y a ustando las dosis de EPO, retirando eritropoyetina si los niveles de hematócritos se acercan al extremo superior del rango blanco (36% en el caso de esta población de pacientes) o se eleva en más de 4 puntos en un periodo de 2 semanas, hasta que el nivel de hematócritos retorne al rango blanco sugerido (de 30% a 36% para esta población de paciente; véase PDR, p. 523, col. 1 y p. 2129, col. 1, en la sección "Ajuste de dosis") . En contraste, en el caso de pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia, el PDR indica que se debe ajustar la dosificación a un nivel de hematócritos diferente, es decir, si el nivel de hematócritos rebasa el 40% (véase pag. 212.9, col. 2, bajo la sección "Ajuste de dosis"). En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido tiene una o varias actividades eritropoyéticas, pero en niveles que no son suficientes para provocar efectos adversos, es decir, efectos que contrarrestan el beneficio terapéutico de la actividad de protección celular de una citocina recombinante de protección tisular. En ' una modalidad, las citocinas recombinantes de protección tisular que poseen una o varias actividades eritropoyéticas pueden todavía utilizarse en los métodos de la presente invención a condición que los niveles de actividad "eritropoyética sean medidos. En estas modalidades cuando la citocina recombinante protectora de tejido posee una o varias, actividades eritropoyéticas, las actividades eritropoyéticas pueden ser medidas y la cantidad de dosis y/o régimen de dosis de la citocina puede ajustarse .para asegurar que la citocina recombinante protectora de tejido no es tóxica. En estas modalidades en las cuales la citocina recombinante protectora de tejido posee una o varias actividades eritropoyéticas, las actividades eritropoyéticas pueden ser medidas y la cantidad de dosis y/o régimen de dosis de la citocina pueden ajustarse con el objeto de asegurar que la citocina recombinante protectora de tejido tiene una baja toxicidad. En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido presenta una disminución de una o varias de las actividades . eritropoyéticas en aproximadamente 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 100% en comparación con Epo recombinante. La invención proporciona una citocina recombinante protectora de tejido que no tiene por lo menos una .actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de elevación de nivel de hematócritos, vasoconstricción, hiperactivación plaquetarias, actividades pro-coagulantes, asi como una producción incrementada de trombocitos . La citocina comprende por lo menos una actividad de protección celular respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor. En una modalidad de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido comprende uno o varios residuos de aminoácidos alterados entre las posiciones 11 y 15 de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 1], posiciones 44 a 51 de SEQ ID NO 10 [SEQ ID NO: 2], posiciones 100 a 108 de SEQ ID NO [SEQ ID NO: 3] o posiciones 146-151 de SEQ ID NO 10 [SEQ ID NO: 4] . En otra modalidad, la citocina- recombinante protectora de tejido comprende un residuo de aminoácidos alterado en una o varias de las posiciones siguientes de SEQ ID NO: 10: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, - 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 ó 161. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 coñ uno o varios de los cambios siguientes (a cada secuencia alterada se le ha asignado un número de identificación de secuencia separado) : una alanina en residuo 6 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 15); una alanina en residuo 7 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 16); una seria en residuo 7 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 17); una isoleucina en residuo 10 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID - O: 18); una serina en residuo 11 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 19); una alanina en. residuo 12 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 20); una alanina en residuo 13 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 21); una alanina en residuo 14 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 22); un ácido glutámico en residuo 14 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 23); una glutamina en residuo 14 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 24); una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 25); una fenilalanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 26); una isoleucina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 27); un ácido glutámico en residuo 20 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 28); una alanina en residuo de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 29) ; una alanina en residuo 21 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 30) ; una lisina en residuo 24 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 31); una serina en residuo 29 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 32) ; una tirosina en residuo 29 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 33) ; una asparagina en residuo 30 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: .34); una treonina en residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 35); una serina en residuo 33 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 36) ; una tirosina en residuo 33 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 37) ; una lisina en residuo 38 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 38); una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 39); una asparagina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 40); una alanina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 41); una alanina en residuo 43 de SEQ -ID NO: 10 (SEQ ID NO: 42) ; una isoleucina en residuo 4 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 43) ; un ácido aspártico en residuo 45 de SEQ ID NO: 10' (SEQ ID NO: 44); una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 45); una alanina en residuo 46 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 46); una alanina en residuo 47 de · SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 47); una isoleucina en residuo 48 de, SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 48); una alanina en residuo 48 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ' ID NO: 49); una alanina en residuo 49 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 50); una seria en residuo 49 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 51); una fenilalanina en residuo 51 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 52); una asparagina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 53); una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 54); una asparagina en residuo 59 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID' NO: 55); una treonina en residuo 62 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 56); una serina en residuo 67 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 57); una alanina en residuo 70 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 58) ; una arginina en residuo 96 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 59) ; una alanina en residuo 97 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 60) ; una arginina en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ' ID NO: 61); un ácido glutámico en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 62); una alanina- en residuo 100 de SEQ ID NO: ' 10 (SEQ ID NO: 63); una treonina en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 64) ; una alanina en residuo 101 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO": 65); una isoleucina en residuo 101 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 66); una alanina en residuo 102 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 67); una alanina en residuo 103 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 68); un ácido glutámico en residuo 103 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 69); una alanina en residuo 104 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 70); una isoleucina en residuo 104 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 71); una alanina en" residuo 105 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 72); una alanina en residuo 106 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 73) ; una isoleucina en residuo 106 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 74); una alanina en residuo 107 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 75); una leucina en residuo 107 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 76); una lisina en residuo 108 de SEO ID NO: 10 (SEQ ID NO: 77) ; una alaniña en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO : 78 ) ; una serina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 79) ; una alanina ' en residuo 116 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO_: 80) ; una alanina en residuo 126 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 81) una alanina en residuo 132 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 82) ; una alanina en residuo 133 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 83) ; una alanina en residuo 134 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 84) ; una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: : 85¡i ; una isoleucina en residuo 142 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 86) ; una alanina en residuo 143 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 87) ; una alanina en residuo 146 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 88 ) ; una lisina en residuo 147 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 89) ; una alanina en residuo 147 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 90) ; una tirosina en residuo 148 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 91); una alanina en residuo 148 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 92) ; una alanina en residuo 149 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 93); una alanina en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 94); un ácido glutámico en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 95); una alanina en residuo 151' de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 96); una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 97); un triptófano en residuo.152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 98) ; una alanina en residuo 153 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 99); una alanina en residuo 154 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 100); una alanina en residuo 155 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 101); una alanina en residuo 158 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 102); una serina en residuo 160 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 103); una alanina en residuo 161 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 104); o bien una alanina en residuo 162 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 105) . En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con una o varias de las sustituciones de residuos de aminoácidos de SEQ ID Nos: 15-105 y 119. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con una deleción de residuos de aminoácidos 44-49 de SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende las secuencias · de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con por lo menos uno de los cambios siguientes (a cada secuencia alterada se le ha asignado un número separado de identificación de secuencias) : i) un -ácido aspártico en residuo 45 y un ácido glutámico en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 106);. ii) una asparagina en residuo 30, una treonina en residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 107); iii) un ácido aspártico en residuo 45, un ácido glutámico en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: -108); iv) un ácido glutámico en residuo 103, y una serina en residuo 108 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 109); v) una alanina en residuo 140 y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 110); vi) una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 111); vii) una 'alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 112) ; iix) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 113) ; ix) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 114); x) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, y una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 115) ; xi) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 154, una lisina en residuo 24, una lisina en residuo 38, una lisina en residuo 83, una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 116); xii) una lisina en residuo 24, una lisina en residuo 38, y una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 117); o- bien xiv) una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 118) . En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con por lo menos una de las sustituciones siguientes de residuos de aminoácidos de SEQ ID Nos: 106-118. En una modalidad, la presente invención se enfoca a la cítocina recom inante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba,, que comprende además una modificación química de uno o varios aminoácidos. En otra modalidad, la modificación química ' comprende la alteración de la carga de la citocina recombinante protectora de tejido. En otra modalidad, una carga positiva o negativa se agrega químicamente a un residuo de aminoácido en donde un residuo de aminoácido cargado es modificado en un residuo no cargado. Además, tales citocinas protectoras de tejido recombinantes mencionadas arriba pueden ser modificadas adicionalmente por tener una modificación química de uno o .varios aminoácidos como por ejemplo el descrito -en las siguientes solicitudes co-pendierítes: solicitud PCT No. de Serie PCT/US01/49479, presentada el día 28 de diciembre de 201, Solicitud de patente norteamericana No. de Serie 097753,132 presentada el 29 de diciembre de 20, y solicitud de patente norteamericana No. de Registro de Abogado KW00-009C02-US presentada -el 3 de julio de 2002, cada una de estas solicitudes se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Estas modificaciones químicas adicionales pueden ser utilizadas para incrementar las actividades protectoras de tejido de las citocinas recombinantes protectoras de tejido o suprimir efectos que las citocinas recombinantes protectoras de tejido pueden tener sobre la médula ósea. En una modalidad adicional, la modificación química adicional se proporciona para restaurar la solubilidad de la molécula que puede ser reducida como resultado de la modificación genética mencionada arriba, como por ejemplo mediante la adición química de una carga positiva o negativa a la molécula si Un residuo - de aminoácido cargado es cambiado a un residuo no cargado. A título de ejemplos no limitativos/ citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención incluyen la muteína de eritropoyetina humana S100E (SEQ ID NO: 5) ,· la muteína de eritropoyetina humana K45D (SEQ ID NO: 6), y cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido no eritropoyéticas y sin embargo protectoras de células o bien las que pueden ser de provecho para una célula," tejido u órgano respondedor que se describen en Elliott y colaboradores, 1997, Blood 89:493-502; Boissel y colaboradores, Journal of Biologícal Chemistry, vol . 268, No. 21, pp. 15983-15993 (1993); en y ¦ colaboradores, Journal Biological Chemistry, vol. 269, No. 36, pp. 22839-22846 (1994); y Syed y colaboradores, Nature, vol. 395, pp. 511-516 (1998), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención se enfoca a métodos para el uso de cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido mencionadas arriba para la protección, restauración y mejora de células, tejidos y órganos respondedores. Otras citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención incluyen una eritropoyetina antes mencionada que comprende por lo menos un aminoácido genéticamente modificado con por lo menos una modificación adicional que puede ser otra modificación de por lo menos un aminoácido adicional de la molécula de eritropoyetina, o una modificación de por lo menos un carbohidrato de la molécula de eritropoyetina. El (los) aminoácido (s) genéticamente alterado (s) puede (n) ser el aminoácido modificado adicionalmente o bien los aminoácidos modificados adicionalmente . Evidentemente, moléculas de citocinas recombinantes protectoras de tejido útiles para los propósitos de la presente invención pueden tener varias modificaciones en comparación con la molécula de eritropoyetina nativa como por ejemplo múltiples modificaciones de la porción' de aminoácidos de la molécula, múltiples modificaciones de la porción de carbohidrato de la molécula, o bien por lo menos una segunda modificación de la porción de aminoácidos de la molécula y por lo menos una modificación de la .porción de carbohidrato de la molécula. La molécula de citocina recombinante protectora de tejido conserva su capacidad de proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras, y sin embargo otras propiedades de la citocina recombinante protectora de tejido no relacionadas con la característica deseable mencionada arriba pueden estar ausentes en comparación con la molécula nativa. En una molécula preferida, la citocina recombinante protectora de tejido no es eritropoyética . En otra modalidad, las citocinas recombinantes protectoras de tejido pueden ser modificadas por fucosilación para alterar los patrones de glicosilacion en una glicoproteina . Una modalidad de la invención se enfoca a la citocina recombinante protectora de te ido de conformidad con . lo descrito aquí arriba que es una muteína de eritropoyetina humana. En otra modalidad de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido es una muteína de eritropoyetina fenilglioxal humana. En otra modalidad de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido es una muteína de asialoeritropoyetína humana. En una modalidad, de conformidad con lo descrito arriba, la citocina recombinante protectora de proteína comprende por lo menos una actividad protectora de células respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor. En una modalidad de este tipo, la célula de mamífero respondedora comprende una célula neuronal, muscular, cardiaca, pulmonar, hepática, renal, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, capilar, endotelial, de testículo, de ovario, endometrial o célula progenitora. En otras modalidades, la célula comprende un célula de fotoreceptor, ganglio, bipolar, horizontal, amacrina, Müller, miocardio, marcapaso, nodo sinoatrial, nodo sinusal, nodo atriventricular, fascículos de His, hepatocito, células esteladas, Kupffer, mesañgial, Goblet, glándula intestinal, endocrino enteral, glomerulosa, fasciculada, reticularis, cromafina, pericita, Leydig, Sertoli, esperma, folículos Grafianos, folículos primordiales, células de estroma endometrial o célula endometrial . De conformidad con otro aspecto de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido, de conformidad con lo descrito arriba, puede atravesar una barrera de células endoteliales . En una modalidad relacionada, la barrera de células endoteliales comprende la barrera hemato-encefálica, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato-testicular, la barrera hemato-ovariana, la barrera hemato-placental, la barrera hemato-cardiaca, la barrera hemato-renal, y la barrera hemato-uterina . En otra modalidad de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba es modificada adicionalment . En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido se selecciona dentro del grupo que consiste de: i) una citocina que tiene un número reducido de porciones de ácido siálico o ninguna porción de ácido siálico ii) una citocina que tiene un número reducido de carbohidratos enlazados con N o enlazados con O o bien ningún carbohidrato enlazado con N en enlazado con 0; iii) una citocina que tiene por lo menos un contenido reducido de carbohidratos en virtud de un tratamiento de citocina nativa con por lo menos una glicosidasa; iv) una citocina que tiene por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados; v) una citocina que tiene por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados y es químicamente reducida; vi) una ' citocina que tiene por lo menos uno o varios residuos dé arginina modificados; vii) una citocina que tiene por lo menos uno o varios residuos de lisina modificados o una modificación del grupo N-aminoterminal de una molécula de citocina; viii) una citocina que tiene por lo menos un residuo de tirosina modificado; ix) una citocina que tiene por lo menos un residuo modificado de ácido aspártico o ácido glutámico; x) una citocina que tiene un residuo de triptófano modificado; xi) una citocina que tiene por lo menos un grupo de aminoácido modificado; xii) una citocina que tiene ¦ por lo menos una abertura de por lo menos uno de los enlaces de cistina en la molécula de citocina; xiii) una citocina truncada; xiv) una citocina que tiene por lo menos una molécula de polietilenglicol fijada; xv) una citocina que tiene por lo menos un ácido graso fijado; xvi) una citocina que tiene un patrón de glxcosilación no de mamífero en virtud de la expresión de una citocina recombinante en células no de mamífero y xvi) una citocina que tiene por lo menos un aminoácido marcado con histidina para facilitar la purificación . En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención tiene un número reducido de' porciones de ácido siálico o bien ninguna porción de ácido siálico. En una modalidad preferida, la citocina recombinante protectora de tejido es la forma asíalo de una eritropoyetina (es decir, no tiene porciones de ácido siálico) , y con mayor preferencia, es una asialoeritropoyetina humana. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, ¦ 7, 8, 9 10, 11 ,12 ó 13 porciones de ácido siálico. El número de sitios disponibles par sialilación puede ser alterado por la presencia de uno o varios aminoácidos alterados o modificados en la citocina recombinante protectora de tejido. Por consiguiente, la presente invención abarca modalidades en donde la citocina recombinante protectora de tejido es o bien hiposialilada o hipersialilada . En un aspecto preferido, la muteína de eritropoyetina tiene más que 14 porciones de ácido siálico presentes en la eritropoyetina nativa. En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con" N. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina con un número reducido de carbohidratos enlazados con N. En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con O. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina que tiene un número reducido de carbohidratos enlazados con O. En otra modalidad, las citocinas recombinantes protectoras de tejido pueden ser modificadas por fucosilación para alterar los patrones de glicosilación en una glicoproteina . En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es tratada con por lo menos una glicosidasa. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido tiene por lo menos un contenido reducido de carbohidrato en virtud de tratamiento de la citocina recombinante protectora de tejido con por lo menos una glicosidasa. En otra modalidad, la porción carbohidrato de la citocina recombinante protectora de tejido tiene por lo menos un patrón de glicosilación no de mamífero en virtud de la expresión de una eritropoyetina recombinante en células no de mamífero. Eñ modalidades preferidas, las citocinas recombinantes protectoras de tejido se expresan en células de insecto, células vegetales, células bacterianas o células de levadura . En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido tiene además por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados que pueden también' estar químicamente reducidos. En una modalidad preferida, la citocina recombinante protectora de tejido es eritropoyetina oxidada con periodato. En ciertas modalidades, la eritropoyetina oxidad con periodato es químicamente reducida con cianoborohidruro de sodio. En otra modalidad, la citocina recorabinante protectora de tejido para los usos mencionados arriba tiene por lo menos uno o varios residuos de arginina modificados. En una modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende una porción R-glioxal en el residuo de arginina o en los varios residuos de arginina, en donde R es una porción arilo o alquilo. En- otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es fenilglioxal-eritropoyetina. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina en la cual un residuo de arginina es modificado por reacción con una dicetona vecina como por ejemplo 2, 3-butandiona y ciclohexandiona, pero sin limitarse a estos ejemplos. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido es una eritropoyetina en la cual un residuo de arginina reacciona con 3-desoxiglucosona. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende por lo menos uno o varios residuos de lisina modificados o una modificación del grupo amino N-terminal de la. molécula de eritropoyetina, tales . codificaciones que resultan de la reacción del residuo de lisina o grupo amino N-terminal con un agente de modificación de grupo amino. El residuo de lisina modificado puede además estar químicamente reducido. En una modalidad preferida, una ' citocina recombinante protectora de tejido es biotinilada o carbamilada o acilada, como por ejemplo acetilada, a través de uno o varios grupos lisina. En otra modalidad preferida, la lisina reacciona con un aldehido o azúcar reductor para formar una imina que puede ser estabilizada por reducción, como por ejemplo con cianoborohidruro de sodio para formar una lisina N-alquilada, como por ejemplo glucitolil lisina, o bien, ¦ en el caso de azúcares reductores, que puede estabilizarse a través de reacomodo de ¾madori o Heyns para formar un azúcar alfa-desoxi alfa-amino como por ejemplo alfa-desoxi-alfa-fructosillisina. En otra modalidad preferida, el grupo lisina es carbamilado (carbamoilado) , como por ejemplo en virtud de una reacción con ion cianato, alquilo-carbamilado, aril-carbamilado o aril-tiocarbamilado con un alquil-isocianato, aril-isocianato o aril-isotiocianato, respectivamente, o bien puede ser acilado por un- derivado reactivo de ácido alquilcarboxílico o ácido arilcarboxilico como por ejemplo mediante reacción con anhídrido acético, anhídrido succínico, o anhídrido ftálico. Por lo menos un grupo lisina puede también ser trinitrofenilo, modificado por reacción con un ácido trinitrobencensulfónico, o preferentemente con su sal. En otra modalidad, los residuos de lisina pueden ser modificados por reacción con un derivado de glioxal como por ejemplo reacción con glioxal, metilglioxal o 3-desoxiglucosona, para formar los derivados alfa-carboxialquilo correspondientes. En una modalidad relacionada, la citocina carbamilada consiste de alfa-N-carbamo.ileritropoyetina; N-epsilon-carbamoileritropoyetina alfa-N-carbamoilo, N-epsilon-carbamoileritropoyetina; alfa-N-carbamoilasialoeritropoyetina; N-epsilon-carbamoilasialoeritropoyetina; alfa-N-carbamoilo, N-epsilon-carbamoilasialoeritropoyetina; alfa-N-carbamoilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-carbamoilo, N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina . En otra modalidad, la citocina' recombinante protectora de tejido comprende por lo menos un residuo de lisina acilado. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende por lo menos un residuo de lisina acilado. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende por lo menos un residuo de lisina acilado. En una modalidad relacionada, la citocina . acetilada comprende alfa-N-acetileritropoyetina; N-epsilon-acetileritropoyetina; alfa-N-acetilo; N-epsilon-acetileritropoyetina; alfa-N-acetilasialoeritropoyetina; N-epsilon-acetilasialoeritropoyetina; alfa-N-acetilo, N-epsilon-acetilasialoeritropoyetina; alfa-N-acetilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-acetilhiposialoeritropoyetina; alfa-N-acetilo, N-epsilon-acetil iposialoeritropoyetina; alfa-N-acetil ipersialoeritropoyetina; N-epsilon-acetilhipersialoeritropoyetina; alfa-N-acetilo, y N-epsilon-acetilhipersialoeritropoyetina . En otra .modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido tiene un residuo de · lisina que es súccinilado . - En una modalidad relacionada, la citocina su'ccinilada consiste de alfa-N-succinileritropoyetina; N-epsilon-succinileritropoyetina; alfa-N-succinilo, N-epsilon-succinileritropoyetina; alfa-N-succinilasialoeritropoyetina; N-epsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinilo, N-epsilon-succinilasialoeritropoyetina/ alfa-N-succinilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-succinilhiposialoeritropoyetina; alfa-N-succinilo, N-epsilon-succinilhiposialoeritropoyetina alfa-N-succinilhipersialoeritropoyetina; ' N-epsilon-succinilhipersialoeritropoyetina; y N-epsilon-succinilhipersialoeritropoyetina . En una modalidad, por lo menos un residuo de tirosina de una citocina recombinante protectora de tejido puede ser modificado en una posición de anillo aromático por un reactivo electrofilico, como por ejemplo por nitración o yodinación. En una modalidad relacionada, la citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aquí comprende por lo menos un residuo de lisina modificado por 2, 4, 6-trinitrobencénsulfonato de sodio u otra sal del mismo. En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende por lo menos un residuo de tirosina nitrado o yodinado . En otra modalidad, la citocina recombinante protectora de tejido comprende un residuo de ácido aspártico o de ácido glutámico que reacciona con una carbodiimida seguido por reacción con una amina. En una modalidad relacionada, la amina es glicinamida. En una modalidad, por lo menos un residuo de triptófano de una citocina recombinante protectora de tejido es modificado como por ejemplo por reacción con n-bromosuccinimida o n-clorosuccinimida . En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido se proporciona la cual tiene por lo menos un grupo amino de eritropoyetina removido, como por reacción por reacción con nihidrina seguido por " reducción del grupo carbonilo resultante por reacción con borohidruro. En otra modalidad, se proporciona una citocina recombinante protectora de tejido que tiene por lo menos una abertura de por lo menos uno de los enlaces de cistina en la molécula por reacción con un agente reductor como por ejemplo ditiotreitol, seguido por reacción de los sulfohidrilos subsiguientes con yodoacetamida, ácido yodoacético u otro electrófilo para evitar la reformación de los enlaces disulfuro . En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido es sometida a una proteólisis química limitada que se enfoca hacia residuos específicos, como por ejemplo para disociar después de residuos triptofano. Dichos fragmentos de citocina protectora de tejido recombinante resultantes están abarcados aquí. Como se mencionó arriba, una citocina recombinante protectora de tejido útil para los propósitos aquí puede opcionalmente tener por lo menos una de las modificaciones · químicas mencionadas arriba además del aminoácido (de los aminoácidos) genéticamente alterado (s), pero puede tener más que úna de las modificaciones antes mencionadas. A título de ejemplo de una citocina recombinante protectora de tejido con una modificación en la porción carbohidrato de la molécula y una modificación de la porción de aminoácido, una citocina recombinante protectora de tejido es una asialoeritropoyetina que tiene sus residuos de lisina biotinilados, acilados (como por ejemplo acetilado) o carbamilados . Las citocinas recombinantes protectoras de tejido pueden también ser modificadas mediante la adición de cadenas de ácido graso. En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido es modificada por pergalación, para crear citocinas protectoras de tejido pegiladas por adición de polietilenglicol (PEG) . De conformidad con un aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que ' codifica un polipéptido que comprende la citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. En una modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de residuo de nucleótidos- 5461"" a 6041 del constructo de vector de SEQ ID NO: 208, los residuos de nucleótidos 5461 a 6041 de SEQ ID NO: 209, los residuos de nucleótidos 5461 a 6041 de SEQ ID NO: 210, los residuos de nucleótidos 5461 a 6041 de SEQ ID NO: 211, o bien los residuos de nucleótidos 5461 a 6041 de SEQ ID NO: 212. En una modalidad de la invención, se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ADNc, una secuencia de nucleótidos interrumpida por intrones, o bien no interrumpida por intrones), que codifica un polipéptido que comprende o consiste de la citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aqui arriba a condición que la molécula de ácido nucleico no codifique una citocina recombinante protectora de tejido que comprende una o varias de las' sustituciones de aminoácidos siguientes: I6A, C74, K20A, P42Á, D43A, K45D, K45A, F48A, Y49A, 52A, K49A, S100E, R103A, K116A, T132A, I133A, K140A, N147K, N147A, R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A, o bien R162A. En una modalidad relacionada, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba a condición que la molécula de ácido nucleico no codifique una citocina recombinante protectora de tejido que. comprende cualquiera de las combinaciones siguientes de sustituciones: N24K/N38K/N83K o bien A30N/H32T. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos que codifica la citocina recombinante protectora de tejido es sintetizada empleando codones preferidos que facilitan la expresión óptima en una célula huésped particular. Tales codones preferidos pueden ser óptimos para su expresión en células de una especie de plantas, bacterias, levadura, mamífero, hongos o insectos. " ¦ La invención ofrece también un vector que comprende la molécula de ácido nucleico. La invención ofrece también un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico y por lo menos una región reguladora operablemente enlazada a la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, el vector es un vector pCiNeo . En otra modalidad, la invención proporciona una célula que comprende el vector de expresión". En .otra modalidad, se proporciona una célula genéticamente modificada que comprende la molécula de ácido nucleico . En otra modalidad, la presente invención abarca también composiciones que incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden una o varias de las citocinas recombinantes protectoras de tejido mencionadas arriba. De conformidad con otro, aspecto de la invención, se proporciona una composiciones farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba, que por lo menos no tiene una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, vasoconstricción, hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes, así como producción incrementada de trombocitos. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba, pero las citocinas no tienen por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, vasoconstricción, hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes, y producción incrementada de trombocitos. La citocina comprende por lo menos una actividad de protección celular respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedora. La citocina recombinante protectora de tejido de la composición farmacéutica puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. con por lo menos uno de los cambios siguientes, es decir sustituciones, (cada cambio o combinación de cambio listado ha sido asignado un número de identificación de secuencia separado) : i) un ácido aspártico en residuo 45 y un ácido glutámico en residuo 100 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 106); ii) una asparagina en residuo 30, una treonina en residuo 32 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 107) ; iii) un ácido aspártico en residuo 45, un ácido glutámico en residuo 150 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 109); v) una alanina en residuo 140 y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 110); vi) una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 111); vii) una alanina en residuo 97, y una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 112) ; iix) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 113) ; ix) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, y una alanina en residuo 52 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 114) ; x) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, ¦ una alanina en residuo 52, y una alanina en residuo 140 de SEQ ID NO": 10 (SEQ ID NO: 115); xi) una alanina en residuo 97, una alanina en residuo 152, una alanina en residuo 45, una alanina en residuo 52, una alanina en residuo 140, una alanina en residuo 154, una lisina en residuo 24, una lisian en residuo- 38, una lisina · en residuo 83, una lisina en residuo 24 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 116) xii) una lisina en residuo 24, una lisina en residuo 38, y una lisina en residuo 83 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 117) ; o bien xiv) una lisina en residuo 24 y una lisina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 118) . De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una citocina recombinante protectora de tejido, que comprende por lo menos una de las sustituciones siguientes de residuos de aminoácidos: (a cada cambio o combinación de cambios listado se le ha asignado un número de identificació de secuencia separado) : un triptófano en residuos 152 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 98) ; una alanina en residuo 14 y una alanina en residuo 15 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 119); una alanina en residuo 6 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 15); una alanina en residuo 7 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 16); una alanina en residuo 43 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 42); una alanina en residuo 42 de SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 41) ; una alanina en residuo 48 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 49) ; una alanina en residuo 49 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 50) ; una treonina . en . residuo 32 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 35) ; una alanina en residuo 133 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 83) ; una alanina en residuo 134 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 84) ; una alanina en residuo 147 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 90) ; una alanina en residuo 148 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 92) ; una alanina en residuo 150 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 94) ; una alanina en residuo 152 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 96) ; una alanina en residuo 158 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 102) ; una alanina en residuo 161 de SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 104) ; o bien una alanina en residuo 162 de- SEQ ID NO: 1 0 (SEQ ID NO : 105) . una modalidad, la composición farmacéutica descrita arriba se formula para administración oral, intranasal o parenteral . En otra modalidad, la composición farmacéutica se formula como una solución para perfusado. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados, comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una citocina recombinante protectora de tejido, que comprende por lo menos una sustitución de residuos aminoácido de secuencias nativas de aminoácidos de eritropoyetina humana.

En otras modalidades, una composición farmacéutica de la presente invención para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados, comprende una , cantidad terapéuticamente efectiva de. una citocina recombinante protectora de tejido, que comprende una actividad de protección celular puede no tener una o varias actividades eritropoyéticas o efectos tales como niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes así como producción incrementada de trombocitos . En otras modalidades, la composición farmacéutica de la presente invención para proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados, comprende una cantidad terapéuticamente efectiva · de una citocina recombinante protectora de tejido, que comprende una actividad de protección celular tiene también una o varias actividades eritropoyéticas o efectos tales como niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes y producción incrementada de trombocitos. De conformidad con un aspecto de la invención, se proporciona un método para proteger, mantener o mejorar la viabilidad de una célula, tejido u órgano aislado de un cuerpo de mamífero, que comprende la exposición de dicha célula, tejido u órgano a una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido conformada por una eritropoyetina que no tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trombocitos. En ciertas modalidades, la protección no afecta la médula ósea. La invención proporciona también un método para proteger, mantener o mejorar la viabilidad de una célula, tejido u órgano aislado de un cuerpo de mamífero, que comprende la exposición de dicha célula, tejido u órgano a una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido, de conformidad con lo descrito arriba, que no tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de . hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trombocitos. La invención ofrece además el uso de citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba que · no tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trpnxbocitos , para la preparación de una composición farmacéutica para la protección contra lesión tisular y para la prevención de lesión tisular asi como para la restauración y rejuvenecimiento de tejido y función tisular en un mamífero. En una modalidad, · la lesión es causada por un padecimiento de tipo ataque, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, infarto del miocardio, inflamación, pérdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, daño por radiación, parálisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia relacionada con el SIDA, pérdida de memoria, esclerosis lateral' amiotrófica, alcoholismo, trastornos del humor, trastornos de ansiedad, trastornos de déficit de la atención, hiperactividad, autismo, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, trauma o isquemia cerebral o de la médula espinal, desvío cardiaco pulmonar, insuficiencia cardiaca crónica, degeneración macular, neuropatía diabética, retinopatía diabética, glaucoma, isquemia retinal o bien trauma retinal .

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero, dicho método comprende la administración a dicho mamífero de una composición que comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba, que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, presión sanguínea incrementada, hiperactivación plaquetaria y producción incrementada de trombocitos, en una modalidad, la asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable,- o una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula. Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero, dicho método comprende la administración a dicho mamífero de una composición que comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba, y que tiene una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, presión sanajiínea incrementada, hiperactivación plaquetaria, y producción incrementada de trombocitos. En una modalidad, la asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula. En otra modalidad-, la barrera de células endoteliales se selecciona dentro del grupo que consiste de la barrera hemato-encefálica, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato-testicular, la barrera hemato-ovariana, la barrera hemato-cardiaca, la barrera hemato-renal y la barrera hemato-placental . En otra modalidad, la molécula es una hormona agonista o antagonista de receptores, un factor neurotrófico, un factor antimicrobiano, un agente antiviral, un agente radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un inmunosupresor, un colorante, un marcador o un fármaco anti-cáncer. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición para transportar una molécula por medio de transcitosis a través de una barrera de células endoteliales, dicha composición comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido, de conformidad con lo definido aguí arriba, que no tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante producción incrementada de trombocitos . De conformidad con otro aspecto de la 'invención, se proporciona una composición para transportar una molécula por medio de transcitosis a través de una barrera de células endoteliales,- dicha composición comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido, de conformidad con lo descrito arriba, y tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivas plaquetaria, actividad pro-coagulante asi como producción incrementada de trombocitos. En una modalidad, la asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o bien una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula. En otra modalidad, la molécula es una hormona agonista o antagonista de receptores, un factor neurotrófico, un agente antimicrobiano, un agente radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un inmunosupresor, un colorante, un marcador o un fármaco anticáncer . La invención ofrece también el uso de una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba, que no tiene por lo menos una actividad eritropoyética seleccionad dentro del" grupo que consiste de un nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulante, asi como una producción incrementada de trombocitos . En una modalidad, la asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente. con un sitio de enlace para dicha molécula. En otra modalidad, la molécula es una hormona agonista o antagonista de receptores, un factor neurotrófico, un agente antimicrobiano, un agente radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un agente inmunosupresor, - un colorante o un marcador o un fármaco anti-cáncer. Asi, la invención se enfoca al uso de protección celular de cualquier citocina recombinante protectora de tejido con una alteración en por lo menos un aminoácido de la contraparte de eritropoyetina nativa, en donde la citocina recombinante protectora de tejido tiene una actividad de protección celular de conformidad con lo descrito aqui . Dicha actividad de protección celular incluye, sin limitarse a este ejemplo, una actividad neuroprotectora. La invención se enfoca además al uso de cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido mencionadas arriba en el tratamiento de una célula, tejido u órgano respondedor, en particular para el tratamiento de una condición, o enfermedad que involucra dicha célula, tejido u órgano respondedor. En una modalidad de este tipo, las citocinas recombinantes protectoras de tejido tienen por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (vásoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes asi como producción incrementada de trombocitos . Una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención mantiene preferentemente la conformación tridimensional de una eritropoyetina nativa. La citocina recombinante protectora de tejido puede tener una actividad eritropoyética o- bien no tener una actividad eritropoyética. En una modalidad de la invención, la citocina recombinante protectora de tejido es creada como una proteina recombinante con fusión N-terminal de HisTag-(6x residuos His) . En ciertas modalidades, secuencias adicionales de aminoácidos pueden agregarse como espaciador. En una modalidad especifica, las muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido marcadas con histidina de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, K45D-6xHis y S100E-6xHis . En otro aspecto de la invención, se puede utilizar cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido antes mencionadas en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento ex vivo de células, tejidos y órganos con el objeto de proteger, mantener, mejorar o restaurar la función o viabilidad de células de mamífero respondedoras y sus células, tejidos y órganos asociados. Dicho tratamiento ex vivo, es útil, "para la preservación de células, tejidos u órganos para transplante, ya sea auto-transplante o bien xenotransplante. Las células, tejido u órgano pueden estar bañados en una solución que comprende muteinas de eritropoyetina o ' citocinas recombinantes protectoras de tejido, o bien el perfusado puede ser instilado en el órgano a través de la vasculatura o de otras formas, para mantener el fracción celular durante el periodo en el cual las células, tejido u órgano no están integrados en la vasculatura del donador o receptor. La administración del perfusado puede efectuarse a un donador antes de cosechar el órgano, asi como al órgano cosechado y al receptor. Además, el uso antes mencionado de una citocina rec mbinante protectora de tejido es útil cuando una- célula,' tejido- u órgano es aislado de la vasculatura del " individuo y por consiguiente existe esencialmente ex vivo durante un período de tiempo, el término aislado refiriéndose a la restricción o fijación de. la vasculatura de la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo, como se puede efectuar durante una intervención quirúrgica, incluyendo, en particular, intervención quirúrgica de desvío cardiopulmonar; desvío de la vasculatura de la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo; remoción de la célula, tejido, .órgano o parte de cuerpo del cuerpo de mamífero, como se · puede hacer por adelantado en el caso de xenotransplante o antes y durante un auto-transplante; o bien la amputación traumática de una célula, tejido, órgano o parte del cuerpo. Así, este aspecto de la invención se refiere' tanto a la perfusión con una muteína de eritropoyetina in situ y ex vivo. Ex vivo, la citocina recoirtbinante protectora de tejido puede proporcionarse en una solución de conservación de célula, tejido u órgano. Cualquiera que sea el aspecto, la exposición puede efectuarse a través de perfusión continua, perfusión pulsátil, infusión, baño, inyección o cateterización.' En un aspecto adicional, la invención se enfoca a un método para proteger,, mantener, mejorar o restaurar la viabilidad de una célula, tejido, órgano o parte de cuerpo de un mamífero que incluye una célula o tejido respondedor, en donde la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo es aislado del cuerpo del mamífero. El método incluye por lo menos la exposición de la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo de mamífero aislado a una cantidad de una muteína de eritropoyetina o citocina recombinante protectora de tejido durante un período efectivo para proteger, mantener, mejorar o restaurar la viabilidad mencionada arriba. En ejemplos no limitativos, aislado se refiere a la restricción o fijación de la vasculatura de la célula, tejido, órgano o parte corporal como se puede efectuar durante una intervención quirúrgica, especialmente . en el caso de" una intervención quirúrgica de desvío cardiopulmonar; desviando la vasculatura de la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo; removiendo la célula, tejido, órgano o parte del cuerpo del cuerpo de mamífero, como se puede efectuar por adelantado en el caso de xenotransplante o bien antes y durante un auto-transplante; o bien amputación traumática de una célula, tejido, órgano o parte del cuerpo. Asi, este aspecto de la invención se refiere tanto a la perfusión con una muteína de eritropoyetina o citocina recombinante protectora de tejido in situ o como ex vivo. Ex vivo,- la citocina recombinante protectora de tejido puede proporcionarse en una solución de conservación de células, tejido u órgano. En cualquier caso, la exposición puede efectuarse a través de perfusión continua, perfusión pulsátil, infusión, baño, inyección o cateterización. A titulo de ejemplos no limitativos, la célula o tejido respondedor ex vivo antes mencionado puede ser o comprender células o tejidos neuronales, retínales, musculares, cardiacos, pulmonares, hepáticos, renales, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endoteliales capilares, de testículos, de ovarios, de páncreas, de hueso, de médula ósea, de piel, de sangre de cordón umbilical, o endometriales . Estos ejemplos de células respondedoras son simplemente ilustrativos. Todos los métodos antes mencionados así como los usos presentados arriba se aplican preferentemente a seres humanos, pero son útiles también para cualquier mamífero, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, animales mascotas, animales - domésticos, ganados y animales de zoológicos. Las vías de administración de las composiciones farmacéuticas antes mencionadas incluyen administración oral, intravenosa, intranasal, tópica, intraluminal, por inhalación o parenteral, esta última vía de administración incluyendo administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, sub-mucosal o intradermal . Para uso ex vivo, se prefiere un perfusado o una solución de baño. Esto incluye la perfusión de una porción aislada de la vasculatura in si tu. En otro aspecto de la invención, cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido mencionadas arriba son útiles para preparar una composición farmacéutica para restaurar una célula, tejido u órgano disfuncional cuando se administra después de la enfermedad o condición responsable de la disfunción. A titulo de ejemplo no limitativo, la administración de una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido restaura la función cognoscitiva en animales antes que tengan un trauma cerebral, aun cuando se administra mucho, tiempo después (por ejemplo, un día, tres días, cinco días, una semana, un mes, o más) del trauma inicial. La presente invención abarca composiciones farmacéuticas para el tratamiento (es decir, mejora o inversión de los síntomas o efectos) y prevención (es decir, retardo del inicio, inhibición o suspensión) de daño subsiguiente a células o tejidos que forman una cascada a partir del trauma inicial. Citocinas recombinantes protectoras de tejido útiles para dichas aplicaciones incluyen cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido antes mencionadas particulares. Cualquier forma de citocina recombinante protectora de tejido capaz de ser benéfica para células respondedoras se encuentra dentro del marco de este aspecto de la invención. En otra modalidad, la invención ofrece métodos para el uso de la citocina recombinante protectora de tejido mencionada arriba para restaurar un tejido u órgano disfuncional cuando se administra después del inicio de la enfermedad o condición responsable de la disfunci-ón. A titulo de ejemplo no limitativo, métodos de administración de una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido restaura la función' ¦ cognoscitiva en animales que han tenido previamente trauma cerebral, aún cuando se administra mucho después (por ejemplo tres días, cinco días, una semana, un mes, o más tiempo) de la desaparición del trauma. Citocinas recombinantes protectoras de tejido y modificaciones adicionales a las mismas son de conformidad con lo descrito arriba. Cualquier forma de citocina recombinante protectora de tejido .capaz de ser enéfica para células respondedoras se encuentra dentro del marco de este aspécto de la invención. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona métodos para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero mediante la administración de una composición de una molécula en asociación con una. muteína de eritropoyetina o una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. La asociación entre la molécula a transportar y la citocina recombinante protectora de tejido puede ser, por ejemplo, un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable o una asociación no covalente con el sitio de enlace · para la molécula. La citocina recombinante protectora de tejido y una proteína a transportar pueden ser expresadas como polipéptido de fusión. Barreras de células endoteliales pueden ser la barrera hemato-encefálica, la barrera hemato-cardiaca, la barrera hemato-renal, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato-testicular, la barrera hemato-ovariana y la barrera hemato-placental . Moléculas adecuadas para transporte mediante el método de la presente invención incluyendo hormonas, como por ejemplo hormonas de crecimiento, antibióticos y agentes anti-cáncer. E un aspecto adicional de la presente invención para proporcionar una composición para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero, dicha composición comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. En otro aspecto de la presente invención, cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido antes mencionadas es útil para preparar una composición farmacéutica para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero, dicha composición comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con' lo descrito arriba. La asociación puede ser, por ejemplo, un enlace · covalente lábil, ..un polipéptido de fusión, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente con un sitio de enlace para la molécula. Barreras de- células endoteliales pueden ser la barrera hemato-encefálica, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato-testicular, la barrera hemato-ovariana y la barrera hemato-placental . Moléculas adecuadas para transporte a través del método de la presente invención incluyen, por ejemplo, hormonas tales como hormonas de crecimiento, factores neurotróficos, antibióticos, antivirales o antifúngales tales como los normalmente excluidos del cerebro y de otros órganos que presentan barreras, agentes radiofarmacéuticos peptídicos, fármacos de antisentido, anticuerpos contra agentes biológicamente activos, agentes farmacéuticos, colorante, marcadores y agentes anti-cáncer. Estos y otros aspectos de la invención se entenderán mejor con referencia a las figuras siguientes y a la descripción detallada que se presenta más adelante. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura- · 1 muestra la distribución de receptor para eritropoyetina en un cerebro humano normal, en secciones delgadas mar-cadas con un anticuerpo anti-eritropoyetina . La figura 2 es una amplificación de mayor potencia de la imagen de la figura- G. La figura 3 muestra, empleando anticuerpos secundarios marcados con oro, la distribución ultra-microscópica de receptores para eritropoyetina. La figura 4, preparada de manera semejante a la figura 3, muestra receptores para eritropoyetina de alta densidad en las superficies luminales y anti-luminales de capilares cerebrales humanos. La figura 5 muestra la translocación de eritropoyetina administrada parenteralmente en el fluido cerebro-espinal. La figura 6A y la figura 6B indican los resultados del ensayo de neuroprotección de células de neuroblastoma SK-N-SH (contra rotenona) para eritropoyetina asi como las citocinas recombinantes protectoras de tejido con las citocinas recombinantes protectoras de tejido K45D y S100E. El eje y en la gráfica indica las lecturas de absorbencia, y los datos son .medias ± rango de determinaciones por duplicado. La gráfica dentro de la figura 6A indica claramente que la vialidad de las células dentro de las muestras de K45D y S100E mantuvieron su viabilidad demostrando su efecto de protección celular. La figura 6B muestra el mapa de plásmido de hEPO-6xHisTag-PCiNeo. La figura 7 compara la eficacia in vitxo de la eritropoyetina y asialoeritropoyetina sobre la viabilidad de células P19 con deprivación de suero. La figura 8 muestra otro experimento que compara la eficacia in vitxo de eritropoyetina y asialoeritropoyetina sobre la viabilidad de células P19 con deprivación de suero. La figura 9 muestra la protección de eritropoyetina y asialoeritropoyetina en un modelo de isquemia cerebral focal de rata. La figura 10 muestra una respuesta a dosis que compara la eficacia de eritropoyetina humana y asialoeritropoyetina humana en oclusión de arteria cerebral media en un modelo de ataque isquémico. La figura 11 muestra la actividad de eritropoyetina yodinada en el ensayo de P19. La figura 12 muestr ' el efecto de eritropoyetina biotinilada y asialoeritropoyetina en el ensayo P19. La figura 13 compara la eficacia in vitro de la eritropoyetina con eritropoyetina modificada con fenilglioxal sobre la viabilidad de células P19 con deprivación de suero. La figura 14 muestra el efecto de citocinas protectoras de tejido en el ensayo de intoxicación de agua. La figura 15 muestra el mantenimiento de la función de un corazón preparado para transplante por una eritropoyetina.

La figura 16 muestra la protección del miocardio contra daño isquémico por eritropoyetina después de una oclusión vascular temporal . Las figuras 17A, 17B, 17C y 17D muestran los efectos de un tratamiento, con eritropoyetina en un modelo de glaucoma .de rata. La figura 18 muestra la magnitud de la preservación de la función retinal por una eritropoyetina en el modelo de glaucoma de rata. La figura 19 muestra la restauración de la función cognoscitiva después de trauma cerebral por administración de una eritropoyetina empezando cinco días después del trauma. La figura 20 muestra la restauración de la función cognoscitiva después de trauma cerebral por administración de una eritropoyetina empezando 30 días después del trauma. La figura 21 muestra la eficacia de asialoeritropoyetina humana en un modelo de kainato de toxicidad cerebral. La figura 22 muestra la eficacia de citocinas protectoras de tejido en un modelo de lesión de médula espinal de rata. La figura 23 muestra la eficacia de citocinas protectoras de tejido en un modelo de lesión de médula espinal de conejo. Las figuras 24A, 24B, y 24C muestran una sección coronal de la capa cortical cerebral teñida por hematoxilina y eosina. Las figuras ¦ 25A, 25B y 25C muestran secciones coronales de corteza frontal adyacente a la región de infarto teñida por anticuerpo GFAP. Las figuras 26A y 26B muestran sección coronales de capa de corteza cerebral teñido por anticuerpo OX-42. La figura 27A y 27B muestran secciones, coronales de capa de corteza cerebral adyacente a la región de infarto teñida por anticuerpo OX-42. La figura 28 muestra la eficacia -de una eritropoyetina contra la inflamación en un modelo de EAE . La figura 29 compara los efectos de la dexametasona y una eritropoyetina sobre la inflamación en el modelo de EAE. Las figuras 30A y 30B muestran que la eritropoyetina suprime la inflamación asociada con la muerte neuronal.__ La figura 31 muestra que la eritropoyetina humana y las citocinas recombinantes protectoras de tejido R130E y R150E reducen efectivamente la muerte celular inducida por NMDA cuando se agregan a los cultivos de células neuronales hipocampales primarias antes de tratamiento con NMDA. Las células tratadas con R103E (5 nm) presentaron significativamente menos muerte celular en comparación con las células de control tratadas con vehículo (p=0.01) . Las células tratadas con R103E (5 nm) presentaron significativamente menos muerte celular en comparación con las células de control tratadas con vehículo (p=0.01). Las células tratadas con R150E (5 nM) presentaron aproximadamente una disminución del 20% de la muerte celular en comparación con las células de control tratadas con solvente (p=0.001). Estadísticas: ANOVA más prueba post-hoc de Tukey. La figura 32 muestra la protección neuronal a partir -de retiro de suero en células P19. El porcentaje de células apoptóticas disminuyó en el caso de las células pre-tratadas con Epo, EpoWT, y citocina recombinante protectora de tejido S100E. Las células tratadas . con Epo presentaron una disminución de aproximadamente 20% en cuanto a la muerte celular apoptótica en comparación con las células de control no tratadas. Las células tratadas con EpoWT y S100E presentaron en ambos casos una disminución de aproximadamente el 10% de la muerte celular apoptótica en comparación con las células de control no tratadas. Las figuras 33A y 33B muestran el efecto de la pre-incubación con S100E en células PC12 diferenciadas sometidas a retiro de NGF en dos experimentos independientes. Las células PC12 diferenciadas fueron. pre-tratadas con S100E en las concentraciones indicadas durante 24 horas, Figura 33A (3 pM) Figura 33B (0.00003 pM-3pM) . La viabilidad fue medida en el ensayo MTT. Se utilizó NFG (100 ng/ml) como control positivo y un medio libre de NGF (-NGF) como control negativo. Los datos presentados en la figura 33 se presentan como porcentajes -de viabilidad de control positivo (+NGF) (n=8 en arabos experimentos) . Existe un incremento estadísticamente significativo de la viabilidad de células tratadas con S100E en comparación con las células de control negativo (-NGF) mediante el uso de ANOVA de un sentido y prueba post-hoc de Bonferroni . ***p<0.001, *p<0.05. Los efectos observados con S100E fueron semejantes a los efectos observados con Epo en este sistema de prueba con relación a potencia y eficacia.

Las figuras 34A, 34B y 34C muestran el efecto de la pre-incub'áción con Epo en células PC12 diferenciadas sometidas a retiro de NGF. Las células PC12 diferenciadas fueron pre-tratadas con Epo, S1Ó0E, o Epo carbamilado (30 pM-30 nM) durante 24 horas. La molécula Epo químicamente modificada, AA24496, presentó una- actividad 10,000 veces inferior que EPO en el ensayo de células UT-7. La viabilidad fue medida en el ensayo MTT. Se utilizó NGF (100 ng/ml) como control positivo y el medio libre de NGF (-NGF) como control negativo. La figura 35 muestra curvas de concentración-respuesta de Epo, K45D y S100E en células UT-7. Concentraciones diferentes de Epo, EpoWT, K45D y S100E se agregaron a células UT-7. La viabilidad fue medida 48 horas después en el ensayo WST-1. Los datos son media ± desviación estándar de tres experimentos diferentes cada uno efectuado : por duplicado. La curva es un ajuste de curva de regresión no lineal. La figura 36 muestra las curvas de respuesta a dosis de Epo, R103E y R150E en células UT-7. Concentraciones diferentes de Epo, Epo T, R103E y R150E fueron agregadas a células UT-7. La viabilidad se midió 48 horas después en el ensayo WST-1. Los datos son media ± desviación estándar de tres experimentos diferentes cada uno efectuado por duplicado. La curva es un ajuste de curva de regresión no lineal. La figura 37 es una gráfica que demuestra las velocidades locomotoras de las ratas que se recuperan de trauma a la médula espinal durante un periodo de cuarenta y dos días. Como se puede observar a partir de la gráfica, las ratas que recibieron S100E se recuperaron más rápidamente de la lesión y demostraron una mejor recuperación global de la lesión que las ratas de control y que las ratas que recibieron metilprednisolona . La figura 38 muestra la proporción de latencia del ojo lesionado en comparación con la latencia del ojo normal para los varios regímenes de tratamiento. La rata tratada con EPO presentó una latencia de 1.2, lo que es mejor que lo observado en el caso de la rata tratada con solución salina. Cada una de las cuatro citocinas recombinantes protectoras de tejido resultó en resultados de latencia iguales o mejores que EPO con R103E, R150E, y S100E mostrando una mejora estadística en comparación con EPO.

La presente invención se refiere a muteínas de citocinas recombinantes protectoras de tejido. En particular, la presente invención ofrece composiciones que comprenden molécula de ácido nucleico aisladas que codifican muteínas de citocinas recombinantes protectoras de tejido, así como células aisladas y/o recombinantes y vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico. La invención abarca además polipéptidos aislados de muteínas de citocina recombinante protectora de tejido que no tienen por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva (yasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes; así como producción incrementada de trombocitos, " la citocina que tiene por lo menos una actividad de protección celular respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido ü órgano de mamífero respondedor. " La invención abarca también métodos para proteger, mantener o mejorar la viabilidad de una célula, tejido u órgano aislado de un cuerpo de mamífero, empleando muteínas de citocina recombinante protectora de tejido de la invención y el uso de tales muteínas en el tratamiento y prevención de enfermedades y condiciones. Una "célula respondedora" se refiere a una célula de mamífero cuya función o viabilidad puede ser mantenida, promovida, mejorada, regenerada, o bien con beneficio de otro tipo, mediante la exposición a una eritropoyetina.. Ejemplos no limitativos de tales células incluyen células neuronales, retínales, musculares, cardiacas, pulmonares, hepáticas, renales, de intestino- delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endotelxales capilares, de testículos, de ovario, de páncreas, de hueso, de piel -y células endometriales . En particular las células respondedores incluyen, sin limitación células neuronales; células de Purkinje, células retínales: fotoreceptor (bastoncitos y conos), células de ganglios, bipolares, horizontales, amacrinas y de Müeller.- Células musculares; células cardiaca: miocardio, marcapaso, nodo sinoatrial, nodo sinusal, así como células de tejido de unión (nodo atrioventricular y fascículos de his) ; células pulmonares; células hepáticas, hepatocitos, células esteladas y células de upffer; células renales: células mesangiales, epiteliales renales e intersticiales tubulares; células de intestino delgado: células de Goblet, células de glándula intestinal (.criptas) y células endocrinas entéricas; células de corteza adrenal: células de glomerulosa, fasciculadas y reticulares; células de médula adrenal: células de cromafina; células capilares, células de perícito; células de testículos: células de Leydig, Sertoli- y esperma y sus precursores, células ovarianas; células de folículos Grafianos y folículos primordiales; células de "páncreas: isletas de Langerhans, células a, células ß, células ? y cédulas F; células óseas: osteoprogenitores, osteoclastos, y osteoblastos; células cutáneas; células endometríales : células endometriales y de estroma endometrial; así como las células progenitoras y endoteliales presentes en los órganos listados arriba. Además, tales células respondedoras y los beneficios que se les proporciona por una citocina recombinante protectora de tejido pueden extenderse para proporcionar protección o mejora indirectamente a otras células que no son directamente respondedoras o bien a tejidos u órganos que contienen tales células no respondedoras. Estas otras células, tejidos u órganos que se benefician indirectamente de la mejora de las células respondedoras están presentes como parte -de las células, tejido u órgano como células, tejidos y órganos "asociados". Así, los beneficios de una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aquí pueden proporcionarse como resultado de la presencia de un pequeño número o de una proporción de células respondedoras en un tejido u órgano, como por ejemplo, tejido excitable o neuronal presente en dicho tejido, o bien las células de Leydig del testículo, que forman la testosterona . En un aspecto, la célula respondedora o sus células, tejidos u órganos asociados no son células, tejidos u órganos excitables o no comprenden predominantemente células o tejidos excitables. Los métodos de la invención ofrecen la protección o mejora local o sistémica de células, tejidos y órganos dentro del cuerpo de un mamífero, bajo una amplia gama de condiciones normales y adversas, o la protección de los contemplados para re-localización en el cuerpo de otro mamífero. Además, la restauración o regeneración de disfunción se proporciona también. Como se mencionó arriba,- la capacidad de una muteína de eritropoyetina o una citocina recombinante protectora de tejido para atravesar una barrera hermética de células endoteliales y ejercer sus efectos positivos sobre células respondedoras (así como otros tipos de células) distales de la vasculatura ofrece el potencial de prevenir y de trata una amplia gama de condiciones y enfermedades que causan por otro lado un daño celular y tisular significativo en un animal, incluyendo seres humanos, y además permiten el éxito de procedimientos , quirúrgicos hasta la fecha no posibles para los cuales tradícionalmente el riesgo es mayor que los beneficios. La duración _y: - grado de condiciones voluntariamente adversas inducidas para beneficio último, como por ejemplo quimioterapia de alta dosis, radioterapia, supervivencia de transplante ex vivo prolongado, y períodos prolongados de isquemia inducida quirúrgicamente, pueden llevarse a cabo aprovechando la presente invención. Sin embargo, la presente invención no se limita a esto sino que incluye como uno de sus aspectos, métodos y composiciones en donde las células respondedoras blanco están distales con relación a la vasculatura por medio de una barrera de células endoteliales o uniones herméticas endoteliales . En general, la invención se enfoca _a cualquier célula respondedora y células, tejidos y órganos, asociados que puede beneficiarse de una exposición a una citocina recombinante protectora de tejido. Además, la disfunción celular, tisular o de órgano puede ser restaurado o regenerado después de un evento adverso agudo (como por ejemplo trauma) por exposición a una citocina recombinante protectora -de tejido. La invención se enfoca por consiguiente en términos generales al uso de citocinas recoiabinantes protectoras de tejido para la preparación de composiciones farmacéuticas para .los propósitos mencionados arriba en donde la función celular es mantenida, promovida, mejorada, regenerada o se ve beneficiada de cualquier otra forma. La invención se enfoca también a métodos para mantener, mejorar, promover o regenerar la función celular mediante la administración a un mamífero de una cantidad efectiva de una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aquí. La invención se enfoca además a métodos para mantener, promover, mejorar o regenerar la función célula ex vivo mediante la exposición de una célula, tejido u órgano a una citocina recombina te protectora de tejido. La invención se enfoca también a una composición de perfusado que comprende una citocina recombinante protectora de tejido para su uso en la preservación de un órgano o tejido. Los varios métodos de la invención utilizan una composición farmacéutica que incluye por lo menos una citocina recombinante protectora de tejido en una cantidad efectiva para la via particular y duración de exposición para ejercer efectos positivos o beneficios sobre células respondedoras dentro del cuerpo de un mamífero o bien fuera de dicho cuerpo. Cuando la célula blanco, tejidos u órganos de la terapia contemplada requieren de citocina . recombinante protectora de tejido para atravesar una barrera de células endoteliales, la composición farmacéutica incluye la citocina recombinante protectora de te ido en una . concentración que puede, después del atravesamiento de la barrera de células endoteliales, ejercer sus efectos deseables sobre las células respondedoras. Las moléculas capaces de interactuar con un receptor para eritropoyetina, y modular una actividad de protección celular dentro de la célula son útiles en el contexto de la presente invención. 5.1 ÁCIDOS NUCLEICOS DE LA INVENCIÓN Una citocina recombinante protectora de tejido que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención incluye ácidos nucleicos que codifican citocinas protectoras de tejido que ,comprenden una muteina de eritropoyetina que no tiene o bien que presenta una disminución de por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de hematócritos, acción vasoactiva ( asoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulantes asi como producción incrementada de trombocitos, la citocina tiene por lo menos una actividad de protección celular respondedora seleccionada' dentro del grupo que consiste de. protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor. Una citocina protectora tisular que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención incluye ácidos nucleicos que ' codifican la muteina de eritropoyetina, con la actividad descrita arriba, que comprende uno o varios residuos de aminoácidos alterados entre las posiciones 11-15 de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 1], posición 44-51 de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 2], posición 100-108 de SEQ ID NO:10 [-SEQ ID NO: 3], o posición 146-151 - de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 4]. Una citocina protectora de tejido que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención que incluye los ácidos nucleicos que codifican la muteina de eritropoyetina, con la actividad descrita arriba, que comprende un residuo de aminoácido alterado en una o varias de las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 10: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 ó 161. Una citocina protectora de tejido que comprende una molécula de - ácido nucleico de la invención incluye ácidos nucleicos que codifican la muteina de eritropoyetina, con la actividad descrita arriba, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con uno o varios de los cambios siguientes: una alanina en el residuo 6 de SEQ ID NO: 10, un alanina en el residuo 7 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 7 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 10 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 11 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 12 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo- -13 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 14 de SEQ ID NO: 10, un ácido glutámico en el residuo 14 de SEQ ID NO: 10, una glutamina en el residuo 14 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 15 de SEQ ID NO: 10, una fenilal-anina en el residuo 15 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 15 de SEQ ID NO: 10, un ácido glutámico en el residuo 20 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 20 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 21 de SEQ ID NO: 10, una lisina en el residuo 24 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 29 de SEQ ID NO: 10; una tirosina en el residuo 29 de SEQ ID NO: 10, una asparagina en el residuo 30 de SEQ ID NO: 10, una treonina en el residuo 32 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 33 de SEQ ID NO: 10, una tirosina en el residuo 33 de SEQ ID NO: 10, una lisina en el residuo 38 de SEQ ID NO: 10, una Usina en el residuo 38 de SEQ ID NO: 10, una asparagina en el residuo 42 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 42 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 43, una isoleucina en el residuo 44 de .SEQ ID NO: 10, un ácido aspártico en el residuo 45 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 45 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 46 de SEQ ID NO: 10,. una alanina en el residuo 47 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 48 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 48 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 49 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 49 de SEQ ID NO: 10, una fenilalanina en el residuo 51 de SEQ ID NO: 10, una asparagina en el residuo 51 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 52 de SEQ ID NO: 10, una asparagina en el residuo. 59 de SEQ ID NO: 10, una treonina en el residuo 62 de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 67 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 70 de SEQ ID NO: 10, una arginina en el residuo 96 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 97 de SEQ ID NO: 10, una arginina en el residuo 100 de SEQ ID NO: 10, un ácido glutámico en el residuo 100 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 100, una treonina en el residuo 100 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 101 de .SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 101 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 102 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 103 de SEQ ID NO: 10, un ácido glutámico en el residuo 103 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 104 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 104 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 105 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 106 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 106 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 107.de SEQ ID NO: 10, una -leucina en el residuo 107 de SEQ ID NO: 10, una lisina en el residuo 105 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 108 "de SEQ ID NO: 10, una serina en el residuo 108 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 116 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 126 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 132 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 133 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 134 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 140 de SEQ ID NO: 10, una isoleucina en el residuo 142 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 143 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 146 de SEQ ID NO: 10, una lisina en el residuo 147 de SEQ ID NO:' 10, una alanina en el residuo 147 de SEQ ID NO: 10, una tirosina en el residuo 148 de SEQ ID NO: 10., una alanina en el. residuo 148 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 149 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 150 de SEQ ID NO: 10, un ácido glut mico ' en el residuo 150 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 151 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 152 de SEQ ID NO: 10, un triptófano en el residuo 152 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 153 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el. residuo 154 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 155 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 158 de SEQ ID NO: 10, una serina en el . residuo 160 de SEQ ID NO: 10, una alanina en el residuo 161 de SEQ ID NO: 10, o una alanina en el residuo 162 de SEQ ID NO: 10. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen además secuencias de nucleótidos que codifican muteinas de eritropoyetinas recombinantes que tienen un nivel de identidad de por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o más en cuanto a secuencia de aminoácidos con una de las muteinas de eritropoyetina descritas arriba. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos que codifican muteinas de eritropoyetina, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácido o ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico) . Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o de nucleótidos se- comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas que se empalman/número total de posiciones que se empalman x 100%) . En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen además secuencias de nucleótidos que codifican muteinas de eritropoyetinas recombinantes en donde las secuencias de ácido nucleico que codifica la eritropoyetina que es alterada por una o varias de las sustituciones, deleciones o modificaciones descritas arriba comprende por lo menos una identidad de secuencia de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 701, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98%, con SEQ ID NO: 7. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen " también secuencias de nucleótidos que codifican muteinas de eritropoyetina recombinantes en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica eritropoyetina que es alterada por una o varias- de las sustituciones, deleciones, o modificaciones descrita arriba es un ácido nucleico que codifica una eritropoyetina no humana. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede también lograrse empj ^-ando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo preferido de un , algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altsc ul, 1990 , Nat .

Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como Karlin y Altscfiul, 1993, Proc. Nat . Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y colaboradores, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Búsquedas e nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteínas BLAST pueden ser efectuadas con el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos que son homologas a una molécula de proteina de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad con lo descrito en Altschul y colaboradores, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se puede utilizar PSI-Blast para efectuar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (Altschul y colaboradores, 1997, supra) . Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo no limitativo preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos ponderadas PAM120, una penalidad por longitud de hueco de 12, y una penalidad de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse empleando técnicas semejantes a las descritas arriba, con o sin permitir espacios. Al calcular el porcentaje de identidad, se cuentan típicamente solamente las correspondencias exactas . Las moléculas de ácido- nucleico de la presente invención incluyen además: (a) cualquier secuencia de nucleótidos que se híbrida con una muteína de eritropoyetina o una citocina recombinante protectora de tejido que codifica una molécula de ácido nucleico de la invención . descrita arriba, bajo condiciones estrictas, es decir, hibridación con ADN unida a filtro en 6x cloruro de' sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45°C seguido por uno o varios lavados en 0.2xSSC/0.1% SDS a aproximadamente 50-65°C, o bien (b) bajo condiciones altamente estrictas, como por ejemplo, hibridación con ácido nucleico unido a filtro en 6xSSC a una temperatura de aproximadamente 45°C seguido por uno o varios lavados en O.lx SSC/0.2% SDS a una temperatura de aproximadamente 68°C, o bien bajo otras condiciones de hibridación que son aparentes a una persona con conocimientos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel F. M. y colaboradores, eds . , 1989, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular] Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John iley & sons, Inc., New York, en páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3). Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de muteina de eritropoyetina codificadora que se híbrida en las condiciones descritas en (a) y (b) , arriba, es una molécula que comprende el complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica una muteina de eritropoyetina. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico que se hibridan bajo condiciones (a) y (b), arriba, codifican productos de proteína,' como por ejemplo, productos de proteína funcionalmente equivalentes, es decir que tienen una o varias de las actividades de eritropoyetina descritas arriba, de una muteina de eritropoyetina. Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son humanos. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen además las secuencias de nucleótidos arriba que se hibridan con la muteina de eritropoyetina o una citocina recombinante de protección de tejido de conformidad con lo descrito arriba y que además no tiene o bien presenta una disminución de por lo menos una actividad eritropoyética seleccionada dentro del grupo que consiste de niveles incrementados de ematócritos, acción vasoactiva (vasoconstricción/vasodilatación) , hiperactivación plaquetaria, actividades pro-coagulante, asi como una producto incrementada de trombocitos, ¦ la citocina o muteina comprendiendo por lo menos una actividad de protección celular respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento,-¦ mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor. La disminución puede ser - una disminución ligera o bien una falta casi total de una de las actividades eritropoyéticas . Tales disminuciones pueden medirse a través de técnicas estándares conocidas (Gruber y colaboradores, 2002, J. Biol Chem. 277 (81) : 27581-27584; Page y colabor-adores, 1996, Cytokine 8(1): 66-69; Park y colaboradores, 1997, Mol. Cells 7 (6) : 699-704; Wolf y colaboradores, 1997, Thro b Haemost 78:1505-1509; y Dale y colaboradores, 2002, Nature 415:175-179. Los ensayos de células UT-7 descritos en la Sección 6.17 son un ejemplo no limitativo de una técnica para medir la actividad eritropoyética disminuida o aminorada. Las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden además los complementos de los ácidos nucleicos descritos arriba. Fragmentos de las moléculas de ácido nucleico de muteina de eritropoyetina se refieren a las secuencias de ácido nucleico de muteina de eritropoyetina descritas arriba que pueden ser por lo menos 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, o más nucleótidos contiguos de longitud. Alternativamente, los ..fragmentos pueden comprender secuencias que codifican por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o más residuos de aminoácidos contiguos de la muteina de eritropoyetina. En una modalidad, · la molécula de ácido nucleico de muteina de eritropoyetina codifica un producto génico que presenta por f lo menos una actividad biológica de una muteina de eritropoyetina correspondiente. Fragmentos de las 'moléculas de ácido nucleico de muteina de eritropoyetina pueden también referirse a porciones de regiones codificadoras de muteina de eritropoyetina .que ¦ codifican dominios de muteina de eritropoyetina madura o bien muteina de eritropoyetina madura . La eritropoyetina derivada de otros organismos puede ser utilizada para crear las muteinas de eritropoyetina de la invención. Con relación a la clonación de variantes de la muteina de eritropoyetina o ácidos nucleicos de citocina recombinante protectora de tejido y homólogos y ortólogos de otras especies, las secuencias de ácido nucleico de eritropoyetina aislada divulgadas aquí pueden ser marcadas' y utilizadas para tamizar una biblioteca de ADN construida a partir del AR m obtenido de células o tejidos apropiados derivados del organismo de interés. Las condiciones de hibridación utilizadas deben ser generalmente de un menor nivel de estrictez cuando la biblioteca de "ADNc es derivada de un organismo diferente del tipo de organismo a partir del cual se derivó la secuencia marcada y puede determinarse de manera rutinaria con base por ejemplo en la relación relativa entre el organismo blanco y el organismo de referencia. Alternativamente, el fragmento etiquetado . puede ser utilizado para tamizar una biblioteca genómica derivada del organismo de interés, otra vez, empleando condiciones apropiadas de estrictez. Las condiciones apropiadas de estrictez son bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia de conformidad con lo comentado arriba y varían de manera predecible según los organismos específicos a partir de los cuales se derivan la biblioteca y las secuencias etiquetadas . ' Para alineamientos en cuanto a estas condiciones, véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio] , Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y colaboradores 1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular] , Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., ambos incorporándose aquí por referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, para elaborar una citocina recombinante protectora de tejido, se puede amplificar ADN a partir de ADN genómico o ADNc (es decir SEQ ID NO: 7) por amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) empleando cebadores diseñados a partir de la secuencia conocida donde un citocina recombinante protectora de tejido relacionada u homologa. Se utiliza la reacción en cadena de polimerasa para amplificar la secuencia deseada en clon de ADN o una biblioteca genómica o de ADNc, antes de la selección. Se puede llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa por ejemplo por medio de uso de un ciclizador térmico y Taq polimerasa (Gene Amp®) . La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza habitualmente para obtener genes o fragmentos de genes de interés. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una citocina recombinante- protectora de tejido de cualquier longitud deseada puede ser generada empleando cebadores de reacción en cadena de polimerasa que flanquean la secuencia de nucleótidos que codifica un cuadro de lectura abierto. Alternativamente, una secuencia de gen de citocina recombinante protectora de tejido puede ser disociada en sitios apropiados con endonucleasa (s) de restricción si tales sitios están disponibles, liberando un fragmento de ADN que codifica el gen de ¦ citocina recombinante protectora de tejido. Si 'sitios de restricción convenientes no están disponible, pueden ser creados en las posiciones apropiadas por mutagénesis dirigida a sitio y/o métodos de amplificación de ADN conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Shankarappa y colaboradores, 1992, PCR Method Appl . 1:277-2-78) . El fragmento de ADN que codifica la citocina recombinante .protectora de tejido es después aislado y ligado en un vector de expresión apropiado, cuidándose de asegurar que se mantiene el cuadro de lectura de traducción apropiado. Cualquier técnica de mutagénesis conocido en la técnica puede emplearse para modificar los nucleótidos individuales en una secuencia de ADN, con el objeto de efectuar sustitució (es) de aminoácido (s) en la secuencia de péptidos expresada, o bien para crear/remover sitios de restricción para facilitar adicionalmente las manipulaciones. Tales técnicas incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, mutagénesis química, mutagénesis dirigida a sitio in vitro (Hutchinson y colaboradores, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos (Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hill y colaboradores, 1987, Methods Enzymol. 155:558-568) de conformidad con lo descrito en la sección 6.3, extensión de empalme basado en PCR (Ho y colaboradores, 1989, Gene 77:51-59), mutagénesis de megacebador basada en PCR (Sarkar y colaboradores, 1990, Biotechniques 8:404-407), etc. Las modificaciones pueden ser confirmadas, por ejemplo por secuenciamiento de ADN de didesoxinucleótido de doble cadena.

La invención incluye también moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ADN que son los complementos de las secuencias de nucleótidos de los párrafos anteriores. En ciertas modalidades, las ' moléculas de ácido nucleico de la invención están presentes como parte de moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos para contener o codificar secuencias heterólogas (por ejemplo, vector, vector de expresión o proteina de fusión). 5.2 CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO DE LA INVENCIÓN Las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención incluyen muteinas de eritropoyetina que mantienen una actividad eritropoyética parcial ' o completa. La eritropoyetina es una hormona de glicoproteina que, en seres humanos, tiene un peso molecular de aproximadamente 34 kDa . La proteina madura comprende .165. aminoácidos , y los residuos glicosilo conforman aproximadamente el 40% del peso de la molécula. Las formas de citocina recombinante protectora de tejido útiles en la' práctica de la presente invención abarcan por lo menos un cambio individual de aminoácidos en las formas" naturales, sintéticas y recombinantes de las siguientes moléculas relacionadas con eritropoyetina de seres humanos y otros ¦ mamíferos: eritropoyetina, asialoeritropoyetina, eritropoyetina desglicosilada, análogos de eritropoyetina, miméticos de eritropoyetina, fragmentos de eritropoyetina, moléculas de eritropoyetina híbridas, moléculas de enlace con receptor de eritropoyetina, agonistas de eritropoyetina, eritropoyetina renal, eritropoyetina cerebral, oligómeros y multímer'os de los mismos y congéneres de los mismos. Tales citocinas recombinantes protectoras de tejidos equivalentes incluyen eritropoyetinas mutantes que pueden contener sustituciones, deleciones, incluyendo deleciones · internas, adiciones, incluyendo adiciones que proporcionan proteínas de fusión o sustituciones conservadoras de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos y/o adyacente a la secuencia de aminoácidos, pero que resultan en un cambio "silencioso" ' en que el cambio produce una muteína de eritropoyetina funcionalmente equivalente o , . una citocina recombinante protectora de tejido. En una modalidad -preferida, la citocina recombinante protectora de "tejido no es eritropoyética, es decir, no tiene una actividad eritropoyética o bien presenta una actividad eritropoyética disminuida. Sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden efectuarse con base en la semejanza de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, aminoácidos ' no polares (hidrofóbreos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína/ tirosina, asparagina, y glutamina; aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyendo arginina, lisina e histidina; y aminoácidos cargados negativamente (ácidos) ••incluyen - ácido aspártico y ácido glutámico .. Alternativamente, cambios de aminoácidos no conservadores asi como inserciones y deleciones mayores pueden emplearse para crear citocinas recombinantes protectoras de tejido funcionalmente alteradas. Tales mutantes pueden ser utilizados para alterar las propiedades de la eritropoyetina en formas deseables. Por ejemplo, en una modalidad, una eritropoyetina' útil para la práctica de la presente invención puede ser una citocina recombinante protectora de tejido alterada en uno o varios aminoácidos dentro de los cuatro dominios funcionales de la eritropoyetina que afectan el enlace con receptor: VLQRY (SEQ ID NO: 1) y/o TKVNFYAW (SEQ ID NO: 2) y/o SGLRSLTTL (SEQ ID NO: 3) y/o SNFLRG (SEQ ID NO: 4) . En otra modalidad, la eritropoyetina que contiene mutaciones en las áreas aledañas de la molécula que afectan las propiedades cinéticas o de enlace con receptor de la molécula pueden emplearse. La determinación de qué alteraciones o qué posiciones en los dominios afectarán el enlace puede lograrse empleando métodos estándares. Por ejemplo, los dominios pueden ser alterados por mutaciones de alanina en pares (mutagénesis de exploración ala) seguidas por medición de las características cinéticas de enlace de mutantes con el objeto de examinar el efecto sobre el enlace con un receptor (Bernat y colaboradores, 2003, PNAS 100:952-957; Wells y colaboradores, 1980, Science 244:1081-1085) . El término "citocina recombinante protectora de tejido" asi como una "citocina recombinante protectora de tejido" pueden utilizarse de manera intercambiable o bien de manera conjuntiva con el objeto de abarcar las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención y modificaciones adicionales a las mismas, como por ejemplo formas de desglicosiladas, asialiladas, y otras formas parcialmente glicosiladas de la citocina recombinante protectora de tejido, o bien modificaciones químicas de los aminoácidos. Ejemplos no limitativos de tales variantes se describen en Tsuda; y colaboradores, 1990, Eur. J. Biochem. 188:405-411, que se incorpora aquí por referencia. Las citocinas son altamente flexibles y, en el caso de la hormona de crecimiento de ser humano, se sabe que se requiere de flexible para activación (Wells y colaboradores, 1989, Science. 244:1081-1085). Así, mutaciones que estabilizan la estructura tridimensional de una citocina, evitando una activación normal del receptor de eritropoyetina están dentro del marco de la presente invención. Además, varios sistemas de huéspedes pueden ser utilizados para la expresión y producción de citocinas recombinantes protectoras de tejido incluyendo, pero sin limitarse a estos ejemplos, sistemas de células de bacterias, levaduras, insectos, plantas y mamíferos, incluyendo seres humanos. Por ejemplo, la eritropoyetina recombinante producida en bacterias, que no glicosila, asialila ni glicosila parcialmente el producto, podría emplearse con el objeto de producir formas no -glicosiladas de la. ¦-citocina recombinante protectora de tejido o bien puede ser glicosiladas adicionalmente utilizando métodos conocidos en la técnica como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, las técnicas divulgadas en las solicitudes de patentes norteamericanas Nos. US 2003/0040037 Al y US 2003/0003529 para el uso de la fucosilación con el objeto de ajustar la " glicosilación de las proteínas. Alternativamente,- se pueden producir citocinas recombinantes protectoras de tejido en otros sistemas capaces de glicosilar proteínas expresadas, como por ejemplo, plantas e incluyen células humanas. Como se indicó arriba, la invención abarca todas y cada una de las moléculas moduladoras de actividad de receptor para eritropoyetina capaces de ejercer una actividad positiva sobre células respondedoras, independientemente de cualquier relación estructural de la molécula con la eritropoyetina. Además, la citocina recombinante protectora de tejido puede estar modificada para adecuar sus actividades para un tejido específico o para tejidos específicos. Varias estrategias no limitativas que pueden efectuarse para lograr esta especificidad de tejido deseada incluyen modificaciones que acortan la vida media circulante y por consiguiente reducen el tiempo durante el cual la citocina recombinante protectora de tejido puede interactuar con precursores de eritroides, o la modificación de la estructura primaria de la muteina de eritropoyetina .o molécula de citocina recombinante protectora de tejido. Un enfoque para reducir la vida media circulante es remover o modificar las porciones de glicosilación cuya eritropoyetina tiene tres enlaces N y un enlace 0. Dichas variantes de una citocina recombinante protectora de tejido glicosilada pueden ser producidas de varias formas. Por ejemplo, técnicas para modificar la estructura primaria de la eritropoyetina para generar las citocinas protectoras de tejido de la presente invención son numerosas e incluyen la sustitución de uno o varios aminoácidos específicos, es decir, por- mutación de los aminoácidos en los sitios, de glicosilación, enlazados con N o enlazados con 0 y/o modificación química de uno o varios aminoácidos, o adición de otras estructuras que interfieren con la interacción de eritropoyetina con cualquiera de sus receptores. La utilización de tales formas de citocinas recombinantes protectoras de tejido se encuentra totalmente abarcado dentro del marco de la presente invención. Los ácidos siálicos que determinan el extremo de las cadenas de azúcar pueden ser removidos por sialidasas específicas según el enlace químico que conectada el ácido siálico con la cadena de azúcar. Alternativamente, la estructura gicosilada puede ser desmantelada en formas diferentes mediante la utilización de otras enzimas que disocian en enlaces específicos. En una modalidad preferida, la vida media de la citocina recombinante protectora de tejido no eritropoyética de la invención es reducida en aproximadamente 90% en comparación con la eritropo-yetina nativa. Algunas de estas moléculas de citocina recombinante protectora de tejido imitará sin embargo, las acciones de la eritropoyetina en sí en otros tejidos ü órganos. Por ejemplo, un 17-mero que contiene la secuencia de aminoácidos, de 31-47 de la eritropoyetina nativa es inactivo para la eritropoyesis pero totalmente activo para células neurales in vitro (Campaan & O'Brien, 1998; Int. J. Mol. Med. 1:235-41). Además, moléculas de citocina recombinante protectora de tejido derivadas deseables para los usos descritos aquí pueden ser generadas mediante guanidinación, amidinación, carbami'lación (carbamoilación) , trinitrofenilación, acilación, como por ejemplo acetilación o succinilación, nitración, o modificación de arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, tirosina, triptófano o residuos de cisterna o grupos carboxilo entre -otros procedimientos, como por ejemplo proteólisis limitada, remoción de grupos amino, y/o sustitución por mutación de arginina, lisina, tirosina, triptófano o residuos ' de cisterna por técnicas biológicas moleculares para producir muteinas de eritropoyetina o citocinas recombinantes protectoras de tejido que mantienen un nivel adecuado de actividades para órganos y tejidos específicos pero no para otros, como por ejemplo eritrocitos (por ejemplo,' Satake y colaboradores; 1990, Biochim¿ Biophys. Acta 1038:125-9; que se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . Un ejemplo no limitativo de. conformidad con lo descrito abajo es la modificación de residuos de arginina de eritropoyetina por reacción con un glipxal como por ejemplo fenilglioxal (según el protocolo de Takahashi, 1977, J. Biochem. 81:395-402). Como se observará abajo, dicha molécula de citocina recombinante protectora de tejido retiene totalmente el efecto neurotrófico de la eritropoyetina. Dichas moléculas de citocina recombinante protectora de tejido está totalmente abarcadas por los varios usos y composiciones descritos aquí. Además, estas modificaciones químicas pueden ser utilizadas adicionalmente para incrementar los efectos protectores de las citocinas recombinantes protectoras de tejido o neutralizar cualquier cambio en la carga de la molécula que resulta de la mutación de aminoácidos de la eritropoyetina nativa. Tales modificaciones se describen en las solicitudes copendientes : No. de Serie PCT/US01/49479, presentada el 28 de Diciembre de 2001; No'. ' de Serie 09/753,132, presentada el 29 de Diciembre de 2000 y número de Registro de Abogado W00-009CO2-US presentada el día 3 de Julio de 2002, todas las cuales se incorporan aquí en su totalidad. Moléculas sintéticas y recombinantes, como por ejemplo eritropoyetina cerebral y eritropoyetina renal, formas de eritropoyetina de mamífero recombinantes así como ' sus isoformas en que ocurren naturalmente, derivadas de tumores y recombinantes tales como moléculas expresadas recombinantemente y las moléculas preparadas por recombinación homologa se proporcionan aquí. Además, la presente invención incluye moléculas que abarca péptidos que se unen al receptor para eritropoyetina así como constructos recombinantes u otras moléculas que poseen una parte o la totalidad de las propiedades estructuras y/o biológicas de la eritropoyetina, incluyendo fragmentos y multímeros de eritropoyetina o sus fragmentos. Muteínas de eritropoyetina y otras citocinas recombinantes protectoras de tejido que tienen números adicionales o reducidos de sitios de glicosilación están incluidas aquí, como se indicó arriba, los términos "eritropoyetina" y "miméticos" así como los demás términos se utilizan en forma intercambiable aquí para referirse a las moléculas protectoras y de mejora de células respondedoras relacionadas con la eritropoyetina así como las moléculas que son capaces de atravesar barreras de células endoteliaies .- Además, las moléculas producidas por animales transgénicos están también incluidas dentro del marco de la presente invención. Se observará que las moléculas de eritropoyetina abarcadas aquí no se parecen necesariamente estructuralmente a las eritropoyetinas ni de alguna otra forma, que excepto en cuando a su capacidad para interactuar con receptor para eritropoyetina o modular la actividad de receptor para eritropoyetina o activar cascadas de señalización activadas por eritropoyetina, de conformidad con lo descrito en el presente documento. A titulo de ejemplos no limitativos, formas de citocinas recombinantes protectoras de tejido útiles para la práctica de la presente invención incluyen citocinas recombinantes protectoras de tejido tales como las citocinas con aminoácidos alterados en el -extremo carboxi descritas en la patente norteamericana No. 5,457,089 y en la patente norteamericana No. 4,835,260; isoformas de asialoeritropoyetina y eritropoyetina con varios números de residuos de ácido siálico por molécula, tales como las descritas en la patente norteamericana No. 5,856,298; polipéptidos descritos en la patente norteamericana No. 4,703,008; agonistas descritos en la patente norteamericana No. 5, 767, 078; péptidos que s_e unen al receptor de eritropoyetina de conformidad con lo descrito en las patentes norteamericanas 5,773,569 y 5,830,851; miméticos de moléculas pequeñas que activan el receptor para eritropoyetina, de conformidad con lo descrito en la patente norteamericana No. 5,835/382; y análogos de eritropoyetina descritos -en los documentos WO 9505465, WO 9718318 y WO 9818926. Todas las citas mencionadas arriba se incorporan aquí en la medida en que tales divulgaciones se refieren a las varias formas alternativas o procesos para preparar tales formas de las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. · La eritropoyetina puede obtenerse comercialmente, por ejemplo, bajo las marcas comerciales de PROCRIT, dispositivo en Ortho Biotech Inc., Raritan, NJ, y EPOGEN, disponible en Amgen, Inc. Thousand Oaks, C7A. La actividad (en unidades) de moléculas de eritropoyetina (EPO) y moléculas de tipo eritropoyetina se define · tradicionalmente con base en su eficacia para estimular la -producción de células rojas en modelos de roedores (y según lo derivado por estándares internacionales de eritropoyetina) . Una unidad (U) de eritropoyetina regular (peso molecular de ~ 30,000 a 34,000) es ~ 8 ng de proteina (1 mg de proteina es aproximadamente 125,000 U) . Sin embargo, puesto que el. efecto de la eritropoyesis es incidental para las actividades deseadas aquí y puede no necesariamente ser una propiedad detectable de algunas de las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención, la definición de actividad basada en la eritropoyesis es una definición inapropiada. Asi, como se emplea aquí, la unidad de actividad de la eritropoyetina o moléculas relacionadas con eritropoyetina se define como la cantidad de proteina que se requiere para provocar la misma actividad en sistemas de células neurales u otros sistemas celulares respondedores de conformidad con lo causado por la eritropoyetina de estándar " internacional de la Organización Mundial de la Salud en el mismo sistema. La persona con conocimientos en la materia determinará fácilmente las unidades de una citocina recombinante protectora de tejido no eritropoyética o molécula relacionada siguiendo los lineamientos presentados aquí. :t - Las muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, las proteínas y polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico de eritropoyetina descritas en la Sección 6.3. La invención abarca muteinas funcionalmente equivalentes al producto de gen de eritropoyetina descrito en la Sección 6.3. Tales productos de gen de eritropoyetina pueden contener una o - varias deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácido de eritropoyetina dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de eritropoyetina, pero que resultan en un cambio silencioso, produciendo así un producto génico de eritropoyetina funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos * pueden efectuarse con base a semejanza en cuanto a polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o naturaleza antipática de los residuos involucrados. Las muteinas de citocinas recombinantes protectora de tejido de la invención pueden ser generadas por mutagénesis, por ejemplo, mutación de punto o truncado discreto. Una muteína de citociria recombinante protectora de tejido de la presente invención conserva las actividades biológicas de protección celular de la forma que ocurre naturalmente, pero le falta una o varias de las actividades eritropoyéticas de la forma que ocurre naturalmente de la proteina. Asi, efectos biológicos específicos pueden ser provocados por . adición de una muteína de función limitada. La .modificación de la estructura de las muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido puede también efectuarse para propósitos tales como mejorar la eficacia, estabilidad o modificaciones post-traslacionales (por ejemplo, para alterar el patrón de fosforilación de las muteinas) . Tales muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido modificadas, cuando se diseñan para conservar por lo menos una actividad de protección celular de la forma que ocurre naturalmente de la proteína, o para producir antagonistas específicos de las mismas, se consideran equivalentes funcionales de las muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido. Dichas muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido modificadas pueden ser producidas, por ejemplo, por sustitución, deleción, o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo semejante de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (es decir,. mutaciones isostéricas y/o isoeléctricas) no tendrán un efecto principal sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de una muteina de citocina recombinante protectora de tejido resulta en un homólogo funcional, o un homólogo no funcional (es decir, que no presenta una o varias de las actividades de la citocina no mutadas), puede ser fácilmente determinado por evaluación de la capacidad de la muteina variante para producir una respuesta en células en forma similar a la citocina de tipo silvestre, o inhibir competitivamente dicha respuesta. Muteinas de citocinas recombinantes protectoras de tejido en las cuales más que un reemplazo se ha efectuado pueden ser probadas fácilmente de la misma manera. Las muteinas de la presente invención que presentan una función alterada pueden ser identificadas por el tamizado de bibliotecas combinatorias de imitantes, como por ejemplo mutantes de truncado, de la citocina recombinante protectora de tejido de la invención para actividad deseada o falta de ella. En una modalidad, una biblioteca variada de variante es generada por mutagénesis de combinación a nivel de ácido nucleico y es codificada por una biblioteca génica variada. Una biblioteca variada de variantes puede ser producida como por ejemplo, mediante el ligado enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de ácido nucleico de tal manera que un conjunto de generado de secuencias de proteínas potenciales pueda expresarse como polipéptidos individuales, o bien alternativamente como un conjunto de proteínas de fusión de mayor tamaño (por ejemplo, para despliegue de fagos) . Existen varios métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de variantes potenciales de las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención a partir de una - secuencia de oligonucleótidos degenerados. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores, 1984, Science 198:1506; Ike y colaboradores, 1983, Nucleic Acid Res. 11:477) . Además, bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificadora de una citocina recombinante protectora de tejido de la invención pueden utilizarse para generar varias poblaciones de citocinas recombinantes protectoras de tejido para tamizar y selección subsiguiente de muteínas . Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de secuencias codificadoras puede ser generada mediante el tratamiento de un fragmento de Reacción en Cadena de Polimerasa de doble cadena de la secuencia codificadora de interés con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre un corte solamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, renaturalizando el ADN para formar ADN de cadena doble que puede incluir pares de sentido/anti-s.entido de productos cortados diferentes, remover porciones de una sola cadena de duplexes reformados por tratamiento con SI nucleasa, y ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. A través de este método, una biblioteca de expresión puede ser derivada la cual codifica fragmentos de N-terminal e internos de varios tamaños de las muteinas de citocina recombinante protectora de tejido de interés . - En la técnica se conocen varios métodos para tamizar productos génicos de bibliotecas de combinación . elaboradas por mutaciones de punto o truncado, y para tamizar · bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que se prestan a un análisis de alto rendimiento, para tamizar grandes bibliotecas de genes incluyen típicamente la clonación de la biblioteca de genes en vectores 'de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, expresar los genes combinatorios bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Una mutagénesis de ensamble recursiva (REM) , una técnica que incrementa la frecuencia de imitantes funcionales . en las bibliotecas, puede emplearse en combinación con los ensayos de tamizado para identificar muteinas de una citocina recombinante protectora de tejido de la invención (Arkin y Yourvan, 1992, Proc. Nati. Acadl . Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave y colaboradores, 1993, Protein Engineering 6(3): 327-331) . " .

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una muteina puede ser creada mediante la introducción de una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de eritropoyetina de tal manera que una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introduzca en la citocina recombinante protectora de tejido codificada. Mutaciones pueden ser introducidas por técnicas estándares, como por ejemplo mutagénesis dirigida a sitios y mutagénesis mediada por reacción en cadena de polimerasa. En resumen, cebadores de reacción en cadena de polimerasa son diseñados los cuales remueven el codón de trinucleótidos del aminoácido a cambiar y lo reemplazan por el codón de trinucleótidos del aminoácido a incluir. Este cebador es utilizado en la amplificación por reacción en cadena de polimerasa del ADN que codifica la citocina recombinante protectora de tejido de interés. Este fragmento es después, aislado e insertado en el ADN de longitud completa que codifica la citocina protectora de tejido de interés y expresada en forma recombinante. La citocina recombinante protectora de tejido resultante incluye ahora el reemplazo de aminoácidos. Se pueden efectuar sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en uno varios residuos de aminoácidos. Tanto las sustituciones conservadoras como las sustituciones no conservadoras pueden efectuarse. Reemplazos conservadores son los reemplazos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos y que son relacidnados con sus cadenas laterales. Aminoácidos genéricamente codificados pueden ser divididos en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. De manera similar, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) alifático = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, . con serina y treonina agrupadas opcionalmente separadamente como al hidroxilo alifático; (4) aromáticos = fenilalanina, tirosina, triptófano; (5) amida = asparagina, glutamina; y (6) que contiene azufre = cisterna y metionina. (Véase, por ejemplo Bioc emistry, 4a Ed. por L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1995). Alternativamente, mutaciones pueden ser introducidas de manera aleatoria a lo largo de la totalidad o una parte de la secuencia codificadora de una citocina recombinante protectora de tejido,- como por ejemplo mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser tamizados para actividad biológica para identificar mutantes que conservan actividad. Después de la mutagénesis, la proteina codificada puede ser expresada de manera recombinante y la actividad de la citocina recombinante protectora de tejido puede ser determinada. Además de las modificaciones de eritropoyetina mencionadas arriba útiles aqui, el comentario siguiente amplia las varias citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención. De conformidad con lo descrito en Elliott y colaboradores, Boissel y colaboradores, y Wen y colaboradores, mencionados arriba, las muteinas de eritropoyetina siguientes son útiles para los propósitos aqui, y pueden proporcionarse en una composición farmacéutica para los métodos aqui. En la nomenclatura de muteina utilizada aqui, el aminoácido cambiado es representado con un código de una letra de aminoácido nativo primero, seguido por su posición en la molécula de eritropoyetina, seguido por un código de una letra de aminoácido de reemplazo. Por ejemplo, "eritropoyetina humana S100E" o "citocina recombinante protectora de tejido S100E" - se refiere a una molécula de eritropoyetina humana en donde el aminoácido 100, una serina, ha sido cambiado a ácido glutámico . Tales muteinas útiles en la práctica de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos cambios, una eritropoyetina humana en la cual por lo menos uno de los cambios siguientes de aminoácidos se ha efectuado: I6A, C74, C7S, R10I, V11S, L12A, E13A, R14A, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20E, K20A, E21A, N24K, C29S, C29Y, A30N, H32T, C33S, C33Y, N38K, N83K, P42N, P42A, D43A, T44I, K45D, K45A, V46A, N47A, F48I, F48A, Y49S, deleción 44-49, W51F, W51N, 52A, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, K97A S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, R103E, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, L108S, K116A, S126A, T132A, I133A, T134A, K140A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, P148A, L149A, R150A, R150E, G151A, K152A, K152W, L153A, K154A, L155A, G158A, C160S, C161A, o bien R162A. En una modalidad preferida, una.muteina de eritropoyetina o una citocxna recombinante protectora de tejido de la presente invención comprende una o varias de las sustituciones mencionadas arriba. En otras modalidades, una muteina de eritropoyetina u otra citocina recombinante protectora de tejido de la invención comprende una de las sustituciones antes mencionadas o una combinación de las mismas.

En una modalidad alternativa, las citocinas recom inantes protectoras de tejido, composiciones farmacéuticas, uso y método de tratamiento de la invención comprenden una o varias de la sustituciones mencionadas arriba a condición que no abarquen una o varias de las sustituciones siguientes: I6A, C7A, K20A, P42A, D43A, 45D, K45A, F48A, ?49?, K52A, K49A, S100E, R103A, K116A, T132A, I133A, 140A, N147K, M147A, R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A ó R162A. En una modalidad relacionada de la invención, las citocinas recombinantes protectoras de tejido, composiciones farmacéuticas, uso y métodos de tratamiento de la invención comprenden una o varias de las sustituciones antes mencionadas a condición que no abarquen ninguna de las combinaciones de sustituciones 'siguientes: N2 K/ 38K/N83K ó A30N/H32T. En ciertas modalidades, más que uno de los cambios de aminoácidos antes mencionados pueden combinarse para crear una muteina. Ejemplos de tales combinaciones incluyen, sin limitarse a estos ejemplos: K45D/S100E, A30N/H32T, K45D/R150E, · R103E/L108S, 140A/K52A, K1 0A/K52A/K45A, K97A/K152A, K97A/K152A/K45A, K97A/K152A/K45A/K52A, K97A/K152A/K45A/ 52A/K140A, 97A/K152A/ 45A/ 52A/K140A/K154A, N24K/N38 /N83 y N24K/Y15A. En ciertas modalidades, la muteina de citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención no comprende una o varias de las numerosas sustituciones mencionadas arriba. En ciertas modalidades, las composiciones" farmacéuticas de la invención que comprenden la muteina de citocina recombinante protectora de tejido de la invención no comprenden una o varias de las numerosas sustituciones mencionadas arriba. En ciertas modalidades, los métodos de uso y tratamiento de la invención que utilizan la muteina de citocina recombinante protectora de tejido de la invención no incluyen una o varias de las numerosas sustituciones antes mencionadas. Ciertas modificaciones o combinaciones de modificaciones pueden tener un efecto sobre la flexibilidad de las muteinas de eritropoyetina efectuando el enlace con un receptor, como por ejemplo el receptor para eritropoyetina o un receptor secundario al cual la eritropoyetina o una muteina de eritropoyetina se une. Ejemplos de tales modificaciones o combinaciones de modificaciones útiles en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, K152W, R14A/Y15A, I6A, C7A, D43A, P42A, F48A, Y49A, T132A, I133A, T134A, N147A, P148A, R150A, G151A, G158A, C161A, y R162A. Mutaciones correspondientes son conocidas por ser perjudiciales en la hormona de crecimiento de ser humano (Wells y colaboradores) . En ciertas modalidades, la muteina de citocina recombinante protectora de tejido de la invención no comprende una o varias de las sustituciones mencionadas arriba. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden la muteína de citocina recombinante protectora de tejido de la invención no incluyen una o varias de las sustituciones antes mencionadas. En ciertas modalidades, los métodos .de uso y tratamiento de la invención que utilizan la muteína de citocina recombinante protectora de tejido de la invención no comprenden una o varias de las sustituciones, mencionadas arriba. Además de una de las modificaciones de aminoácidos mencionadas arriba, una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención puede también presentar por lo menos ausencia de porciones de ácido silícico, que se conoce como una muteína de asialoeritropoyetina. Preferentemente, una muteína de asialoeritropoyetina de la presente invención es asialoeritropoyetina humana. En modalidades alternativas, la citocina protectora de tejido recombinante de la presente invención puede tener por lo menos 1, 2, 3, 4,· 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 residuos de ácido siálico. Puede prepararse mediante la desialilacíón de una citocina recombinante protectora de tejido utilizando una sialidasa, como por ejemplo de conformidad con lo descrito en el empaque del fabricante para Sialydase A de ProZy e Inc., San Leandro, California. Típicamente PROZYME® GLYCOPRO® SIALYDASE AMK de grado de secuenciamiento (N-acetilneuraminato glicohidrolasa, EC 3.2.1.18) se utiliza para disociar todos los residuos de ácido siálico terminales no reductores de carbohidratos y glicoproteinas de complejo como por ejemplo eritropoyetina . Disocia también los ácidos siálicos ramificados (enlazados a un residuo interno)". La sialidasa ? es aislada de un clon de Art robacter ureafaciens. Un ejemplo no limitativo de sialilación de un glicopéptido se encuentra en la solicitud de patente No. US 2003/0040037, que divulga métodos de sialilación utilizando sialitransferasas bacterianas o de mamíferos. Otro ej.emplo no limitativo de método para sialilación y alteración de patrones de sialilación en glicoproteinas se encuentra en la solicitud de patente norteamericana No. US 2002/0160460 Al y en US 6,399, 336 Bl. Ahí, se divulgan métodos in vitro para la sialilación de glicoproteinas recombinantes en donde una porción donadora de ácido 'siálico es combinada con una glicoproteína que tiene una galactosa o una porción de aceptador de N-acetilgalactosamina . En tales métodos, una sialiltransferasa combinada con el aceptador y donador fijaba un ácido siálico con un sacárido. Una cítocina recombinante protectora de tejido de la presente invenció puede tener por lo menos un número reducido de carbohidratos enlazado con N. para remover los carbohidratos enlazados con N, una citocina recombinante protectora de tejido puede ser tratado con hidrazina, de conformidad, por ejemplo con los métodos descritos por Hermentin y colaboradores, Glycobiology 6(2): 217-30. Como se observó arriba, una eritropoyetina tiene tres porciones carbohidrato enlazados con N; la presente invención abarca las eritropoyetinas con dos, una o ningún carbohidrato enlazado con N. Una citocina recombinante protectora de tejido de la invención puede tener por lo menos un contenido de carbohidrato reducido en virtud de tratamiento de. una citocina recombinante protectora de tejido con por lo menos una glicosidasa. Por ejemplo, se puede seguir el procedimiento de Chen y Evangelista, 1998, Electrophoresis 19(15): 2639-44. Además, la remoción del carbohidrato enlazado con O puede lograrse siguiendo los métodos descritos en Hokke y colaboradores, 1995, Eur. J. Biochem. 228(3) :981-1008. La porción de carbohidrato de una molécula de citocina recombinante protectora de tejido puede tener por lo menos un patrón de glicosilación no de mamífero en virtud de -la expresión de una muteina de eritropoyetina recombinante en células no de mamífero. Preferentemente,, las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención son expresadas en células de insectos o en células vegetales. A título de ejemplo no limitativo, la expresión de una citocina recombinante protectora de tejido en células de insecto empleando un sistema de expresión dé baculovirus puede efectuarse de conformidad con Quelle y colaboradores, 1989, Blood 74(2): 652-657. Otro método se describe en la patente norteamericana No. 5,637,477. La expresión en un sistema vegetal puede efectuarse de conformidad con el método de Matsumoto y colaboradores, 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57 ( 8 ): 1249-1252. Alternativamente, la expresión en bacteria resultará en formas no glicosiladas de una citocina recombinante protectora de tejido. Estos son simplemente ejemplos de métodos útiles para la producción de una citocina recombinante protectora de tejido de la invención y no pretenden de ninguna manera limitar la presente invención. Un ejemplo no limitativo de modificación de patro_nes de glicosilación es el uso de la fucosilacion de conformidad con lo divulgado en la solicitud de patente norteamericana No. US 2003/0040037 Al y en la solicitud de patente norteamericana No. US 2003/0003529 Al. Aquí, ' se divulgan métodos para modificar un patrón de glicosilación de un glicopéptido mediante el contacto de un glicopéptido que tiene una porción aceptadora para una fucosiltransferasa con una mezcla de reacción que tiene una ^ porción donadora de fucosa para modificar el patrón de glicosilación del glicopéptido. Se divulgan también métodos para la modificación de los patrones de glicosilación utilizando glicopéptido recombinante. Una citocina recombinante protectora de tejido de la invención puede tener por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados que pueden también presentar una reducción química. Por ejemplo, la citocina recombinante protectora de tejido puede también ser una muteína de eritropoyetina oxidada con periodato; la muteína de eritropoyetina oxidada con periodato puede también estar químicamente reducida con una sal de borohidruro como por ejemplo borohidruro de sodio o cianoborohidruró de sodio. La oxidación con periodato de una muteína de eritropoyetina puede efectuarse, por ejemplo, a través de los métodos descritos por Linsley y colaboradores, 1994, Anal. Biochem. 219 (2) :207-17. La reducción química " después de oxidación por periodato puede efectuarse siguiendo los métodos de Tonelli y Meints, 1978, J. Supra ol . Struct. 8(l):67-78. Se observará que algunas de las modificaciones de aminoácidos mencionados arriba y algunas de las modificaciones de aminoácidos presentadas a continuación a una eritropoyetina nativa puede no ser posible püesto que el aminoácido- blanco particular para modificación química en la molécula nativa ha sido alterado para formar la citocina recombinante protectora de tejido de la invención. Evidentemente, el aminoácido alterado puede ser sometido a modificación química el mismo y la presente invención abarca también tales moléculas. Una persona con conocimientos en la materia determinará fácilmente los residuos de aminoácidos disponibles de una citocina recombinante protectora de tejido de la invención y modificación (es) disponible ( s ) . Una citocina recombinante protectora de tejido para los usos mencionados arriba puede tener por lo menos uno o varios residuos de ' arginina modificados. Por ejemplo, la citocina recoittbinante protectora de tejido puede comprender una porción R-glioxal en uno o varios residuos de arginino, en donde R puede ser un grupo arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alcoxi inferior, o cicloalquilo o bien un grupo alfa-desoxiglicitolilo . Como se emplea aquí, el término "alquilo" inferior se refiere ' a un grupo hidrocarburo alifático saturado de cadena recta o de cadena ramificada que contiene preferentemente 1-6 átomos de carbono. Representantes de tales grupos son metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, butilo, pentilo, hexilo y similares. El término "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo inferior de conformidad con lo definido arriba fijado sobre el resto de la molécula por oxigeno. Ejemplos de alcoxi incluyen metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi y similares. El término "cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos con de tres hasta aproximadamente 8 átomos de carbono, incluyendo, por ejemplo, ciclopropílo, ciclobutilo, ciclohexilo y similares. El término arilo se refiere a grupos fenilo y naftilo. El término heteroarilo se refiere a grupos heterocíclicos que contienen de 4 a 10 miembros de anillo y 1-3 heteroátomos seleccionados dentro del grupo que consiste de oxigeno, nitrógeno y azufre. Ejemplos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, isoxazolilo, fenilisoxazolilo, furilo, pirimidinilo, quinolilo, tetrahidroquinolilo, piridilo, " imidazolilo, pirrolidinilo, 1, 2, 4-triazolilo, tiazolilo, tienilo y similares. El grupo R puede estar sustituido, como por ejemplo el grupo 2, 3, 4-trihidroxibutilo de 3-desoxiglucosona. Ejemplos típicos de compuestos R-glioxal son glioxal; metilglioxal, 3-desoxiglucosona y fenilglioxal . Compuestos R-glioxal preferidos son metilglioxal o fenilglioxal . Un método de ejemplo para dicha modificación puede encontrarse en Werber y colaboradores, 1975, Isr. J. Med: Sci. 11(11): 1169-70, utilizando fenilglioxal . En un ejemplo adicional, por 'lo menos un residuo de arginina puede estar modificado por reacción con una dicetona vecina, como por ejemplo 2, 3-butandiona o ciclohexandíona, preferentemente en amortiguador de borato, aproximadamente 50 milimolar, pH 8-9. Un procedimiento para la modificación posterior con 2, 3-butandiona puede efectuarse según Riordan, 1973, Biochemistry 12(20): 3915-3923; y la modificación con ciclohexanona puede llevarse a cabo de conformidad con Patthy y colaboradores, 1975, J. Biol . Chem. 250(2): 555-9. Una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención puede" comprender por lo menos uno o varios residuos de lisina modificados o una modificación del grupo amino N-terminal de la molécula de eritropoyetina, tales modificaciones son el resultado de la reacción del residuo de lisina con un agente modificador de grupo amino . En otra modalidad, residuos de lisina pueden ser modificados por reacción con derivados de glioxal como por ejemplo reacción co glioxal, metilglioxal y 3-desoxiglucosona para formar derivados de alfa-carboxilalquilo . Ejemplos son reacción con glioxal para formar carboxímetillisina cmo · en Glom y Monnier, 1995, J. "Biol. Chem. 270 (17 ): 10017-25, o bien con metilglioxal para formar (1-carboxietil) lisina como en Degenhardt y colaboradores, 1998, Cell . Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 44 (7 ): 1139-45. El residuo de lisina modificado puede ser reducido químicamente adicionalmente . Por ejemplo, una citocina recombinante protectora de tejido" puede ser. biotinilada a través de grupos lisina, en donde éster N-hidroxisuccinimídico de ácido D-biotinil-s-aminocapróico reaccionó con eritropoyetina, seguido por remoción de la biotina sin reaccionar por filtración en gel en una columna Centricon 10, según lo descrito por Wojchowski y Caslake, 1989, Blood 74(3): 952-8. E este documento, los autores utilizan tres métodos diferentes para biotinilar la eritropoyetina, todos los cuales pueden utilizarse para la -.A preparación de las eritropoyetinas para sus usos aquí. La biotina puede ser agregada a (1) las porciones de ácido siálico, "(2) los grupos carboxilato o (3) grupos amino.

En otra modalidad preferida, la lisina puede reaccionar con un aldehido o con un azúcar reductor para formar una imina, que puede ser estabilizada por reducción como por ejemplo en el caso de cianoborohidruro de sodio para formar una lisina N-alquilada como por ejemplo glucitolil lisina, o bien que en el caso de azúcares reductores puede ser estabilizada por reacomodo de Amadori - o Heyns para formar un azúcar alfa-desoxi alfa-amino como por alfa-desoxi-alfa-fructosillisina . Como ejemplo de preparación de una proteina modificada con fructosillisina por incubación con glucosa 0.5 M en amortiguador de fosfato de sodio a' pH 7.4 durante 60 días, hacemos referencia a lo descrito por Makita y colaboradores, 1992, J. Bipl. Chem. 267:5133-5138. En otro ejemplo, el grupo lisina puede ser carbamilado como por ejemplo por medio de reacción con ion cianato, o bien alquil- o aril-carbamilado o -tiocarbamilado con una alquil- o aril-isocianato o -isotiocianato o bien puede ser acilado por un derivado reactivo de ácido alquilcarboxilico o arilcarboxílico como por ejemplo por reacción con anhídrido acético o anhídrido succínico o anhídrido itálico. Ejemplos son la modificación de grupos -lisina con 4-sulfofenilisotiocianato o bien con anhídrido acético, ambos descritos en Gao y colaboradores, 1994, Proc Nati 'Acad Sci USA 91 (25) : 12027-30. Los grupos lisina pueden también estar modificados por trinitrofenilo por reacción con ácido trinitrobéncensulfónico o preferentemente sus sales . Por lo menos un residuo de tirosina de una citocina recombinante protectora de tejido puede ser modificado en una posición de anillo aromático con un reactivo electrofilico, como por ejemplo por_ nitración o yodinación. ? titulo de ejemplo no limitativo, una eritropoyetina puede reaccionar con tetranitrometano (Nestler y colaboradores, 1985, J. Biol. Chem. 260 (12) : 7316-21) ; o bien yodinada de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 4. Por lo menos' un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico de una citocina recombinante protectora de tejido puede ser modificado como por ejemplo por reacción con una carbodiimida seguido por reacción con una amina como por ejemplo glicinamida, pero sin limitarse a este ejemplo. En otro ejemplo, un residuo de triptófano de una citocina recombinante protectora de tejido puede ser modificado, como por ejemplo mediante reacción con n-bromosuccinimida o n-clorosuccinimida, siguiendo métodos descritos en Josse y colaboradores, Chem Biol Interact 1999 Mayo 14/ 119-120. En otro ejemplo, una citocina recombinante protectora de tejido puede ser preparada mediante la remoción de por lo menos un grupo amino, como por ejemplo se puede lograr por reacción con . ni idrina seguido por reducción del grupo carbonilo subsiguiente por reacción con borohidruro. En otro ejemplo adicional, se proporciona una citocina recombinante protectora de tejido que tiene por lo menos una abertura de por lo menos uno de los enlaces cisteina en la molécula de eritropoyetina por reacción con un agente reductor como por ejemplo ditiotreitol, seguido por reacción de los sulfhidrilos subsiguientes con yodoacetamida, ácido yodoacético u otro electrófilo para prevenir la reformación de los enlaces bisulfuro. Como se observó . arriba, alternativamente o en combinación, enlaces disülfuro pueden ser cancelados mediante la alteración de una molécula de cisteina que participa en la reticulación real o por lo menos otro residuo ¦ de aminoácido que resulta en la incapacidad de la muteína de eritropoyetina para formar .por lo menos uno de los enlaces disulfuro presentes en la molécula nativa. Una citocina recombinante protectora de tejido puede prepararse mediante el hecho de someter una eritropoyetina a una proteólisis química limitada que enfoca residuos específicos, por ejemplo para disociar después de residuos de triptófano. Tales fragmentos resultantes de citocina recombinante protectora de tejido está abarcado dentro del marco de la presente invención. Como se indicó arriba, una citocina recombinante protectora de tejido útil para los . propósitos de la presente invención puede tener por lo menos una de las modificaciones mencionadas arriba, pero puede tener más que una de dichas modificaciones.' A título de ejemplo de una citocina recombinante protectora de tejido con una modificación de la porción carbohidrato de la molécula y una modificación de la porción aminoácido, una citocina recombinante protectora de tejido puede ser asialoeritropoyetina y tener su residuo de lisina en posición 45 cambiado a ácido aspártico. Asi, varias, moléculas de citocina recombinante protectora de tejido y composición farmacéuticas que las contienen para los usos descritos aqui se incluyen- dentro del marco de la presente invención. Como se mencionó arriba, tales moléculas de eritropoyetina incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, muteinas que son asialoeritropoyetina, eritropoyetina N-_desglicosilada, eritropoyetina O-desglicosilada, eritropoyetina con un contenido reducido de carbohidrato, eritropoyetina con patrones alterados de glicosilación, eritropoyetina con carbohidratos oxidados y después reducidos, eritropoyetina modificada con arilglioxal, eritropoyetina modificada con alquilglioxal, eritropoyetina modificada con 2, 3-butandiona, eritropoyetina modificada con ciclohexandiona, eritropoyetina biotinilada, lisil-eritropoyetina N-alquílada, glucitolil-lisina-eritropoyetina, alfa-desoxi-alfa-fructosillisin-eritropoyetina, eritropoyetina ca-rbamilada, eritropoyetina acetilada, eritropoyetina succinilada, alfa-carboxialquil eritropoyetina, eritropoyetina nitrada, eritropoyetina yodinada, solamente para mencionar algunos ejemplos representativos pero no limitativos basados en las enseñanzas incluidas aqui . Se prefieren las formas modificadas mencionadas arriba basadas en eritropoyetina humana. Además, la invención abarca las" citocinas recombinantes protectoras de tejido antes mencionadas y composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos. A titulo de ejemplo no limitativo, .tales citocinas recombinantes protectoras- de tejido incluyen muteina de eritropoyetina oxidada con periodato, muteina de glucitolil-lisina-eritropoyetina, muteina de fructosil-lisína-eritropoyetina, muteina de 3-desoxiglucosona-eritropoyetina, y muteina de asialoeritropoyetina carbamilada. 5.3 SISTEMAS DE EXPRESIÓN varias sistemas de huésped-vectores de expresión pueden emplearse para producir las citocinas recombinantes protectoras de tejido, incluyendo moléculas de muteina de eritropoyetina de la invención. Tales sistemas huésped-vector de expresión representan vehículos a través de los cuales las citocinas "recombinantes protectoras de tejido de interés pueden ser producidas y subsiguientemente purificadas, pero representan también células que pueden, cuando son transformadas o transfectadas con _ las secuencias codificadoras' de ' nucleótidos apropiadas, presentar el producto de gen de eritropoyetina modificado in situ. Incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, sistemas de huéspedes bacterias, insectos, plantas, mamíferos, incluyendo seres humanos, como por ejemplo, sin limitarse a estos ejemplos, sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras de productos de citocina recombinante protectora de tejido; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o bien transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo plásmido Ti) que contiene secuencias codificadoras de citocina recombinante protectora de tejido; o bien sistemas de células de mamíferos, incluyendo sistemas de células humanas (por ejemplo, HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que contienen constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o bien a partir de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus de vaccinia de 7.5K) . Un constructo de expresión como se emplea aquí, se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una citocina recombinante protectora de tejido asociada operablemente con una o varias regiones reguladora que permite la expresión de la citocina recombinante protectora de tejido en una célula huésped apropiada. La expresión "asociada operablemente" se refiere a una asociación en la cual las regiones reguladoras y la secuencia de -polipéptido de citocina recombinante protectora 'de tejido a expresar están unidas y colocadas de tal manera que se permite la transcripción y finalmente la traducción de la secuencia de citocina recombinante protectora de tejido. Una variedad de vectores de expresión puede emplearse para la expresión de citocina recombinante protectora de tejido, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, plásmidos, cósmidos, fagos, fagémidos o virus modificados. Ejemplos incluyen bacteriófagos tales como derivados lambda o plásmidos tales como pBR322 o derivados de plásmidos pUC o el vector Bluescript (Stratagene) . Típicamente, tales vectores de expresión comprenden un origen funcional ' de replicacion para propagación del vector en una célula huésped apropiada, uno o varios sitios de endonucleasa de restricción para inserción de la secuencia de gen de citocina recombinante protectora de tejido y uno o varios marcadores de selección. En modalidades preferidas, el vector · pCI-neo es utilizado para fusionar los oligonucleótidos sobre el clon de ADNc de EPO de ser humano original con el objeto de introducir las mutaciones de conformidad con lo descrito arriba. El vector pCI-neo contiene el gen de neomicina fosfotransferasa, un marcador seleccionablé para células de mamífero. El vector pCI-neo puede ser utilizado para la -expresión transiente o para la expresión estable por selección de células transfectadas con el antibiótico G-418. (Brondyk, 1995, New Mammalian Expression Vector v/ith a selectable marker: pCI-neo [Nuevo vector de expresión de mamífero con un marcador seleccionable : pCI-neo] ; Promega Notes 51, 10-14). • Para la expresión de ci ocina recombinante protectora de tejido en células de huésped de mamífero, se puede utilizar una gama de regiones reguladoras, como por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor temprano intermedio de citomegalovirus (CMV) y el promotor de repetición de terminal larga de virus de sarcoma de Rous (RSV-LTR) . Promotores inducible que pueden ser útiles en células de mamífero incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, los promotores asociados con el gen de metalotioneína II en repeticiones de terminales largas respondedoras a glucocorticoide de virus de tumor de mama de ratón (MMTV- LTR) , y el gen de cx-interferon (Williams y colaboradores, 1989, Cáncer Res. 49:2735-42; Taylor y colaboradores, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 165-75). La eficacia de la expresión de la citocina recombinante protectora de tejido en una célula huésped puede ser mejorada mediante la inclusión de elementos apropiados de realzador de transcripción en el vector de expresión como por ejemplo los encontrados en el virus SV40, virus de la hepatitis B, citomegalovirus, genes de inmunoglobulina, metalotionina, a-actina (véase Bittner y colaboradores, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544; Gorman, 1990, Curr. Op. In Biotechnol . 1:36-47). El vector de expresión puede contener secuencias que permiten el mantenimiento y la replicación del vector en más que en 8n tipo de célula huésped o bien la integración del vector en el cromosoma del huésped. Tales secuencias pueden incluir sin limitarse a estos ejemplos, orígenes de replicación, secuencias de replicación autónoma (ARS) , ADN de centrómero, y ADN de telómero. Se puede utilizar también de manera provechosa vectores lanzadera que pueden ser replicados y mantenidos en por lo menos dos tipos de células huésped. Además, el vector de expresión puede contener genes marcadores seleccionables o tamizables para ' aislar o identificar inicialmente las células huésped que contienen ADN que codifica una citócina recombinante protectora de tejido. Para el largo plazo, una producción de alto rendimiento de citocinas recombinántes .protectoras de tejido, una expresión estable en células de mamífero, plantas, bacterias u hongos puede utilizarse. Numerosos sistemas de selección pueden ser utilizados para células de mamífero, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, genes de timidina quinasa de virus de virus de Herpes simplex (Wigler y colaboradores, 1977, Cell 11:223), de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalski y Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 48:2026), · y de adenina fosforibosiltransferasa (Lowry y colaboradores, 1980 Cell 22:817) pueden emplearse en células tk, hgprt o aparato, respectivamente. Asimismo, la resistencia anti-metabolíto puede ser utilizada como la base de la selección de dihidrofolto reductasa (dhfr) , que confiere resistencia al metotrexato' (Wigler y colaboradores, 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenolico (Mulligan y Berg,. 1981,- Proc. Nati. Acad. Sci . USA 78:2072); neomicina fosfotransferasa (neo), que- confiere resistencia al aminoglicósido G-418. r (Colberre-Garapin y colaboradores, 1981, J. Mol. Biol. 150:1.); y higromicina fosfotransferasa (hyg) , que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y colaboradores, 1984, Gene 30: 147). Otros marcadores seleccionables, tales como el histidinol y ZeocinMR pueden utilizarse, sin limitarse a estos ejemplos. Con el objeto de insertar la secuencia codificadora de citocina recombinante protectora de tejido en el sitio de clonación de un vector, secuencias de ADN con funciones reguladoras, tales como promotores, deben fijarse sobre las secuencias codificadoras, para este propósito, enlazadores o adaptadores que proporcionan los sitios de restricción compatibles apropiados pueden ligarse a los extremos de ADNc o ADN sintético que codifica una citocina recoiubinante protectora de tejido por técnicas bien conocidas (Wu y colaboradores, 1987, Methods Enzymol. 152:343-349. La disociación con una enzima de restricción puede ser seguida por modificación . para crear extremos planos por retrodigestión o relleno en terminales de ADN de una sola cadena antes de ligación. Alternativamente, un sitio de enzima de restricción deseado puede ser introducido en un fragmento^ de ADN por amplificación del ADN mediante el uso de reacción- en cadena de polimerasa con cebadores que contienen el sitio de enzima de restricción deseado. El constructo de expresión que comprende una secuencia codificadora de citocina recombinante protectora de tejido operablemente asociada con regiones reguladoras pueden ser directamente introducido en las células huésped apropiadas para expresión y producción de citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención sin clonación adicional (véase por ejemplo, patente norteamericana No. 5,580,859). Los constructos de expresión pueden también contener secuencias de ADN que facilitan la entrega de la secuencia codificadora en el genoma de la célula huésped, por ejemplo, mediante recombinación homologa. En este caso, no es necesario emplear un vector de expresión que comprende un origen de replicación adecuado para células huéspedes apropiadas con el objeto de propagar y expresar las citocinas recombinantes protectoras de tejido, en las células huéspedes... Constructos de " expresión que contienen secuencias codificadoras de citocinas recombinantes protectoras de tejido clonada pueden ser introducidas en la célula huésped de mamífero a través de varias técnicas conocidas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, transfección' mediada por fosfato de calcio (Wigler y colaboradores, 1977, .Cell 11: 223-232), transfección mediada por liposoma (Shaefer-Ridder y colaboradores, 1982, Science' 215:166-168), electroporación (Wolff y colaboradores, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. 84:3344), y microinyección (Cappechi, 1980, Cell 22:479-488). Además, una cepa de célula huésped puede seleccionarse la cual modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto génico en la forma especificada deseada. Tales modificaciones (por ejemplo glicosilación) y ¦ procesamiento (por ejemplo disociación) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huéspedes ' tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación post-traslacional de proteínas y productos génicos. Líneas de células apropiadas y sistemas de huésped apropiados pueden seleccionarse con el objeto de asegurar la modificación correcta y si procesamiento adecuado de la proteína foránea expresada. . Para este propósito, células huéspedes eucarióticas que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación, y fosforilación del producto génico pueden utilizarse. Tales' células huéspedes de mamífero, incluyendo células huéspedes humanas, incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 y I38. Para la producción- de largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, se pueden manipular líneas de células que expresan - de manera estable el producto génico de molécula relacionada con citocina recombinante protectora de tejido. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, células huéspedes pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos apropiados de control de expresión (por ejemplo, promotor, realzador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN foráneo, se puede permitir que las células manipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren el plásmido en sus cromosomas de manera estable y crezcan para formar focis que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas de células. Este método puede ser utilizado de manera provechosa para manipular lineas de células que expresan el producto génico de citocina recombinante protectora de tejido. Tales lineas de células manipuladas pueden ser particularmente útiles en el tamizado y evaluación de compuestos- que afectan la actividad endógena del producto génico de citocina recombinante protectora de tejido. Cualquiera de los vectores de expresión descritos aquí pueden ser sintetizados y ensamblados a partir de secuencias de ADN conocidas por técnicas bien conocidas. Las regiones reguladoras y los elementos realzadores pueden ser de varios origines, tanto naturales como sintéticos. Algunos vectores y células huéspedes pueden obtenerse comercialmente . Ejemplos no limitativos de vectores útiles se describen en el Anexo 5 de Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular] , 1988, ed Ausubel y colaboradores,' Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, que se incorpora aquí por referencia; y los catálogos de proveedores comerciales tales como Clontech Laboratories, Stratagene Inc., e Invitrogen, Inc. Alternativamente, numerosos sistemas de expresión basados en virus pueden también utilizarse con células de mamífero para la expresión recombinante de citocinas protectoras de tejido. Vectores que utilizan estructuras de virus de ADN .han sido derivados de virus de simio 40 (SV40) (Hamer y colaboradores, 1979, Cell 17:275), adenovirus (Van Doren y colaboradores, 1984, Mol. ' Cell 'Biol. 4: 1653), virus adenoasociado (McLaughliñ y colaboradores, 1988,. J. Virol. 62:1963), y virus de papiloma bovino (Zinn y colaboradores, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. 79:4897). En casos en los cuales se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de ADN de donador puede ligarse a una región de control de transcripción/traducción de adenovirus, como por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma del adenovirus mediante reco binación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El ó E3) resultará en uh virus recómbinante que es viable y capaz de expresar productos heterólogos en huéspedes infectados (véase -por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Alternativamente, el promotor de 7.5K de vaccina puede utilizarse (véase por ejemplo Mackett y "colaboradores, 1982,' Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett y colaboradores, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali y colaboradores, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:4927-4931) . En casos en los cuales se utiliza una célula huésped humana, se pueden utilizar vectores basados en el origen (OriP) de virus de Epstein-Barr (EBV) y antígeno nuclear de EBV 1 (ÉBNA-1; un factor "de replicación de transacción) .

Tales vectores pueden ser utilizados con una amplia gama de células huéspedes humanas, como por ejemplo, EBO-pCD (Spickofsky y colaboradores, 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:14- 18), pDR2 y DR2 (disponible en Clohtech Laboratories). La expresión de citocina recombinante protectora de tejido puede también lograrse a través de un sistema de expresión basado en retrovirus. En contraste con la transíección, los retrovirus -pueden infectar eficientemente y transferir genes a una amplia gama de tipos de células, incluyendo, por ejemplo, células hematopoyéticas primarias. En retrovirus ¦ tales como virus de leucemia de murino Moloney, la mayoría de las secuencias de gen viral pueden ser removidas y reemplazadas por una secuencia codificador de citocina recombinante protectora de tejido, mientras que las funciones virales faltantes pueden ser suministras en trans . El rango de huéspedes para infección por un vector retroviral puede también ser" manipulado mediante la elección de la envoltura utilizada para empacar el vector. Por ejemplo, un. vector retroviral puede comprender una repetición terminal larga 5' (LTR) , una repetición terminal larga 3' , una señal de empaque, un origen bacteriano de replicacióh, y un marcador seleccionable ... El ADN de citocina recombinante protectora de tejido es insertado en una posición entre la repetición terminal larga 5' y la repetición terminal larga 3' de tal manera que la transcripción a partir del promotor de repetición terminal larga 5' transcriba el ADN clonado . La repetición terminal larga 5' comprende un promotor, que incluye, sin limitarse a esto, un promotor de repetición terminal larga, una región R, una región U5 y un sitio de ¦ enlace de cebador, en este orden. Las secuencias . de nucleótidos de estos elementos de repetición terminal larga. - (LTR) son bien conocidos en la técnica. Un promotor heterólogo asi como múltiples marcadores de selección de fármaco pueden también' incluirse en el vector - de expresión para facilitar la selección de las células infectadas (véase McLauchlin y colaboradores, 1990, Prog. Nucleic Acid Res. y Molec. Biol. 38: 91-135; Morgenstern y colaboradores, 1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596; Choulika y colaboradores, 1996, J.. Virol. 70:1792-1798; Boesen y colaboradores, 19.94, Biotherapy .6:291-302; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin. en Genetics and Devel . 3:110-114) . En una modalidad de la invención, una citocina recombinante protectora de tejido deficiente en residuos siálicos o que falta totalmente de residuos siálicos puede ser producida en una célula de mamífero, incluyendo una célula humana. Tales células pueden ser manipuladas para que sean deficientes o que no tengan las enzimas que agregan ácidos siálicos, es decir, la ß-galactosido a 2,3 sialiltransferasa ( a 2,3- sialiltransferasa@ y la ß-galactosido « 2,6 sialiltransferasa (?a 2,6 sialiltransferasat?) . En una modalidad, una célula de mamífero es utilizada en la cual cualquiera del gen a 2,3 sialiltransferasa y/o gen 2,6 sialiltransferasa se borra o ambos genes se borran. Dichas deleciones pueden ser construidas empleando técnicas de noqueado génico bien conocidas. En otra modalidad, se utilizan células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en' dihidrofolato reductasa (DHFR) como la célula huésped para la producción de citocinas recombinantes protectoras de tejido. Las células CHO no expresan la enzima a 2,6 sialiltransferasa y por consiguiente no agregan ácido siálico en el enlace 2,6 a los oligosacáridos enlazados con N de las glicoproteínas producidas -en estas células.' Como resultado, proteínas recombinantes producidas en células CHO no presentan ácido siálico en enlace 2, 6 con galactosa (Sasaki y colaboradores (1987; Takeuchi y colaboradores supra; Mutsaers y colaboradores Eur. J. Biochem. 156, 651(1986); Takeuchi y colaboradores, J. Chromotgr. 400, 207 (1987) . En una modalidad, para producir una célula huésped para la producción de una asialo-eritropoyetina, el gen que codifica la a 2,3 sialiltransferasa en células CHO es borrado. Tales células CHO -noqueada en cuanto a 2,3 sialiltransferasa presentan una ausencia completa de actividad sialiltransferasa y como resultado - son útiles para la expresión recombinante y producción de muteína de asialoeritropoyetina . En otra modalidad, asíalo glicoproteínas pueden ser producidas por interferencia con transporte de ácido siálico en el aparato de Golgi como por ejemplo, Eckhardt y colaboradores, 1998, J. Biol. Chem. 273:20189-95). Utilizando métodos bien conocidos por parte de las ' personas con conocimientos en la material (por ejemplo, Oelmann y colaboradores, 2001, J. Biol. Chem. 276:26291-300), se puede lograr una mutagénesis de transformador de CMP de azúcar nucleótido-ácido siálico para producir mutantes de células de ovario de hámster chino. Estas células no pueden agregar residuos de ácido siálico a glicoproteínas como por ejemplo una citocina recombinante - protectora ce tejido y producen solamente una muteína de asialoeritropoyetina. Células de mamífero transfectadas que producen una muteína de eritropoyetina producen también sialidasa citosólica que si se fuga al medio de cultivo degrada la muteína de sialoeritropoyetina con alta eficiencia (por ejemplo, Gramer y colaboradores, 1995 Biotechnology 13:692-698). Utilizando métodos bien conocidos por parte de ' las personas con conocimientos, en la materia (por ejemplo a partir de información proporcionada en Ferrari y colaboradores, 1994, Glycobiology 4:367-373), líneas de células pueden ser transfectadas, mutadas o bien se puede provocar de otra forma la producción constitutiva de sialidasa. De esta forma se puede producir una muteína de asialoeritropoyetina durante la fabricación de muteína de asialoeritropoyetina. Las células recombinantes pueden ser cultivadas bajo condiciones estándares de temperatura, tiempo de incubación, densidad óptica y composición -de medio. Alternativamente, condiciones y medios de cultivo modificados pueden · utilizarse con el objeto de incrementar la producción de citocina recombinante protectora de tejido. Por ejemplo, . células recombinantes pueden ser cultivadas bajo condiciones que promueven la expresión inducible de citocina recombinante protectora de tejido. Cualquier técnica conocida puede aplicarse para establecer las condiciones óptimas para la producción de citocinas recombinantes protectoras de tejido. Lisados celulares o extractos que comprenden citocinas recombinantes protectoras de tejido pueden ser purificadas adicionalmente para aislar ¦ citocinas recombinantes protectoras de tejido. Para facilitar la purificación de las citocinas recombinantes protectoras de tejido, una secuencia de aminoácidos de marcador es un péptido hexa- istidina, como por ejemplo la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QÍAGEN, Inc. 9259 Eton Avenue, Chats orth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles.- De conformidad con. lo descrito en Gentz y colaboradores, 1989, PNAS 86:821, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de" la proteina de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para purificación incluye, sin limitarse a estos ejemplos, la etiqueta de hemaglutinina "HA" que corresponde a un epítopo derivado de una proteína ole hemaglutinina de influenza (Wilson y colaboradores, 1984, Cell 37:767) y la etiqueta "bandera". Cualquier método de purificación conocido en la técnica puede emplearse (véase, por ejemplo, La publicación de .patente internacional WO 93/21232; EP 439,095; Naramura y colaboradores, 1994, Immunol. Lett . ¦ 39 : 91-99; la patente norteamericana 5,474, 981, Guillies - y colaboradores, 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell y colaboradores 1991, J. Immunol. 146:2446-2452). 5.4 ENSAYOS PARA LAS PROPIEDADES PROTECTORAS DE TEJIDO DE LAS CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO Después de la elaboración de las citocínas recombinantes protectoras de tejido, y en algunas modalidades después de una modificación química adicional de tales citocinas protectoras de tejido -de la presente invención, una persona con conocimientos, ordinarios en la materia puede verificar "los atributos de protección de tejido de las citocinas y la ausencia de un efecto sobre la médula ósea utilizando ensayos bien conocidos. Por ejemplo, el efecto no eritropoyético de una citocina recombinante protectora de tejido puede verificarse a través del uso de un ensayo TF-1. En este ensayo, células TF-1 se cultivan en un medio RPMI completo su lementado con 5 ng/ml de GM-CSF y 10% de FCS durante 1 día a una temperatura de 37 °C en un incubador de C02. Las células son después lavadas y suspendidas a una densidad de 106 células/ml durante 16 horas en un medio de deprivación (FCS al 5% sin GM-CSF) . Se prepara una placa de 96 pozos mediante: (1) agregar 100 µ? de agua estéril a los pozos externos para mantener la humedad; (2) agregar medio (FCS al 10% sin células ó GM-CSF) solo a 5 pozos;' y (3) sembrar 25,000 células/pozo con medio que contiene FCS al 10% y las citocinas recombinantes protectoras de tejido en las células restantes (cinco pozos por citocina en estudio) . Si- proliferaron las células, la citocina recombinante protectora de tejido puede ser eritropoyética. El efecto in vivo del compuesto debe ser probado en un ensayo in vivo que monitorea el incremento del nivel de hematócritos debido a la ' citocina recombinante protectora de tejido. Un resultado negativo - ausencia de proliferación de células en el ensayo in vitro de TF-1 y/o una ausencia de incremento en cuando a los niveles de hematócritos dentro del marco del ensayo in vivo - significa que la citocina recombinante protectora de tejido" no es eritropoyética. Como alternativa al ensayo TF-1 descrito arriba, una' persona con conocimientos en la materia puede emplear otros ensayos eritropoyéticos conocidos en la técnica incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, ensayo de células UT-7 tales como los descritos abajo en las secciones de ejemplo. Las propiedades de protección de tejido de las citocinas" recombinantes protectoras de tejido pueden verificarse empleando un ensayo in vítro de P-19 o un ensayo in vivo de intoxicación con agua en ratones, ambos presentándose con detalles adicionales a continuación. Ensayos alternativos incluyen, sin limitarse .a estos ejemplos, los ensayos adicionales presentados en los Ejemplos abajo, como por ejemplo los ensayos de PC-12 y el ensayo de secciones hipocampales . Los ensayos mencionados arriba se proporcionan simplemente como ejemplos y otros ensayos adecuados para determinar los efectos protectores de tejido y/o los efectos sobre la médula ósea de las citocinas recombinantes protectoras de tejido son conocidos de las personas con conocimientos ordinarios en la materia y se contemplan también. 5.5 COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN En la práctica de un aspecto de la presente invención, una i composición farmacéutica de conformidad con lo descrito arriba que contiene una citocina re-combinante protectora de tejido puede administrarse a un mamífero por cualquier vía que ofrece un nivel suficiente de citocina recombinante protectora de tejido en la vasculatura para permitir la translocación a través de una barrera de células endoteliales y lograr efectos benéficos en células respondedoras. Cuando se utiliza para el propósito de perfusar un tejido o un órgano, se desean obtener resultados similares. En el caso en el cual la muteina de eritropoyetina se utiliza para la perfusión ex vivo, la citocina recombínante protectora de tejido puede tener cualquier forma de una muteina de eritropoyetina, como por ejemplo la citocina recombinante protectora de tejido antes mencionada. En el caso en el cual las células o tejido no son vascularizados y/o la administración es mediante el hecho de bañar las células o tejido con la composición de la invención, la composición farmacéutica proporciona una cantidad efectiva benéfica para células respondedoras de una citocina recombinante protectora de tejido. Las. barreras de células endoteliales a través de la cual una citocina recombinante protectora de tejido puede translocalizarse incluye uniones herméticas, juntas perforadas, uniones con ventana, y cualquier otro tipo de barreras endoteliales presente en un mamífero. Una barrera preferida es una unión hermética de células endoteliales, "pero la invención no se limita a este caso. Las citocinas recombinantes protectoras de tejido antes mencionadas son generalmente útiles para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades humanas del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico que tienen síntomas primariamente neurológicos o psiquiátricos, enfermedades oftálmicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiopulmonares, enfermedades respiratorias, enfermedades renales, urinarias y reproductivas, enfermedades gastrointestinales asi como anormalidades endocrinas y metabólicas. En particular, tales condiciones y enfermedades incluyen condiciones hipóxicas que afectan de manera negativa los tejidos excitables tales como los tejidos- excitables en el tejido del sistema nervioso central, tejido de sistema nervioso periférico o tejido cardiaco o retinal como por ejemplo cerebro, corazón o retina/ojo. Por consiguiente, la invención puede utilizarse para tratar o prevenir daño a tejido excitable que resulta de condiciones hipóxicas en varias condiciones y circunstancias. Ejemplos no limitativos de tales condiciones y circunstancias se proporcionan en la Tabla siguiente. En el ejemplo de la protección de patologías de tejido neuronal que pueden tratarse de conformidad con la presente invención, tales patologías incluyen las. patologías que resultan de una oxigenación reducida de "tejidos neuronales. Cualquier condición qué reduzca la disponibilidad de oxígeno al tejido neuronal, resultando en estrés, daño y finalmente muerte de células neuronales, puede ser tratada por los métodos de la presente invención. Se conorg generalmente como hipoxia y/o isquemia las condiciones que surgen o incluyen los' ejemplos siguientes, sin limitarse a ellos: apoplejía, oclusión vascular, deprivación de oxígeno prenatal o postnatal, sofocación, asfixia, casi ahogamiento, envenenamiento por monóxido de carbono, inhalación de humo, trauma, incluyendo intervención quirúrgica y radioterapia, asfixia, epilepsia, hipoglicemia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, síndrome de depresión respiratoria del adulto, choque hipotensivo, choque séptico, choque anafiláctico, choque de insulina,- crisis de células falciformes, paro cardiaco, disritmia, narcosis por nitrógeno asi como déficits neurológicos causados por procedimientos de desvío cardiaco-pulmonar. En una modalidad, por ejemplo, las composiciones de citocinas recombinantes protectoras de tejido específicas pueden ser administradas para prevenir lesión o daño tisular que resulta de riesgo de lesión o daño tisular durante una intervención quirúrgica como por ejemplo resección de tumor o reparación de aneurisma. Otras patologías causadas por hipoglicemia o resultante de hipoglicemia que pueden tratarse a- través de los métodos descritos aquí, incluyen sobredosis de insulina que se conoce también como hiperinsulinemiá iatrogénica, insulinoma, deficiencia de hormona de crecimiento, hipocortisolismo, sobredosis de fármaco, y ciertos tumores. Otras patologías que resultan de un daño a tejido neuronal excitable incluyen trastornos de ataques - como por ejemplo epilepsia, convulsiones, o trastornos de ataques crónicos. Otras condiciones y enfermedades tratables incluyen sin limitarse a estos ejemplos, enfermedades tales como apoplejía, esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, trauma cerebral o a la médula espinal, demencia, sida, pérdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos de ataques, alcoholismo, isquemia retinal, daño al nervio óptico como resultado de glaucoma, y pérdida neuronal . La composición y métodos específicos de la presente invención pueden utilizarse para tratar inflamación resultante de condiciones de enfermedad o varios traumas, como por ejemplo inflamación inducida física o químicamente, tales trauma incluyen angitis, bronquitis crónica, pancreatitis, osteomielitis, artritis reumatoide, glomerulonefritis, neuritis 'óptica, arteritis temporal, encefalitis, meningitis, mielitis transversa, dermatomiositis, . polimiositis, fasciitis necrotizante, hepatitis y enterocolitis necrotizante. La evidencia ha demostrado que los astrocitos activados pueden ejercer una función citotóxica sobre las, neuronas, mediante la producción de neurotoxinas . Óxido nítrico, especies de oxígeno reactivas así como citocinas son liberadas de las células gliales en respuesta a una isquemia cerebral (véase Becker, K. J. 2001. Targeting the central nervous system inflammatory responde in ischemic stroke [Enfoque de la respuesta inflamatoria del sistema nervioso central en ataque isquémico]. Curr Opinión Neurol 14:349-353 y Mattson, M. P., Culmsee, C, y Yu, Z. F. 200. Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke [Mecanismos apoptóticos y antiapoptóticos en ataques]. Cell TissueRes 301:173-187). Estudios han demostrado adicionalmente que en modelos de neurodegeneración, la activación glial y la producción ' subsiguiente de citocinas inflamatorias dependen del daño neuronal primario (véase Viviani, B., Corsini, E., Galli, C. L., Padovani, A. , Ciusai, E., y Marinovich, M. 2000. Dying neural cells actívate glia through the reléase pf a protease product [Las células neurales agonizantes activan las células gliales a través ' de la liberación de un producto de proteasa] . Glia 32:84-90 y Rabuffetti, M., Scioratti, C, Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A. A., y Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-l-like activity by Ac-Tyr-Val- Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammator'y cytokines [Inhibición de la actividad de tipo caspasa-1 por Ac-Tyr-Val- Ala-Asp-clorometil cetona incluye ¦ una neuroprotección de larga duración en la isquemia cerebral a través de una reducción de la apóptosis y una disminución de la. citocinas proinflamatorias] . J Neurosci 20:4398-4404)·. La inflamación y activación glial es común a diferentes formas de trastornos neurodegenerativos, incluyendo isquemia cerebral, trauma cerebral y encefalomielitis alérgica experimental, trastornos en los cuales la eritropoyetina ejerce un efecto de protección celular. La inhibición de la producción de citocina por eritropoyetina podría, por lo menos parcialmente, mediar su efecto protector. Sin embargo, a diferencia de las citocinas antiinflamatorias "clásicas" como por ejemplo 11-10 y IL-3 que inhiben directamente la producción de factor de necrosis tumoral, la eritropoyetina parece ser activa solamente en presencia de la muerte neuronal . Mientras no se desea ' limitarse a ninguna teoría particular, parece que esta actividad antiinflamatoria puede ser explicada hipotéticamente a través de varias teorías no limitativas. Primero, puesto que la eritropoyetina evita la apóptosis, se podría prevenir los eventos inflamatorios activados por la apóptosis. Además la eritropoyetina puede prevenir la liberación de señales moleculares provenientes de neuronas agonizantes que estimulan las células gliales o bien podría actuar directamente sobre las células gliales reduciendo su reacción a estos productos. Otra posibilidad es que la eritropoyetina enfoqué" los miembros más próximos de la cascada inflamatoria (por ejemplo, caspasa 1, intermediarios de oxígeno reactivo o · nitrógeno)' que activan tanto la apóptosis como la inflamación. Además, la eritropoyesis parece proporcionar una protección antiinflamatoria sin el efecto de rebote típicamente asociado con . otros compuestos antiinflamatorios tales' como dexametasona . Otra vez, sin desear limitarnos a ninguna teoría particular, parece que esto puede deberse al efecto de la eritropoyetina sobre neurotoxinas de propósitos múltiples como por ejemplo óxido nítrico- (NO). Aún cuando los astrocitos activados y las células icrogliales producen cantidades neurotoxicas de NO en -respuesta a varios traumas, el NO sirve' para muchos propósitos en el cuerpo incluyendo la modulación de funciones, fisiológicas esenciales. .Así, aun cuando el . uso de un antiinflamatorio puede mitigar la inflamación mediante la supresión de NO u otras neurotoxinas, si el antiinflamatorio tiene una vida media excesivamente larga, puede también interferir con estas funciones químicas en la reparación del daño resultante del trauma que provocó la inflamación. Se plantea de manera hipotética que las citocinas" recombinantes protectoras de tejido de la presente invención pueden mitigar la inflamación sin interferir con las capacidades restaurativas de las neurotoxinas tales como NO. Las composiciones y métodos específicos de la presente invención pueden utilizarse . para tratar condiciones al tejido retinal y daños al tejido retinal. Tales trastornos incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, isquemia retinal, degeneración ' macular, desprendimiento de retina, retinitis pigmentosa, retinopatia arteriosclerótica, retinopatia hipertensiva, bloque de arteria retinal, bloqueo de vena retinal, hipotensión, así como retinopatia diabética. En · otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para proteger o tratar una lesión resultante de daño por radiación a un tejido excitable. Una .utilidad adicional de , los métodos de la presente invención es el tratamiento de envenenamiento por neurotoxinas, como por ejemplo envenenamiento por mariscos con ácido domóico, neurolatirismo, y enfermedad de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Parkinson. Como se mencionó arriba, la presente invención se enfoca . también a un método para mejorar la función de un tejido excitable en un mamífero a través de la administración periférica de una citocina recombinante protectora de tejido ¦ de conformidad con lo descrito arriba. Varias" enfermedades y condiciones se prestan para el tratamiento con este método y además, este método es útil para incrementar la función cognoscitiva en ausencia de una condición o enfermedad. Estos usos de la presente invención se describen con detalles adicionales abajo e incluyen una mejora del aprendizaje y de la capacitación tanto en mamíferos humanos como en mamíferos no humanos . Condiciones y enfermedades tratables por los métodos de este aspecto de la presente invención enfocados al sistema nervioso central incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, trastornos del humor, trastornos de ansiedad, depresión, autismo, trastorno de hiperactividad y déficit de atención as-i como disfunción cognoscitiva. Estas condiciones se benefician de una mejora de la función neuronal. Otros trastornos tratables de conformidad con las enseñanzas de la presente invención incluyen por ejemplo trastorno del sueño, apnea del sueño, trastornos relacionados con los viajes; sangrados ¦ sub-aracnoide y causado por aneurisma, choque hipotensivo,- lesión concusiva, choque séptico, choque anafiláctico - y secuelas de varias encefalitis y meningitis, como por ejemplo cerebritis relacionadas con enfermedades de tejido conectivo como por ejemplo lupus. Otros usos incluyen la prevención o la protección contra envenenamiento por neurotoxinas, como por ejemplo envenenamiento por mariscos con ácido dompico, neurolatirismo, y enfermedad d Guam, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, tratamiento post-operativo para lesión embólica o isquémica; y radiación de cerebro entero; crisis de células falciformes; y eclampsia. Un grupo adicional- de condiciones tratables por los métodos de la presente invención incluyen la disfunción mitocondrial de naturaleza hereditaria o bien de naturaleza adquirida, que son la causa de varias enfermedades neurológicas tipificadas por lesión neüronal y muerte. Por ejemplo, la enfermedad de Leigh (encefalopatía necrotizante sub-aguda) se caracteriza por una pérdida progresiva de' la vista y encefalopatía, causada por una disminución ne ronal, y miopatía. En estos casos, un metabolismo mitocondrial defectuoso no alcanza a suministrar una cantidad suficientemente alta de sustratos de energía para impulsar el metabolismo de las células excitable. Un modulador de actividad de receptor de eritropoyetina optimiza la función que está fallando^ en varias enfermedades mitocondriales . De conformidad con lo mencionado arriba, las condiciones hipóxicas afectan negativamente los tejidos excitable. Los tejidos excitables incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, tejido del sistema nervioso central, tejido del sistema nervioso periférico, y tejido cardiaco. Además de las condiciones ¦ descritas arriba, los métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de envenenamiento por inhalación como por ejemplo inhalación de monóxido de carbono y humo, asma severa, síndrome de depresión respiratoria de los adultos, asfixia, y casi ahogamiento. Condiciones adicionales que crean condiciones hipóxicas · o bien que inducen de otras formas daños a tejidos excitables incluyen hipoglicemia que puede ocurrir en una dosificación inapropiada de insulina, o bien con neoplasmas que producen insulina (insulinoma) . ' Varios trastornos neuropsicológicos los cuales se consideran originándose de un daño a tejidos excitables pueden tratarse a través de los métodos de la presente invención. Trastornos crónicos en los cuales está involucrado un daño neuronal y para los cuales se proporciona tratamiento a través de la presente invención incluyen trastornos que se relacionan con el sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico incluyendo la pérdida de la función cognoscitiva relacionada con- la edad y demencia senil, trastornos de ataques crónicos, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, esclerosis tuberosa, enfermedad de ilson, parálisis cerebral y supranuclear progresiva, enfermedad de Guara, demencia de cuerpo de Lewy, enfermedades causadas por priones ' como por ejemplo encefalopatías espongiformes, por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica, ataxia de Freidrich y otras ataxias así como síndrome de Gilíes de la Tourette, trastornos de ataques, como por ejemplo epilepsia y trastorno de ataques crónicos, apoplejía, trauma cerebral o de - la médula espinal, demencia por sida, alcoholismo, autismo, isquemia retinal, glaucoma, trastornos- de la función autonómica, como por ejemplo hipertensión y trastorno del 1.46 sueño, así como trastornos neuropsiquiátricos que incluye, sin limitarse a estos ejemplos, " esquizofrenia, trastorno esquizóafectivos, hiperactividad con trastorno de déficit de atención, trastorno distímico, trastorno depresivo mayor, inania,'' trastorno obsesivo-compulsivo, trastornos del uso de sustancias psicoactivas, ansiedad, trastornos de pánico, así como trastornos afectivos unipolares y bipolares. Trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos adicionales incluyen, por ejemplo, los trastornos 'listados en el manual de diagnóstico y estadísticas de trastornos mentales (DSM) , de la American Psychiatric Association, la versión más actualizada, IV, incorporándose aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, moléculas recombinantes de toxinas quiméricas que comprenden una citocina recorabinante protectora de tejido pueden emplearse para la administración terapéutica de toxinas con el objeto de tratar un padecimiento proliferativo, como por ejemplo cáncer, o un trastorno viral, como por ejemplo panencefa-litis esclerosante sub-aguda. La tabla siguiente presenta una lista de indicaciones adicionales, de ejemplos", no limitativas- en cuanto a las varias condiciones y enfermedades que se prestan a un tratamiento con las citocinas recombinantes protectoras de tejido mencionadas arriba.

Célula, Disfunción o Condición o Tipo tejido u patología enfermedad órgano Corazón Isquemia Enfermedad de Agudo, crónico, arteria estable, coronaria inestable Infarto del Síndrome de miocardio Dressler Angina Enfermedad Cardiopatía cardiaca valvular congénita Angina de Prinzmetal Ruptura cardiaca Perforación septal aneurismática Angiitis Arritmia Taqui- , Estable, bradiarritmia inestable, nodo Supraventricular de seno de , ventricular, carótida anormalidades de hipersensible la conducción Insuficiencia Izquierda, Cardiomiopatías, cardiaca derecha, bi- como por ej eiaplo congestiva ventricular, enfermedad de sistólica, almacenamiento, diastólica metabólica, infecciosa, familiar idiopática, deficiencias, trastorno de tejido conectivo, e infiltración y granulomas, neurovascular Miocarditis Autoinmune, infectivo, idiopático Cor pulmonar Trauma superficiales y penetrantes Toxinas Toxicidad de cocaína Enfermedad Fibrosis pulmonar pulmonar intersticial idiopática Congénita Fibrosis cística Cor pulmonar Trauma Neumonías y Infecciosas, neumonitis parásitas, tóxicas, traumáticas, por quemaduras, aspiración • Sarcoidosis Páncreas Endocrina Diabetes mellitus, tipo I y ii Otras Insuficiencia de insuficiencias células beta, de células disfunción por endocrinas del neuropatía páncreas diabética Exocrina Insuficiencia Pancreatitis exocrina de páncreas Hueso Osteopenia Primaria, Hipogonadisitio, secundaria inmovilización, Hiperparatiroi- dismo relacionado con la edad, postmenopáusico, hipertiroidismo, deficiencia de calcio, magnesio, fósforo y/o vitamina D Osteomielitis Necrosis. Avascular Trauma Enfermedad de Paget Piel •Alopecia Aerata Primaria Total secundaria alopecia de patrón masculino Vitíligo Localizado Primario generalizado secundario Ulceración diabética Enfermedad vascular periférica Lesiones por . quemaduras Trastornos Lupus auto- eritematoide, · inmunes Sj iogren, artritis reumatoide, glomerulonefri tis, angiitis Histiocitosis de Langerhan |0j< Neuritis óptica Lesiones superficiales y penetrantes, infecciones, sarcoide, enfermedad de células falciformes, desprendimiento de retina, arteritis temporal Isquemia retinal, degeneración macular, retinitis pigmentosa, retinopatia arterioscle- rótica, — retinopatia hipertensiva, bloqueo de arteria retinal, bloqueo de vena retinal, hipotensión, retinopatia diabética, y edema macular Trastornos Asfixia embrió-nicos y fetales Isquemia CNS Síndrome de Fatiga crónica, síndromes hipóosomola- res e hiperosmola- res agudos y crónicos, demencia por SIDA, Electrocución Encefalitis Rabia, Herpes Meningitis Hematoma Subdural Adicción a la nicotina Abuso y retiro Cocaína, de drogas heroína, crack, marihuana, LSD, PCP, abuso de drogas múltiples , ecstasy, opioides, hipnóticos sedantes, anfetaminas, cafeína Trastornos obsesivos-compulsivos Estenosis espinal, mielitis transversa, Guillian Barre, trauma, compresión de raíz nerviosa, compresión tumoral, insolación EÑT Tinitus Síndrome de Meuniere Pérdida de oído Lesión traumática, barotraumas Riñon Insuficiencia Aguda, crónica Enfermedad renal vascular/isquémic a, intersticial, enfermedad de riñon diabético, síndromes nefróticos, infecciones, herida, inducida por contraste, inducida por quimioterapia, inducida por CPB o preventiva Henoch S . Púrpura Músculo Enfermedades Miastenia grave estriado auto-inmunes Dermatomiositis Polimiositis Miopatias Metabólica heredada, endocrina y • · tóxica Insolación Lesión por aplastamiento Rabdomilosis Enfermedad mitocondrial Infección Fasciitis necrotizante Disfunción Central y Impotencia sexual periférica secundaria a (por ejemplo, medicación disfunción (diabetes)' eréctil) Hígado Hepatitis Viral, bacteriana, parásita Enfermedad isquémica Cirrosis, hígado graso Enfermedades infiltrativas/ metabólicas Gastrointe Enfermedad stinal intestinal isquémica Enfermedad intestinal inflamatoria Enterocolitis necrotizante Transplant Tratamiento de e de donador y órgano receptor Tracto Infertilidad Vascular reprpducti Auto-inmune o Anorma1idades uterinas - Trastornos de implante Endocrina Hiperfunción e ipofunción glandular Como se mencionó arriba, .estas enfermedades, trastornos o condiciones son simplemente ilustrativos del rango de beneficios proporcionados por las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. Por consiguiente, esta invención ofrece generalmente un tratamiento terapéutico o profiláctico de las consecuencias de trauma mecánico o de enfermedades humanas. Un tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones del sistema nervioso central /o sistema nervioso periférico se prefieren. Se proporciona un tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones que tienen un componente psiquiátrico. Se proporciona un tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o condiciones que incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, los que tienen un componente oftálmico, cardiovascular, cardiopulmonar, respiratorio, renal, urinario, reproductivo, gastrointestinal, endocrino o metabólico . En una modalidad, dicha composición farmacéutica de una citocina recombinante protectora de tejido puede administrarse sistémicamente para proteger o mejorar las células, tejido u órgano blanco. Dicha administración puede ser parenteral, a través de inhalación o transmucosal, por ejemplo, oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosal o transdérmica . Preferentemente, la administración es parenteral, por ejemplo, por inyección intravenosa o intraperitoneal, e incluyendo también, sin limitarse a estos ejemplos, administración intraarterial,- intramuscular, intradérmica y subcutánea. Para otras vias de administración, como mediante el uso de un perfusado, inyección en " un órgano u otra administración local, se puede proporcionar una composición farmacéutica que resulta en niveles semejantes de una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. Se prefiere un nivel de aproximadamente 0.01 pM -30 nM. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un gobierno estatal o bien listado en la Farmacopea Norteamericana u otra farmacopea foránea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra l agente terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como por ejemplo soluciones salinas en agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético como por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Una solución salina es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica es administrada de manera intravenosa. Soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden también emplearse como . vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes f rmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o 'bien agentes amortiguadores del pH. Las composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación " prolongada y similares. La composición puede formularse como supositorio, con aglomerantes tradicionales . y vehículos tales como triglicéridos . Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en forma neutral o en forma de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas con grupos amino libres o tales como las derivadas de ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo con el objeto de proporcionar la forma para administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración . Composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral' pueden ser proporcionadas como cápsulas o tabletas; como polvos o gránulos, como soluciones, jarabes o suspensiones (en liquidos acuosos o no acuosos); como espumas comestibles o cremas; o bien como emulsiones. Tabletas o cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, -almidón o derivados de los mismos, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico o sales de los mismos. Cápsulas de gelatina blanda pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, políoles semi-sólidos o liquidos, etc. Soluciones y jarabes pueden comprender agua, políoles y azúcares. Un agente activo contemplado para administración oral puede estar revestido o mezclado con un material que retarda la desintegración y/o absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo puede emplearse) . Así, la liberación sostenida de un agente activo puede lograrse durante muchas horas, y en caso necesario, el agente activo puede ser protegido contra degradación en el estómago. Composiciones farmacéuticas para administración oral pueden ser formuladas con el objeto de facilitar' la liberación de un agente activo en una ubicación gastrointestinal particular debido a un pH específico o a condiciones enzimáticas específicas. Composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden proporcionarse como parches discretos contemplados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo prolongado de tiempo- Composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden proporcionarse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, geles, pastas, rocíos, aerosoles o aceites. Para administración tópica sobre la piel, boca, ojo u otros tejidos externos, se utiliza preferentemente un ungüento tópico o crema. Cuando se fórmula en un ungüento, el ingrediente activo puede emplearse ya sea con una base de ungüento parafxnico o con una base de ungüento miscible. en agua. Alternativamente, el ingrediente activo puede ser formulado en una crema con una base de aceite-en-agua o con una base de agua-en-aceite . Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica al ojo incluyen gotas para los ojos. En estas composiciones, el ingrediente activo puede estar disuelto o suspendido en un vehículo adecuado, por ejemplo en . un solvente acuoso. Composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca y en tabletas, pastillas y enjuagues bucales. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal y pulmonar pueden comprender vehículos sólidos tales como polvos (que . tienen preferentemente un tamaño de partículas dentro de un rango de 20 a 5C0 mieras) . Los polvos pueden ser administrados de, tal manera que puedan ser inhalados' rápidamente a través de la nariz a partir de un recipiente o polvo mantenido cerca de la nariz. Alternativamente, las composiciones adaptadas para administración nasal pueden comprender vehículos líquidos como por ejemplo rocíos nasales o gotas nasales. Alternativamente, la inhalación directa en los pulmones puede lograrse mediante una inhalación profunda o mediante la instalación a través de un pieza bucal en la orofaringe, estas composiciones pueden comprender soluciones acuosas o de aceite del ingrediente activo. Las composiciones para administración por inhalación pueden suministrarse en dispositivos especialmente adaptados incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, aerosoles presurizados, atomizadores o insufladores que pueden ser construidos con el objeto de proporcionar dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en la cavidad nasal directamente o bien en los pulmones a través de la cavidad nasal u oro faríngea. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden proporcionarse como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden proporcionarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones tipo rocío. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluye soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos, disolutos que vuelven las composiciones sustancialmente isotónicas con la sangre de un receptor contemplado. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, como por ejemplo. Composiciones adaptadas para administración parenteral pueden estar presentadas en recipiente de dosis unitaria o de dosis múltiples, como por ejemplo, ampolletas selladas y frascos, y pueden almacenarse en una condición liofilizada requiriendo solamente de- la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, una solución salina estéril para inyecciones inmediatamente antes de uso. Soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas. En una modalidad, un auto-inyector que comprende una solución inyectable de una citocina recombinante protectora de tejido puede proporcionarse para uso en emergencias en ambulancias, sales de emergencias y situaciones de campo de batalla o bien hasta para auto-administración en un entorno doméstico, especialmente cuando puede ocurrir la posibilidad de amputación traumática, como por ejemplo en el caso del uso imprudente de una cortadora de césped. La probabilidad que células y tejidos de un pie cortado o de un dedo cortado sobrevivan después de su recolocación puede incrementarse mediante la administración de una citocina recombinante protectora de tejido en sitios múltiples en la parte cortada lo más pronto posible, aún antes de la llegada del personal médico en el sitio, o bien a la llegada del individuo lesionado con el dedo córtado en la sala de emergencia. En una modalidad preferida, la composición se formula de conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son composiciones en amortiguador acuoso isotónico estéril, en caso necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y un anestésico local como por ejemplo lidocaína para aminorar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran ya sea separadamente o bien combinados juntos en forma unitaria de dosificación, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado anhidro en un recipiente herméticamente sellado como . por ejemplo una ampolleta o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición debe ser administrada por infusión, puede surtirse con una botella para infusión que contiene un agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolleta de solución salina estéril de tal manera que los ingredientes puedan ser mezclados antes de la administración. Los supositorios contienen generalmente ingredientes activos en un rango de 0.5% a 10% en peso; las formulaciones orales contienen preferentemente de 10% a 95% de ingrediente activo. Una composición de perfusado puede proporcionarse para uso en baños para órganos transplantados, para perfusión in situ o bien para administración a la vasculatura de un donador de órgano antes de .la cosecha del órgano. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender niveles de una citocina recombinante protectora de tejido o una forma de una citocina recombinante protectora de tejido no adecuada para administración aguda o crónica, local o sistémica a un individuo, pero servirán las funciones contempladas aqui en un cadáver, baño de órgano, perfusado de órgano, o bien perfusado in situ antes de la remoción o reducción de los niveles de la citocina recombinante protectora de tejido contenida ahí antes de exposición o retorno del órgano o tejido tratado a la circulación regular. La invención ofrece también un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o varios recipientes llenos de uno o varios de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente un folleto puede estar asociado con dicho (s) recipiente (s) en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho folleto refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana. En otra modalidad, por ejemplo, - una citocina recombinante protectora de tejido puede ser administrada en un sistema de liberació , controlada. Por ejemplo, el polipéptido puede ser administrado empleando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald y colaboradores, 1980, Surgery 88:507; Saudek y colaboradores, 1989, N. Engl . J. Med. 321:574). En otra modalidad, el compuesto 'puede ser administrado en una vesícula, especialmente un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 ' (1990); Treat y colaboradores, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, páginas 353-365 (1989); WO 91/04014; Patente Norteamericana Nos. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid. Páginas 317-327; véase generalmente ibid). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales polímeros (véase Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Press: Boca Ratón, Florida, 1974 ,' Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley; Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol . ' Sci. R'ev. Macromol . Chem. 23:61, .1953; véase también Levy y colaboradores, 1985, Science 228:190; During y colaboradores, 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard y colaboradores, 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra modalidad, el sistema de liberación controlada puede estar colocado cerca del blanco terapéutico, es decir, las células, tejido u órgano blanco, requiriendo por consiguiente solamente de una fracción de la dosis sistémica (véase por ejemplo Goodson, páginas 115-138 en Medical Applications of Controlled Reléase, vol . 2, supra 1984). Otros sistemas de liberación controladas se comentan en la reseña efectuada por Langer (1990, Science 249.1527-1533). En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido, formulada apropiadamente, puede administrarse por via nasal, oral, rectal, vaginal o sublingual. En una modalidad especifica, puede ser deseable administrar las composiciones de citocina recombinante protectora de tejido de la invención localmente al área que requiere de tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, no a titulo limitativo, mediante infusión local, durante una intervención quirúrgica, aplicación tópica, por ejemplo, en combinación con vendaje de herida después de una intervención quirúrgica, por inyección, a través de un' catéter, por medio de un supositorio, o bien a través de un implante, dicho implante elaborándose de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, como por ejemplo membranas silásticas, o fibras. La selección de la dosis efectiva preferida será determinada por una persona con conocimientos en la materia con base en el hecho de tomar en cuenta varios factores que son conocidos por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. Tales factores incluyen la forma particular de citocina recombinante protectora de tejido y sus parámetros farmacocinéticos como por ejemplo biodisponibilidad, metabolismo, vida media, etc., que se establecerán durante los ¦ procedimientos de desarrollo habituales típicamente empleados en la obtención de las autoridades reguladoras para un compuesto farmacéutico. - Factores adicionales para determinar la dosis incluyen la condición o enfermedad a tratar o el beneficio a lograr en un individuo normal, la masa corporal del paciente, la vía de administración, si la administración es aguda o crónica, medicaciones concomitantes, y otros factores bien conocidos por afectar la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. Así, la • dosificación precisa debe ser decidida según el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente, por ejemplo, según la condición del estado inmune del paciente individual y según las técnicas clínicas estándares . En otro aspecto de la invención, se proporciona un perfusado o una solución de perfusión para perfusión y almacenamiento de órganos para transplante, la solución de perfusión incluye una cantidad de citocina recombinante protectora de tejido efectiva para proteger células respondedoras " y células, tejidos u órganos asociados. Los transplantes incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, xenotransplante, en donde el órgano (incluyendo células, tejido u otra parte del cuerpo) es cosechado de un donador y transplantado en un recipiente diferente; y autotransplante, en donde el órgano es tomado de una parte del cuerpo y colocado en otra parte, incluyendo procedimientos quirúrgicos de banco, en donde un órgano puede ser removido, y mientras ex vivo, es cortado, reparado, o manipulado de otra forma, como por ejemplo, para remoción de tumor, y es después retornado a la ubicación original. En una modalidad, la "solución de perfusión es la solución de la Universidad de ¦ Wisconsin (U ) (Patente Norteamericana No. 4,798,824) que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 U/ml de eritropoyetina, almidón de hidroxietil al 5% (que tiene un peso molecular de aproximadamente 200,000 a aproximadamente 300,000 y sustancialmente exento de etilenglicol, etiléno clorohidrina, cloruro de sodio y acetona) ; H2P04; 25mM; glutationa 3mM; adenosina 5mM; glucosa lOmM; amortiguador HEPES lOmM; gluconato de magnesio 5mM;CaC12 1.5mM; gluconato de sodio 105mM; 200,000 unidades de penicilina; 40 unidades de insulina; 60mg de Dexametasona; 12mg de Fenol Rojo; y tiene un pH de* 7.4-7.5 y una osmolalidad de aproximadamente 320 mOSm/1. La solución se utili-za para mantener ríñones y páncreas de cadáveres antes de transplante. Utilizando la solución, la conservación puede ser extendida más allá del límite de 30 horas recomendado para la preservación de riñon de cadáveres. Este perfusado particular es simplemente ilustrativo de varias soluciones de este tipo y puede ser adaptado para- el .uso presente' mediante la inclusión de una cantidad efectiva de una citocina recombinante protectora de tejido. En una modalidad adicional, la solución de perfusado contiene de aproximadamente O.Olpg/ml a aproximadamente 400 ng/ml de citocina recombinante protectora de tejido, o. bien de aproximadamente 40 a aproximadamente 300 ng/ml de" citocina recombinante protectora de tejido. Como se mencionó arriba, cualquier forma de citocina recombinante protectora de tej.ido puede ser utilizada en este aspecto de la invención. Mientras el receptor preferido de una citocina recombinante protectora de tejido para los propósitos contemplados aquí es un ser humano, los métodos aplican también igualmente a otros mamíferos, especialmente animales domésticos, ganado, mascotas y animales de jardín zoológico. Sin embargo, la invención no se limita a esto y los beneficios pueden aplicarse a cualquier mamífero. 5.6. USOS TERAPÉUTICOS Y PREVENTIVOS DE CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO Como se 'indica en el Ejemplo 1 abajo, la presencia de receptores para eritropoyetina en el endotelio humano de capilar cerebral indica que los blancos de las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención están presentes en el cerebro humano y que los estudios con animales sobre estas citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención pueden transferirse directamente al tratamiento o profilaxis de seres humanos. En otro aspecto de la invención, métodos y composiciones para mejorar la viabilidad de células, tejidos, u órganos que no están aislados de la vasculatura por una barrera de. células endoteliales se proporcionan mediante la exposición de las células, tejido u órganos directamente a una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido o mediante la administración o contacto de una composición farmacéutica que contiene citocina recombinante protectora de tejido a la vasculatura del tejido u órgano. Una actividad incrementada de células respondedoras en el tejido u órgano tratado es responsable de los efectos positivos ejercidos. Como se describió arriba, la invención se basa, en parte, en el descubrimiento que las moléculas de eritropoyetina pueden ser transportadas a partir de la superficie luminal hacia la superficie de membrana de basamento de las células endoteliales de los capilares de órganos con uniones herméticas de células endoteliales, incluyendo, por ejemplo, cerebro, la retina y los testículos. Asi, células respondedoras a través de la barrera son blancos susceptibles para los efectos benéficos de una citocina recombinante protectora de tejido y otros tipos de células o tejidos u órganos que contienen y dependen en su totalidad o_ en parte de células respondedoras ahí son blancos para los métodos de la invención. Mientras no se desea limitar a ninguna teoría en particular, después de la transcitosis de una citocina recombinante protectora de tejido, la citocina recombinante protectora de tejido puede interactuar con un receptor para eritropoyetina en una célula respondedora, por ejemplo, célula neuronal, retinal, muscular, cardiaca, pulmonar, hepática, renal, del intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, endotelial capilar, de testículos, ovariana, de páncreas, de hueso, de piel, o célula endometrial, y enlace con receptor que iniciar una cascada de transduccíón de señales que resulta en la activación de un programa de expresión génica dentro de la célula o tejido respondedor, resultando en la protección de la célula o tejido, u órgano, contra daño, por ejemplo por toxinas, agentes quimioterapéuticos, terapia con radiaciones, hipoxia, etc. Así, métodos para proteger un tejido que contiene células respondedoras contra lesión o estrés hipóxico, y de incremento en la función de dicho tejido " se describen con detalles abajo. Como se indicó arriba, los métodos de la invención pueden aplicarse igualmente a seres humanos asi como a otros animales . En la práctica de una modalidad de la invención, un paciente mamífero está siendo sometido a la quimioterapia sistémica · para tratamiento de cáncer, incluyendo terapia con radiaciones, que tiene frecuentemente efectos adversos tales como daños a los nervios-, · pulmones, corazón, ovarios, o testículos. La administración de la composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba se efectúa antes y durante 'la quimioterapia y/o radioterapia con el objeto de proteger varios tejidos y órganos contra daño por el agente quimioterapéutico, como . por ejemplo para proteger los testículos. El tratamiento puede ser proseguido hasta que los niveles circulantes del agente quimioterapéutico hayan bajado por debajo de un nivel de peligro potencial para el cuerpo del mamífero. En la práctica de otra modalidad de la invención, se planea la cosecha de varios órganos de una víctima de un accidente de automóvil para transplante en varios receptores, algunos de los cuales requerían de transporte sobre una distancia amplia y un período de tiempo extenso. Antes de la cosecha de los órganos, la víctima fue infusada con una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aquí. Los órganos cosechados para su envase fueron perfusados con un perfusado que contiene una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aqui y almacenados en un baño que comprende una citocina recombinante protectora de tejido. Ciertos órganos fueron perfusados continuamente con un dispositivo de perfusión pulsátil, utilizando un perfusado que contiene una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con la presente invención. Se observa un deterioro mínimo de la función de los_ órganos durante el transporte y al efectuarse el implante . y reperfusión de los órganos in situ. En__ otra" modalidad de la invención, un procedimiento quirúrgico para preparar una válvula cardiaca requirió de una cardioplegia temporal y de oclusión arterial. Antes de la intervención quirúrgica, el paciente fue infusado con 4 µg de citocina recombinante protectora de tejido por kg de peso corporal. Dicho tratamiento evitó un daño celular isquémico hipóxico, especialmente después de uña reperfusión . En otra modalidad de la invención, en un procedimiento quirúrgico, como por ejemplo, en una intervención quirúrgica de desvío cardiopulmonar, una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención puede emplearse. En una modalidad, la administración de una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba se efectúa antes, durante, y/o despüés del procedimiento de desvio, con el objeto de proteger la función cerebral, cardiaca y de otros órganos. En los ejemplos antes mencionados en los cuales se utiliza una citocina recombinante protectora de tejido de .la presente invención para aplicaciones ex-vivo, o- para tratar células respondedoras como por ejemplo células de tejido neuronal, tejido retinal, corazón, pulmón, . igado, riñon, intestino delgado, corteza adrenal, médula adrenal, células endoteliales capilares, células de testículo, ovario o células de tejido endometriales, la invención ofrece una composición farmacéutica en una forma de dosificación unitaria abarcada para la protección o la mejora de células, tejido u órganos respondedores, distantes de la vasculatura que comprende, por unidad de dosificación, una cantidad no tóxica efectiva dentro de un rango de aproximadamente de 0.01 pg a 5 mg, de 1 pg a 5 mg, de 500pg a 5mg, de 1 ng 'a 5 mg, de 500 ng a 5 mg, de 1 a 5 mg, de 500 ]ig a 5 mg, o de 1 mg a 5 mg de una citocina recombinante protectora de tejido y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un modalidad preferida, la cantidad de citocina recombinante protectora de tejido está dentro de un rango de apro imadamente 1 ng a 5 mg. En una modalidad preferida, la citocina recombinante protectora de tejido de la composición mencionada arriba no es eritropoyética .

En un aspecto adicional de la invención, se encontró que la administración EPO restaura la función cognoscitiva en animales que han sido sometidos a trauma cerebral. Las citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención pueden tener los mismos efectos de protección celular que EPO. Después de - un retardo de 5 días o bien 30 días, EPO sigue capaz de restaurar la función en comparación con animales tratados en forma ficticia, lo que indica la capacidad de un EPO para regenerar o restaurar la actividad cerebral. Asi, la invención se enfoca también al uso de una citocina recombinante protectora de tejido para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trauma cerebral y otras disfunciones cognoscitivas, incluyendo el tratamiento mucho después de la lesión . (por ejemplo, tres días, cinco días, una semana, un mes, o más> . La invención se enfoca también a un método para el tratamiento de la disfunción cognoscitiva después de una lesión mediante la administración de una cantidad efectiva de una citocina recombinante protectora de tejido. Cualquier citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito aquí puede utilizarse para este aspecto de la invención. Además, este aspecto restorativo de la invención se enfooa al uso de cualquiera de las citocinas recombinantes protectoras de tejido para la preparación de una composición farmacéutica para la restauración de la disfunción celular, tisular o de órgano, en donde el tratamiento es iniciado después, y mucho después de la lesión inicial, responsable de la disfunción. Además, el tratamiento utilizando las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención puede abarcar el transcurso de la enfermedad o condición durante la fase aguda asi como una. fase crónica. En el caso en el cual una citocina recombinante protectora de tejido- de la invención tiene una actividad eritropoyética, en una modalidad preferida, la citocina recombinante protectora de tejido puede ser administrada sistémicamente en una dosificación comprendida entre aproximadamente 0.01 pg y aproximadamente 100 µg/kg peso corporal, preferentemente aproximadamente 1-50 µg/kg de peso corporal, con mayor preferencia aproximadamente 5-30 µ9/]^ de peso corporal, por administración. Esta dosis efectiva debe ser suficiente para lograr niveles séricos de citocina recombinante protectora de tejido mayor que aproximadamente 10,000, 15,000 ó 20,000 mU/ml de suero después de la administración de la citocina recombinante protectora de tejido. Tales niveles séricos pueden lograrse aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, ? , 8, 9 ó 10 horas después de la administración. Las dosificaciones pueden ser repetidas según lo necesario. Por ejemplo, la administración puede se repetida diariamente, si es clínicamente necesario, o después de un intervalo apropiado, por ejemplo, cada 1 a 12 semanas, pero preferentemente cada 1 a 3 semanas. En una modalidad, la cantidad efectiva de citocina recombinante protectora de tejido y un vehículo farmacéuticamente aceptable puede empacarse en un frasco para una sola dosis o bien en otro recipiente. En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido es útil para los propósitos aquí en una citocina no eritropoyética, es decir, que puede ejercer las actividades descritas aquí sin causar un incremento de la concentración de hemoglobina o del nivel de hematócritos . Dicha forma eritropoyética de una citocina recombinante protectora de tejido se prefiere en casos en los cuales los métodos de la presente invención se contemplan para proporcionarse crónicamente. En otra modalidad, una citocina recombinante protectora de tejido se administra en una dosis mayor que la dosis necesaria para estimular máximamente la eritropoyesis . Como se indicó arriba, una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención no tiene necesariamente una actividad eritropoyética, y por consiguiente, las dosis expresadas en unidades son simplemente ejemplos de citocinas recombinantes protectoras de tejido; arriba se proporcionan equivalentes molares para dosificaciones, que pueden aplicarse a cualquier citocina recombinante protectora de tejido. La presente invención se enfoca además a un método para facilitar' el transporte de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero mediante la administración de una composición que comprende la molécula particular en asociación con una citocina recombinante protectora dé tejido de conformidad con lo descrito arriba. Según lo descrito arriba, unas uniones herméticas entre células endoteliales en ciertos órganos del cuerpo crean una barrera a la entrada de ciertas moléculas- Para el tratamiento de varias condiciones dentro del órgano protegido por la barrera, es deseable contar con medios para facilitar el pasaje de agentes farmacéuticos . Una citocina recombinante protectora de tejido de la invención es útil como vehículo para suministrar otras moléculas a través de la barrera hematoencefálica y a través de otras barreras semejantes. Se prepara una composición que ' comprende una molécula que se desea pase a través de la barrera con una citocina recombinante protectora de tejido, y la administración periférica de la composición resulta en la transcitosis de la composición a través de la barrera. La asociación entre la molécula a transportar a través de la barrera y la citocina recombinante protectora de tejido puede ser un enlace covalente lábil, en cuyo caso la molécula es liberada de asociación con la citocina recombinante protectora de tejido después de atravesar la barrera. Si la actividad farmacológica deseada de la molécula es mantenida o no afectada 'por la asociación con la citocina recombinante protectora de tejido, se puede administrar un complejo de este tipo. La persona con conocimientos en la materia conocerá varios medios para asociar moléculas con una citocina recombinante protectora de tejido de la invención y los demás agentes descritos arriba, por medios covalentes, no covalentes, y por otros medios; además, la evaluación de la eficacia de la composición puede ser dictaminada fácilmente en un sistema experimental. La asociación de moléculas con una citocina recombinante protectora de tejido puede lograrse a través de varios medios, incluyendo enlace covalente, lábil, reticulación, etc. Las interacciones biotina/avidina pueden emplearse. Como se mencionó arriba, una molécula híbrida puede prepararse por medios recombinantes o sintéticos, por ejemplo, incluyen tanto el dominio de la molécula con actividad farmacológica deseada como el dominio responsable de la modulación ' de la actividad de receptor para eritropoyetina . Una molécula puede ser conjugada con una citocina recombinante protectora de tejido ' a través de una molécula polifuncional, por ejemplo, un reticular polifuncional . Como se emplea, el término "molécula po1 -¾funcional" abarca moléculas que tienen un grupo funcional que puede reaccionar más de una. vez sucesivamente, como por ejemplo formaldehído, así como 'moléculas con más de un grupo reactivo. Como se 135 emplea aquí, el término "grupo reactivo" se refiere a un grupo funcional en el agente de reticulación que reacciona con un grupo funcional en una molécula (por ejemplo, péptido, proteína, carbohidrato, ácido nucleico, particularmente una hormona, antibiótico o agente anti-cáncer para su administración a través de una barrera de células endoteliales ) con el objeto de formar un enlace covalente entre el agente de reticulación y esta molécula. El término "grupo funcional" conserva su significado estándar en química orgánica. Las moléculas polifuncionales que pueden utilizarse son preferentemente enlazadores biocompatibles, es decir, son moléculas que no son carcinogénicas, no son tóxicas, y sustancialmeñte no son inmunogénicas in vivo. Agentes polifuncionales tales como los conocidos en la técnica y descritos aquí pueden ser probados fácilmente en modelos de animal con el objeto de determinar su biocompatibilidad. La molécula polifuncional es preferentemente bifuncional. Como se emplea aquí, el término "molécula bifuncional" se refiere a una molécula con dos grupos reactivos. La molécula-bifuncional puede ser heterobifuncional y homobifuncional. Un agente de reticulación heterobifuncional permite una configuración vectorial. Se prefiere particularmente que la molécula polifuncional sea suficientemente soluble en agua para que ocurran las reacciones de reticulación en soluciones acuosas cómo por ejemplo en soluciones acuosas amortiguadas a pH 6 a 8, y para que el conjugado resultante permanezca soluble en agua para una bio-distribució'n más efectiva. Típicamente, la molécula polifuncional se enlaza covalentemente con un grupo funcional amino o un grupo funcional sulfhidrilo. Sin embargo, moléculas polifuncionales reactivas con otros grupos polifuncionales como por ejemplo, ácidos carboxílicos o grupos hidroxilo se' contemplan dentro del marco de la' presente invención. Las moléculas homobifuncionales tienen por lo menos dos grupos funcionales reactivos, que son los mismos. Los grupos funcionales reactivos en una molécula homobifuncional incluyen, por ejemplo, grupos aldehido y grupos éster activos. Las moléculas homobifuncionales que tienen grupos aldehido incluyen, por ejemplo, glutaraldehído y subaraldehído . El uso de glutaraldehído como agente de reticulación fue divulgado por Poznansky y colaboradores, Science 223, 1304-1306(1984). Moléculas homobifuncionales que tienen por lo menos dos unidades de éster activas incluyen ésteres de ácidos dicarboxílieos y N-hidroxisuccinimida . Algunos ejemplos de tales ésteres ' N-succinimidilo incluyen suberato de disuccinimidilo y ditio-bis- (prdpionato de succinimidilo) , y sus sales solubles de ácido bis-sulfónico y bls-sulfonato tales como sales de sodio y potasio. Estos reactivos homobifuncionales están disponibles en numerosas fuentes comerciales (Pierce, Rockford, Illinois) .

Las moléculas heterobifuncionales tienen por lo menos dos grupos reactivos diferentes. Los grupos reactivos reaccionan con grupos funcionales diferentes, por ejemplo, presentes en la muteina de eritropoyetina y la molécula. Estos dos grupos funcionales diferentes que reaccionan, con el grupo reactivo en el agente de reticulación heterobifuncional son habitualmente un grupo amino, por ejemplo, el grupo amino epsilon 'de lisina, un grupo sulfhidrilo, por ejemplo, el grupo tiol de cisteina; un ácido carboxílico, por ejemplo, el carboxilado en ácido aspártico; o un grupo hidroxilo, por ejemplo, el grupo hidroxilo en serina. Evidentemente, citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención pueden no tener un residuo de aminoácido particular que podría facilitar la reticulación de eritropoyetina, pero una persona con conocimientos en la materia estará conciente de las porciones de residuos disponibles en una muteina de la invención y de la reticulación correspondiente. Además, las varias moléculas de citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención pueden no tener grupos reactivos adecuados disponibles para su uso cori ciertos agentes de reticulación; sin embargo, una persona con •conocimientos en la materia tendrá conocimiento amplio de la elección de agentes de reticulación con base en los grupos disponibles para reticulación en una eritropoyetina de la invención.

Cuando un grupo reactivo de una molécula eterobifuncional forma un enlace covalente con un grupo amino, el enlace cpvalente será abitualmente un enlace amido o imido. El grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo amino, puede ser por ejemplo, un grupo carboxilato activado, un grupo halocarbonilo, o un grupo éster. El grupo halocarbonilo preferido es un grupo clorocarbonilo . Los grupos éster son preferentemente grupos éster reactivos como por ejemplo, un grupo éster de N-hidroxi-succinimida . El otro grupo funcional es típicamente ya sea un grupo tiol, un grupo capaz de ser convertido en un grupo tiol, o un grupo c[ue forma un enlace covalente con un grupo tiol. El enlace covalente será habitualmente un enlace tioéter o un disulfuro. El grupo reactivó que forma un enlace covalente con un grupo tiol puede, por ejemplo, ser un enlace doble que reacciona con grupos tiol, o un disulfuro activado. Un grupo reactivo que contiene un enlace doble capaz de reaccionar con un grupo tiol es el grupo maleimido, aún cuando otros, como por ejemplo acrilonitrilo, son también posibles.. Un grupo disulfuro reactivo puede ser por ejemplo, un grupo 2-piridilditio o un grupo 5, 5' -ditio-bis-ácido- (2-nitrobenzoico) . Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales qué contienen enlaces disulfuro reactivos incluyen 3- (2-piridil-ditio) propionato de N-succinimidilo (Carlssoñ; y colaboradores, 1978, Biochem. J. , 173:723-737), 139 S-4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metilbencilt'iosulfato de sodio, y 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil (2-piridilditio) tolueno . Se prefiere 3- (2-piridilditio) propionato N-succinimidilo . Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales comprenden grupos reactivos que tienen un enlace doble que reacciona con un grupo tiol incluyen 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidiio y m-inaleimidobenzoato de succinimidiio. Otras moléculas heterobifuncionales incluyen 3-(maleimido) propionato de succinimidiio, 4- (p-maleimido-fenil) butirato de sulfosuccinimidilo, 4- (N-maleimidoiaetil-ciciohexanó) -1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, 'éster de maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida . La sal de sulfonato de sodio de m-maleimidobenzoato de succinimidiio se prefiere. Muchos de los reactivos heterobifuncionales mencionados arriba y sus sales de sulfonato están disponibles en Pierce Chemical Co . , Rockford, Illinois EUA. La necesidad de que los conjugados descritos arriba sean reversibles o lábiles puede ser fácilmente determinada por la persona con conocimientos en la materia. Un conjugado puede ser probado in vitro tanto para la actividad de citocina recombinante protectora de tejido como -para la actividad farmacológica deseable. Si el conjugado conserva ambas propiedades, su carácter adecuado puede ser probado in vivo. Si la molécula conjugada requiere de separación de la citocina recombinante protectora de tejido para actividad, un enlace lábil o una asociación reversible con la citocina recombinante protectora de tejido se prefiere. Las características de labilidad pueden también ser probadas empleando procedimientos estándares in vitro antes de la prueba in vivo. Información- adicional en cuanto a cómo preparar y utilizar estos reactivos así como otros reactivos polifuncionales pueden obtenerse a partir de las publicaciones siguientes o partir de otras publicaciones disponibles en la técnica: 1. Carlsson, J. y colaboradores., 1978, Biochem. J. 173:723-737. 2. Cumber, J. A. y colaboradores., 1985, Methods in Enzymology 112:207-224, 3. Jue, R. ' et al., 1978, Biochem 17:5399-5405. 4. Sun, T.T. et al., 1974, Biochem. 13:2334-2340. 5. Blattler, W.A. et al., 1985, Biochem. 24:1517 -152. 6. Liu, F.T., et al., 1979, Biochem. 18:690-697. 7. Youle, R. J. and Neville, D.M. Jr., 1980, Proc. ati. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486. 8. Lerner, R.A. et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 78:3403-3407. 9. Jung, S.M. and Moroi, M. 1983, Biochem. Biophys . Acta 761-162. lO.Caufield, M.P. et al., 1984, Biochem. 81:7772-7776. ll.Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955. 12. Yoshitake, S.- et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101:395- 399. 13. Yoshitake, S. et al., 1982, J. Biochem. 92:1413-1424. 14.Pilch, P.F. and Czech, M.P., 1979, J. Biol . Chem. 254- 3375-3381. 15. Novick, D. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487. 16. Lomant, a.J. and Fairbanks, G., 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261. 17.Hamada, H. and Tsuruo, T., 1987, 7Anal . Biochem. 160:483-488. 18.Hashida, S. et al., 1984, J. Applied Biochem, 6:56-63. Además, métodos de reticulación están reseñados por Means y Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12. Las barreras atravesadas por los métodos y composiciones descritos arriba de · la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, la barrera hemato encefálica la barrera hemato ocular, la barrera hemato testicular, la barrera hemato ovariana, la barrera hemato cardiaca, la barrera hemato renal, y la barrera hemato uterina. Las moléculas candidatos para transporte a través de una barrera de células endoteliales incluyen, por ejemplo, hormonas tales como hormona de crecimiento, factores neurotróficos, antibióticos, antivirales o antifungales tales como los normalmente excluidos del cerebro y de otros órganos coñ barrera, radiofarmacéuticos peptídicos, fármacos de antisentido, anticuerpos y antivirales contra agentes biológicamente activos, f rmacéuticos y agentes anti-cáncer. Ejemplos no limitativos de tales moléculas incluyen hormonas tales como hormona de crecimiento, factor de crecimiento de nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , factor neurotrófico ciliar- (CNTF) , factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) , factor de crecimiento transformante ß? (TGF|51), factor de crecimiento transformante ß2· {TGF&2) , factor de crecimiento transformante ß3 {TGF>3) , interleucina 1, interleucina 2, interleucina 3, e interleucina 6, AZT, anticuerpos contra factor de necrosis tumoral y agentes inmunosupresivos como por ejemplo ciclosporina . Además, colorantes o marcadores pueden estar fijados sobre la eritropoyetina o una de las citocinas protectoras de tejido de la presente invención con el objeto de visualizar células, te idos y órganos dentro del cerebro y otros órganos con barrera para propósitos de diagnóstico. Como ejemplo, un marcador utilizado para visualizar placa en el cerebro podría adjuntarse a la eritropoyetina o una citocina protectora de tejido con el objeto de determinar el avance de la -enfermedad de Alzheimer en un paciente. La presente invención se enfoca también a una composición que comprende una molécula que debe ser transportada por medio de transcitosis a través de una barrera de unión hermética de células endoteliales y una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba. La invención se refiere también al uso de un conjugado entre una molécula y una citocina recombinante protectora de tejido de conformidad con lo descrito arriba para la preparación de una preparación farmacéutica para la administración de la molécula a través de! una barrera de conformidad con lo descrito arriba. La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos que se proporcionan como ejemplos de la invención. Los siguientes ejemplos se pr.esentan con el objeto de ilustrar más cabalmente las modalidades preferidas de la invención. No deben considerarse de ninguna manera como limitativos del alcance amplio de la invención. 6. EJEMPLOS 6.1. EJEMPLO 1: DISTRIBUCIÓN DE RECEPTOR PARA ERI ROPOYE INA EN CEREBRO HUMANO Cerebros humanos normales removidos . ' durante procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, para proporcionar márgenes libres de tumor en resecciones tumorales) fueron inmediatamente fijados en acroleina al 5% en amortiguador de fosfato 0.1 M (pH 7.4) durante 3 horas. Las secciones fueron cortadas con un microtomo vibrante a un espesor de 40 micrómetros . Se efectuó una tinción inmunohistoquimica utilizando secciones de flotación' libre y método de anticuerpo peroxidasa antiperoxidasa indirecto utilizando una dilución 1:500 de antisuero de receptor para eritropoyetina (obtenido en Santa Cruz Biotechnology) . La actividad peroxidasa endógena fue apagada por pre-tratamiento de la sección de te ido con peróxido de hidrógeno (3% en metanol durante 30 minutos) . Se efectuaron también controles tisulares mediante la omisión de anticuerpo -primario y mediante la utilización del péptido de bloqueo apropiado (de Santa Cruz Biotech.) para confirmar que la tinción era especifica para el receptor de eritropoyetina (EPO) . La Figura 1 muestra que capilares del cerebro humano expresan niveles muy altos de receptor de EPO, de conformidad con lo determinado por inmunohistoquimica utilizando anticuerpos específicos anti-receptor EPO. Esto ofrece un mecanismo a través del cual EPO puede penetrar en- el cerebro a partir de la circulación sistémica, a pesar de la barrera hemato encefálica. La Figura 2 muestra que el receptor de EPO se localiza densamente dentro de los capilares y alrededor de los capilares que forman la barrera hemato encefálica en el cerebro humano . -j Un protocolo similar como en el caso de las Figuras 1 y 2 fue efectuado en el caso de la Figura 3, excepto que se cortaron secciones' de 10 micrómetros a partir de parafina, las secciones integradas fueron fijadas por inmersión en paraformaldehido al 4%.· La Figura 3 muestra que existe la necesidad alta de receptor para EPO en las superficies luminales y anti-luminales de los capilares de cerebro humano, que forman la base anatómica para el transporte de EPO a través de la circulación hacia el cerebro.' La Figura 4 fue obtenida siguiendo un protocolo similar al caso de la Figura 3, excepto que el tejido fue cortado, en un ultramicrotomo para microscopía electrónica y el anticuerpo secundario fue marcado con partículas de oro coloidal. Esta figura muestra que el receptor de EPO se encuentra en la superficie endotelial (*), dentro de vesículas-- citoplásmicas (flechas) y una protuberancia de extremo glial (+) en el cerebro humano, proporcionando la base anatómica para el transporte de EPO desde la circulación hacia el cerebro. 6.2. EJEMPLO 2: LA ERITROPOYETINA ATRAVIESA LA BARRERA HERMÉTICA SANGRE-FLUIDO CE EBROESPINAL Ratas Sprague-Dawley adultas, machos, fueron anestesiadas y recibieron intraperitonealmente erítropoyetina humana recombinante a razón de 5000 U/kg de peso corporal. El fluido cerebroespinal fue muestreado a partir de la cisterna magna a intervalos de 30 minutos durante un período de 4 horas y se determinó la concentración de erítropoyetina utilizando un inmunoensayo enlazado a enzima específico y sensible. Como se ilustra en la Figura 5, la concentración de erítropoyetina de línea basal en el fluido cerebroespinal es de 8 raU/ml. Después' de un retardo de varias horas, los niveles de eritropoyetina medidos en el fluido cerebroespinal empiezan a elevarse y a las 2.5 horas y después dichos niveles son significativamente diferentes de la concentración de línea basal en el nivel p<0.01. El nivel pico de aproximadamente 100 mU/ml se encuentra dentro del rango conocido por ejercer efectos protectores in vítro (0.1 a 100 mU/ml)". El tiempo hasta el pico ocurre a aproximadamente 3.5 horas, lo que es retardado ' significati amente en comparación con los niveles séricos picos que ocurren en menos de 1 hora. Los resultados de este experimento ilustran que niveles significativos de eritropoyetina pueden lograrse a través de una unión celular hermética por la administración parenteral de bolos de eritropoyetina en concentraciones apropiadas. 6.3 EJEMPLO 3: CITOSINA RECOMBINANTE PROTECTORA DE TEJIDO Los siguientes constructos de eritropoyetina humana fueron elaborados empleando los procedimientos siguientes. El ADNc para la eritroproyetina humana fue clonado por reacción en cadena de polimerasa a partir de ADNc de cerebro humano mediante la utilización de cebadores basados en la secuencia de ADNc de ser humano publicada (número de acceso NM_000799) . Los cebadores fueron diseñados para introducir un sitio Xho I en el extremo 5' y un sitio Xba I en el extremo 3' del ADNc. Las secuencias de cebadores son: ????-5-Xho I 5'-AGCTCTCGAGGCGCGGAGATGGGGGTGCACGAATG-3' (SEQ. ID. 8) ????-3-Xba I 5'-ATGCTCTAGACACACCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3' (SEQ. ID. 9).

El producto de reacción en cadena de polimerasa fue clonado entre los sitios X o I y Xba I en vector de expresión pCiNeo (Promega) . Los clones fueron secuenciados y la secuencia fue verificada para corresponder a la secuencia en NM_000799 a excepción de una sola base. La base 418 en la secuencia codificadora (empezando la numeración a partir de ATG) fue C en lugar de G> cambiando el aminoácido 140 en la secuencia EPO de~ longitud compieza empezando a partir de la primera metionina de ¾rg a G-ly. sin embargo, se trata de una variación de secuencia normal a partir de la secuencia original y se observa en la mayoría de las formas de eritropoyetina . La secuencia codificadora a partir del ADNc de eritropoyetina se presenta a continuación: ATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCT GTCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGA CAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCA CGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCT GAATGAGAATATCACTGTCCCAGACA CCAAAGTTAATTTCrATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTA GAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGC CCTGTTGGTCAACTCT CCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCACTGCATGTGGATAAA 193 GCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG AAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATC ACTGCTGACACTTTCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAA AGCTGAAGCTGJACACAGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATGA (SEQ ID- NO: 7).

Este ADNc codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa de eritropoyetina, que se ofrece a continuación MGVHECPAWLWL1I£I SI^ TTGCAEHCSI_l ÍE]SniYPDTKyN^ AWIIOvlEVGí^AVEVWQGLAll EAVLJlGQA LLVNSSQPWEPLQLH^KAVSGLRSLTTLI-RALGAQ TI¾KIJ¾WSNETLRG L LYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 10).

Los primeros 27 residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 comprenden una secuencia líder. Su etiqueta 6xHis fue introducida en el extremo C-terminal de la proteína de EPO de ser humar.o mediante el diseño de nuevo oligonucleótido de tal manera que las 6 histidinas estuvieran unidas en el Asp 192 en la secuencia de longitud completa utilizando el oligonucleótido siguiente: 3'-6xhis- hEP05'- GGTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-31 (SEQ ID NO-.134) El ADNc de EPO fue amplificado por reacción en cadena de -, · ' · polimerasa empleando el ciigo ????-5-Xho I y el oligo 6xHis- Tag y clonado entre los sitios Xho I y Xba I en el vector de expresión de mamífero en pCiNeo. El inserto fue secuenciado otra vez y se verificó la secuencia. Las mutaciones descritas arriba en la sección 5.2 en la secuencia de ADNc de EPO de ser humano con una etiqueta 6xHis C-terminal, fueron introducidas por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos utilizando los oligonucleótidos descritos en esta sección. Clones imitantes fueron secuenciados para confirmar las mutaciones. Numerosos métodos para la purificación de citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención pueden emplearse, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, el protocolo siguiente que fue utilizado en combinación con unas citocinas protectoras de tejido expresadas recombinantemente marcadas con histidina de la invención. El sobrenadante de células recombinantes (CH0-K1) ' (por ejemplo, resina de (Ni-CAM HC RESIN: Matriz de Afinidad de Quelato de Níquel de Alta Capacidad, Sigma, número de Catalogo N 3158) ) fue resuspendido Completamente con inversión suave. Después, se agregaron 100 µ? de suspensión de resina (equivalente a 50 µ? de resina empacada) a un tubo de microcentrifugación (tamaño 1.7 mi) . La mezcla fue sometida a centrifugación de 8,000 revoluciones por minuto a una temperatura de 4°C durante 5 minutos para formar la resina en pellas y después el sobrenadante fue desechado. La . microcentrifugadora fue Megafuge 1.0R (Heraeus Instruments). Las mezcla fue lavada dos veces con 1 mi de agua desionizada (filtración: 0.2 um) con el objeto de remover el etanol. La resina fue resuspendida en 500 µ? de amortiguador de equilibración (fosfato de sodio 50mM, pH 8.0, NaCl 0.3M, imidazol lOmM) , y después la mezcla fue transferida a un tubo cónico de 50 mi. El tubo de microcentrifugación fue enjuagado con 500 µ? de amortiguador de equilibración y después se agregó esta cantidad a la mezcla en un tubo cónico de 50 mi. La mezcla fue sometida a centrifugación e 3,000 revoluciones por minuto a 4°C durante 5 minutos para formar la resina en pellas. El sobrenadante fue removido y - desechado. Las muestras - (sobrenadante CHO- I) fueron centrifugadas -a 3,800 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos antes del enlace. El sobrenadante de células fue agregado a la resina. El amortiguador de adición a la muestra (fosfato de sodio -50mM, pH 8.0, NaCl 3M, imidazol lOOmM) fue ¦ agregado a IX, y mezclado suavemente en una plataforma rotatoria durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Un' ejemplo de una plataforma de este tipo que se utilizó es Nutator (plataforma rotatoria) (CLa Adams Grand) . La mezcla fue centrifugada a 3,000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos. 'El sobrenadante fue removido y guardado para análisis SDS-PAGE y ELISA (no unido) . La resina fue resuspendida en 500 µ? de amortiguador de lavado y después la muestra fue transferida a un tubo de microcentrifugación. El tubo cónico de 50 mi fue enjuagado con 500 µ? de amortiguador- de equilibración, y después esta cantidad fue agregada a la mezcla en _ el tubo de microcentrifugación. La suspensión de resina fue después mezclada en una plataforma rotatoria durante 10 minutos a 4°C. La suspensión fue centrifugada a 8,000 revoluciones por minuto, a 4°C durante 5 minutos (el primer lavado fue guardado para ELISA) . La resina fue resuspendida en 1 mi de amortiguador de lavado y la suspensión de resina fue mezclada otra vez en una plataforma rotatoria durante 10 minutos a una temperatura de 4°C, para lavar la resina una vez más. El lavado fue desechado. ' Después, se agregaron 75 µ? de amortiguador de elusión (fosfato de sodio 50mM, pH 8.0, NaCl 0.3M, imidazol 500mM) . La tesina fue mezclada en una plataforma rotatoria durante 10 minutos, a 4°C. La mezcla fue centrifugada a 8,000 revoluciones por minuto, a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante fue removido y guardado. La proteína marcada con histidina estuvo en esta fracción. Para eluir más proteína/ se agregaron otra vez 75 µ? de amortiguador de elusión (fosfato de sodio 50mM, pH 8.0, NaCl 0.3M, imidazol 500mM) . La resina fue mezclada otra vez en una plataforma rotatoria durante 10 minutos a 4°C. La mezcla fue centrifugada otra vez a 8,000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos. Las fracciones eluidas fueron conservadas en un solo conjunto o bien como fracciones separadas".

Alternativamente, se utilizó el procedimiento siguiente para aislar citocinas etiquetadas con histidina. El medio acondicionado fue recogido y filtrado a través de 0.45 um. Una alícuota de 50 mi fue después aplicada a un elemento de quelación HiTrap 5 mi (Amersham biosciences ) equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 7.4, y activado con 12.5 mi de NiS04 100 mM. La columna fue lavada con fosfato de sodio, 20 mM, pH 7.4 y eluida con un gradiente de imidazol de 0 M a 0.5 M en fosfato de sodio 20 M, pH 7.4 en 25 volúmenes de columna. El flujo fue de 5 ml/minuto y el tamaño de las fracciones de 5 mi. Fracciones fueron analizadas para determinar la presencia de citocina recombinante protectora de tejido por SDS-PAGE y EPO ELISA. Las fracciones' positivas fueron combinadas contra Tris 10 mM, pH 7.0. La combinación fue aplicada a 1 mi de HiTrap Q HP (Amersham biosciences) equilibrada con Tris 10 mM, pH 7.0. Después de lavar con -amortiguador de equilibración, la muestra fue eluida con un gradiente de NaCl a 0.5 M en 10 volúmenes de columna a un flujo de 1 ml/minuto. Fracciones de 1 mi fueron recogidas y analizadas por SDS-PAGE, EPO ELISA y "Western blot" utilizando anticuerpos contra marcador hexa-his (Anti-His6, ROCHE) . Las -fracciones que contenían la citocina recombinante protectora de tejido fueron combinadas y concentradas empleando un Centricon con un tamaño de corte de 10 kDa ' (Amicon) a un volumen final do 1-2 mi.

La combinación final de citocina recombinante protectora de tejido fue analizado por SD-PAGE (NuPage 4-12%; Invitrogen) y visualizada empleando NOVEX Colloidal Blue (Invitrogen) mediante el protocolo recomendado por el fabricante. La pureza de la citocina recombinante protectora de tejido fue evaluada a partir del gel resultante. Solamente una banda correspondiente a la citocina recombinante protectora de tejido glicosilada estuvo presente en cada una de las lineas del gel indicando una alta pureza de la citocina aislada. Todos los plásmidos fueron transíectados ya sea a células CHO-1 o bien a células COS-7 mediante la utilización de lipofectamina . De cuarenta y ocho horas a 72 horas después de la transfección el medio de las células fue recogido. Este medio fue probado para EPO con ensayo ELISA y utilizado ya sea directamente o después de purificación en ensayo hematopoyético o en ensayo neuronal . Las mutaciones 45D, S100E, y A30N/H32T en la secuencia de ADNc de EPO de ser humano fueron introducidas por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos empleando los oligonucleótidos siguientes : HEPO-SlOOE-superior 5'- CATGTGGATAAAGCCGTCGAGGGCCTTCGCAGCCTCACr- CTCTG-3' (SEQID | NO: 11) ! HEPO-SlOOE-inferior 5'- CAGAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCCTCGACGGCTTTATCCACATG-3' (SEQ ID NO: 12) HEPO-K45D-superior 5'- GAGAATATCACTGTCCCAGAC CCGACGTTAATI CTATGCCTGG-3' (SEQ ID NO: 13) HEPO-K45D-inferior 5'- CCAGGCATAGAAATTAACGTCGGTGTCTGGGACAGTGATATTC C-3' (SEQ ID NO: 14) hEPO-A30N/H32t-superior 5'- GAATATCACGACGXJGCTGTAATGAAACCTGCAGCTTGAATGAG-3' (SEQ ID NO: 132) hEPO-A30N/H32T-iriferior 5'- CTCATTCAAGCTGCAGGTTTCATTACAGCCCGTCGTGATATTC-3' (SEQ ID NO: 133) Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para las otras proteínas de eritropoyetina y citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención incluyen: Para la muteína R150E: R150E-F GTCTACTCCAATTTCCTCGAGGGAAAGCTGAAGCTG, (SEQ ID NO: 120) R150E-R GCTTCAGCTÍTCCCTCGAGGAAATTGGAGTAGAC (SEQ ID NO: 121) Para la muteína R103E: R103E-F CCGTCAGTGGCC TGAGAGCCTCACCACTCTG, (SEQ ID NO: 122) R103E-R CÁGAGTGGTGAGGCTCTCAAGGCCACTGACGG (SEQ LD NO: 123) Para la muteina de combinación R103E/L108S (103) R103E-F CCGTCAGTGGCCTTGAGAGCCTCACCACTCTG (SEQ ID NO: 124) R103E-R CAGAGTGGTGAGGCTCTCAAGGCCACTGACGG (SEQ ID NO: 125) L108S(103)F CGCAGCCTCACCAGT CGCITCGGGCTCTGG, (SEQ ID NO: 126) L108S(103)R CCAGAGCCCGAAGCGAAGTGGTGAGGCTGCG (SEQ LD NO: 127) Para la deleción 44-49 d44-49F GAATATCACTGTCCCAGACGGTGGTGCCTGGAAGAGGATG, (SEQ LD NO: 128) d44-49R CATCCTCTTCCAGGCACCACCGTCTGGGACAGTGATATTC (SEQ ID NO: 129) Para la muteina K20A: .

K20A-F TACCTCTTGGAGGCCGCGGAGGCCGAGAATATC, (SEQ ID NO: 0) K20A-R GÁTATTCTCGGCCTCCGCGGCCTCCAAGAGGTA (SEQLD NO: 131) Para la muteina K140A: 140A-F GCTGACACTrrCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC, (SEQ ID NO: 132) K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC (SEQ ID NO: 133) Para la muteina 152A: 152A-F AT CCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG, (SEQ LD NO: 134) K152A-R CTGTGTACAGCrrCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT (SEQ ID NO: 135) Para la muteina ?G54?: K154A-F CTCCGGGGAAAGCTGGCGCTGTACACAGGGGA, (SEQ ID NO: 136) K154A-R TCCCCTGTGTACAGCGCCAGCTTTCCCCGGAG (SEQ ID NO: 137) Para la muteina · ?45?: K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAAnTCTATGCCTG, (SEQ ID NO: 138) K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT (SEQ LD NO: 139) Para la muteina K52A: K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG, (SEQ ? NO: 140) K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: WD Para la muteína K97A: K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ ID NO: 142) K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQ ID NO: 143) Para la muteina K116A: K116A-F CTCTGGGAGCCCAGGCGGAAGCCATCTCCCCT, (SEQ ID NO: 144) K116A-R AGGGGAGATGGCTTCCGCCTGGGCTCCCAGAG (SEQ ID NO:. 45) Para la mureína de combinación K140A/K52A: K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC, (SEQ ID NO: 146) 140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC (SEQ ID NO: 147) 52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG, (SEQ ID NO: 14g) K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: 149) Para la muteína de combinación K140A/K52A/K45A: 140A-F GCTGAC1ACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC, (SEQ ID NO: 150) 140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC (SEQ ID NO: 151) 52A-F AGTTAATrrCTATGCC GGGCGAGGATGGAGGTCG, (SEQ ID NO: 152) ' K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: 153) l n K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCrATGCCTG, (SEQ ID NO: 154) K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT (SEQ JD NO: 155) Para la-muteina de combinación K97A/K152A: 15 K57A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ LD NO: 156) K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQ ID NO: 157) 0 l 52A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTAC AC AG, (SEQ ID NO: 158) 152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT (SEQ ID NO: ) Para la muteína de combinación K97A/ 152A/ 45A: K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ ID NO: 160) K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQ ID NO: 161) K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG, (SEQ ID NO: 164) - K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACÁGT (SEQ ID NO: 165) · ' " .

Para la muteina de combinación K97A/K152A/K45A/K52A: K 7A-F TGCAGCTGGATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ ID NO: 166) : K 7A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQ ID NO: 167) K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGC GTACACAG, (SEQ ID NO: 168) K152A- CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT (SEQ ID NO: 169) K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG, (SEQ ID NO: 170) K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT (SEQ ID NO: 171) 52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG, (SEQ ID NO: 172) • K52A- CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: 173) Para 1a muteína de combinación K97A/K152A/K45A/K52A/K1 0A: K 7A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ ID NO: 174) K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQID NO: 175) 152A-F ATTrCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG, (SEQ LD NO: 176 152A-B. CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT (SEQ ID NO: 177) 1 K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAAT TCTATGCCTG, (SEQ ID NO: 178) 45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT (SEQ ID NO: 179) K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG, (SBQ ID NO: 180) K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: 181) K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC, (SEQ ID NO: 182) K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC (SEQ ID - NO: 183) Para la muteina de combinación K97A/K152A/K45A/K52A/K140Á/K154A : 97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC, (SEQ ID NO: 184) K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA (SEQ ID NO: 185) K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG, (SEQ ID NO: 185) ! K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT (SEQ ID NO: 187) 45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG, (SEQ ID NO: 188) l o ' K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT (SEQ ID NO: 189) 52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG, (SEQ ID NO: 190) 52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT (SEQ ID NO: 20 191) K140A-F GCTGACACT TCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC, (SEQ ID NO: 192) K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC (SEQ ID NO: 193) 5 K154Á(152)F CTCCGGGGAGCGCTGGCGCTGTACACAGGGGA, (SEQ LO NO: 194) 154(152)R TCCCCTGTGTACAGCGCCAGCGCTCCCCGGAG (SEQ ID NO: < 195) Para la muteína de combinación N24K/N38K/N83K: N24 -F CAAGGAGGCCGAGAAAATCACGACGGGCTGT,^(SEQID O: 196) N24 -R ACAGCCCGTCGTGATTTTCTCGGCCTCCTTG (SEQ ID NO: 197) N38K-F ACTGCAGCTTGAATGAGAAAATCACTGTCCCAGACAC, (SEQ ID NO: 198) N38K-R GTGTCTGGGACAGTGATT TCTCATTCAAGCTGCAGT (SEQ ID NO: 199) N83K-F AGGCCCTGTTGGTCAAATCTTCCCAGCCGTG, (SEQ ID NO: 200) N83 -R CACGGCTGGGAAGATTTGACCAACAGGGCCT (SEQ ID NO: 201) Para la muteína K152W: K1152W-F ATTTCCTCCGGGGATGGCTGAAGCTGTACACAG, (SEQ ID NO: 202) K152W-R CTGTGTACAGCTTCAGCCATCCCCGGAGGAAAT (SEQ H> NO: 203) Para la muteína de combinación R14A/Y15A: RY14AA-F AGCCGAGTCCTGGAGGCGGCCCTCTTGGAGGCCAA, (SEQ ID NO: 204) RY14AA-RTTGGCCTCCAAGAGGGCCGCCTCCAGGACTCGGCT (SEQ ID NO: 205) Y15A-F AGCCGAGTCCTGGAGAGGGCCCTCTTGGAGGCCAA (SEQ ID NO: 206) Y15A-R TTGGCCTCCAAGAGGGCCCTCTCCAGGACTCGGCT (SEQ ID NO: / 207) ' A continuación se presentan ejemplos de constructos que fueron elaborados: secuencia de EPO de ser humano (hEPO)-6xHisTag-pCiNeo (SEQ ID NO: 208); hEPO6xPO6xHisTag-A30N/H32T-pCiNeo (SEQ ID NO: 209); secuencia hEPO-6xHisTag-K45D-pCiNeo secuencia (SEQ ID NO: 210); secuencia hEPO-6xHisTag-S100E-pCiNeo secuencia (SEQ ID NO: 211) ; y secuencia hEPO-6xHisTag-K45DiNeo secuencia (SEQ ID NO: 212). El vector de expresión de mamífero pCI-neo lleva la región realzadora/promotora temprana inmediata de citomegalovirus_ (CMV) · para promover la expresión constitutiva de insertos de ADN clonado en células de mamífero. Estos oligcnucleótidos fueron fusionados con el clon de ADNc de eritropoyetina de ser humano original en pCiNeo para introducir las mutaciones . Los clones mutantes fueron secuenciados para confirmar las mutaciones. Todos los plásmidos ' fueron transfectados en células CHO-1 o bien en células CCS-7 mediante la utilización de lipofectamina . Dentro de un rango de 48 a 72 horas después de transfección el medio de las células fue recogido. Este medio fue probado para eritropoyetina empleando ELISA y utilizado directamente o después de purificación ya sea en ensayo hematopoyético o ensayo neuronal .

Posteriormente, ambas citocinas recombinantes protectoras de tejido K45D y S100E fueron probadas dentro de un ensayo neuronal . Específicamente, un ensayo de neuroproteccion in vitro utilizando células de neuroblastoma SK-N-SH fue utilizado. Las células SK-N-SH fueron colocadas en platos a una densidad de 40,000 células/pozo en platos de 24 pozos durante 24 horas. Después citocinas recombinantes protectoras de tejido fueron agregadas a una concentración de 3nM durante 24 horas adicionales (Eritropoyetina = preparación comercial; EPO = eritropoyetina y citocinas recombinantes protectoras de tejido expresadas en células CHO; vector puro = sobrenadante celular de células CHO transíectadas con vector sin constructo Epo) . Después de preincubación, las células fueron expuestas a rotenona (5 µ; ) durante 4 horas, lavadas, dejadas para recuperación durante 24 horas. Las variantes de EPO indicadas estuvieron presentes durante todas estas etapas. La viabilidad celular fue cuantificada al final del experimento por incubación de células con el colorante de tetrazolio WST-1 (según las instrucciones del fabricante: Roche # 1644807) durante 2 horas, y la viabilidad fue indicada como lectura de absorbencia. La Figura 6A y la Figura B indican los resultados de ensayo de neuroproteccion de célula de neuroblastoma SK-N-SH (contra rotenona) para eritropoyetina, así como las citocinas recombinantes protectoras de tejido con las citocinas recombinantes protectoras de tejido K45D y S100E. El eje Y en la gráfica indica las lecturas de absorbencia y los datos son medias +_ rango de determinaciones por duplicado. La gráfica dentro de la Figura 6A indica claramente que la viabilidad de las células dentro de las muestras S45D y S100E mantuvieron su viabilidad demostrando su efecto de protección celular. La Figura 6B muestra el mapa de plásmidos de hEPO-6xHisTag-PciNeo . 6.4. EJEMPLO 4: CITOCINAS PROTECTORAS DE TEJIDO Las citocinas recombinantes protectoras de tejido deseables para los usos descritos aquí pueden ser modificadas adicionalmente por desialación, guanidinación, carbamilación, amidinación, trinitrofenilación, acetilación, succinilación, nitración, o modificación de residuos de arginina o grupos carboxilo, entre otros procedimientos. Alternativamente, estas modificaciones pueden efectuarse a la eritropoyetina nativa o un derivado de eritropoyetina, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, eritropoyetina desialilada, guanidinada, carbamilada, amidinada, trinitrofenilada, acetilada, succinilada, o nitrada, antes de su mutación en una citocina recombinante protectora de tejido. Algunos ejemplos de modificaciones adicionales a las citocinas recombinantes protectoras de tejido se describen a continuación. Una persona con conocimientos ordinarios en la materia entenderá que los procedimientos .listados abajo pueden también utilizarse para modificar químicamente la eritropoyetina nativa o sus derivados antes de la introducción de . mutaciones para generar una citocina recombinante protectora de tejido. 6.4.1. Désialilación de Citocinas Recombinantes Protectoras de Tejido. Una citocina recombinante- protectora de tejido puede ser desialilada a través del procedimiento siguiente que se ofrece como ejemplo. Se obtiene siálidasa.. (aislada de Estreptococo sp 6646K) en SEIKAGAKU América (No. de Código 120050) . La citocina recombinante protectora de tejido es sometida a désialilación por siálidasa (0.025 U/mg EPO) a 37 °C durante 3 horas. Se desaliniza y concentra la mezcla de la reacción a través de una unidad de filtración por centrifugación Ultrafree Centrifugal Filter Unit. Se aplica la muestra a una columna de intercambio de iones en un sistema AKTAprime14 . Se eluye la proteína con los amortiguadores seleccionados. Se efectúa un análisis de gel IEF de las fracciones eluidas que contienen una cantidad significativa de proteína. Se combinan las fracciones que contienen solamente las dos bandas superiores (migración a pl -8.5 y ~7.9 en gel IEF) . Se determina el contenido de proteína y se agrega 1/9 volumen de 10 x solución salina (NaCl 1M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) . Se determina el contenido de acidez siálico. No se detecta contenido significativo de ácido siálico. La asialoeritropoyetina fue tan efectiva como · la eritropoyetina nativa para células neurales in vitro como se muestra en las Figuras 7-8. Una prueba in vitro fue efectuada utilizando células de carcinoma embrional de tipo neural (P19) que son sometidas a apóptosis al retirar el suero. Veinticuatro horas antes de la remoción de suero, se agregó 1-1000 ng/ml de eritropoyetina o una eritropoyetina modificada a los cultivos. Al día siguiente, el medio fue removido, las · células lavadas con medio fresco que no contenia suero, y se agregó de nuevo a los cultivos durante 48.. horas adicionales medio que contenia la sustancia de prueba (sin suero) . Para determinar el número de células viables, se efectuó' un ensayo de reducción de tetrazolio (CellTiter 96; Promega, Inc.) Como lo ilustran las Figuras 7-8, la asialoeritropoyetina parece ser tan potente como la eritropoyetina misma para prevenir la muerte de las células. Retención de la actividad neuroprotectora in vivo fue confirmada empleando un modelo de isquemia focal de rata en donde se efectúa una lesión reversible en el territorio de la arteria cerebral media de conformidad con lo previamente descrito (Brines y colaboradores, 2000, Proc. Nat . Acad. Sci. U.S. . 97:10526-31).' Ratas Sprague-Da ley machos adultos recibieron asialoeritropoyetina o eritropoyetina (5000 U/kg de peso ' corporal intraperitonealmente) o vehículo al principio de la oclusión arterial. Veinticuatro horas después, los animales fueron sacrificados y sus cerebros fueron removidos para estudio. Secciones en serie fueron cortadas y teñidas con sales de tetrazolio con el objeto de identificar las regionés vivas del cerebro. Como se muestra en la Figura 9, la asialoeritropoyetina fue tan efectiva como la eritropoyetina nativa para proporcionar neuroprotección, es decir, reducir el volumen de infarto, a partir de 1 hora de isquemia. La Figura 10 muestra los resultados de otro modelo de isquemia focal en donde efectúa un ensayo comparativo de respuesta a la dosis con eritropoyetina y asialoeritropoyetina. En la dosis más baja de 4 fig/kg, la asialoeritropoyetina proporcionó protección mientras que la eritropoyetina no modificada no proporcionó protección. El número de ratas en cada grupo, n, fue mayor o igual a 4. Resultados semejantes podrían esperarse de asíalo citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. 6.4.2. Carbamilación de Citocina Recombinante Protectora de Tejido. La citocina recombinante protectora de tejido puede utilizarse para preparar las moléculas carbanilladas respectivas, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en Jin Zeng (1991) . Lysine modification of metallothionein by carbamylation and guadination. [Modificación de lisina de metalotioneina por carbamilación y guanidinación] . Methods in Enzymology 205: 433-437. Se • recristaliza cianato de potasio. Se prepara amortiguador de borato 1 M (pH 8.8). Se mezcla un solución de citocina recombinante protectora de tejido con volumen igual de amortiguador de borato. Se agrega cianato de potasio directamente al tubo de la reacción a una concentración final de 0.5 M. Se mezcla bien y se incuba a 37 °C durante 6-16 horas. Se dializ'a completamente. Se remueve el producto de la tubería de diálisis y se recoge en un tubo fresco. Se mide el volumen y se agrega 1/9 volumen de una solución salina 10 X (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) . Se determina el contenido de proteí.na y se calcula la tasa de recuperación de producto. Se analizan los productos por gel de IEF después de una prueba in vitro con células TF-1. 6.4.3. Succini1ación de Citocinas Recombinantes Protectoras de Tejido . La citocina recombinante protectora de tejido puede ser utilizada para preparar la molécula succinilada respectiva, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en Alcalde y colaboradores (2001) . La succinilación de ciclodextrina glicosiltransferasa de Thermoanaerobacter sp. 501 mejora la actividad transferasa empleando almidón como donador. J. Biotechnology 86: 71-80. La citocina recombinante protectora de tejido (100 üg) en NaHC03 0.5 M (pH 8.0) fue incubada con un exceso 15 molar de anhídrido succínico a una temperatura de 15°C durante 1 hora. La reacción fue detenida por diálisis contra agua destilada. Se disuelve ¦ anhídrido succínico en acetona seca a 27 mg/ml. Se efectúa la reacción en in tubo de. Eppendorf en amortiguador de fosfato de sodio 10 mM (pH 8.0). Se agrega una proteína de citocina recombinante protectora de tejido y un exceso 50 molar de anhídrido succínico al tubo. Se mezcla bien y se hace girar el tubo a una temperatura de 4°C durante 1 hora. Se detiene, la reacción mediante diálisis contra amortiguador de fosfato de sodio 10 M, utilizando un cassette Dialysis (Slide-A-Laze 7KI, Piwerce 66373) . Se remueve el producto del cassette de diálisis y se recoge en un tubo fresco. Se. mide el volumen y se agrega 1/9 volumen de una solución salina 10 X (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) . Se determina el contenido de proteína y se calcula la tasa de recuperación del producto. Se analizan los productos por gel IEF seguido por una prueba in vitro con células TF-1. 6.4.4. Acetilación de Citocina Recombinante Protectora de Tejido. La citocina recombinante · protectora de tejido puede utilizarse para preparar la molécula acetilada respectiva, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en Satake y colaboradores (1990) . Modificación química de eritropoyétina : incremento de la actividad in vitro por guanidinación. Biochimica et Biophysica Acta. 1038: 125-129. Se efectúa la reacción en un tubo de Eppendorf en amortiguador de fosfato de sodio 80 mM (pH 7.2). Se agrega citocina recombinante protectora de tejido y una cantidad molar igual de anhídrido acético. Se mezcla bien y se incuba en hielo durante 1 hora. Se detiene la reacción por diálisis contra- agua, utilizando el cassette Dialysis (Slide-A-Laze 7K, Pierce 66373) . Se remueve el producto del cassette de diálisis y se recoge en un tubo fresco. Se mide el volumen y se agrega 1/9 volumen de solución salina 10 X (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) . Se determina el contenido de proteín . y se calcula la tasa de recuperación del producto. Se analizan los productos por gel IEF seguido por una prueba in vitro con células TF-1. 6.4.5. Carboximetilación de Lisina de Citocina Recombinante Protectora de Tejido. La citocina recombinante protectora de tejido puede ser utilizada para preparar N*- (carboximetil) lisina (CML) respectivas en donde uno varios residuos de lisilo de la citocina recombinante protectora de tejido son modificados, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en Akhtar y colaboradores (1999) Conformational study de N*- (carboximetil) lysine. adducts of recombinant a-cristallins [estudio conformacional de aductos de N*- (carboximetil ) lisina de a-cristalinos recombinantes . Current Eye Research, 18: 270-276. Prepare fresco 200 mM de ácido glioxilico y 120 mM de NaBH3CN en -amortiguador de fosfato de sodio (50 mm, pH 7.5). En un tubo Eppendorf, agregue citocina recombinante protectora de tejido (en amortiguador de fosfato) ; calcule el equivalente de lisina en la solución (aproximadamente 8 residuos de lisina/mol) . Agregue 3 veces más NaBH3CN y 5 ó 10 veces más ácido glioxilico al tubo. Someta cada tubo a vórtice e incuba durante 5 horas a 37 °C. Dialice las muestras contra amortiguador de fosfato durante la noche a 4°C. Mida el volumen de cada producto después de diálisis. Determine la concentración de proteína y calcule la velocidad de recuperación de producto. Analice los productos por gel IEF seguido por una prueba in vitr'o con células TF-1. 6.4.6. Yodinación de Citocina Recombinante Protectora de Tej ido Una citocina recombinante protectora de tejido puede utilizarse para preparar la molécula yodinada respectiva, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en las instrucciones proporcionadas por Pierce Chemical Company (Rockford, IL) para Tubos de Yodinación Pre-Revestidos con YODO-Gen (producto # 28601) . Prepare 0.1 M de Nal y. efectúe 'yodinación en Tubo de Yodinación Pre-Revestido con YODO-Gen (Pierce, 28601), con un volumen de reacción total de .1 mi/tubo en amortiguador de 22'3 fosfato de sodio (40 mM,' pH 7.4) . Mezcle el sustrato de proteina (citocina recombinante protectora de tejido) con amortiguador de fosfato de sodio y después transfiera a un Tubo de Yodinación Pre-Revestido YODO-Gen. Agregue Nal a concentración final de 1 - 2 mM, haciendo que la proporción molar Nal/proteína sea 14-20. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave. Detenga la -reacción mediante la remoción de la mezcla de la reacción y agregue a un tubo que contiene 3.9 mi de amortiguador de sodio (es decir, una dilución 40 veces) . Concentre el producto mediante la utilización de una unidad de filtro centrifugo Ultrafree pre-humedecido . · Mida el volumen de concentrado y agregue 1/9 volumen de solución salina 10 X (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) . Determine la concentración de proteína y calcule la fase de recuperación de producto. Analice los productos por gel IEF seguido por una prueba in vitro con células TF-1. Alternativamente, la citocina recombinante protectora de tejido puede ser yodinada empleando el esquema siguiente. Se incuba una perla Iodo Bead (Pierce, Rockford, IL) en 100 ul de PBS (fosfato de sodio 20mM, NaCl 0.15M, pH 7.5) que contiene 1 mCi de Nal25I libre durante 5 minutos. Cien microgramos de citocina recombinante protectora de tejido en 100 ul se agregaron después a la mezcla. Después de un período dé incubación de diez minutos a temperatura ambiente, la reacción fue detenida por remoción de la solución de 200 ul del vaso de reacción (dejando atrás la Iodo Bead (Perla Yodo) ) . El yodo en exceso fue removido por filtración en gel en una columna Centricon 10. Como se muestra en la Figura 11, la yodo-eritropoyetina producida de esta forma es eficaz para proteger células P19 contra retiro de suero. Una persona con capacidad ordinaria en la materia podrá reconocer que resultados similares podrían esperarse de la yodinación de una citocina recombinante protectora de tejido. A continuación se presenta otro método para la yodinación de una citocina recombinante protectora de tejido. Cien microgramos de citocina recombinante protectora de tejido en 100 ul PBS se agregaron a 500 uCi Nal25I y se mezclaron juntos en un tubo Eppendorf. Se agregaron después veinticinco microlitros de cloraminas T (2 mg/ml) y la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 1 minuto . Cincuenta microlitros de amortiguador de detención Chloramine T (2.4 mg/ml de metabisulfito de sodio, 10 mg/ml de tirosina, glicerol al 10%, xileno al 0.1% en PBS) se agregaron después. La citocina recombinante protectora de tejido yodinada y la yodotirosina fueron después separadas por filtración en gel en una columna Centricon 10. 6.4.7. Biotinilación de Citocina Recombinante Protectora de Tejido Un'a citocina recombinante protectora de tejido puede ser utilizada para preparar las moléculas biotiniladas respectivas, de conformidad con el procedimiento siguiente, según lo descrito en las instrucciones proporcionadas por Pierce Chemical Company (Rockford, IL) para NHS-LC-Biotina con enlace EZ (producto # 21336) . Inmediatamente antes de la reacción, disuelva NHS-LC-Biotina con enlace EZ (Pierce 21336) en DMSO a 2 itig/ml . Efectúe la reacción en un tubo (17 x 100 MI) con un volumen total de 1 mi que contiene bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8.3) . Agregue citocina recombinante protectora de tejido y < 10% DE nhs-lc-Biotina con- enlace EZ, con razón molar Biotina/proteina de ~ 20. Mezcle bien e incube en hielo durante 2 horas. Desalinice y concentre el producto de la reacción mediante la utilización de una unidad de filtro centrifugo Ultrafree. Recoja . el producto en un tubo fresco. Mida el volumen y agregue 1/9 volumen de solución salina 10X (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.2 M, ácido cítrico 3 mM) .Determine el contenido de proteína y calcule la tasa de recuperación de producto. Analice los productos por gel IEF seguido por una prueba xn vitro con células TF-1. Un método para la biotinilación de los grupos amino libre de una citocina recombinante protectora de tejido se divulga abajo. Se disolvió 0.2 mg de éster N-hidroxisuccinimídico de ácido D-biotinoil-e-aminocaproico (Boehringer Mannheim # 1418165) en 100 ul de DMSO. Esta solución fue combinada con 400 ul de PBS que contenía aproximadamente 0.2 mg de citocina recombinante protectora de tejido en un tubo cubierto con una hoja. Después incubación durante' 4 horas a temperatura ambiente, la biotina sin reaccionar fue separada por filtración en gel en una columna de Centricon 10. Como se muestra en la Figura 12, esta eritropoyetina biotinilada protege las células pl9 contra retiro de suero. Una persona con conocimientos normales en la materia reconocerá que resultados similares podrían esperarse de la biotinilación de una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención. Finalmente, en "Biotinylated recombinant human eriythropoietins : Bioactivity and Utili.ty as a receptor ligand" [eritropoyetínas humanas recombinantes biotiniladas : bioactividad y utilidad como ligando para receptor] por Wojchowsky y colaboradores, 1989, 74(3):952-8, ¦ los autores utilizan tres . métodos diferentes de biotinilación de eritropoyetina. Se agrega biotina a (1) las porciones de ácido siálico; (2) los grupos carboxilato; y (3) los grupos amino. Los autores utilizan un ensayo de proliferación de células de bazo de ratón para demostrar que (1) la adición de biotina a las porciones de ácido siálico no desactivan la actividad biológica de la eritropoyetina; (2) la adición de biotina a los grupos carboxilato provoca una desactivación biológica " sustancial de la eritropoyetina; (3) la adición de biotina a grupos amino resultó en una desactivación biológica completa de eritropoyetina. Estos métodos y modificaciones están totalmente abarcados aqui. La Figura 12 demuestra la actividad de la eritropoyetina biotinilada y la asialoeritropoyetina en el ensayo de P19 sin cuerpo. Una persona con conocimientos normales en la materia reconoceré que resultados semejantes podrían esperarse de la yodinación de una citocina recombinante protectora de tejido de la presente invención. Véase Sección 6.15. 6.5. EJEMPLO 5: MODIFICACIÓN DE CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO POR OTROS MÉTODOS 6.5.1. Trinitrofenilación Se modificó citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) con sulfonato de 2, 4, ß-trinitrobenceno de conformidad con lo descrito en Plapp y colaboradores ("Activity of bovine pancreatic deoxiribonuclease A with modified amino groups" [Actividad de - desoxiribonucleasa A pancreática bovina con grupos amino modificados] 1971, J. Biol Chem. 246, 939-845) . 6.5.2. Modificaciones de arginina Se modificó citocina recombinante protectora de tejido con 2,3 butandiona de conformidad con lo" descrito en Riordan ("Functional arignyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione" [Residuo de arginilo funcional en carboxipeptidasa A. Modificación con butandiona] Riordan JF, Biochemistry 1973, 12(20): 3915-3923).

En otra modificación en donde se modifican residuos de aminoácido ' de eritropoyetina, residuos de arginina fueron modificados mediante la utilización de fenilglioxal según el protocolo de Takahas i (1977, J. Biochem. 81:395-402) efectuado durante lapsos de tiempo variables desde 0.5 hora a 3 horas a temperatura ambiente. La reacción fue terminada mediante la " dialización de la mezcla de la reacción contra agua. El uso de tales formas modificadas de eritropoyetina se encuentra totalmente abarcado aquí. "Se probó la eritropoyetina modificada con fenilglioxal utilizando el ensayo de células P19 descrito arriba. Como se muestra en la Ej^gura 13, esta eritropoyetina modificada químicamente conserva totalmente los efectos neuroprotector . Resultados similares forman una citocina recombinante protectora de tejido modificada de manera semejante de la presente invención. Una citocina recombinante protectora de tejido fue modificada con ciclohexanona de conformidad en indicado en Patthy y colaboradores ("Identification of, functional arginine residues in ribonuclease A and lysozyme" [Identificación de residuos funcionales de arginina en ribonucleasa ? y lisocima] Patthy, L, Smith EL, J. Biol. Chem. 1975 250(2); 565-9) . Una citocina recombinante protectora de tejido fue modificada con fenilglioxal de conformidad con lo descrito en Werber y colaboradores · ("Proceedings : Carboxypeptídase B: modification of functional arginil residues" [Minuta: Carboxipeptidasa B: modificación de residuos funcionales de arginilo] Serber, MM, Sokolovsky M Isr J. Med. Sci . 1975 11(11): 1169-70). 6.5.3. Modificaciones de tirosina Se incubó una citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) con -tetranitrometano de conformidad con lo descrito previamente' en Nestler y colaboradores "Stimulation of rat ovarían cell steroidogenesis by high density lipoproteins modified with tetranitromethane"' - [Estimulación de esteroidogénesis de células ovarianas de rata por lipoproteinas " de alta densidad modificadas con tetranitrometano] Nestler JE, Chacko GK, Strauss JF 3rd. J. Biol. Chem. 1985 Junio 25; 260 (12) : 7316-21) . 6.5.4. Modificaciones de ácido glutamico (y ácido aspártico) Para modificar los grupos carboxilo, citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) fue incubada con 0.02 M EDC en glicinamida 1M a pH 4.5 a temperatura ambiente durante 60 minutos, de conformidad con lo descrito en Carraway y colaboradores "Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen" [Modificación de grupo carboxilo en quimiotripsina y quimiotripsinógeno] Car--j¡way KL, Spoerl P, Kos land DE Jr. J. Mol. Biol. 1969 Mayo 28/ 42(1); 133-7. 6.5.5 Modificaciones de residuo de triptófano Una citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) fue incubada con n-bromosuccinimida (20 uM) en amortiguador de fosfato de potasio 20 mM (pH 6.5) a temperatura ambiente de conformidad con lo descrito en Ali y colaboradores, J. Biol. Chem. 1995 Mar 3; 270(9): 4570-4. El número de residuos de triptófano oxidados determinado a través del método descrito en Korotchkina ( orotchkina, LG. y colaboradores Protein Expr. Purif. 1995 Feb; 6(l):79-90). 6.5.6. Remoción de grupos amino Con el objeto de remover grupos amino de citocina recoiabinante protectora de tejido, se incubaron 100 ug en PBS (pH 7.4) que contenía nihidrina 20 mM (Pierce Chemical, Rockford, II), a temperatura de 37°C durante dos horas de conformidad con lo indicado en Kokkini y colaboradores (Kokkini, G. , y colaboradores "Modification of hemoglobin by ninhydrin" [Modificación de hemoglobina por nihidrina] Blood, Vol. 556, No 4 1980: 701-705) . La reducción del aldehido resultante se logró mediante la reacción del producto con borohidruro de sodio o hidruro de litio aluminio. Específicamente, la eritropoyetina (100 ug) fue incubada con borohidruro de sodio 0.1M en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reducción fue terminada mediante el enfriamiento de las muestras en hielo durante 10 minutos y dializando contra PBS, tres veces, durante la noche. (Kokkini, G., Blood, Vol. 556, No 4 1980: 701-705). La reducción empleando' hidruro de litio aluminio se logró mediante la incubación de citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) con hidruro de litio aluminio 0.1M en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reducción fue terminada por enfriamiento de las muestras en hielo durante 10 minutos y dializando contra PBS, tres veces, durante la noche. 6.5.7. Reducción y estabilización de disulfuro Se incubó una citocina recombinante protectora de tejido (100 ug) con DTT 500 mM durante 15 minutos a una temperatura de 60 °C. Se agregó después yodoacetamida (20 mM) a la mezcla y se incubó durante 25 minutos, a temperatura ambiente en oscuridad. 6.5.8. Proteólisis limitada Una citocina recombinante protectora de tejido puede ser sometida a una proteólisis química limitada que enfoca residuos específicos. Una citocina recombinante protectora de tejido puede reaccionar con 2- (2-nitrofenilsulfenil) -3-metil-3' -bromoindolenina que disocia específicamente después de los residuos de triptófano en un exceso 50 veces en ácido acético al 50% durante 48 horas en la oscuridad a temperatura ambiente en tubos tapados bajo una presión de nitrógeno. La reacción fue terminada por apagamiento con triptófano y remoción de sal. Como se observó arriba, una citocina recombinante protectora de tejido puede ser modificada, sin embargo, se pueden también ' efectuar múltiples modificaciones así como modificaciones adicionales de la molécula de citocina recoiabinante protectora de tejido sin desviarse del espíritu de la presente invención. 6.6. EJEMPLO 6: LAS CITOCINAS PROTECTORAS DE TEJIDO TIENEN UN EFECTO NEUROPROTECTOR El efecto neuroprotector de la eritropoyetina químicamente • ' modificada fue evaluado utilizando ' un ensayo de intoxicación con agua de conformidad con Manley y colaboradores, 2000, "Aquaporin-4 deletion in mice reduces grain edema after acute water intoxication and ischemic stroke" [La deleción de acuaporin-4 en ratones reduce el edema cerebral después de intoxicación acuosa aguda y ataque isquémico] Nat. Med. 2000 '· Feb 6 (2) .-159-63. Se utilizaron ratones C3H/HEN hembras. Los ratones recibieron 20% de su peso corporal de agua IP con 400 ng/kg de peso corporal .DDAVP (desmopresina) . Los ratones recibieron eritropoyetina (A) o una citocina protectora de tejido: asialoeritropoyetina (B), asialoeritropoyetina carbamil'ada (C) ; asialoeritropoyetina succinilada (D) , asialoeritropoyetina acetilada -' (E) ; asialoeritropoyetina yodinada (F) ; asialoeritropoyetina carboximetilada (G) ; eritropoyetina carbamilada (H) ; eritropoyetina acetilada (I); eritropoyetina yodinada (J) o bien W carboxi metil eritropoyetina (K) . Los ratones recibieron duna dosis de 100 microgramos/kg de eritropoyetina o bien eritropoyetina químicamente modificada intraperitonealmente 24 horas antes de la administración del agua y otra vez al momento de 1 administración del agua. Se utilizó una escala modificada d Manley y colaboradores para evaluar los ratones. La escal modificada es de conformidad con lo listado abajo: Explora la jaula/mesa Si 0 No 1 Rastrea vxsualmente objetos Si 0 No 1 Movimiento de bigotes Presente 0 Ausente 1 Movimientos de pata-cola Normal 0 Rígido ' 1 Paralizados 2 Retiro por dolor (pellizco de dedo) Si 0 No 1 Coordinación de movimiento Normal - 0 Anormal 1 Detención en borde de mesa ' 'Si 0 No 1 Resultado total posible: 8 Los ratones fueron evaluados . en los siguientes puntos de tiempo: 15, 30, 45, 60, 75, 90,120, 150 y 180 minutos. La Figura 14 representa gráficamente el desempeño de los ratones que recibieron eritropoyetina o la eritropoyetina químicamente modificada como porcentaje del déficit neuronal presentado 'por los ratones de control. La Figura 14 muestra que las citocinas protectoras de tejido protegen los ratones contra el trauma neurológico inducido por intoxicación con agua. Resultados semejantes podrían esperarse de citocinas recombinantes protectoras de tejido con modificaciones químicas semejantes. Se determinó también la significación estadística. Estos regímenes de administración con diferencias significativas, p<0.05, en comparación con los controles se indican con *, mientras que los regímenes de administración con diferencias altamente significativas, p<0.01, se indican mediante **. 6.7. EJEMPLO 7: MANTENIMIENTO DE LA FUNCIÓN EN CORAZÓN PREPARADO PARA TRANSPLANTE Ratas machos Wistar de un peso comprendido entre 300 y 330 gramos recibieron eritropoyetina (5000 U/ -f de peso corporal) o vehículo 24 horas antes de la remoción del corazón para estudio ex vivo, efectuados de conformidad con el protocolo Delcayre' y colaboradores, 1992, Amer. J. Physiol. 263:H1537-45. Los animales son sacrificados con pentobarbital (0.3mL), y heparinizados de manera intravenosa (0.2 mL) . Se permite inicialmente que los corazones se equilibren durante 15 minutos. El globo ventricular izquierdo es después inflado a un volumen que proporciona una presión diastólica final de 8 muí Hg. Una curva de presión-volumen ventricular izquierdo se construye mediante el inflado incremental del volumen del globo por alícuotas de 0.02 mi. Un volumen cero es definido como el punto en el cual la presión diastólica final del ventrículo izquierdo es cero. Al terminar la curva de presión-volumen, el globo ventricular izquierdo es' desinflado para ajustar la presión diastólica final de nuevo a 8mmHg, y el período de control es proseguido durante 15 minutos, después de revisar el flujo coronario. Después el corazón es parado .con 50 mL de molécula Celsior + para reposar a 4°C bajo una presión de 60cm de H20. El corazón es después removido y almacenado durante 5 horas a una temperatura de 4°C en un recipiente de plástico lleno de la misma solución y rodeado con hielo aplastado. Al terminar el almacenamiento, el corazón es transferido a un aparato de Langerdof. El catéter de globo es reinsertado en el ventrículo izquierdo -e inflado de nuevo al mismo volumen que durante el período preisquémico . El corazón es reperfusado por lo menos durante 2 horas a una temperatura de 37 °C. La presión de reperfusión es ajustado a 50 cm de H;0 durante 15 minutos de re-flujo y después de nuevo a 100 cm H20 durante las 2 ñoras siguientes . Se instituye de nuevo el ritmo del corazón (320 latidos por minuto) . Mediciones isovolumétricas de índice de contracción y presión diastólica ' se toman por triplicado a 25, 45, 60 y 120 minutos de reperfusión. En este punto de tiempo, se efectúan curvas de presión-volumen y efluente coronario durante la repercusión de 45 mn recogido para medir la fuga de creatina quinasa. Los • dos grupos de tratamiento son comparados empleando una prueba t no pareada, y una regresión lineal empleando los datos de presión diastólica final para diseñar curvas de cumplimiento. Como se muestra en la Figura 15, ocurre una mejora significativa de la presión del ventrículo izquierdo después de tratamiento don eritropoyetina, así como una curva de volumen-presión mejorada, disminución . de la presión véntricular diastólica izquierda y disminución de la fuga de creatina quinasa. Resultados semejantes pueden esperarse del tratamiento con citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. 6.8. EJEMPLO 8: LA ERITROPOYE INA PROTEGE EL MIOCARDIO CONTRA LESIÓN SQUÉMICA Ratas adultas machos, que recibieron eritropoyetina humana recombinante (5000 U/kg de peso corporal) 24 horas antes son anestesiadas y preparadas para oclusión de arteria coronaria. Una dosis adicional de eritropoyetina se administra al inicio del procedimiento y la arteria coronaria principal izquierda permaneció ocluida durante 30 minutos y después fue liberada. La misma dosis de eritropoyetina se proporciona diariamente durante una semana después del tratamiento. Los animales son después estudiados para función cardiaca. Como lo ilustra la Figura 16, animales que reciben una inyección ficticia (solución salina) presentaron un incremento importante de la presión diastólica final izquierda, lo que indica un corazón rígido, dilatado, secundario a un infarto del miocardio. Al contrario, animales que recibieron eritropoyetina no presentaron una disminución de la función cardiaca, en comparación con los controles operados de manera ficticia (diferencia significativa al nivel p<0.01). Resultados semejantes podrían esperarse de tratamiento con citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. 6.9. EJEMPLO 9: PROTECCIÓN DE ISQUEMIA RETINAL POR ERI ROPOYE INA ADMINISTRADA PERIFÉRICAMENTE Las células retinales son muy sensibles a la isquemia de la tal manera que muchas moderan después de 30 minutos de estrés isquémico. Además, una isquemia subregula o crónica es la causa del deterioro de la vista que acompaña un gran número de enfermedades humanas comunes como por ejemplo, diabetes mellitus, glaucoma, y degeneración macular. Actualmente no hay ninguna terapia eficaz -para proteger las células contra isquemia. ' Una barrera endotelial hermética existe entre la sangre y la retina que excluye la mayoría de las moléculas grandes. Para probar si la eritropoyetina administrada periféricamente protege -las células sensibles a la isquemia, se utilizó un modelo de rata de glaucoma reversible, agudo o de conformidad con lo descrito en en Rosenbaum y colaboradores (1997; Vis. Res. 37:3443-51). Específicamente, se inyectó una solución salina en la cámara anterior del ojo de ratas adultas, machos, a una presión superior a la presión arterial sistémica y se mantuvo durante 60 minutos. Los animales recibieron una solución salina de 5000 U de eritropoyetina/kg de peso corporal intraperitonealmente 24 lloras antes de la ' inducción de la isquemia, y se prosiguió con dosis diaria durante 3 días adicionales. Una eritrorretinografía fue efectuada en ratas adaptadas a la oscuridad 1 semana después del tratamiento. La Figura 17 y la Figura 18 ilustran que la administración de eritropoyetina se relaciona con una buena conservación del electrorretinograma (ERG) (Figura 17, Panel D) , en contraste con los animales tratados con solución salina sola (Figura 17, Panel C) , para los cuales permaneció muy poca función. La Figura 18 compara las amplitudes de onda a y de onda b de electrorretinograma después de 60 minutos de isquemia para el grupo tratado con eritropoyetina y el grupo tratado con solución salina, y muestra la protección significativa proporcionada por la eritropoyetina. Resultados semejantes pueden obtenerse a oartir del tratamiento con citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. 6.10. EJEMPLO 10: EFECTOS DE RESTAURACIÓN DE LA ERI ROPOYETINA SOBRE LA FUNCIÓN COGNOSCITIVA DISMINUIDA QUE PROVIENE DE UNA LESIÓN CEREBRAL. En un estudio para demostrar la capacidad ' de la eritropoyetina para restaurar una función cognoscitiva disminuida en ratones después de un trauma cerebral, ratones Balb/c hembras fueron sometidas a un trauma cerebral contundente de conformidad con lo descrito en Brines y colaboradores PNAS 2000, 97; 10295-10672 y cinco días después, empezó la administración diaria de eritropoyetina de 5000 U/kg de peso corporal, en forma intraperitoneal . Doce días después de la lesión, los animales fueron probados para determinar la función cognoscitiva en el laberinto de agua de Morris, con cuatro ensayos por día. Si bien tanto los animales tratados como los animales no tratados tuvieron un desempeño insatisfactorio en la prueba (con tiempos de nadado de aproximadamente 80 segundos de 90 segundos posibles) , la Figura 19 muestra los resultados de la prueba de laberinto de agua de Morris, con cada grupo de ratones, n = 16, después de un trauma cerebral contundente con administración de EPO empezando el día cinco posterior a la lesión. La primera prueba empezó una semana después del inicio de la administración de EPO (12 días después- de la lesión) . Ambos grupos de animales tuvieron un desempeño insatisfactorio con tiempos de nadado de aproximadamente 80 segundos entre los 90 segundos posibles. Los animales tratados con eritropoyetina tuvieron un mejor desempeño (en esta presentación, un valor negativo mejor) . Se utilizó la media de 4 ensayos por día.' La Figura 19 lo muestra. Aún si el inicio del tratamiento con eritropoyetina es retardado hasta 30 días después del trauma (Figura 20), la restauración de la función cognoscitiva se observa también. En la Figura 20, cada grupo de ratones, n = 7, fue tratado con 5000 U/kg de EPO diariamente excepto los fines de semana, empezando un mes después de la lesión. La media de los ensayos fue también la media de 4 ensayos diariamente. Resultados semejantes pueden obtenerse a partir del tratamiento con citocinas recombinantes protectoras de tejido .de la presente invención. 6.11. EJEMPLO 11: MODELO DE ??????? En el modelo de neurotoxicidad de kainato, la asialoeritropoyetina fue administrada de conformidad con el protocolo de Brines y colaboradores Proc. Nat . Acad. Sci . U.S.A. 2000, 97/ 10295-10672 a una dosis-, de 5000U/kg de peso corporal, con administración intraperitoneal 24 horas antes de la administración de 25 mg/kg de kainato y resulta ser eficaz que la eritropoyetina, como se muestra a través de la gráfica de tiempo versus fallecimiento (Figura 21) . Resultados similares se requieren a partir del tratamiento con citocinas protectoras de tejido de la presente invención. 6.12. EJEMPLO 12: MODELOS DE LESIÓN DE LA MÉDULA ESPINAL 6.12.1. Compresión de la Médula Espinal de Rata para Probar E itropoyeti a y Citocinas Protectoras de Tejido Ratas Wistar (hembras) de un peso comprendido entre 180-300g fueron utilizadas en este estudio. Los animales fueron sometidos a ayunas durante 12 horas antes de la intervención quirúrgica, y fueron restringidos y anestesiados de forma humanitaria con una inyección intraperitoneal de tiopental sólido (40 mg/kg de peso ¦ corporal) . Después de la infiltración de la piel (bupivacaina 0.25%), se efectuó una laminectomia completa de nigel único (T-3) a través de una incisión de 2 cm con la ayuda de un microscopio de disección. La lesión traumática la médula espinal fue inducida por aplicación extradural de una grapa temporal para aneurismo que ejerce una fuerza de cierre de 0.6 Newton (65 gramos) sobre la médula espinal durante 1 minuto. Después de la remoción de la grapa, la incisión cutánea fue cerrada y se permitió la recuperación completa de los animales de la anestesia y su retorno a sus jaulas. Las ratas fueron monitoreadas continuamente con palpación de la vejiga por o menos dos veces al día hasta que se reiniciara el vaciado espontáneo. Cuarenta animales fueron divididos aleatoriamente en cinco grupos. Los animales en el grupo de control (I) (n = 8) recibieron una solución salina normal (a través de inyección intravenosa) inmediatamente después del cierre de la incisión El grupo (II; n = 8) recibió rhEP0@16 microgramos/kg de peso corporal iv; el grupo (III) recibió una citocina protectora de tejido asíalo de la presente invención (asialoeritropoyetina) @ 16 microgramos/kg de peso corporal iv, el grupo (IV) recibió una citocina protectora de tejido @ 30 microgramos/kg de peso corporal iv, y el grupo (V) recibió una citocina protectora de tejido asíalo de la presente invención (asialoeritropoyetina) @ 30 microgramos/kg de peso corporal; todas como una inyección intravenosa de un solo bolo inmediatamente después de la remoción de la grapa para aneurismo. La función neurológica motriz de las ratas fue evaluada mediante el uso de la escala de calificación locomotriz de Basso y colaboradores. En esta escala, los animales fueron calificados en la escala de 0 (ausencia de movimientos observables de las patas traseras) a 21 (andar normal) . Las ratas prueban para déficits funcionales a 1, 12, 24, 48, 72 horas y después a 1 semana después de la lesión por el mismo examinador ciego con relación al tratamiento recibido por cada animal . La Figura 22 es una gráfica que demuestra las evaluaciones locomotrices de las ratas recuperándose del trauma a la médula espinal durante un período de treinta días. Como se puede observar a partir de la gráfica, las ratas que recibieron eritropoyetina (grupo II) o citocinas protectoras de tejido (grupos III-V se recuperaron de la lesión más fácilmente y demostraron una mejor recuperación global de la lesión que las ratas de control. Resultados similares podrían esperarse del tratamiento terapéutico con las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. En un segundo estudio relacionado, animales fueron lesionados de la misma manera.- Cuarenta animales fueron divididos aleatoriamente en tres grupos. Los animales en el grupo de control (n = 8} recibieron una solución salina normal (a través de inyección intravenosa) inmediatamente después del cierre de la incisión. El segundo grupo (n = 8) recibió metilprednisolona @ 30 mg/kg x3 y después bisemanalmente, una terapia común para lesiones de la médula espinal; el tercer grupo recibió una citocina recombinante protectora de tejido S100E, de la presente invención en una" dosis de ~10ug/kg inmediatamente después de la lesión, todas como inyección única de bolo intravenoso inmediatamente después de la remoción de la grapa para aneurisma. La función neurológica motriz de la rata se evalúa mediante el uso de la escala de calificación locomotriz de Basso y colaboradores. En esta escala, a los animales se les asigna una calificación de un rango de 0 (ningún movimiento observado de las patas traseras) a 21 (andar normal) . Las ratas se prueban para déficits funcionales a 1, 12, 24, 48 y 72 horas y después a 1 semana después de una lesión por el mismo examinador ciego con relación al tratamiento recibido por cada animal . La Figura 37 es una gráfica que demuestra las evaluaciones locomotrices dé las ratas que se recuperan del trauma a la médula espinal mediante un lapso de cuarenta y dos días. Como se puede observar a partir de la gráfica, las ratas que recibieron S100E se recuperaron de la lesión más fácilmente y demostraron una mejor recuperación global de la lesión que las ratas de control y las ratas que recibieron metiloprednisolona . 6.12.2. Isquemia de Médula Espinal de Conejo para Probar Eritropoyetina y una Citocina Protectora de Tejido Treinta .y seis conejos New Zealand White (de 8 a 12 meses de edad, machos) de un peso comprendido entre 1.5-2.5 kg se utilizaron dentro del marco de este estudio. Los animales fueron sometidos a ayunas durante 12 horas y restringidos de manera humanitaria. La inducción de la anestesia se llevó a cabo a través de halotano a un 3% en oxigeno al 100% y se mantuvo con halotano de 0.5 a 1.5% en una mezcla de oxigeno al 50% y aire al 50%. Un catéter intravenoso (calibre 22) fue colocado en la vena de la oreja izquierda. Se infusó lactato de Ringer a razón de 4 ml/kg peso corporal (bw) por hora durante la intervención quirúrgica. Preoperativamente, se administró en forma intravenosa cefazolina 10 mg/kg de peso corporal para profilaxis de la infección. Los animales fueron colocados en la posición de decúbito lateral derecho, la piel fue preparada con povidona yodo, infiltrada con bupivacaina (0.25%) y se efectuó una incisión cutánea en el flanco de forma paralela a la espina dorsal al nivel de la 12a costilla Después de la incisión de la piel y fascia toracolumbar subcutánea, los músculos longissimus lumborum e iliocostalis lumborum- presentaron retracción. La aorta abdominal fue expuesta a través de un enfoque retroperitoneal izquierdo y ¦ movilizada justo debajo de la arteria renal izquierda. Un P-e.d3.zo_ de tubería PE- 60 fue colocado en forma de bucle alrededor de la aorta inmediatamente distal con relación a la aorta renal izquierda y ambos extremos pasaron a través de un tubo de hule de mayor tamaño. Jalando la tubería de PE, la aorta fue cerrada de manera no traumática durante 20 minutos. Se administró heparina (400 UI) en un bolo intravenoso antes de la inclusión aórtica. Después de 20 minutos de oclusión, se removieron el tubo y el catéter, la incisión fue cerrada y los animales fueron monitoreados hasta una recuperación completa y después evaluados en serie para función neurológica . Treinta y seis animales fueron divididos aleatoriamente en seis grupos. En un grupo de control (I), los animales (n = 6) recibieron una solución salina normal intravenosa inmediatamente después de la liberación de oclusión aórtica. El grupo (II) recibió rhEPO @6.5 microgramo/kg de peso corporal; el grupo (III) recibió una citocina protectora de tejido (eritropoyetina carbamilada) @ 6.5 microgramos/kg de peso corporal; el grupo (IV) recibió otra citocina protectora de tejido (asialoeritropoyetina) @ 6.5 microgramos/kg de peso corporal; el grupo (V) recibió la misma citocina protectora de tejido qüe el grupo (IV) pero @ 20 microgramos/kg de peso corporal; y el grupo (VI) recibió otra citocina protectora de tejido (eritropoyetina asialocarbamilada) @ 20 microgramos/kg de peso corporal, todas de manera intravenosa inmediatamente después de la reperfusión (n - 67 para cada grupo) . La función motriz fue evaluada de conformidad con los criterios de Drummond y Moore por un investigador ciego en cuanto al tratamiento 1,24 y 48 horas después de la reperfusión. Un resultado de 0 a 4 fue asignado a cada animal de la manera siguiente: 0 = parapléjico sin evidencia de función motriz en las extremidades inferiores; 1 = función motriz limitada en las extremidades inferiores, movimiento antigravedad débil solamente; 2 =¦ función moderada de las extremidades inferiores con buena resistencia antigravedad, pero inactividad para jalar las patas deb -jo del cuerpo; 3 = excelente función motriz con capacidad de jalar las patas debajo del cuerpo y saltar, pero no normalmente; 4 = función motriz normal. La vejiga urinaria fue evacuada manualmente en animales parapléjicos dos veces al dia. La Figura 23 es una gráfica que muestra la función motriz de los conejos en recuperación. La gráfica demuestra que aún durante un lapso de tiempo de solamente dos días, la eritropoyetina y las -citocinas protectoras de tejido de la presente invención permiten la recuperación más completa de los conejos de la lesión de la médula espinal. Se podrían ¦ -esperar resultados semejantes del tratamiento terapéutico con las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. 6.13. EJEMPLO 13: EFECTOS ANTI-INFLAMATORIOS DE LA ERITROPOYETINA Estudios in vivo: MCAO en Ratas Ratas machos . Crl : CD (SD) BR con un peso comprendido entre los 250 y los 280 g se obtuvieron de Charles River, Calco, Italia. Se efectuó una intervención quirúrgica en estas ratas de conformidad con las enseñanzas de Brines M.L., Ghjezzi, P., Keenan, S., Agnello, D., de Lanerolle, N. C, Cerami, C, Itri, L. M., y Cerami, A. 2000 Erythropoietin crosses the blood- brain. barrier to protect against experimental brain injury [La eritropoyetina atraviesa la barrera hematoencefálica para proteger contra lesión cerebral experimental], Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:10526-10531. En resumen, las ratas fueron anestesiadas con hidrato cloral (400 mg/kg de peso corporal, i.p.), las arterias carótidas fueron- visualizadas, y la carótida derecha fue ocluida con dos suturas y cortadas. Un orificio de perforación adyacente y rostral con relación a la órbita derecho emitió una visualización de MCA, que fue cauterizado distal con relación" a la arteria rinal . Para producir una penumbra (zona de borde) que rodea esta lesión de MCA fija, la arteria .carótida contralateral fue ocluida durante 1 hora mediante la utilización de tracción proporcionada por un fórceps fino y después re-abierta. Se administró PBS o rhEPO (5,000 U/kg de peso corporal, i.p.; se había demostrado previamente que era protector en este modelo (1) ) inmediatamente después de MCAO. Cuando se indicó, se cuantificaron TNF e IL-6 en omogenados de corteza cerebral de conformidad con lo previamente descrito (8). Se midió MCP-1 en los homogenados utilizando un kit ELISA comercialmente disponible (biosource, Camarillo, CA) . Veinticuatro horas después de MCAO, las ratas " fueron anestesiadas de conformidad con lo descrito arriba y sometidas a perfusión transcardialmente con 100 mi de solución salina seguida por 250 mi de una solución de paraformaldehído al 4% amortiguada con fosfato de sodio. Los cerebros fueron rápidamente removidos, fijados en una solución de paraformaldehído al 4% amortiguada por fosfato de sodio, transferidos a una solución de sucrosa al 20% en PBS durante la noche, y después en una solución de sucrosa al 30% hasta que se hundieran y fueron subsiguientemente congelados en 2-metilbutano a una temperatura de -45°C. Secciones (30 um) fueron cortadas en un criostato (HM 500 OM, Microm) a -20°C en el plano transversal a través del cerebro y se seleccionó cada quinta sección para histoquimica contra antigenos diferentes, o.bien tinción por hematoxilina-eosina . Secciones de flotación libre fueron procesadas para inmuno-reactividad" tanto con anticuerpo monoclonal de ratón de proteina de ácido fibrilar anti-glial (GFAP) (1:250, Boehringher Mannheim, Monza, Italia) como con anticuerpo monoclonal de ratón anti-cdllb (MRC OX-42) (1:50, Serotec, Reino Unido) , de conformidad con los protocolos descritos por Houser y colaboradores y el protocolo del fabricante, respectivamente. Todas las secciones fueron montadas para microscopía de luz en solución salina en la tina revestida, deshidratadas a través de' alcoholes clasificados, fijadas en xileno y cubiertas empleando un montante DPX (BDH, Poole, Reino Unido) . Secciones adyacentes fueron teñidas con hematoxilina-eosina de conformidad con lo descrito en (10) . La Figura 24 muestra una sección coronal de la capa de corteza cerebral teñida con hematoxilina y eosina. Una rata de control (A) , rata isquémica tratada con PBS (B) , rata isquémica tratada con rhEPO (5,000 U/kg de peso corporal, i.p., inmediatamente después de MCAO) (C) . La sección B muestra una disminución notable de la tinción tisular lo que es consistente con inflamación, acompañada por una pérdida de componente neuronal en comparación con el control (A) . La administración- sistémica de rhEPO reduce en gran medida el daño isquémico localizando la muerte celular o lesión en un área restringida (C) . (Amplificación 2.5x. Barra de tamaño = 800 um) . La Figura 25 muestra secciones coronales de corteza frontal adyacente a la región de infarto teñida por anticuerpo GFAP. Rata de control (A) , rata isquémica tratada con PBS (B) , y rata isquémica tratada con rhEPO (C) . Los astrocitos activados son visualizados por sus procesos positivos para GF.¾P._0?anel B) . Obsérvese la reducción notable del número asi como de la intensidad de tinción en un animal representativo tratado con rhEPO (Panel C) . (Amplificación lOx. Barra de tamaño = 200 um) . La Figura 26 muestra secciones coronales de capa de corteza cerebral teñida por anticuerpo OX-42. Rata isquémica tratada con PBS (A) , y rata- isquémica tratada con rhEPO (B) . En el hemisferio cerebral isquémico, la- tinción celular es especialmente prominente alrededor del tejido infartado en ambos grupos' de tratamiento, pero es mucho más densa y se extiende adicionalmente en el grupo tratado con solución salina. (Amplificación 20x; Barra de tamaño = 100 um) . La Figura 27 muestra secciones coronales de capa de corteza cerebral adyacente a la región de infarto teñido por anticuerpo OX-42. Una densidad mucho mayor de las células inflamatorias mononucleares se observa en el tejido a partir de una rata isquémica tratada con. PBS (A) en comparación en una rata isquémica tratada con rhEPO (B) . Los leucocitos que se están infiltrando, con forma redonda típica, ex-tenderán potencialmente el volumen de infarto. (Amplificación lOx; Barra de tamaño = 200 um) . Resultados ' similares pueden esperarse del tratamiento terapéutico con las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. Encefalomielitis Alérgica Experimental Aguda (EAE) en ratas Lewis Ratas Lewis hembras, de 6 a 8 semanas de edad, fueron compradas en Charles River (Calco, Italia) . Se indujo EAE en ratas mediante la inyección de 50 µg de MBP de conejillo de la india (Sigma, St. Louis, MO) en agua emulsificada en volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma) adicionado con 7 mg/ml de M. tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI) muerto con · aplicación de calor en un volumen final de 100 µ bajo anestesia ligera con éter en ambos cojinetes de patas posteriores. 1. Las ratas fueron examinadas en forma ciega para signos de FjjS y calificadas de la siguiente manera: 0, ausencia de enfermedad, 1, cola flácida, 2, ataxia; 3, parálisis completa de las patas posteriores con incontinencia urinaria. Empezando desde el 3er día después de la inmunización, las ratas recibieron r-Hu-EPO (EPOetin alfa, Procrit, Ortho Biotech, Raritan, NJ) en forma intraperitoneal (i.p.) una vez al día en las dosis indicadas, en PBS . Puesto que la albúmina sérica humana contenía EPO de grado clínico, los animales de control recibieron siempre PBS que contenía una cantidad idéntica de albúmina sérica humana. La administración diaria de 5,000 U/kg peso corporal de EPO incrementó el nivel de hematócritos en 30%. Cuando se indicó, ratas fueron inyectadas s.c. una vez al día desde el día 3 hasta el día 18 con 1.3 mg/kg de peso corporal de sal disódica de fosfato de dexametasona (DEX) (Sigma) que corresponde a 1 mg/kg de peso corporal de DEX, disuelto en PBS. Cuando se indicó, se cuarítificaron TNF e IL-6 en homogenados de cerebro y médula espinal de conformidad con lo previamente descrito [Agnello, 2000 #10] . La Figura 28 muestra el efecto de protección sobre los signos clínicos de EAE de diferentes dosis de' EPO, administradas desde el día 3 después de la inmunización con MBP hasta el día 18. EPO, en forma dependiente de la dosis, retardó el inicio de la enfermedad y disminuyó la severidad de la enfermedad, de conformidad con lo presentado de manera resumida en. la Tabla 1, pero no retardó el tiempo hasta la mayor severidad. Como se muestra en . esta tabla, EPO en las dosis de 2,500 y 5, 000 U/kg de peso corporal, disminuyó significativamente la calificación acumulada media.

En experimentos en donde el tratamiento de EPO fue discontinuado después de la regresión de la enfermedad y en donde las ratas fueron monitoreadas hasta durante dos meses, no se observó ninguna recaída, a diferencia de DEX que induce una exacerbación de la enfermedad después de la suspensión de su administración (Figura 29) . Resultados semejantes podrían esperarse del tratamiento terapéutico con las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la presente invención. Estudiso in Vitro Cultivos primarios de células gliales fueron preparados a partir de ratas Sprágue-Dawley recién nacidas de 1-2 día de edad. Los hemisferios cerebrales fueron liberados de las meninges y perturbados mecánicamente. Las células fueron dispersadas en una solución de tripsina al 2.5% y DNAasa al 1%, filtradas a' través de una maya de nylon de 100 µ y colocadas en placas (140, 000' células por plato de 35 mm) en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% de suero fetal de becerro, 0.6% de glucosa, estreptomicina (0.1 mg/ml) y penicilina (100 Ul/ml) . Cultivos gliales fueron alimentados dos veces por semana y cultivados a 37 °C en un incubador humidificado con C02 al 5%. Todos los experimentos fueron efectuados en cultivos de células gliales de 2-3 semanas de edad con 97% de astrocitos y 3% de microglia, de conformidad con lo evaluado por inmunoquímica, de GFAP y Griffonia simplicifólia isolectina B4. Los cultivos neuronales fueron establecidos a partir del hipocampo de fetos.de rata de 18 dias. Los cerebros fueron removidos y liberados de las meninges y se aisló el hipocampo. Las células fueron dispersadas por incubación durante 15-20 minutos a 37°C en una solución . de tripsina 2.5% seguida por titulación. La suspensión de las células fue diluida en el medio utilizado para células gliales y las células fueron colocadas en placas en cubreobjetos revestidos con poliornitina a una densidad de 160,000 células por cubreobjetos. El dia después de la colocación en placas, los cubreobjetos fueron transferidos a platos que contenían una monocapa glial en medio de mantenimiento de neuronas (medio Eagle modificado por Dulbecco y una mezcla de nutriente de Ham F12 suplementada con 5 µ?a/ml de insulina, 100 pg/ml de transferina, 100 g/ml de putrescina, 30 nM de Na selenite, 20 nM de progesterona y penicilina 100 U/ml) suplementado con citocina arabinósido 5 uM. Los cubreobjetos fueron invertidos de tal manera que las neuronas hipocampales hicieran frente a la monocapa glial. Puntos de parafina se adhieren a los cubreobjetos soportándolos arriba de la capa glial, creando un espacio angosto que evitó que los dos tipos de células entraran en contacto entre ellas, pero permitió la difusión de sustancias solubles.. Estas condiciones de cultivo permitieron el crecimiento de cultivos neuronales diferenciados con una homogeneidad mayor al 98%, de conformidad con lo evaluado por inmunoquímica de proteína asociada con microtúbulos 2 y GFAP. Las células fueron después tratadas durante 24 horas con Trimetil estaño (TMT) 1 um, en presencia o ausencia de rhEPO (10 U/ml), los sobrenadantes fueron utilizados para ensayo TNF y la viabilidad celular fue evaluada de conformidad con lo descrito abajo. Cuando se indicó, células gliales fueron cultivadas en presencia.de LPS durante 24 horas, con o sin rhEPO, y se midió TNF en los sobrenadantes cultivados. La viabilidad celular fue medida por el ensayo de bromuro de 3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) .

Denizot, F., y Lang, R. 1986. Rapid colorimetric assay for G l-l-.__growth and survival . Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability [ensayo calorimétrico rápido para . crecimiento celular y supervivencia. Modificaciones al procedimiento de colorante de tetrazolio proporcionando sensibilidad y conflabilidad mejoradas]. J. Immunol . Methods 89:271-277. En resumen la sal de MTT tetrazolio fue disuelta en medio libre de suero a una concentración final de 0.75 mg/ml y se agregó las células al final . del tratamiento durante 3 horas a 37°C. El medio fue después removido y el formazano fue extraído con 1N HCl : risopropanol (1:24). Se leyó la absorbencia a 560 nm en un lector de microplacas . La Figura 30 muestra que rhEPO evita la producción de TNF inducida por muerte neuronal en cultivos mixtos neuronas- gliales. Panel ?: Porcentaje de muerte de células neurales inducidas por TMT 1 uM sin o con tratamiento con rhEPO (10 U/ml) . Panel B: Liberación de TNF-OÍ a partir de células gliales expuestas a TMT 1 uM en presencia (barras sombreadas) o ausencia (barras llenas) de neuronas, con o sin rhEPO (10 U/ml) . Resultados semejantes podrían esperarse del tratamiento . terapéutico con las citocinas recombinantes protectoras ' de tejido de la presente invención. 6.14. EJEMPLO 14: ENSAYO DE MUERTE CELULAR INDUCIDA POR NMDA Se puede definir la excitotoxicidad como la activación excesiva de receptores para glutamato, como por ejemplo receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) . El receptor NMDA presenta una actividad incrementada en la respuesta a isquemia y otros traumas' (Fauci y colaboradores, 1998, Harrison' s Principies of Internal Medicine), (Nishizawa, 2001, Life Sci. 69, 369-381), (White y colaboradores, 2000, J. Neurol. Sci. 179, 1-33) . Asi, el ensayo sirve como modelo para evaluar un efecto de los compuestos sobre lesión y muerte celular. Protocolo de excitotoxicidad de NMDA en neuronas hipocampales ¦primarias . Se prepararon cultivos neuronales hipocvpales primarios a partir de ratones recién nacidos (menos de 24 horas de edad) esencialmente de conformidad con lo previamente - descrito por Krohn y colaboradores (1998) . En resumen, los hipocampos fueron disecados en DMEM que contenia BSA al 0.02%. El tejido fue transferido a DMEM que contenia papaina al 0.1% e incubado durante 20 minutos a 37 °C. La digestión fue detenida por aspiración del medio que contenia papaina y adición de MEMII y las células hipocampales fueron disociadas por trituración con punta de pipeta de 1000 µ? . Se permitió el asentamiento de los pedazos de tejido y el sobrenadante que contenia células individuales fue transferido en MEMII que contenia inhibidor de tripsina al 1% (tipo II-O) y BSA al 1%. El paso de trituración fue repetido tres veces antes que las células individuales fueran centrifugadas a 600 U/minuto durante 10 minutos y resuspendidas en medio de crecimiento (MEMII, D-glucosa 20 mM, 100 U/ml penic'ilinar 100 ]ig estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10% Un-suero (bovino) , suplemento B27 al 2%, NaHC03 26.2 M). Se utilizaron células de 10 hipocampos para sembrar una placa de 24 pozos. Un dia después del sembrado, las células fueron tratadas con citocina-arabino-furanósido (1 uM) . El dia dos, el medio fue cambiado y se agregó citocina-arabino-furanósido (1 uM) . Ensayo de excitotoxicidad Cultivos de doce días de edad fueron pre-incubados con el Gompuesto de prueba (vehículo, R103E, R150E, o EPO) a 5nM durante 24 horas. El dia 13, el medio fue removido de las células y conservados mientras los cultivos eran retados con 300 µ? NMDA durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después del ataque excitotóxico, el medio pre-acondicionado fue devuelto a los cultivos y la lesión fue cuantificada por exclusión de azul tripano después de 24 horas adicionales de incubación. Se contaron aproximadamente 300 neuronas por condición en por lo menos cuatro pozos separados y los experimentos fueron repetidos por lo menos dos veces (Krohn, A.J., Preis, E. y Lprehn, J.H.M. (1998} J. Neurosci. 18 (20) : 8186-8197) . La Figura 31 muestra que la eritropoyetina humana y las citocinas recombinantes protectoras de tejido R130E y R150E reducen efectivamente la muerte células inducida por NMDA cuando se agregan a los cultivos de células neuronales hipocampales primarias antes de tratamiento con MDÁ. Las células tratadas con R103E (5 nM) presentaron una muerte de células significativamente menor en comparación con las células de control de vehículo (p = 0.01).· Las células tratadas con R103E (5 nM) presentaron una muerte celular significativamente menor en comparación con las células de control de vehículo (p = 0.01). Las células tratadas con . R150E (5 nM) presentaron una disminución de aproximadamente ¦ el 20% en cuanto a la muerte celular en comparación con las células de control con solvente (p = 0.001). Estadísticas: ANOVA más prueba de Tukey post-hoc. 6.15. EJEMPLO 15: PROTECCIÓN NEURONAL DE RETIRO DE SUERO EN CÉLULAS P19 Para examinar el efecto protector neuronal de las citocinas recombinantes protectoras, de tejido de la invención, se utilizó como modelo el retiro de suero de cultivo de células PC19. El clon P19S1801A1 fue proporcionado amablemente por el Dr. W-. H. Fischer. Las células fueron mantenidas en Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L glutamina 2 mM, 100 U/ml · de penicilina G, 100 ug/ml de sulfato de estreptomicina y 10% de suero fetal de becerro (FCS; todos de Gibco, Paisley, Escocia, Reino Unido), que contenia 1.2 g/1" de NaHCCb/ amortiguador Hepes 10 mM (Cario Erba, Milán Italia) , que se conoce a continuación como medio completo, en un incubador umidificado bajo una atmósfera de 7% C02 en aire. El medio libre de suero (N2) tiene los mismos constituyentes que arriba con deleción de suero y la adición de lo siguiente: 5 µg/ml de insulina, 100 g/ml de transférina, progesterona 20 nM, putrescina 100 uM y Na2Se03 30 nM (todos de Sigma) . En el caso de los experimentos de fallecimiento, las células son disociadas con pancreatina al 10% (Gibco) , lavadas una vez con medio completo, dos veces con medio N2 y colocadas en placas, a menos que se indique lo contrario, colocadas en placas en frascos de cultivo de tejido de 25 cnr (Falcon Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey) a una densidad final de 104 células/cm2 en 5 mi de medio libre de suero. Se tomó L-acetilcarnitina (100 uM) como un control positivo, que confiere protección, reduciendo en 50% el porcentaje de núcleos apoptóticos 24 horas después de la deprivación de suero. Veinticuatro horas después de la deprivación de suero, las células fueron desprendidas golpeando el frasco (sin tripsina) sembrado en platinas de microscopio por centrifugación de citospina (Shandon Southern, USA) a 600 revoluciones por minuto durante 10 minutos, y fueron fijadas en una solución Carnoy (metanol : ácido acético. 3:1) durante 10 minutos, teñidas con Hoechst 33258 (0.1 g/ml PBS) durante 1 hora a 37 °C, lavadas con agua del grifo durante 15 minutos, secadas en aire y montadas. Las platinas fueron observadas con un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Alemania) a una longitud de onda de excitación de 365 nm. El porcentaje de núcleos apoptóticos fue determinado contando en ciego un total de 100 células en por lo menos 5 determinaciones . Células P19 fueron pre-incubadas con Epo 3 nM o citocina recombinante protectora de tejido S100E durante 24 horas. Este tratamiento resultó en una protección significativa (p <0.001) contra la apoptósis activada por retiro de suero. Los datos son medias de determinaciones por triplicado dentro de un experimento. El experimento fue efectuado dos veces con resultados semejantes. La Figura 32 muestra la protección neuronal contra retiro de suero en células P19. El porcentaje de células apoptóticas disminuyó en el caso de las células pre-tratadas con Epo, EpoWT, y citocina recombinante protectora de tejido S100E. Las células tratadas con Epo presentaron una disminución de aproximadamente 20% en cuanto a la muerte de células apoptóticas en comparación con las células de control sin tratamiento. Las células tratadas con EpoWT y S100E presentaron amabas aproximadamente una disminución del 10% de la muerte de células apoptóticas en comparación con las células de control no tratadas. 6.16. EJEMPLO 16: RETIRO DE NGF EN CÉLULAS PC12 DIFERENCIADAS Para examinar el efecto de protección neuronal de las citocinas recombinantes protectoras de tejido de la invención, s-e—..utilizó el retiro de NGF en células PC12 diferenciadas como modelo. En el ensayo es un modelo bien establecido de apóptosis. Esta linea de células de rata PLC12 fue derivada de un faeocromocitoma medular adrenal y puede ser diferenciada ' en células de tipo neuronal en presencia de NGF (Masuda y colaboradores, 1993, J. Biol. Chem. 268, 11208-11216) . La linea de células PC12 es una linea de células neuroendocrinas que, en presencia de NGF, puede diferenciarse para expresar un fenotipo de tipo neuronal (Vaudry y colaboradores, 2002, Science 296, 1948-1949) . Una vez que las células están totalmente diferencias, se vuelven dependientes de NGF y el retiro de NGF induce la apóptosis. Células PC12 fueron mantenidas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de caballo térmicamente · desactivado al 10%, suero fetal bovino térmicamente desactivado al 5%, piruvato de sodio al 1% y penicilina-estreptomicina al 1% (P/S) (Invitrogen, Carlsbad, EUA) . Para experimentos, células fueron diferenciadas durante 7 días en placas de 48 pozos revestidas con colágena G a una densidad de 24,000 células/pozo en DMEM suplementado con suero de ca'ballo térmicamente desactivado al 1%, piruvato de sodio al 1%, P/S al 1% y. 100 ng/ml de NGF (factor de crecimiento de nervios 7S) , glándulas submaxilares de. ratón, adquirido en Calbiochem, No. de Catálogo 480354) con medio cambiado cada 2-3 días. El día 6, el ñútante de Epo en el aminoácido 100 (= S100E) fue agregado a las células en las concentraciones indicadas durante 24 horas, después de lo cual el medio fue reemplazado con RPMI1640, P/S al 1%, para remover NGF de todas las células. Se agregó de nuevo S100E, asi como NGF (100 ng/ml) como control positivo ' (+NGF) . Después de 24 horas, se midió la viabilidad a través de un ensayo de reducción de tetrazolio (MTT) . Las Figuras 33A y 33B muestran el efecto de la pre-incubación con S100E en células PC12 diferenciadas sometidas a retiro de NGF en dos experimentos independíenos . Células PC12 diferenciadas fueron tratadas previamente con S100E en las concentraciones indicadas durante 24 horas, Figura 33A (3 pM) Figura 33B (0.00003 pM-3pM) . La viabilidad fue medida en el ensayo MTT . Se utilizó NGF (100 ng/ml) como control positivo y medio libre de NGF (-NGF) como control negativo. Los datos presentados en la Figura 33 son presentados como % de viabilidad de control positivo (+NGF) (n = 8 en ambos experimentos) . Existe un incremento estadísticamente significativo de la viabilidad de células tratadas con S100E en comparación con las células de control negativo (-NGF) mediante el uso de ANOVA de "un sentido y prueba de- Bonferroni post-hoc. ***p<0.001, *p<0.05. Los efectos observados con S100E fueron semejantes a los efectos observados con Epo en este sistema de prueba con relación a potencia y eficacia. La Figura 34 muestra el efecto de pre-incubación con Epo en células PC12 diferenciadas sometidas a retiro " NGF." Las células PC12 diferenciadas fueron tratadas previamente con Epo, S100E, o bien Epo carbamiladó" (30 pM-30 nM) durante 24 horas. La molécula Epo químicamente modificada, AA24496, tiene una actividad 10000 veces menos que EPO en el ensayo de células ÜT-7. La viabilidad fue medida en el ensayo MTT. Se utilizó NGF (100 ng/ml) como control positivo y medio libre de NGF (+NGF) como control negativo. 6-17- EJEMPLO 17; BIO-ENSAYO EPO DE PROLIFERACIÓN DE CÉLULA UT-7 UT-7 es una línea de células dependiente de Epo de leucemia para la determinación del efecto eritroide de citocina recombinante protectora de tejido como por ejemplo K45D. Las células UT-7 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen -und Zellkulturen (DSMZ) , No. de Catálogo ACC 363) fueron normalmente cultivadas en presencia de FBS al 10% y 5 ng/ml de Epo. La respuesta de proliferación/supervivencia (= incremento de viabilidad) de las células expuestas a Epo es mediada por el receptor Epo periférico tipo clásico. La respuesta de proliferación es una medición cuantitativa y se correlaciona con la capacidad de variantes de Epo para estimular el receptor Epo clásico. Métodos para el ensayo de Viabilidad de células UT-7 La linea de células de leucemia humana UT7 fue tornada dependiente de Epo, y la respuesta de proliferación a Epo/citocinas recombinantes protectoras de tejido agregadas se utilizó como una medición de su actividad biológica. El día uno del " ensayo, las células fueron transferidas a un medio RPMI 1640 completo fresco con 10% dé suero que contenía Epo (5 ng/ml) (10% de suero donador de becerro, L-glutamina 4mM, suplementado con 5ng/ml de rhuEPO) . Las células fueron cultivadas en los frascos de 75 cm^con 20 mi de cultivo/frasco . El día dos del ensayo, las células fueron transferidas- del frasco (de los frascos) a un tubo cónico de 50 mi y sometidas a centrifugación a 1,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos a temperatura, ambiente. El medio antiguo fue desechado y las células fueron lavadas dos veces con 10 mi de medio de deprivación (suero de becerro donador al 3%, L-glutamina 4mM) . Las células fueron resuspendidas en medio de deprivación, utilizando movimiento ascendente y descendente de una pipeta para obtener una sola suspensión -celular. Para determinar la densidad de células, las células resuspendidas fueron divididas con el medio de deprivación a una densidad de 4 x -10° células/ml con un volumen total de cultivo de 10 mi y colocadas en un frasco de 25 cm2. La mezcla fue - incubada durante 4 horas en un incubador humidificado con C02 al 5% a una temperatura de 37°C. Durante la última hora de incubación, se preparó una placa de 96 pozos. Al final de la incubación de 4 horas, los cultivos de células fueron removidos del incubador y las células fueron transferidas de un frasco a un tubo cónico de 50 mi. Los contenidos fueron mezclados manualmente para mantener las células suspendidas. Se agregaron 50 mi de medio de deprivación como el medio bruto sin células. Cinco pozos fueron las células de control sin reactivo. La siguiente fila adyacente de pozos contenia la concentración más baja de citocinas recombinant.es protectoras de tejido. Cada fila adyacente de pozos posteriormente fue llenada con concentraciones secuencialmente más grandes. Los cultivos de células que fueron incubados en medio con suero al 3% y sin Epo fueron colocados en platos a razón de 200,000 células/ml y .100 µ? por pozo en placas de 96 pozos. Los contenidos fueron mezclados breve y cautelosamente, utilizando' la plataforma de vibración orbital asentada en la parte superior de la. placa de agitación. La placa fue incubada con concentraciones diferentes de variantes de Epo (de 0.2 pM a 20 nM) durante 48 horas en medio RPMI 1640 que contenia suero al 3% en un incubador humidificado con C02 al 5%a 37 °C. El dia. cuatro del ensayo, la placa de 96 pozos fue removida del incubador y colocada a temperatura ambiente en la campana de flujo laminar. Inmediatamente, la bioactividad es cuantificada (absorción espectrofotométrica a 450 nm, restada de la absorción de fondo a 620 nm) mediante la medición de producto formazan formado durante el metabolismo celular del colorante de tetrazolio WSST1, que se correlaciona con la viabilidad celular/número de células. Resultados Las células UT7 presentaron un crecimiento estable y confiable en medio que contenia Epo durante 3 meses. K45D indujo un incremento de la viabilidad de las células UT-7 dependiente de Epo en forma dependiente de la dosis con una ECso de 294.0. En comparación, la EC30 fue de 58.13 para Epo (Figura 35) y 608 para Epo marcado con His (WT) . S100E no incrementó la viabilidad (más del 50%) de las células UT-7 dependiente de Epo en concentraciones <50 nM (es decir, dentro del -rango medible) . Por consiguiente, K45D presentó potencia del mismo orden de magnitud que Epo, mientras S100E mostró uña potencia por lo menos 1000 veces menos en comparación con Epo . R103E no incrementó la supervivencia de las células UT-7 dependientes de Epo en concentraciones hasta 20 nM, es decir, su potencia comparada con Epo fue por lo menos cuatro 'órdenes de magnitud menor. R150E indujo la supervivencia de las células UT-7 dependiente de Epo en forma dependiente de la dosis, con una EC50 de 20 nM. En comparación, la EC5Q fue de 66.5 para Epo (Epo#4) (Figura 36). Por consiguiente, R150E presentó una potencia tres órdenes .de magnitud inferior en comparación con Epo. La Figura 35 muestra curvas de concentración de. respuesta de Epo, K45D y S100E en células UT-7. Concentraciones diferentes de Epo, EpoWt, K45D y S100E se agregaron a células UT-7. La viabilidad fue medida 48 horas después en. el ensayo WST-1. Los datos son la media + desviación estándar de tres experimentos diferentes cada uno efectuado por duplicado. La curva es un ajuste de curva de regresión no lineal. "La Figura 36 muestra curvas de dosis-respuesta de Epo, R103E y R150E en células UT-7. Diferentes concentraciones, de Epo, Epo T, R103E y R150E se agregaron a células UT-7. La viabilidad fue medida 48 horas después en el ensayo WST-1. Los datos la media + desviación estándar tres experimentos diferentes cada uño efectuado por duplicado. La curva es un ajuste de curva de regresión no lineal. 6.18. EJEMPLO 18: PROTECCIÓN DE ISQUEMIA RETINAL POR CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO ADMINISTRADAS PERIFÉRICAMENTE. De conformidad con lo descrito en la Sección 6, 9, las células retínales son muy sensibles a la isquemia de tal manera que muchas mueren después de 30 minutos de estrés isquémico. En este experimento, se utilizó otra vez el modelo de glaucoma reversible de rata descrito por Rosenbaum y colaboradores (1997; Vis. Res. '37:3443-51). Se examinaron los efectos de citocinas recombinantes protectoras de tejido sobre el estrés isquémico Un ojo de cada una de las ratas fue lesionado de conformidad con el protocolo presentado en el ejemplo ofrecido en la Sección 6,9 para inyección salina en la cámara anterior del ojo de rata adulta, macho. Al momento de al reperfusión, es decir, .cuando la presión en la . cámara anterior del ojo es liberada, las ratas recibieron una administración de 10 µg/kg de EPO, uno de cuatro citocinas recombinantes protectoras de tejido: R103E, R150E, S100E, y S.100c/K45D, o solución salina, en forma intravenosa. Los días 1, 3, 5 y 6 después de la lesión, se efectuaron electrorretinogramas tanto en el ojo lesionado -como en el ojo normal de cada rata. La latencia en el ojo dañado de cada rata fue comparada con la latencia en el ojo normal de la misma rata. Los datos fueron registrados como la proporción entre la latencia del ojo dañado y la latencia del ojo normal resultando en una proporción de uno cuando el ojo dañado tenia una función normal. Existen dos componentes de los resultados de la lesión: Amplitud (la diferencia del pico al valle como se muestra en la Figura 17, Panel A, indicado por "b") y Latencia, 'el tiempo que se requiere para alcanzar el pico en respuesta al estimulo. La Figura 38 muestra la proporción entre la latencia del ojo lesionado y la latencia del ojo normal para los varios regímenes de tratamiento. La rata tratada con EPO presentó una latencia de 1.2, que es mejor que la rata tratada con solución salina. Cada una de las cuatro citocinas recombinantes protectoras de tejido resultó en latencia igual o mejor que EPO con R103E, R150E, y S100E mostrando una mejor estadística en comparación con la solución salina. La invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades específicas descritas que se contemplan como ilustraciones particulares de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas aquí serán aparentes a las personas con conocimientos en la materia a partir de la descripción anterior y de los dibujos adjuntos. Tales modificaciones caen "dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias mencionadas aquí se incorporan por referencia en sus totalidades y para todos los propósitos.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> enneth S. Warren Industries, Inc. H. Lundbeck A/S <120> CITOCINAS RECOMBINANTES PROTECTORAS DE TEJIDO Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN PARA LA PROTECCIÓN, RESTAURACIÓN Y MEJORA DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ORGANOS RESPONDEDORES <130> 10165-022-999 <140> <141> <150> 60/392,455 <151> 2002-07-01 <150> 60/393,423 <151> 2002-07-03 <160> 212 <170> Patentln versión <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Gln Arg Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Phe Leu Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: muteina <400> 5 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 ¦ 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 40 45 Ala Glu 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Secuencia Artificial: muteina <400> 69 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 ' 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu „ 40 45 Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly ?? 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Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 120 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 120 gtctactcca atttcctcga gggaaagctg aagctg 36 <210> 121 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 121 gcttcagctt tccctcgagg aaattggagt agac <210> 122 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 122 ccgtcagtgg ccttgagagc ctcaccactc tg 32 <210> 123 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 123 cagagtggtg aggctctcaa ggccactgac gg 32 <210> 124 ' <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 124 ccgtcagtgg ccttgagagc ctcaccactc tg 32 <210> 125 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 125 cagagtggtg aggctctcaa ggccactgac gg 32 <210> 126 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<213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 132 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 133 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 133 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 134 ¦ <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 134 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag <210> 135 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 135 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 136 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 136 ctccggggaa agctggcgct gtacacaggg ga <210> 137 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 137 tcccctgtgt acagcgccag ctttccccgg ag 32 <210> 138 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 138 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 139 ¦- <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 139 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 140 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 140 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg <210> 141 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 141 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact <210> 142 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 142 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc <210> 143 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 143 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca <210> 144 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 144 ctctgggagc ccaggcggaa gccatctccc ct <210> 145 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 145 aggggagatg gcttccgcct gggctcccag ag 32 <210> 146 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 146 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 147 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 147 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 148 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 148 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg 35 <210> 149 ¦ <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 149 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 150 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 150 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc <210> 151 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 151 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc <210> 152 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 152 .. . agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg <210> 153 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 153 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 154 ¦ <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 154 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 155 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 155 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt <210> 156 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 156 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc <210> 157 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial 220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 157 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 158 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 158 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 159 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 159 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 160 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 160 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 161 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 161 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca <210> 162 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 162 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 163 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 163 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 164 · <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 164 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 165 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : -primer o cebador <400> 165 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 166 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 166 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc <210> 167 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 167 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca 33 <210> 168 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 168 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 169 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 169 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 170 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 170 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg <210> 171 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 171 caggcataga aattaactgc 35 <210> 172 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 172 agttaatttc tatgcctggg 35 <210> 173 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de <400> 173 cgacctccat cctcgcccag 35 <210> 174 ' <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 174 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 175 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 175 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca <210> 176 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 176 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 177 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 177 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 178 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 178 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 179 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 179 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 180 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 180 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg <210> 181 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 181 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact 35 <210> 182 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 182 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 183 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 183 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 184 · <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 184 tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc 33 <210> 185 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 185 ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca <210> 186 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 186 atttcctccg gggagcgctg aagctgtaca cag 33 <210> 187 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 187 ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat 33 <210> 188 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 188 actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg 35 <210> 189 · <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 189 caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt 35 <210> 190 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 190 agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg <210> 191 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 191 cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact <210> 192 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 192 gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc 35 <210> 193 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <22'3> "' Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 193 gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc 35 <210> 194 ¦ <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 194 ctccggggag cgctggcgct gtacacaggg ga 32 <210> 195 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 195 tcccctgtgt acagcgccag cgctccccgg ag <210> 196 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 196 caaggaggcc gagaaaatca cgacgggctg t <210> 197 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 197 .. . acagcccgtc gtgattttct cggcctcctt g <210> 198 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 198 actgcagctt gaatgagaaa atcactgtcc cagacac <210> 199 ' <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 199 gtgtctggga cagtgatttt ctcattcaag ctgcagt <210> 200 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 200 . aggccctgtt ggtcaaatct tcccagccgt g 31 <210> 201 <211> 31 <212> ADN <213> Artifi <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 201 cacggctggg aagatttgac caacagggcc t 31 <210> 202 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 202 atttcctccg gggatggctg aagctgtaca cag 33 <210> 203 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 203 ctgtgtacag cttcagccat ccccggagga aat 33 <210> 204 · <211> 35 <212> ADN <213> Artifi. <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 204 agccgagtcc tggaggcggc cctcttggag gccaa 35 <210> 205 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 205 ttggcctcca agagggccgc ctccaggact cggct 35 <210> 206 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 206 agccgagtcc tggagagggc cctcttggag gccaa <210> 207 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primer o cebador <400> 207 ttggcctcca agagggccct ctccaggact cggct 35 <210> 208 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 208 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt- ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggcLc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 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tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 209 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 209 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg ageagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaaccr ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tetattettt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccage 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcecea ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 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ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg 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atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg 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ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgotgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccácgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtcgggt 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catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg 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acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttasgga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059 <210> 212 <211> 6059 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: plásmido <400> 212 ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg 60 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 120 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 180 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 240 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct 300 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 360 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 420 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 480 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt '540 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 600 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 660 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 720 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 780 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt 840 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc 900 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc 960 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1020 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1080 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 1140 ctccgcccat cccgcccctá actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 1200 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 1260 agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa 1320 cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 1380 tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 1440 ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 1500 cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca -ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 1560 cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 1620 gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 1680 gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 1740 cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 1800 tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 1860 cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1920 ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1980 gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 2040 gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 2100 gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 2160 gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt 2220 attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt 2280 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 2340 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 2400 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 2460 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2520 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2700 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2760 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2820 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2880 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2940 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 3000 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3060 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3120 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3180 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3240 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3300 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3360 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3420 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3480 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3540 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3600 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3660 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3720 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3780 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3840 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3900 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3960 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 4020 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4080 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4140 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4200 tctttatagt cctgtogggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4260 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4320 cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata 4380 ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 4440 ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat 4500 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 4560 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 4620 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 4680 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 4740 tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 4800 tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 4860 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 4920 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 4980 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc 5040 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 5100 gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 5160 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc 5220 agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 5280 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 5340 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat 5400 tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga 5460 gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 5520 tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 5580 gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 5640 cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctggaagag 5700 gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 5760 tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 5820 gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg 5880 agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 5940 cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 6000 gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat 6059

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una citocina recombinánte protectora de tejido muteina que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos , acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trombocitos, la citocina comprende por lo menos una actividad de protección celular de respuesta seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor.
2. Lá citocina recombinánte protectora de tejido de la reivindicación 1, que comprende uno o varios residuos de' aminoácidos alterados entre la posición 11 y la posición 15 [SEQ ID NO: 1], entre la posición 44 y la posición 51 de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 2], entre la posición 100 y la posición 108 de SEQ ID NO [SEQ ID NO: 3], o entre la posición 146 y la posición 151 de SEQ ID NO: 10 [SEQ ID NO: 4].
3. La citocina recombinánte protectora de tejido de la reivindicación 1, que comprende un residuos alterado de aminoácido en una o varias de las posiciones siguientes de SEQ ID NO: 10: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 ó 161.
4. La citocina recombinánte protectora de tejido de la reivindicación 1, qué -, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 con una varias de las sustituciones de residuos de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15-105 y 119.
5. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con una deleción de residuos de aminoácidos 44-49 de SEQ ID NO: 10.
6. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con por lo menos una de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos de SEQ ID NOs: 106-118.
7. La citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además una modificación de química de uno o varios aminoácidos .
8. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 7, en donde la modificación química comprende la alteración de la carga de la citocina recombinante protectora de tejido.
9. La citosina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 8, en donde una carga positiva o negativa es agregada químicamente a un residuo de aminoácido en donde un residuo de aminoácido cargado es modificado a un residuo no cargado. •
10. La citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha citocina es una muteina de eritropoyetxna humana.
11. La citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha citocina es una muteina de fenilglioxal eritropoyetina humana .
12. La citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula de mamífero respondedora comprende una célula neuronal, muscular, cardiaca, pulmonar, hepática, renal, de intestino delgado, de corteza adrenal, de médula adrenal, capilar, endotelial, de testículo, de ovario, endometrial, o progenitora .
13. La célula de mamífero respondedora a citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende una célula de fotorreceptor, ganglio, bipolar, horizontal, amacrina, Mueller, miocardio, marca paso, nodo sinoatrial, nodo sinusal, nodo atrioventricular, fascículo de His, hepatocito, estelato, Kupffer, mesangial, de Goblet, de glándula intestinal,' endocrina enteral, glomerulosa, fasciculada, reticular, cromafina, pericito, Leydlg, Sertoli, esperma, folículos Grafianos, folículos primordiales, estroma endometrial, y célula endometrial.
14. La citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha citocina puede atravesar una barrera de células endoteliales .
15. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 14, en donde la barrera de células endoteliales comprende la barrera hematoencefálica, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato testicular, la barrera hemato ovariana, y la barrera hemato uterina.
16. La citocina recombinante protectora de tejido de · cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha citocina se selecciona dentro del grupo que consiste de: i. una citocina que tiene .un número reducido de porciones de ácido siálico o ninguna porción de ácido siálico; ii . una citocina que tiene un número reducido de carbohidratos enlazados con N o enlazados con O o bien ningún carbohidrato enlazado con N o enlazado con O; iii. una citocina que tiene por lo menos un contenido reducido de carbohidrato en virtud de tratamiento de citocina nativa con por lo menos un glicosidasa; iv. una citocina que tiene por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados; v. uria citocina que tiene por lo menos uno o varios carbohidratos oxidados y es químicamente reducida; vi . una citocina que tiene por lo menos uno o varios residuos de arginina modificados; vii. una citocina que tiene por lo menos uno o varios residuos de lisina modificados o una modificación del grupo amino N-terminal de una molécula de citocina;+ viii. una citocina que tiene por lo menos un residuo de tirosina modificado; ix. una citocina que tiene por lo menos un residuo modificado de ácido aspártico o ácido glutámico; x. una citocina que tiene un residuo triptófano modificado; xi . una citocina que tiene por lo menos un grupo aminoácido removido; xii. una citocina que tiene por lo menos una abertura de por lo menos uno de los enlaces de cistina en la molécula de citocina; xiii. una citocina truncada; xiv. una citocina que tiene por lo menos una molécula de polietilenglicol unida; xv. una citocina que tiene por lo menos un ácido graso unido; xvi. una citocina que tiene un patrón de glicosilación no de mamífero en virtud de la expresión de una citocina recom inante en células no de mamífero"; y xvii. una citocina que tiene por lo menos un aminoácido marcado con histidina para facilitar la purificación " ··
17. .La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una asialoeritropoyetina.
18. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 17, en donde dicha asialoeritropoyetina es asialoeritropoyetina humana.
19. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es hiposialilada o hipérsialilada .
20. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 porciones de ácido siálico .
21. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende más que las catorce porciones de ácido siálico presentes en la eritropoyetina nativa.
22. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con N.
23. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación -22, en donde dicha citocina es una eritropoyetina sin carbohidratos enlazados con 0.
24. La citocina xecombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en. donde dicha citocina es tratada con por lo menos una glicosidasa.
25. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es eritropoyetina oxidada con periodato.
26. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 25, en donde dicha eritropoyetina oxidada con periodato es químicamente reducida con cianoborohidruro de sodio. +
27. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende una porción R-glioxal en el residuo arginina o en los varios residuos de arginina, en donde R es arilo o una porción alquilo.
28. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 27, en donde dicha citocina es fenilglioxal-eritropoyetina .
29. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una eritropoyetina en donde un. residuo de arginina es modificado por reacción con una dicetona vicinal seleccionada dentro del grupo que consiste de 2 , 3-bútandiona y ciclohexandiona .
30. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una eritropoyetina en la cual un residuo de arginina reacciona con 3-desoxiglucosona .
31. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una molécula que tiene por lo menos un grupo amino N-terminal o una lisina biotinilada.
32. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina es una glucitolil lisina eritropoyetina o fructosil lisina eritropoyetina .
33. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de lisina carbamilada.
34. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 33, en donde dicha citocina carbamilada consiste de alfa-N-carbamoileritropoyetina; N-epsilon-carbamoileritropoyetina; alfa-N-carbamoil, N-epsilon-carbamoileritropoyetina; alfa-N-carbamoilasialoeritropoyetina; N-epsilon-carbamoilasialoeritropoyetina; alfa-N-ca'rbamoil, N-epsilori-carbamoilasialoeritropoyetina; alfa-N-carbamoilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-carbamoil, N-epsilon-carbamoilhiposialoeritropoyetina .
35. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de lisina acilada.
36. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 35, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de lisina acilada.
37. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 36, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de lisina acilada.
38. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 37, en donde dicha citocina asilada consiste de alfa-N-acetileritropoyetina; N-epsilon-acetileritropoyetina; alfa-N-acetil, N-epsilon-acetileritropoyetina; alfa-N-acetilasialoeritropoyetina; N-epsilon-acetilasialoeritropoyetina; alfa-N-acetil, N-epsilon-acetilasialoeritropoyetina; alfa-N-acetilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-acetilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-acetil, N-epsilon-acetilhiposialoeritropoyetina .
39. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 35, en donde un residuo de lisina de dicha citocina es succinilado.
40. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 39, en donde dicha citocina succinilada comprende alfa-N-succinileritropoyetina; N-epsilon-succinileritropoyetina; alfa-N-succinil, N-epsilon-succinileritropoyetina; alfa-N-succinilasialoeritropoyetina; N-epsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinil, N-epsilon-succinilasialoeritropoyetina; alfa-N-succinilhiposialoeritropoyetina; N-epsilon-succinilhiposialoeritropoyetina; y alfa-N-succinil, N-epsilon-succinilhiposialoeritropoyetina.
41. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de lisina modificado por 2,4,6-trinitrobencensulfonato sódico o una sal del mismo.
42. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende por lo menos un residuo de tirosina nitrado o yodinado.
43. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha citocina comprende un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico que reacciona con una carbodiimida seguido por reacción con una amina.
44. La citocina recombinante protectora de tejido de la reivindicación 16, en donde dicha amina es glicinamida.
45. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
46. ün vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 45.
47. un vector de expresión que comprenae una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 45 y por lo menos la región reguladora enlazada operativamente a la molécula de ácido nucleico.
48. El vector de la reivindicación 46 o de la reivindicación 47 que es un vector pCiNeo.
49. Una célula genéticamente modificada que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 45.
50. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 45.
51. Una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trombocitos, la citocina tiene por lo menos una actividad protectora celular respondedora seleccionada dentro del grupo que consiste de protección, mantenimiento, mejora o restauración de la función o viabilidad de una célula, tejido u órgano de mamífero respondedor.
52. La composición farmacéutica de la reivindicación 51, formulada para administración oral, intranasal, o parenteral.
53. La composición farmacéutica de la reivindicación 51, formulada como solución de perfusado.
54. Un método para la protección, mantenimiento, o mejora de la viabilidad de una célula, tejido u órgano aislado de un cuerpo de mamífero, que comprende la exposición de dicha célula, tejido u órgano a una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido muteina.
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, en donde la protección no afecta la médula ósea.
56. Un método para proteger, mantener o mejorar la viabilidad de una célula, tejido u órgano aislado de un cuerpo de mamífero, dicho método comprende la exposición de dicha célula, tejido u órgano a una composición farmacéutica que comprende una citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de un nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad procoagulante e incremento de la producción de trombocitos .
57. El uso de una citocina recombinante protectora de tejido 'de cualquiera de la reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del-grupo que consiste de nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulante y producción incrementada de trombocitos, para la preparación de una composición farmacéutica para la protección contra una lesión tisular y prevención de una lesión tisular asi como para la restauración del rejuvenecimiento de tejido y función tisular en un mamífero.
58. El uso de la reivindicación 57, en donde la lesión es causada por padecimiento de ataque, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, infarto del miocardio, inflamación, pérdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, daño por radiaciones, parálisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad, de Leigh, demencia por SIDA, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, alcoholismo, trastorno del humor, trastorno de ansiedad, trastorno de déficit de atención, autismo, enfermedad de Creutezfeld-Jakob, trauma o isquemia cerebral o de médula espinal, desvío cardiaco-pulmonar, insuficiencia cardiaca crónica, degeneración macular, neuropatía diabética, retinopatía diabética, glaucoma, isquemia retinal, o trauma retinal .
59. Un método para facilitar la transcitosis de una molécula a través de una barrera de células endoteliales en un mamífero que comprende la administración a dicho mamífero de una composición que comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos una actividad seleccionadas dentro del grupo que consiste de nivel incrementado de hematocritos, presión sanguínea incrementada, hiperactivación plaquetaria, e incremento de la producción de trombocitos .
60. El método de la reivindicación 59, en donde dicha asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula.
61. El método de la reivindicación 59, en donde dicha barrera de células endoteliales se selecciona dentro del grupo que consiste de la barrera de células endoteliales comprende la barrera hematoencefálica, la barrera hemato-ocular, la barrera hemato testicular, la barrera hemato ovariana, la barrera hematc cardiaca, la barrera hemato renal, y la barrera hemato placental.
62. El método de la reivindicación 59, en donde dicha molécula es una hormona agonista o antagonista de receptor, un factor neurotrófico, un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un inmunosupresor, un colorante, ' un marcador, o un fármaco anti-cáncer.
63. Una composición para transportar una molécula por transcitosis a través de una barrera de células endoteliales, dicha composición comprende dicha molécula en asociación con una citocina recombinante protectora de tejido, de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos la actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de un nivel incrementado de hematócritos , acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad procoagulante e incremento de la producción de trombocitos.
64. La composición de la reivindicación 63, en donde dicha asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula.
65. La composición de la reivindicación 63, en donde dicha molécula es una hormona agonista o antagonista de receptor, un factor neurotrófico, un agente antimicrobiano, un radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un inmunosupresor, un colorante, un marcador o un fármaco anti-cáncer.
66. El uso de una citocina recombinante protectora de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que no tiene por lo menos una actividad seleccionada dentro del grupo que consiste de un nivel incrementado de hematócritos, acción vasoactiva, hiperactivación plaquetaria, actividad pro-coagulánte e incremento la producción de trombocitos.
67. El uso de la reivindicación 66, en donde dicha asociación es un enlace covalente lábil, un enlace covalente estable, o una asociación no covalente con un sitio de enlace para dicha molécula.
68. El uso de la reivindicación 66, en donde dicha molécula es una hormona agonista o antagonista de receptor, un factor neurotrófico, un agente antimicrobiano, un radiofarmacéutico, un oligonucleótido de antisentido, un anticuerpo, un inmunosupresor, un colorante, o un marcador, o un fármaco anti-cáncer.