JPH07509599A - キメラ受容体ポリペプチド，ヒトｈ１３タンパク質，ならびにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラ受容体ポリペプチド、ヒトＨ１３タンパク質、ならびにその使用 本発明はウィルス学ならびに分子遺伝学の分野に属するもので、ウィルスおよび ／またはウィルスの外膜のタンパク質結合ドメインと結合する、哺乳類の変異型 のウィルス受容体ポリペプチドを含む核酸、方法、およびタンパク質に関するも のであり、本発明は、それらの製造方法、ならびに遺伝子治療をはじめとする診 断および治療の用途等でのそれらの使用にも関するものである。

背景技術の説明 ウィルスによる細胞の感染は、細胞のウィルス受容体にウィルスが付着すること から始まる。多数のウィルス特異的な細胞受容体が特定されており、こうした受 容体分子の大半が、他の既知の細胞機能を有している。

こうしたウィルス結合性のタンパク質、すなわち受容体が発現していることが、 ウィルス感染に対する感受性を決定する強力な要因である。ウィルスの外膜のタ ンパク質（ｅ　ｎ　ｖ）が標的細胞に融合する際には、ウィルスが結合すること が必要である。この融合は、細胞表面で生じることも、受容体依存性エンドサイ ト−シスの後に酸性となったエンドソーム内で生じることもある（Ｗｈｉｔｅ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｑｕａｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１６：　１５１ −１９５．１９８３）。

この融合の後で、ピリオンのコアが細胞質に入りこみ、ウィルスの複製過程が開 始される。たとえば、ＨＩＶの場合、ＣＤ４以外の細胞表面分子も、ウィルスが ヒト細胞に入りこむ際に重要な役目を果たしていることが、最近の研究によって 示唆されている。

エコトロピックならびにアンフォトロピックマウスレトロウイルス受容体、なら びに感染 エコロトピック（種特異的）マウス白血病ウィルス（Ｅ−ＭｕＬＶ）、あるいは アンフォトロビック（種非特異的）マウス白血病ウィルス（Ｅ−ＭｕＬＶ）によ る感染に対する細胞の感受性も、ウィルス外膜の膜受容体に対する結合性によっ て判定することができる。

ウィルス干渉検定にもとづいて、４種の特異的ＭｕＬＶ受容体が想定されている 。すなわち、（ａ）Ｅ−ＭｕＬＶに対する受容体、（ｂ）野性型アンフォトロピ ックＥ−ＭｕＬＶに対する受容体、（ｃ）Ｅ−ＭｕＬＶから誘導した組換え型ウ ィルス、たとえば「ミンク細胞フォーカス誘導性」、すなわちＭＣＦウィルスに 対する受容体、ならびに（ｄ）アンフォトロピックＭｕＬＶから誘導した組換え 型ウィルスに対する受容体である（Ｒｅｉｎ、　Ａ、　ｅ＋　ａｌ、、　Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　１３６：　１４４−１５２．１９８４）。

最近、マウスエコロトピックレトロウイルス受容体（ｅｃｏｔｒ。

ｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　、　ＥＲＲ）をコードする ｃＤＮＡのクローン（Ｗｌと称する）（配列番号４）が特定された（Ａｌｂｒｉ ｔｔ。

ｎ、　Ｌ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５７：　６５９−６６６、１９８ ９）　、この研究によって、Ｅ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖの感染に対する感受性が、ヒ ｈＥＪ細胞での単一のマウス遺伝子の発現によって獲得されるものであることが 実証された。

ウィルス受容体依存性組織特異性 ＨＩＶは、受容体依存性の組織限定を示すウィルスの一例で、この組織限定が、 ウィルスが一次受容体としてＣＤ４タンパク質を使用していることに基づくこと は明らかである。しかし、細胞特異的受容体が、組織特異性の唯一の決定要因で あるとは考え難い。レトロウィルスが有する組織指向性は、種々の要因、たとえ ば、長末端反復の組織特異性、ウィルスｅｎｖタンパク質の変異、細胞の要因、 適当な細胞表面受容体の発現などが複雑に絡み合った結果である可能性が高い（ Ｋａｂａｔ、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１ｍｍｕｎｏ１． １４８＋　１−３１．１９８９　）。

±ｅａ（Ｔ細胞早期活性化、Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅａｒｌｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ 　）遺伝子（配列番号５）、たとえばクローン２０．　５　（ＭａｃＬｅｏｄ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１：　２７１−２７９．１９ ９０　）は、Ｔ細胞が活性化される間に誘導される多重賞膜タンパク質をコード する能力があるクローニングされた遺伝子、すなわちｃＤＮＡの最初の例である （Ｃｒａｂｔｒｅｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　３５５−３６１．１９８９ ）　ｏ　ｔ　ｅ　ａ遺伝子の機能は、まだわかっていない。

２０．５ｃＤＮＡ　（配列番号５）の配列は、上述のマウスＥＲＲｃＤＮＡクロ ーン（配列番号３）と、驚くほどの相同性を有していた（Ｒｅｃ−１遺伝子）。

レトロウィルスの結合ならびに感染に関する研究では、ｔｅａによってコードさ れるタンパク質が、ウィルス受容体として機能しているのか否かを決定する必要 が生じている（Ｒｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３６：　１４ ４−１５２．１９８４）。

１！互とＥＲＲは高度の相同性を有するものの、双方の遺伝子は、染色体上の位 置も異なっているし、想定されるタンパク質生成物の組織での発現パターンも異 なる。

遺伝子治療ならびに遺伝子の搬送 遺伝子の搬送を達成するうえで、比較的効率は良いものの、問題の多い手段の一 つが、アンフォトロピックレトロウィルス依存性の遺伝子の搬送（Ｇｉｌｂｏａ 、　Ｅ、、　Ｂｌｏ−Ｅｓ５ａｙｓ　５：　２５２−２５８．１９８７；　Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：　４７６ −４８０．１９８４；　Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＲＮＡ　Ｔ ｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５　）である。

組換え型のアンフォトロピックレトロウィルスが、ヒト細胞に遺伝子を搬送する 際のベクターとして使用する可能性を有するものとして、研究されている（Ｃｏ ｎｅ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８１：　６３４９−６３５３．１９８４；　Ｄａｎｏｓ、　０ １ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：　６４６０−６４６４．１ ９８８）　、こうした研究が行われるのは、この種のアンフォトロピックウイル ス、たとえばマウスアンフォトロビックＥ−ＭｕＬＶがヒト細胞に感染しつるか らである。こうしたアプローチにつきものの、臨床展開を阻みかねない安全上の 問題の一つが、複製能欠損性としたアンフォトロビックのレトロウィルスであっ ても、複製能を生じてしまうような組換えによって、野性型の変種を生じること があるという事実である。こうした変化は、遺伝的な改変を意図していなかった 細胞や組織にまで、レトロウィルスによる感染が拡大するといった事態を引き起 こしかねない。その結果、全身性の疾患、たとえば癌をはじめとする病的状態が 生じる可能性もあり、これは、アンフォトロビックウィルスの核酸が、長末端反 復の核酸とともに細胞内の重要な機能性遺伝子に挿入され、機能性遺伝子が破壊 されて病的状態が生じることによるものである（　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，、 ５ｃｉｅｎｃｅ、　１９９３）。本発明は、こうした必要性にこたえ、こうした 問題を解決することをもめざすものである。

このように、既知のアンフォトロピックレトロウィルスを使用して異種遺伝子を 真核細胞に導入するのに伴う問題を一つならず克服することが必要とされている 。ウィルスと結合し、免疫原性、ならびにマウスアンフオトロピツク組換え型ウ ィルスを使用した際に見られる非特異的な細胞との結合という問題を生じること なく診断ならびに治療の用途に使用することのできるヒトウィルス受容体タンパ ク質を提供することも必要とされている。

本明細書では種々の文献を引用しているが、引用した文献が、本出願の請求の範 囲のいずれかの特許性と格別の関連を有する従来技術あるいは考慮材料であると いうことではない。引用した文献の内容や日付けについての記載は、本出願の出 願時に出願人が有していた情報に基づくものであって、それらの記載が正確であ ると確言するわけではない。

発明の開示 本発明は、関連背景技術の欠陥を一つならず克服することを意図するものである 。

本発明は、治療および／または診断上の効果を有する核酸を標的細胞まで運搬し つる、安全性および／または選択性が向上し、核酸が非特異的に細胞に組みこま れたり、付随したりすることの少ない、新規かつ／または優れた遺伝子治療の方 法を提供することも意図するものである。

本発明では、こうした選択的な遺伝子治療を、選ばれた標的細胞に付随している 可能性のある本発明のキメラ受容体ポリペプチドに結合しつるウィルス結合ドメ インを有するベクターを使用することによって提供するものである。標的細胞は 、キメラ受容体ポリペプチドが付随することによって、標的細胞の種以外の種の ウィルス結合ドメインにとって選択性となっている。この変異型受容体ポリペプ チドは、第一の種である標的細胞と同じ種のウィルス受容体の結合部位を有して おり、この結合は、第一の種以外の種に特異的なウィルスとも結合するよう改変 されている。

本発明は、少なくとも第一の種に特異的なウィルスの受容体の結合部分に対応し 、第一の種以外の種に特異的なウィルスによる結合および／または感染、あるい は、少なくとも、第一の種以外の種に特異的なウィルスの外膜のタンパク質（ｅ ｎｖ）の結合性ドメインによる結合を許容するよう改変されているキメラ受容体 ポリペプチドも提供せんとするものである。キメラ受容体ポリペプチドのアミノ 酸配列で、キメラ受容体ポリペプチドのウィルス受容体の結合部位の改変部分を 含むアミノ酸配列を、キメラ受容体の結合部位と称するものとする。この配列の 使用は、その起源にかかわらず、キメラ受容体の概念で具体化されるものとする 。

また、キメラ受容体ポリペプチドは、第一の種以外の種に特異的なウィルスのウ ィルス受容体結合部位の少なくとも１個のアミノ酸に対応する少なくとも１つの アミノ酸の置換、欠失、あるいは付加を生じるよう改変された第一種ウィルス受 容体の結合部位の配列も含むことができるものである。こうした置換、欠失ある いは付加によって、キメラ受容体ポリペプチドの、第一の種以外の種に特異的な ウィルスのｅｎｖ結合ドメインに結合する能力が付与されるのである。第一の種 は、ヒト、霊長類、あるいはげっ歯頚の種から選ぶのが好ましい。

キメラ受容体ポリペプチドは、単離、精製された、組換え型および／または有機 合成ポリペプチドとして提供されるものである。したがって、得られたキメラ受 容体ポリペプチド、あるいは、そうしたキメラ受容体ポリペプチドがその表面に 発現あるいは付随しているキメラ受容体細胞は、第一の種以外の種に特異的なウ ィルスあるいはその結合性ドメインによって、インビボ、インシチュ、あるいは インビトロで結合および／または感染されうるものである。

したがって、本発明は、本明細書に提示する教示内容ならびに指針にもとづいて 、過度の実験をおこなわなくても実施することのできる、すべての化合物、組成 物、ならびにこの種のキメラ受容体ポリペプチドを製造ならびに使用する方法を 包含するものである。

さらに、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、診断、研究あるいは治療、たと えばヒトの遺伝子治療あるいは癌の治療あるいは診断などの用途で、キメラ受容 体ポリペプチドのキメラ受容体結合部位がその表面に発現あるいは付随している 細胞を選択的に標的とする際に使用することも意図するものである。なお、用途 はこれらに限定されるものではない。

本発明の一つの観点では、キメラ受容体ポリペプチドは、第一の秤取外の種に特 異的なウィルス、あるいはそのｅｎｖ結合性ドメインを、キメラ受容体ポリペプ チドが発現あるいは付随している標的細胞に対して選択的に結合させる際に使用 することができる。第一の秤取外の種に特異的なウィルス、あるいはそのｅｎＶ 結合性ドメインを含む複合物は、標的細胞特異的な運搬ベクターとして、少なく とも１種の診断薬あるいは治療薬を、標的細胞あるいは組織に運搬する際に使用 することができる。

本発明は、この種のキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸、および／また はこの種のキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞あるいは組織を提供するこ とも意図するものである。

このように、本発明は、関連技術での種々のアプローチと比べて安全性が改善さ れていると評価される、１種以上の治療薬および／または診断薬を含む運搬ベク ター、たとえば遺伝子治療に適したベクターを提供することを意図するものであ る。特に、本発明は、キメラ受容体細胞である標的細胞、あるいは細胞表面キメ ラ受容体ポリペプチドを発現している組織とのみ実質的に結合する、治療薬およ び／または診断薬用の物質を細胞あるいは組織特異的運搬ベクターの使用を可能 とするものである。この運搬ベクターは、非標的細胞あるいは組織に対する結合 性および／または感染性が実質的に低減しているか、実質的にない。

本発明は、第一の種のキメラ受容体細胞に付随する、すなわち、第一の種のキメ ラ受容体細胞表面上での、キメラ受容体ポリペプチドの過渡的あるいは構成的な 発現を使用することによって、真核生物、たとえば哺乳動物、鳥類、昆虫、ある いは酵母の選ばれた細胞あるいは組織に対する、インビトロ、インシチュ、ある いはインビボでの遺伝子治療を提供することも意図するものである。こうしたキ メラ受容体細胞あるいは組織は、第一の秤取外の種に特異的なウィルスベクター 、あるいはそのｅｎｖ結合ドメインによる排他的な感染、あるいは結合に対して 感受性となっているのである。

非ヒト特異的ウィルスベクターあるいは結合部位の感染によって、遺伝子、たと えば治療用遺伝子が、インビボ、インシチュ、あるいはインビトロで、選ばれた 細胞あるいは組織に安定的に組みこまれ、この選ばれた細胞あるいは組織によっ て、標的細胞あるいは組織に対する所望の効果を有する遺伝子生成物が発現され ることになる。

本発明は、非標的細胞がウィルスベクターに感染したり、モして／またはウィル スベクターと結合したりすることが実質的にないか、実質的に少ない、特定の標 的細胞あるいは組織に対する遺伝子治療を提供することも意図するものである。

本発明は、さらに、遺伝子治療の治療薬の運搬に使用するウィルスベクターが、 複製可能な状態、あるいはウィルスにパッケージングされうる状態に復帰したり 組みかわったりすることが実質的にないか、実質的に少ない遺伝子治療を提供す ることも意図している。標的細胞は、本発明のキメラ受容体ポリペプチドを発現 しつるか、伴いうるものである。

本発明は、インビボ、インシチュ、あるいはインビトロで、ヒト細胞あるいは組 織のレトロウィルスによる感染を抑制する際に使用することのできることができ るキメラ受容体ポリペプチド、あるいはレトロウィルスポリペプチドを提供する ことも意図するものである。

本発明は、本発明の受容体ポリペプチドを使用して、ウィルス感染症、たとえば レトロウィルス感染症（たとえばＨＩ　Ｖ）を予防あるいは治療する方法も提供 するものである。なお、適用症例は、これらに限定されるものではない。

本発明は、８１３分子、あるいはＨ１３アミノ酸配列島るいはその突然変異体に 実質的に対応する配列、あるいはＨ１３アミノ酸配列島るいはその突然変異体か ら本質的になる配列をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え型の核酸（配 列番号８）も提供するものであり、ここで核酸は、ＤＮＡあるいはＲＮＡから構 成される。

当業者であれば、以下の詳細な説明から、本発明の上記以外の目的、特徴、なら びに利点を理解しつるはずである。以下の詳細な説明ならびに特定の実施例は、 本発明の好適な実施態様を示すものではあるものの、本発明を例示するためのも のであって、本発明がこれらによって限定されるものではないと理解されたい。

本発明の精神から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの変更ならびに改変 を行うことができ、本発明は、こうした改変をすべて包含するものである。

図面の簡単な説明 図１は、コード配列および非コード配列を含むＨ２Ｓの核酸配列（配列番号７） 、ならびにＨ１３タンパク質の想定されるタンパク質配列（配列番号８）を示す ものである。

図２は、Ｈ２Ｓの一方の鎖とＥＲＲのｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号７なら びに３）を並列させた模式図を示すものである。配列の分析は、ジェネティクス ・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ 　）の配列解析用ソフトウェア・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２：　３８７−３９５゜ １９８４）を使用して行った。

図３は、Ｈ２Ｓ、ＥＲＲｌならびにＴＥＡの想定アミノ酸配列を並列させて示す ものである。縦線は、配列が相同であることを示す。点１つは、配列が相同でな いことを示し、点２つは、同類アミノ酸置換を示す。配列は、図２と同様にして 分析した。括弧内に示すのは、細胞外ドメイン３（残基２１０−２４９）、なら びに細胞外ドメイン４（残基３１０−３３７）に対応するＨ２Ｓの配列である。

図４は、ＥｃｏＲＩで消化しタヒト（ＣＣＬ　１２０．ＣＣＬ１１９．５ｕｐＴ １、Ｈ９、ＭｏＬＴ４）、ハムスター（ＣＨＯ−Ｋｌ）、およびマウス（Ｂａｌ ｂ／ｃ胸腺細胞あるいはＢＩＯＴ６Ｒ）由来の核酸を、マウスＥＲＲのｃＤＮＡ のＫｐｎｌ−ＫｐｎＩ断片（３９０ｂｐ）でプロービングしたものの、ハイブリ ダイゼーションパターンのオートラジオグラムを示す。

図５は、Ｈ２ＳのｃＤＮＡ（配列番号１）を有する種々の種から得た核酸をサザ ンプロットで分析した際のオートラジオグラムを示す。ハイブリダイズした核酸 は、ＥｃｏＲＩで消化したヒ１−（ＣＣＬ１２０　、　ＣＣＬ１１９　、５ｕｐ Ｔ１　、　Ｈ９、ＭＯＬＴ４）、ハムスター（ＣＨＯ−Ｋｌ）　、およびマウス 胸腺細胞（Ｂａｌｂ／ＣあるいはＢＩＯＴ６Ｒ）由来の核酸である。

図６は、Ｈ１３遺伝子の発現のオートラジオグラムを示す。

図に示すヒト株化細胞由来のＲＮＡを、Ｈｌ３のｃＤＮＡ　（配列番号ｌ）とハ イブリダイズさせた。

図７は、ヒト（ＣＥＭ、Ｈ９、ＭＯＬＴ４．５ｕｐＴ１、ＣＣＬＩ　２０．ＣＣ ＬＩ　１９）　、ハムスター（ＣＨＯＫＩ）　、およびマウス（ＲＬ）由来のＲ ＮＡを、マウスＥＲＲｃＤＮＡのＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片（３９０ｂｐ）でブロ ービングしたもツノ、ハイブリダイゼーションパターンのオートラジオグラムを 示す。

図８は、耐性細胞をＥＲＲのｃＤＮＡでトランスフェクションすることによって 、マウスエコロトピックレトロウイルスによる感染に対する感受性が獲得された ことを例証するノーザンプロットを示す。ＥＲＲのｃＤＮＡをハムスターのＣＨ ＯＫｌ細胞にトランスフェクションした後、マウスレトロウィルス受容体遺伝子 を発現しているトランスフェクション生成物に、マウス放射線白血病ウィルス（ ＲａｄＬＶ）を感染させた。２週間後に、ウィルスプローブを使用してノーザン プロットによる分析を行い、細胞上清の逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定した。

図９は、Ｈ１３、ＥＲＲｌならびにＴＥＡの想定タンパク質の親水性をプロット したものである。縦軸は、ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラム（たと えば、Ｊａｍｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＣＡＢＩＯ３４：　１８１−１８６． １９８８を参照のこと）で得られた親水性の値を示す。

図１０は、Ｈｌ３の想定タンパク質の抗原性を示すグラフを示すものであり、Ｈ １３想定タンパク質の抗原性の分析に際しては、ＰＥＰＴ　ＩＤＥＳＴＲＵＣＴ ＵＲＥＴＭプログラムを使用した。

抗原性の高いペプチド部分の１つ（アミノ酸残基３０９−３６７）は、図１４に 示すＡｃｃｌ−ＥｃｏＲＩ断片を使用することによって調製した。

図１１は、Ｈ１３タンパク質をグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ 　Ｔ）とともに含む融合タンパク質が合成されていることを示す、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥのオートラジオグラムを示す。

融合タンパク質は、Ｈｌ３のｃＤＮＡの１８０ｂｐのＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片 を、抗原を融合タンパク質として発現するプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔにライゲー ションし、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）を加える ことによって誘導し、グルタチオン−セファロースクロマトグラフィーを使用す ることによって精製することによって生成した。

図１２ＡおよびＢは、Ｈ１３遺伝子の、ヒト染色体１３への遺伝的マツピングを 示す。オートラジオグラム（図１２Ａ）は、ヒト−ハムスタ一体細胞雑種からの ＥｃｏＲＩで消化した核酸を、Ｈ１３ｃＤＮＡ（配列番号１）でプロービングし たもののハイブリダイゼーションパターンを示す。レーン１ならびに１１は、そ れぞれ、ヒトならびにハムスターの核酸を含むものである。レーン２−１０は、 図１２Ｂの表に記載した染色体から誘導した核酸を含むものである。

図１３は、Ｈ１３遺伝子、ＥＲＲ遺伝子、ならびにＨ１３遺伝子とＥＲＲ遺伝子 の間の４種のキメラ構築物の遺伝的構造の模式図である。各種の構築物によって トランスフェクションされたヒト細胞に対して、Ｅ−ＭｕＬＶが感染性を有して いることも示唆されている。

図１４は、Ｈｌ３ならびにＥＲＲの、細胞外ドメイン３と称する領域の配列（ヌ クレオチド配列ならびにアミノ酸配列）を比較したものを示す（配列番号７、配 列番号８、ならびに図１の一部としても示しである）。受容体タンパク質のこの 領域は、ヒトの配列とマウスの配列が最も異なっている領域である。配列は、ジ エネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ　）の配列解析用ソフトウェア・パッケージ（たとえば、Ｄｅｖｅｒ ｅｕｘ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１２： 　３８７−３９５．　１９８４を参照のこと）を使用して並列させた。

図１５は、Ｈｌ３の配列を決定する際に使用したいくつかのｃＤＮＡクローンの 模式図を示す。相同なマウスＥＲＲとの間の一般的な構造上の関係も、これらの ｃＤＮＡクローンを用いて決定したものである。クローン？−２（８１３，７− ２）は、完全なＨｌ３の核酸配列の一部を示す。このクローンが、配列を決定し た最初のＨｌ３のクローンで、配列番号１ならびに配列番号２が得られた。クロ ーン１−１　（Ｈｌ３．１−１）ならびにクローン３−２　（Ｈｌ　３．Ｌ−２ ）は、それぞれ、Ｈｌ３の配列の一部を含んでいる。これらの３つのクローンを 組み合わせて配列を決定したところ、Ｈ１３１００核酸配列ならびにアミノ酸配 列（それぞれ、配列番号７および配列番号８）が得られた。

図１６は、細胞外ドメイン３および４の模式図を示す。図中、＊印は、Ｍ　ｕ　 Ｌ　Ｖ−Ｅによる感染の際に必須のアミノ酸を含む位置を示す。マウス−ヒトキ メラ受容体分子（キメラｌ−１１１）は、マウスＥＲＲならびにヒトＨ１３の共 通な制限部位を使用した置換によって調製し、そのＭ　ｕ　Ｌ　Ｖ　−Ｅに対す る受容体としての機能する能力は、組換え型ＭｕＬＶ−Ｅ、ＷＣＲＥ／ＢＡＧピ リオンを使用することによって測定した（たとえば、Ｐｒ１ｃｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　１５６ −１６０．１９８７；　Ｄａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　１５：　６４６０−６４６４．１９８８を参照 のこと）。図の上部の黒い四角は、ＥＲＲとＨｌ３の細胞外ドメインを示しくた とえば、Ａｌｂｒｉｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５７：　６５９−６ ６６゜１９８９；　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 １８５：　１０−１７．１９９１　を参照のこと）、細点ならびに斜線を付した 棒は、それぞれＥＲＲならびにＨｌ３のヌクレオチド配列を示す。この図は、３ 回の異なった実験で得られた代表的な結果の一つである。

図１７は、マウスＥＲＲとヒトＨ１３の、細胞外ドメイン３ならびに４のヌクレ オチド配列とアミノ酸配列とを比較したものを示す。両配列を並列させるにあた っては、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍ ｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　）の配列解析用ソフトウェア・パッケージ（たとえば 、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２：　３８７−３９５．１９８４を参 照のこと）を使用した。必須のアミノ酸残基を特定するために、オリゴヌクレオ チド依存性突然変異誘発を行って、四角で囲んで示したｌないし２個のアミノ酸 の置換あるいは挿入を含む、１３の別個の変異型ＥＲＲ分子を生成した。

図１８は、Ｉ（１３が、突然変異によって、ＭｕＬＶ−Ｅの受容体として機能す る能力を獲得したことを例証する結果を示す。

図１９は、受容体特異性を有するｇｐ７０のアミノ酸配列を、種々の白血病ウィ ルスの配列と並列させて示したものである。エコロトピックレトロウイルスの配 列：　Ａｋｖ　（８）、フレンドＭＬＶ　（１１）　、モロニーＭＬＶ　（１２ ）。非エコロトピックレトロウイルスの配列：　キセノトロピックＭＬＶ　ＮＺ Ｂ、ＩＵ６（２）、ポリトロピックＭＣＦ２４７　（２）　、アンフォトロビッ クＭＬＶ　４０７０Ａ（２）。（＋）二アミノ酸同−性。（−）：配列のギヤツ ブ。大文字：同類アミノ酸置換。下側の事例　非同類アミノ酸置換。数字は、ｇ ｐ７０の配列でのアミノ酸の位置を示す。

図２０は、エコロトピックのＡＫｖと、アンフォトロビックのＭＬＶ　４０７０ Ａについて、Ｎ末端のｅｎｖ領域のアミノ酸ならびに核酸を比較したものを示す 。アンフォトロビックの配列には、アミノ酸３０個のギャップがある。ヌクレオ チド配列、ならびに対応アミノ酸を示す。ＡＫｖ配列（９）：　Ｇｅｎｂａｎｋ の受託番号ＶＯ１１６４゜アンフォトロピックＭＬＢ４０７０（２）：　Ｇｅｎ ｂａｎｋの受託番号ｍｍ４６９゜上側の番号は、報告配列でのヌクレオチドの位 置を示す。下側の番号は、アミノ酸の位置を示す（図４を参照のこと）。ＡＫｖ のＳｍａ　Ｉ制限部位、ならびにＡｍｐｈｏ、ＲｓａＩ制限部位の位置も示す。

ＰＣＲのプライマーに適したヌクレオチド配列を、矢印で示す。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は、遺伝子療法並びに特異性ウィルス、ウィルスベクター及び治療薬及び ／又は診断薬の運搬ベクターに標的細胞特異的結合部位を与えることが発見され たキメラ受容体ポリペプチドに関する。本発明のかかるキメラ受容体ポリペプチ ドは、診断、研究及び遺伝子治療を含む治療的応用に用いることができ、この場 合、かかるキメラ受容体ポリペプチドをそれらの表面上に有する標的細胞は、非 ヒト特異性運搬ベクターにより独占的に及び／又は実質的に感染され得る。かく して、本発明は、非標的細胞の非特異的感染を起こし易い既知のウィルスベクタ ーを用いることに伴うｌ又は２以上の問題、並びにかかるウィルスベクターの複 製コンビテンスへの逆突然変異又は突然変異を克服する。

本発明によれば、ヒト又は他の哺乳動物の細胞又は組織を、キメラ受容体ポリペ プチドと会合するように又は−過的若しくは構成的にそれを発現するように、キ メラ受容体細胞又は組織としてｉｎ　ｖｉｖｏＳｉｎ　５ｉｔｕ又はｉｎ　ｖｉ ｔｒｏで処理することができる。かくして、かかるキメラ受容体細胞又は組織を 有する動物又はヒト被験体を、本発明の細胞表面キメラ受容体ポリペプチドに結 合するｅｎｖ結合ドメインポリペプチドを更に含む治療薬及び／又は診断薬で、 本発明の方法に従って治療又は診断することができる。

本発明の関係では、“キメラ受容体結合部位”又は“キメラ受容体”という用語 は、改変された第一種ウィルス受容体結合部位であって、その改変が非第一種特 異性ウィルス受容体結合部位から少なくとも２つのアミノ酸が置換、欠失又は付 加されたキメラ受容体ポリペプチドから構成される受容体結合部位のことをいう 。

この少なくとも２つのアミノ酸欠失、置換又は付加は、非第一種特異性ウィルス の表面タンパク質のｅｎｖ結合ドメインについてのキメラ受容体上に結合能力を 付与する。好ましくは、この置換又は付加は、ＥＲＲＳＭｕＬＶ又はＧＡＬＶの 如き非ヒト特異性ウィルス受容体で置換されたヒトＨ１３のドメイン３に対応す る。

好ましくは、この置換、欠失又は付加されたアミノ酸残基は、Ｈ２Ｓ（配列番号 ＝８）の残基２００〜２８０又は２２０〜２６０゜２３０〜２４５又はそのうち のいずれかの範囲若しくは値の残基、例えば、以下の表１に示した置換と類似の 残基に相当する。

“キメラ受容体細胞”又は“キメラ受容体組織”という用語は、キメラ受容体ポ リペプチドをその細胞表面上に有するか又はキメラ受容体ポリペプチドと会合し ている結果、非第一種特異性ウィルス又はキメラ受容体ポリペプチドに特異的な ｅｎｖ結合ドメインが、このキメラ細胞又は組織にｉｎ　ｖｉｖｏＳｉｎ　５ｉ ｔｕ又は１ｎｖｉｔｒｏで結合できる、第一種の細胞又は組織のことをいう。好 ましくは、このキメラ受容体ポリペプチドは、あるキメラ受容体ポリペプチドと 会合した細胞特異性受容体を介してこのキメラ受容体細胞に会合してもよく、好 ましくは、この組み合わせ体が、第一種特異性細胞型又は組織型に結合して、本 発明のキメラ受容体細胞を提供する。他の好ましい態様においては、かかる会合 は、少なくとも１つのキメラ受容体ポリペプチドのこの特異性細胞型又は組織型 の組換え体発現によって与えられる。

本発明の関係で“会合”という用語は、共有結合、疎水／親水性相互作用、ファ ンデルワールス力、イオン対、リガンド−受容体相互作用、エピトープ−抗体結 合部位相互作用、酵素−基質相互作用、リポソーム−疎水性相互作用、ヌクレオ チド塩基対合、膜−疎水性相互作用及びそれに類したものの如きあらゆるタイプ の共有又は非共有結合又は会合のことをいうが、これらに限定されない。

“キメラ受容体ポリペプチド”という用語は、ヒトウィルス受容体タンパク質又 はそのコンセンサス配列に対応する少なくとも１０アミノ酸のポリペプチドのこ とをいい、このキメラ受容体ポリペプチドは、１０〜７００．１０〜１００．１ ０〜５０、ｌＯ〜３０．２０〜３０．２０〜４０．４０〜６０又はそのうちのい ずれかの範囲若しくは値の如き非ヒト特異性ウィルスのｅｎｖ結合ドメインに結 合できるキメラ受容体結合部位を含有する。

一方、又は更に、本発明のキメラ受容体ポリペプチドを、第一種ウィルス受容体 の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８３〜８５．８７〜９０ ．９３〜９５．９７〜９８、又は９９％又はそのうちのいずれかの範囲若しくは 値の如き、８１〜９９％又はそのうちのいずれかの範囲若しくは値）の相同性を 有する少なくとも１０残基のアミノ酸配列として、非第一種ウィルス受容体から のアミノ酸を含むように改変されかつ非第一種ウィルスのｅｎｖポリペプチドの 結合ドメインに結合する生物活性を有するあらゆるエコトロピック又はアンフォ トロビック第一種ウィルス受容体として定義することができる。好ましくは、こ の第一種がヒトであって第二種がげっ歯頚であるか又はその逆である。そのよう な対応するヒトウィルス受容体配列の非限定的な例は、配列番号：８、例えば、 配列番号＝８のｌＯ〜６２９アミノ酸又はそのうちのいずれかの値若しくは範囲 に対応するものである。

一方又は更に、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、第一種ウィルス受容体タ ンパク質の少なくとも１〜２０の膜貫通ドメインに対応し、その対応する第一種 ウィルス受容体に少なくとも８０％（８０〜１００％又はそのうちのいずれかの 範囲若しくは値の如き）相同性である疎水性アミノ酸配列を更に含んでもよい。

かかる膜貫通ドメインは、既に記載されたもの、例えば、ヒト上１３配列（配列 番号＝８）又は１４の潜在的な膜貫通ドメインを有するマウスＥＲＲ（配列番号 ：４）（例えば、アイゼンベルブ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、　Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、、　１７９：１２５−１４２　（１９８４））に類似するものであ ってもよく、例えば、そこに又はここに参考として引用されている既知の方法に よる疎水性プロット法を用いて確認することができる。

ヒトウィルス受容体としての第一種ウィルス受容体の非限定的な例は、ヒトＨ１ ３タンパク質（配列番号二８）であり、本発明によるＨ１３ポリペプチドとして 、例えば、いずれも場合もここで参考として引用されるような既知の方法に従っ て精製され又は化学的に合成され又は組換え法で産生されたものの如き天然に存 在しない形で得ることができる。

本発明のキメラ受容体ポリペプチドのそのような非限定的な例は、例えば、非限 定的な例であるＥ−ＭｕＬＶ、ｇｐ−７０又はＥＲＲ受容体タンパク質（配列番 号＝４）の如き非ヒト特異性ウィルスに結合する能力を与えるように改変された 少なくともｌＯアミノ酸の改変ヒトＨ１３アミノ酸配列（例えば、配列番号＝８ の如き）であってもよい。かかる改変は、好ましくは、ヒトウィルス受容体配列 の受容体結合部位において、ＨＩ３内の対応する部位内のマウスＥＲＲアミノ酸 の如き少なくとも１つの非ヒトウィルス受容体アミノ酸による置換を含んでもよ く、キメラ受容体ポリペプチドを有するヒト又は非マウス標的細胞、好ましくは ヒト細胞の、Ｅ−ＭｕＬＶの如きウィルス又はレトロウィルスでの感染を可能に する。

かくして、更なる非限定的な副次的例として、ヒト又は非マウス細胞にＥ−Ｍｕ ＬＶ感染感受性を付与するには、Ｈ２Ｓのドメイン３の対応するＥ−ＭｕＬＶ受 容体アミノ酸残基を置換するのが好ましい。ドメイン３は、位置２１０〜２５０ に数残基を含む（配列番号ニア）。好ましい置換は、ＥＲＲの対応するドメイン からの１〜１０アミノ酸残基又はそのうちの幾つか又はいずれかの範囲での、ア ミノ酸残基２１０〜２４２（配列番号：４）の置換、好ましくはアミノ酸２３８ ．２３９及び２４２の置換、より好ましくは少なくとも２４２を置換することで ある。１〜４残基の置換が好ましい。例えば、Ｈ２Ｓの細胞外ドメイン３とＥＲ Ｒ内で相違する残基及び位置を以下の表１に掲げる。より好ましい態様において は、これは図１８に示すように、Ｈ２Ｓ（配列番号二８）の少なくともＰｒｏ２ ４２をＴｙｒで置換し、Ｇｌｙ２４０とＶａ１２４４（配列番号＝８）の少なく とも１つをそれぞれＶａｌとＧｌｕで置換する。更に、好ましくは、Ｈ１３アミ ノ酸２３９の少なくとも１つを対応するＥＲＲアミノ酸２３３で置換してもよい 。

表１ Ｈ１３細胞外ドメイン３とドメイン４におけるＥ−ＭｕＬＶ結合のための置換の 好例 ドメイン３ もとのＨ２Ｓ　置換用ＥＲＲ 残基　残基 Ｖ　２１４　Ｉ　２１４ Ｅ　２２２　Ｋ　２２２ Ｅ　２２３　Ｎ　２２３ Ｇ　２２５　Ｓ　２２５ Ｌ　２３３　Ｎ　２２７ Ｅ　２３９　Ｎ　２３２ Ｐ　２４２　Ｙ　２３５ Ｖ　２４４　Ｅ　２３７ 本発明によるキメラ受容体ポリペプチドの非限定的な例には、Ｔｙｒ２４２、Ｐ ｈｅ２４２及び／又はＴｒｐ２４２、及びＶａ１１２４０、Ｍｅ　ｔ　２４０、 Ｌｅｕ２４０、ＩＩｅ２４０、Ｇｌｕ２４４、Ｇ　Ｉ　ｎ　２４４、Ａｓｎ２３ ９、又はＡｓｎ２４４のうちの少なくとも１つ；及びＡｓｎ２３９、Ａｓｎ２３ ９、Ｇｌｕ２３９又はＧＩｎ２３９　（配列番号＝３）が含まれ得るが、Ｈ２Ｓ （配列番号：８）の少なくともＰｒｏ２４２をＴｙｒで置換し、そしてＧＩＹ２ ４０とＶａ１２４４（配列番号＝８）の少なくとも１つをそれぞれＶａｔとＧｌ ｕで置換する。

Ｈ２Ｓのウィルス結合特異性を改変するためのもう１つの手段は、ＥＲＲの残基 に対応しないＨＩ３内の１又は２以上の“余分な”アミノ酸残基を欠失させるこ によるものである。好ましい欠失（細胞外ドメイン４内での）は、Ｈ１３位置３ ２６〜３３１（配列番号＝１）からの１〜６残基の欠失、最も好ましくは、これ ら６残基金での欠失である。

本発明のキメラ受容体ポリペプチドのもう１つの非限定的な例では、非ヒトウィ ルスのｅｎｖ結合ドメインに結合するヒト細胞の結合能力を付与するＨ１３キメ ラ受容体ポリペプチドを提供することができる。その場合、かかる結合能力を付 与するために、Ｈ２Ｓの１〜３０アミノ酸をＥＲＲからの対応するアミノ酸によ って置換、欠失又は修飾する。好ましくは、そのようなキメラ受容体ポリペプチ ドは、Ｈ１３ポリペプチド（配列番号＝８）の少なくともＰｒｏ２４２がＴｙｒ で置換され、そしてＧＩＶ２４０とＶａ１２４４（配列番号二８）の少なくとも １つがそれぞれＶａｌとＧｌｕで置換されたペプチド、又はＨ２Ｓのアミノ酸配 列に実質的に一致するアミノ酸配列を有するフラグメントを含み、その結果、得 られるキメラ受容体は、他のヒト又は非マウス標胞型若しくは組織型を感染する ことができないマウスエコトロピックレトロウィルスにより選択的に結合される 。

また、Ｈ２Ｓに対応するアンフオトロビック第一種ウイルス受容体の同種キメラ 受容体ポリペプチドを同じように改変して、非第一種特異性アンフオト口ピック ウイルスの、例えばキメラ受容体細胞又は組織への結合をできるようにしてもよ い。好ましくは、その第一種はヒト又はげつ歯頚である。

ここに記載した全ての用途のための類似の生物活性を有する、Ｈ２Ｓ又はキメラ 受容体ポリペプチドの可溶型、並びにそれらの機能性誘導体も含まれる。キメラ 受容体又はそのキメラ受容体から誘導したＨＩ３ポリペプチド又はＨＩ３転写産 物それぞれの全ての活性型、及び）（１３様活性を有する全ての突然変異体も意 図されている。

正常では膜貫通タンパク質である受容体の可溶型を作る方法は当該技術分野で知 られている（例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｄ、Ｈ，）ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８：１７０４−１７０７　（１９８７）　：フィッシャ ー　（Ｆｉｓｈｅｒ。

Ｒ，Ａ、　）　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３１ニア６−７８　（１９８８）　；　 ／Ｓ　ツセイ　（Ｈｕｓｓｅｙ。

Ｒ，Ｅ、　’）　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１ニア８−８１　（１９８８）　；デ ィーン　（Ｄｅｅｎ、Ｋ、Ｃ，）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１：８２−８４　 （１９８８）　；　）ラウネツ力−（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ。

Ａ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１：８４−８６　（１９８８）　；ゲルショニ （Ｇｅｒｓｈｏｎｉ。

Ｊ、　Ｍ、　）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８５：４０８７−４０８９（１９８８）を参照のこと、これら文献は参照によっ てここに組み入れられるものとする）。かかる方法は、一般に、受容体タンパク 質をコードする核酸のトランケーションに基づくものであって、膜貫通部分を排 除して無傷のレトロウィルス又はレトロウィルスタンパク質若しくは糖タンパク 質の如き特異性リガンドと相互作用できる１つ（又は複数）の細胞外ドメインを 無傷で残すものである。本発明のためには、可溶性キメラ受容体ポリペプチド又 はＨＩ３ポリペプチドが、ウィルスへの結合を可能にするキメラ受容体又はＨＩ ３の結合部位の要素を含むことが重要である。キメラ受容体ポリペプチド又はＨ Ｉ３ポリペプチドは多くのアミノ酸残基を有するが、２〜１５、又は３〜５．６ 〜９若しくは１０〜１５の如きそのうちのいずれかの値若しくは範囲の如きｌ又 は２又はそれ以上だけがウィルス認識及び結合に決定的に関与している。

ここで説明するように、本発明のＨ１３タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチ ドを、ドラッグデザインのために、例えば、免疫原性を低減するために、溶解性 促進又は運搬増進のために、又はクリアランス若しくは分解を阻止するために、 既知の方法に従って更に改変してもよい。更なる態様においては、本発明は、本 発明のキメラ受容体ポリペプチドの突然変異タンパク質を提供する。“突然変異 タンパク質”により、ＨＩ３タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチドの“フラ グメント”、“変異体”又は“化学誘導体”が意味される。突然変異タンパク質 は、本発明によりその利用が可能となるＨＩ３タンパク質の機能の少なくとも一 部を保持している。

ＨＩ３タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチドの“フラグメント”は、この分 子のあらゆるサブセット、即ち、より短いペプチドである。

ＨＩ３キメラ受容体ポリペプチドの“突然変異タンパク質”とは、この金縁ペプ チド又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子のことをいう。突 然変異タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて、直接化学合成法又は 突然変異誘発法を含む突然変異タンパク質の組換え産生法によって都合良く調製 することができる。例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の前記文献、ア ウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）の前記文献、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）の前記文 献を参照のこと。

また、ＨＩ３又はキメラ受容体ポリペプチドの突然変異タンパク質は、この合成 されたペプチドをコードする核酸内の突然変異によって調製することができる。

かかる突然変異体には、例えば、ここに示したアミノ酸配列内の残基の欠失体、 又は挿入体又は置換体が含まれる。最終構築体が所望の活性を有することを条件 として、欠失、挿入及び置換のあらゆる組み合わせを用いて最終構築体に到達す ることもできる。明らかに、突然変異タンパク質ペプチドをコードする核酸内で 行われる突然変異は、そのリーディングフレームを変化させてはならず、そして 好ましくは第二ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補的領域を作り出さないであろう （例えば、ヨーロッパ特許公報ＥＰ７５，４４４を参照のこと）。

遺伝子レベルでは、これら突然変異タンパク質は、通常、このペプチド分子をコ ードする核酸内のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（アデルマン（Ａｄｅ ｌｍａｎ）ら、　ＤＮＡ　２：１８３　（１９８３）又はアウスベルの前記文献 、サムブルーフの前記文献又はコリガンら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎＯＩＯｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡ ｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｎ 、Ｙ、、　（１９９２，１９９３）により例示されている）を行い、それによっ てこの突然変異体をコードする核酸を作成した後、組換え細胞培養でこの核酸を 発現することによって調製される。突然変異タンパク質は、典型的には、キメラ ペプチドと同質の生物活性を示す。

特に、ＥＲＲの如き他の非ヒト又は非動物特異性ウィルスから誘導した決定的な アミノ酸残基を有するキメラ受容体ポリペプチド又はＨＩ３ポリペプチドを、部 位特異的突然変異誘発法を用いて作ってもよい。

突然変異タンパク質のもう１つのグループは、このタンパク質分子内の少なくと も１つ、好ましくは唯１つだけのアミノ酸残基が除去されて異なる残基がその場 所に挿入されたものである。タンパク質化学及び構造の詳細な説明については、 シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ、Ｇ、　Ｅ、）　ら、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８、及びクレ イトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ、Ｅ、）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔ ｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅ ｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　１９８３を参照のこ と。なお、これらは参照により全体がここに組み入れられるものとする。本発明 のタンパク質又はペプチド分子内に行うことができる置換のタイプは、シュルツ らの前記文献の表１〜２及びクレイトンらの前記文献の図３〜９に示されたもの の如き、異なる種の同種タンパク質問のアミノ酸置換の頻度の分析に基づくこと ができる。そのような分析に基づけば、保存的置換は、ここでは次の５グループ のうちの１グループ内での交換として定義される。

１、小さい脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：ａｌａ。

ｓｅｒ、ｔｈｒ　（ｐｒｏ、ｇｌｙ）；２、極性で負に荷電した残基及びそれら のアミド：ａｓｐ。

ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｉｎ； ３、極性で正に荷電した残基：ｈｉｓ、ａｒｇ、ｌｙｓ；４、大きい脂肪族の非 極性残基：ｍｅｔ、ｌｅｕ、ｉｌｅ。

ｖａｌ　（ｃｙｓ）；及び ５、大きい芳香族残基：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ。

機能的又は免疫学的特性の実質的な変化は、上記の５グループ内というよりもむ しろ５グル一プ間の置換の如きあまり保存的ではない置換を選択することによっ てなされる。それら置換により、（ａ）その置換域内のペプチド主鎖の構造、例 えば、シート又はヘリックスコンフォメーションのような構造の維持、（ｂ）標 的部位における分子の電荷又は疎水性の維持、又は（Ｃ）側鎖の嵩高さの維持へ のそれらの効果がより有意に異なるであろう。かかる置換の例は、（ａ）ｇｌｙ 及び／又はｐｒｏの他のアミノ酸による置換又はｇｌｙ若しくはｐｒｏの欠失又 は挿入；　（ｂ）親水性残基、例えば、ｓｅｔ又はｔｈｒの、疎水性残基、例え ば、１ｅｕ、ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｖａｌ又はａｌａに代わる（又はそれによる）置 換；　（ｃ）ｃｙｓ残基の、他のいずれかの残基に代わる（又はそれによる）置 換；　（ｄ）電気的に正の側鎖を有する残基、例えば、ｌｙｓＳａｒｇ又はｈｉ ｓの、電気的に負の電荷を有する残基、例えば、ｇｌｕ又はａｌｐに代わる（又 はそれによる）置換；　（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、ｐｈｅの、そ のような側鎖を有さない残基、例えば、ｇｌｙに代わる（又はそれによる）置換 である。

本発明による殆どの欠失及び挿入、及び置換は、そのタンパク質又はペプチド分 子の特性に根本的な変化をもたらさないものである。しかしながら、置換、欠失 又は挿入をするより先にそうすることの正確な効果を予見することが困難な場合 には、当業者は、その効果が日常的なスクリーニング検定法、つまり免疫学的検 定法又は生物学的検定法により評価されることが理解できるであろう。例えば、 突然変異タンパク質は、典型的には、そのペプチド分子をコードする核酸の部位 特異的突然変異誘発、その突然変異型核酸の組換え細胞培養での発現、及び随意 であるが例えばカラムで（少なくとも１つのエピトープに結合することによって この突然変異タンパク質を吸着するための）特異性抗体を用いるイムノアフィニ ティクロマトグラフィーによるこの細胞培養物からの精製により作られる。

ＨＩ３若しくはキメラ受容体ポリペプチドを含有する細胞溶解産物の活性、又は ＨＩ３若しくはキメラ受容体の精製試料の活性は、所望の特性に適するスクリー ニング検定法でスクリーニングすることができる。例えば、このタンパク質分子 の所与の抗体への結合性の如き免疫学的特性の変化は、（ここに記載するような ）競合型免疫学的検定法によって測定することができる。生物活性は、ここに記 載したように、ウィルス感染性の如き適切な生物学的検定法でスクリーニングさ れる。

酸化還元又は熱安定性、疎水性、タンパク質分解への感受性又はキャリヤーと若 しくは多量体に凝集する傾向の如きペプチド特性の変更は、当業者に周知の方法 によって検定される。

更に、本発明によるキメラ受容体ポリペプチドのアミノ酸の修飾アミノ酸又は化 学的誘導体が提供され得るので、このポリペプチドは、正常ではこのタンパク質 の一部ではない追加の化学部分又は修飾アミノ酸を含有する。かくして、本発明 の範囲内には、このペプチドの共有結合修飾体が含まれる。かかる修飾は、キメ ラ受容体ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応 することのできる有機誘導化剤と反応させることによってこのポリペプチド内に 導入することができる。

二官能性物質での誘導化は、このペプチドを既知の方法に従って非水溶性支持マ トリックス又は他の高分子キャリヤーに架橋するのに有用である。普通に用いら れる架橋剤には、例えば、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタ ン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、例えば、４ −アジドサリチル酸とのエステル、３．３′−ジチオビス（コハク酸イミジルプ ロピオネート）の如きジコハク酸イミジルエステルを含むホモ三官能性イミドエ ステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１゜８−オクタンの如き二官能性マレイミ ドが含まれる。メチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデ ートの如き誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化能中 間体を生成する。また、臭化シアン活性化炭水化物の如き反応性非水溶性マトリ ックス及び米国特許第３，９６９，２８７　；３，６９１．０１６；４．１９５ ，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；及び４，３３０，４４０ 号（これらは参照により全体がここに組み入れられるものとする）に記載された 反応性基質をタンパク質固定化に用いてもよい。

本発明のキメラ受容体ポリペプチドの他の修飾には、既知の方法による、プロリ ン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基の リン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化 （クレイトン。

Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ ｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ、　ｐｐ、７９−８６　（１９８３））　、Ｎ−末端アミンのアセチ ル化、及びある場合にはＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれ得る。

かかる誘導化された部分は、溶解性、吸収性、生物学的半減期及びそれに類した ものを向上させ得る。キメラ受容体ポリペプチドのかかる部分又は修飾は、一方 では、そのタンパク質及びそれに類したものの望ましくない副作用を排除又は弱 め得る。かかる作用を媒介することができる部分が、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔＯ ｎ’　ＳＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１６ｔｈ　ｅｄ 、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、。

Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８０）に開示されている。

キメラ受容体ポリペプチドのかかる化学誘導体も、精製、抗体の生成又はクロー ニングのために；又はキメラ受容体ポリペプチド、それに対する抗体又はそのフ ラグメントを含む治療性組成物にとって望ましい、酵素的分解に対する抵抗性又 は結合親和性の増加又はキメラ受容体ポリペプチドの変調の如き物性の変更のた めに、固体支持体に付着させることができる。かかるペプチド誘導体、並びにか かる誘導体を作る方法は、当該技術分野で知られている。

“単離された又は組換えＨ１３ポリペプチド”とは、配列番号＝８のアミノ酸配 列の少なくともｌＯアミノ酸部分と実質的に一致するか、又は本質的にその部分 からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ＨＩＶｅｎｖ結合ドメイ ンの如きレトロウィルスに結合するポリペプチドのことをいう。キメラ受容体ポ リペプチド又はＨ１３タンパク質のアミノ酸配列に“実質的に一致する”とは、 そのタンパク質分子の可溶性部分内の少なくともｌアミノ酸残基が除去されてそ の場所に異なる残基が挿入されたアミノ酸配列のことをいう。その置換の数は比 較的小さいので、ここに記載するように十分に特徴付けられ又は保存的である。

キメラ受容体ポリペプチド又はＨ１３ポリペプチドを作る方法この発明の好まし い用途は、化学合成又は組換え核酸法によって単独のキメラ受容体ポリペプチド 又は複数のキメラ受容体ポリペプチド又はそれらのフラグメントを作ることであ る。この場合、これらのフラグメントは、できるだけ小さいものであるが、非ヒ ト特異性レトロウィルス又はＨＩＶへの結合に依然として十分に高い親和性を保 持しているものである。Ｈ２Ｓの好ましいフラグメントには、ここに示したよう に細胞外ドメイン３が含まれる。

ウィルス受容体としてのその機能のために、本発明のＨ２Ｓの細胞外フラグメン ト又はキメラ受容体ポリペプチドは、それぞれヒト又は非ヒト特異性ウィルスに 結合することができる。このペプチドのより小さなフラグメントを作ることによ り、当業者は、既知の結合及び阻害検定法を用いて、ここに示した教示及び指針 に基づき、過度の実験をすることなしに、十分に高い親和性でウィルス又はレト ロウィルスの結合ドメインに結合して感染力を抑制することのできる最小のペプ チドを容易に同定することができるであろう。短いペプチドは大きなタンパク質 よりも２つの利点、即ち、（１）より大きい安定性と拡散性、及び（２）より少 ない免疫原性、を有していると考えられる。

非限定的な例として、マウスＥＲＲ配列からのアミノ酸残基の存在のために、本 発明の突然変異型キメラ受容体ポリペプチドは、この受容体を発現するヒト細胞 又は他の非マウス細胞に、マウスＥ−ＭｕＬＶ又はＩ−（ｕ　Ｌ　Ｖの如き非ヒ ト特異性ウィルスにより感染される能力を与える。なお、この非ヒト特異性ウィ ルスは、複製コンピテント型への逆突然変異の可能性を低減するために修飾され ていてもよい。

ウィルス受容体の１又は２以上のアミノ酸残基の適切な置換によって、ここに示 した教示及び指針に基づき、過度の実験をすることなしに、本発明のキメラ受容 体ポリペプチドを得ることができる。

本発明は、ＭｕＬＶ又はＨｕＬＶの如きレトロウィルス及びアデノウィルスを含 む、類似の営容体特異性を有するあらゆる非ヒトエコトロピック又はアンフォト ロビックウィルスへのキメラ受容体ポリペプチドの結合を包含することも意図し ている。

当業者は、ここに示した教示及び指針に基づき、過度の実験をすることなしに、 あらゆる種又は細胞型から本発明のキメラ受容体ポリペプチドの獲得に用いるの に適するウィルス受容体をコードする核酸をどのように得るかを決定することが できるであろう。

かかる操作の非限定的な例として、最初に、興味の対象である種又は細胞型のｃ ＤＮＡライブラリー、例えば、ヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーを（当該技術分 野で日常的に行われる方法を用いて）Ｈ２Ｓの如きヒトウィルス受容体の配列に 基づくプローブを用いてスクリーニングすることになろう。次に、ハイブリダイ ズする核酸をクローン化及び配列決定して“新規な”レトロウィルス受容体の配 列を得ることになろう。目視検査により又は（ここに記載したような）コンピュ ータープログラムで、その新規なレトロウィルス受容体タンパク質の配列がＥＲ Ｒ又はＨ２Ｓと異なっている領域を同定することが可能である。特に、Ｈ２Ｓの 細胞外ドメイン領域３又は類似するドメインに対応するドメインに注目すること になろう。

認められた配列相違点に基づき、ここに示した教示を用いて、その新規な受容体 と既知受容体の間のキメラ受容体が作り出されるような１又は２以上のアミノ酸 置換を有する配列を作成することが可能である。次いで、このキメラ受容体を選 り抜きの細胞内で発現して、慣用的なウィルス結合検定法又はウィルス感染力検 定法を用いてその機能を容易に試験することができる。

更には、本発明によれば、マウス白血病ウィルスの如きウィルスの外膜糖タンパ ク質内の受容体選択決定基の知見に基づきウィルスの受容体付着部位を修飾して 、それがその本来の受容体に結合しないように、又は異なる受容体に結合するよ うにすることが可能である。例えば、バッチニ（Ｂａｔｔｉｎｉ）ら、　Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

６６（３）：１４６８−１４７５　（１９９２）を参照のこと。

例えば、ＨＩ　Ｖ−１の結合を阻止するためにＨＩＶ−Ｉ　ＣＤ４−結合ドメイ ンの配列を変化させると、このウィルスはＣＤ４保有細胞に対し非感染性になる であろう。対応する変化をＨ２Ｓに導入でき、そうすれば、この突然変異型ＨＩ Ｖはそれに結合するであろう。このようにして、適切な変異型受容体を保有する 細胞を選択するためにだけ結合するがＨＩ　Ｖ−１の正常な標的には結合しない 安全なＨＩＶ試料を生じさせることができる。

同し細胞の表面上に２以上の無傷又は突然変異型ウィルス受容体ポリペプチドを 発現させることも本発明の範囲に属する。かくして、第１発現キメラ受容体ポリ ペプチド、例えば、ＥＲＲによって、ヒト細胞を１つのウィルス株でｉｎ　Ｖｉ ｔｒＯで一過的に感染させることができ、そしてサイトカイン成長又は分化因子 の適切な使用によって操作することができる。かかる細胞をレシピエンドに導入 してもよい。望ましい時期に、第２発現キメラ受容体ポリペプチドに結合する第 ２ウイルスをその個体に導入して、第２レトロウィルス受容体を保有するそれら 導入細胞だけを安定に感染させそして変化させることができる。

Ｈ１３１００一部分に相当するオリゴヌクレオチド（配列番号＝２）は、同種遺 伝子の存在のスクリーニング及びかかる遺伝子のクローニングに有用である。か かるオリゴヌクレオチドを合成する技術は、例えば、ウー（Ｗｕ、　Ｒ）ら、　 Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、　２１：１Ｏ１−１４１（１９７８）　 ；アウスベルらの下記文献；サムブルーフの下記文献；ベラガジェ（Ｂｅｌａｇ ａｊｅ、　Ｒ）ら。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５４：５７６５−５７８０　（１９７９） 　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏ ｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　＝エルリッヒ（Ｎｉｅｒｌ　ｉ ｃｈ。

Ｄ、　Ｐ、　’）ら編、　Ａｃａｄ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９７６）中のマ ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ）らの報文；ウーら、　Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍ ｏ１ｅｃ、　Ｂ１１１．。

２１：１Ｏ１−１４１（１９７８）　；　：ｌ−ラフ　（Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｒ ，Ｇ、）、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２０３：６１４−６２５　（１９７９）により開示されている。更に、ＤＮＡ合 成は、自動合成装置を用いて行うことができる。ＤＮＡハイブリダイゼーション の技術は、サムブルーフらの前記文献及びハイメス（Ｈａｙｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、 ）ら（ＤＮＡ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐ ｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８ ５）中の報文）により開示されている。なお、これら文献は参照によってここに 組み入れられるものとする。上記の如き技術又はそれに類似の技術は、ヒトアル デヒドデヒドロゲナーゼ（スー（Ｈｓｕ、　Ｌ、Ｃ，）ら、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８２：３７７１−３７７ ５　（１９８５乃、フィブロネクチン（スズキら、　Ｂｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、　Ｊ、、　４：２５１９−２５２４（１９８５））の遺伝 子、ヒトエストロゲン受容体遺伝子（ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ、　Ｐ、）　ら 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌＪ、ｓ、Ａ、、８２ニ アＢ８９−７８９３　（１９８５））　、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、）　ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０１：２１４−２ ２１　（１９８３））及びヒト出産予定時期胎盤アルカリ性ホスファターゼ相補 的ＤＮＡ　（カム（Ｋａｍ、Ｗ、）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２：８７１５−８７１９　（１９８５）のクローニングを うまくできるようにした。

Ｈ１３遺伝子、受容体突然変異体又はその相当物をクローニングする別の方法で は、（Ｈ２Ｓ、受容体突然変異体又はその相当物を発現することができる細胞か らの）ＤＮＡ又は、より好ましくは、ｃＤＮＡを発現ベクター内にクローニング することにより発現ベクターのライブラリーを調製する。次いで、そのライブラ リーを、抗Ｈ１３、抗突然変異体又は抗相当物抗体に結合し、かつＨ２Ｓ、受容 体突然変異体又はその相当タンパク質若しくはペプチド、又はそのフラグメント と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチ ド配列を有するタンパク質を発現することができるメンバーについてスクリーニ ングする。

本発明のＨ２Ｓ、受容体突然変異体又はその相当物、つまりポリペプチド若しく はタンパク質をコードする核酸配列、又はその機能性誘導体を、連結のための平 滑末端又は粘着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な場合の粘着 末端のｆｉｌｌｉｎｇｉｎ、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホス ファターゼ処理、及び適切なりガーゼでの連結を含む慣用的技術に従って、ベク ターＤＮＡで組み換え、そして適切な宿主細胞内で発現させることができる。か かる操作法は、サムブルーフらの前記文献により開示されており、また当該技術 分野において周知である。

原核細胞内での適切な発現には、遺伝子コーディング配列の上流でのリポソーム 結合部位の存在も必要である。かかるリポソーム結合部位は、例えば、ゴールド （Ｇｏｌｄ、　Ｌ）ら、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３５：３６５−４０４　（１９８１）により開示され ている。

真核性宿主には、　ｉｎ　ｖｉｖｏ又は組織培養でのいずれかの酵母、昆虫、真 菌、及び哺乳動物細胞が含まれる。哺乳動物細胞では、タンパク質分子は、正確 なフォールディング又は正確な部位でのグリコジル化を含む翻訳後修飾に付され る。宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ又はＣＨＯの如き線 維芽細胞起源の細胞又はハイブリドーマＳＰ２１０−Ａｇ　１４若しくはマウス メラノーマＰ３−Ｘ６３Ａｇ８の如きリンパ球起源の細胞、及びそれらの誘導体 が含まれる。好ましい哺乳動物細胞は、遺伝的に欠損のある細胞の機能をｉｎ　 ｖｉｖｏで置き換えるよう意図された細胞である。骨髄幹細胞は、造血又は免疫 系の障害の遺伝子治療に好ましい。

哺乳動物細胞宿主については、多くの可能なベクター系が単独のキメラ受容体ポ リペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの発現に利用可能である。宿主 の性質に依り、幅広い種々の転写及び翻訳調節配列を用いることができる。これ ら転写及び翻訳調節シグナルは、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シ ミアンウィルス又はそれに類したものの如きウィルス性供給源から誘導すること ができる。この場合、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に 関係する。また、アクチン、コラーゲン、ミオシンの如き哺乳動物発現産物から のプロモーターが、タンパク質産生を促進する。生きている昆虫を用いる場合、 現時点では蚕の幼虫及びバキュロウィルスベクターが本発明による大規模単独キ メラ受容体ポリペプチド又は複数キメラ受容体ポリペプチド産生に好ましい宿主 である。例えば、アウスベルの下記文献、サムブルーフの前記文献を参照のこと 。

望ましい場合は、発現した単独キメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容 体ポリペプチドを、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグ ラフィー、電気泳動、又はそれらに類したものの如き慣用的条件に従って単離及 び精製してもよい。例えば、細胞を遠心分離によって又は適当な緩衝剤で採集し 、溶解し、そして、例えば、ＤＥＡＥ−セルロース、ホスホセルロース、ポリリ ボシチジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタイトでのカラムクロマトグラフィ ーによって又は電気泳動若しくはイムノブレシピテーションによってタンパク質 を単離することができる。また、ＥＲＲ由来アミノ酸置換を含有するタンパク質 と依然として反応する抗受容体ポリペプチド抗体の如き特異性抗体を用いること によって、キメラ受容体タンパク質を単離することができる。かかる抗体は、周 知の方法により得ることができる。

更には、本発明の遺伝子構築体を操作すると、単独のキメラ受容体ポリペプチド 又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの膜貫通及び細胞質内部分上に特定のウィ ルス結合ドメインを移植できるか、又は別の分子の膜貫通及び細胞質内部分上に 単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのレトロ ウィルス受容体結合ドメインを移植でき、更に別のタイプのキメラ分子にするこ とができる。

キメラ受容体細胞又は組織の調製 本発明は、レトロウィルス感染の如き与えられた非ヒトウィルスのｅｎｖ結合ド メインによる結合を受け易いヒト又はその他の真核細胞又は組織を与える方法に も関する。

この方法は、随意に、まず、真核細胞又は組織を、キメラ受容体ポリペプチドを コードする発現可能な核酸で、ｉｎ　ｖｔｔｒｏ、　１ｎｖｉｖｏ又はｉｎ　５ ｉｔｕで形質転換して、非特異性ウィルスの細胞外ウィルスｅｎｖ結合ドメイン に結合することができるキメラ受容体ポリペプチドを発現できる組換えキメラ受 容体細胞又は組織を作ることを含む。

組換えＤＮＡ法の一般的原理を述べた標準的な文献には、ワトソン（Ｗａｔｓｏ ｎ、　Ｊ、Ｄ、）ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｇｅｎｅ。

Ｖｏｌｕｍｅｓ　ｌ　ａｎｄ　ＩＩ、　Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍ ｍ１ｎ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、、　ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９８７）　；ダーネル（Ｄａｒｎｅ ｌｌ、Ｊ、Ｅ、）　ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、Ｉｎｃ、、　ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　（１９８６）　；レビン（Ｌｅｗｉ ｎ、　Ｂ、Ｍ、）、　Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ。

ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　（１９８５）　；オー ルド（Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、）ら、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａ ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔ。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　２ｄ　ｅｄｄｉｔｉｏｎ、　Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ、　ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｒ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ　（１９８１）　；サムブルーフら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）　；及びアウスベルら 、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、　ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎ、Ｙ、、　（１９８７ ，１９９３）が含まれる。これら文献は参照によってその全体がここに組み入れ られるものとする。

そのような方法においては、次のものから選択される１種により　ｉｎ　ｖｉｖ ｏ形質転換を行うのが好ましい、即ち、既知の方法による、組織又は細胞内への 突然変異型核酸の注入；組織又は細胞に特異的な少なくとも１つの組織特異的調 節配列の制御下で突然変異型核酸を含む組換えレトロウィルスを用いるレトロウ ィルス感染；組織又は細胞への突然変異型核酸のリポソーム運搬；組織又は細胞 への突然変異型核酸の抗体運搬；又は突然変異型核酸に接合した細胞又は組織特 異性抗体の組織又は細胞との接触。

そのような方法においては、次のものから選択される１種によすｉｎ　５ｉｔｕ 又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ形質転換を行うのが好ましい、即ち、既知の方法による、 組織又は細胞内への突然変異型核酸の注入；発現可能な形で突然変異型核酸を含 む組換えレトロウィルスを用いるレトロウィルス感染；突然変異型核酸のリポソ ーム運搬；突然変異型核酸の抗体運搬：突然変異型核酸での組織又は細胞の形質 移入；又は突然変異型核酸に接合した細胞又は組織特異性抗体の組織又は細胞と の接触。ウィルスが組換えマウスエコトロピック又はハムスターアンフォトロピ ックレトロウィルスであり、キメラ受容体ポリペプチドがここに示したキメラ受 容体ポリペプチドであるのが更に好ましい。

（本頁以下余白） 本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、幾つかの細胞型、特にＴリンパ球及び単 球／マクロファージ系列の細胞内で膜内右柱タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍ ｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）として細胞表面上で発現され得る。これは、 ＨＩＶ−１及びＨＴＬＶ−１の如き既知のヒトレトロウィルスのｉｎ　Ｖｉｔｒ Ｏ向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）と合致する。

かくして、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、正常では非ヒト特異性ウィル ス感染に抵抗性であるヒトにおけるこれら系列の細胞をかかるウィルスで感染さ れるようにするであろう。

ＥＲＲタンパク質で行うよりも本発明のキメラ受容体ポリペプチド置換受容体で 非マウス細胞を形質転換することの主要な利点は、免疫原性の大きな低下である 。

他の態様においては、本発明は、ここに記載した方法により作られた修飾キメラ 受容体細胞又は組織を包含する。この場合、真核細胞又は組織は、哺乳動物、昆 虫、鳥類又は酵母起源がら選択されるがこれらに限定されない。哺乳動物細胞又 は組織がヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯頚、ウシ、ブタ、ヒツジ、 ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ起源のものであるのが好ましいが、他のあらゆる哺乳 動物細胞を用いることができる。

トランスジェニック及びキメラ非ヒト哺乳動物本発明は、ヒトレトロウィルス受 容体として役立つことができる単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメ ラ受容体ポリペプチドをコードする本発明によるゲノミックＤＮＡをその生殖細 胞及び体細胞が含有するトランスジェニック非ヒト真核動物（好ましくはマウス の如きげっ歯頚）にも向けられている。単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複 数のキメラ受容体ポリペプチド核酸は、トランスジェニックにされるべき動物又 はその動物の祖先に、胚形成期に、好ましくは一細胞期、又は受精した卵母細胞 期に、一般には約８細胞期より遅くはない時期に導入される。

ここで用いる“トランスジエン”という用語は、動物のゲノム内に組み込まれそ してその動物内で発現され、そのトランスジェニック動物内にタンパク質を存在 させる遺伝子を意味する。

そのような遺伝子を既知の方法に従って染色体に組み込んで発現させるために、 動物胎児のゲノム内に導入することができる幾つかの手段がある。

全部よりも少ない桑実胚の細胞がトランスジェニック補乳動物の作成プロセス中 に形質移入されるときに作られる動物の如き、全部よりも少ない体細胞及び生殖 細胞が本発明のキメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチド核酸を 含有するキメラ非ヒト哺乳動物も、本発明の範囲内になるよう意図されている。

移植したヒト細胞又は組織をその体内に有するキメラ非ヒト哺乳動物も本発明に 包含される。この哺乳動物は、ヒト組織内でのキメラ受容体ポリペプチドの発現 を試験するのに及び／又は本発明のキメラ受容体ポリペプチドに優先的に結合す る運搬ベクターを伴った治療薬及び／又は診断薬の有効性を試験するのに用いる ことがてきる。キメラ非ヒト哺乳動物を得る方法は、例えば、米国特許出願第０ ７１５０８，２２５．０７１５１８，７４８．０７１５２９．２１７．０７１５ ６２，７４６．０７１５９６．５１８．０７１５７４．７４８．０７１５７５， ９６２．０７／２０７，２７３．０７／２４１，５９０及び０７／１３７，１７ ３に示されている。なお、どのようにしてヒト細胞又は組織を非ヒト哺乳動物の 体内に移植するかのそれらの記載については、参照により全体がここに組み入れ られるものとする。

トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成についてレーダー（Ｌｅｄｅｒ）の米 国特許第４．７３６．８６６号（参照によりその全体がここに組み入れられるも のとする）に記載された技術を、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の 作成に用いてもよい。

パルミタ−（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、　Ｒ，）ら、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ 、、　２０：４６５−９９（１９８６）に記載された種々の技術も用いることが できる。なお、この全内容は、参照によりここに組み入れられるものとする。

ヒトレトロウィルス感染又はかかる感染の結果として起こる疾患を予防、抑制又 は治癒することのできる化合物又は他の治療法を、細胞を感染するそれらレトロ ウィルスについて試験するために、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数の キメラ受容体ポリペプチドを受容体として用いて、キメラ受容体ポリペプチド又 はキメラ受容体ポリペプチド遺伝子を保持する動物を用いることができる。これ ら試験は、この発明のトランスジェニック動物に与えられるウィルスの用量を調 節することができるので、非常に感度が高くなり得る。かかる動物は、同じヒト レトロウィルス疾患の診断法を試験するためのモデルとしても役立つであろう。

かかる疾患には、エイズ、ＨＴＬＶ誘発白血病、及びそれに類したものが含まれ るが、これらに限定されない。本発明によるトランスジェニック動物は、細胞培 養用の細胞の供給源としても用いることができる。

本発明のトランスジェニック動物モデルは、ヒト免疫系の適当な細胞を有するそ れぞれ別々のマウスを再集団化することが必要なためにかなり多くの時間と実験 を要する“５ＣＩＤマウス”モデル（マクキュン（ＭｃＣｕｎｅ、　Ｊ、Ｍ、） ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１：１６３２−１６３９（１９８８））よりも大 きな経済的利点を有している。

キメラ受容体又はＨ１３特異性抗体及び方法この発明は、単独のキメラ受容体ポ リペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体に も向けられている。更なる態様においては、本発明の抗体は、レトロウィルス感 染を予防又は治療するのに、細胞内の又は細胞若しくは組織抽出物内の又は体液 内の単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存 在を検出するのに、又はその量若しくは濃度を測定するのに用いられる。一般的 には、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）の前記文献及びバーロー（ｌｌａｒｌｏｗ） の下記文献を参照のこと。

“抗体”という用語は、ハイブリドーマ、組換え法又は化学合成の如きあらゆる 既知の方法によって与えられる、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍ Ａｂ）、キメラ抗体、抗イデイオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及びそれらのフラグメ ントを含む。

抗体は、ある分子と特異的に反応し、それによってその分子をその抗体に結合さ せるのであれば、その分子と“結合することができる”と言われる。′エピトー プ”という用語は、ある抗体により結合されることができそしてその抗体により 認識されることもてきるあらゆる分子の部分のことをいう。エピトープ又は“抗 原決定基”は、通常、アミノ酸又は糖側鎖の如き分子の化学的に活性な表面群体 からなり、特異的３次元構造特性並びに特異的荷電特性を有している。

“抗原”は、抗体により結合されることができ、更に動物がその抗原のエピトー プに結合できる抗体を産生ずるのを誘発することができる分子又は分子の一部分 である。抗原は１つまたは２つ以上のエピトープを有しつる。上で言及した特異 的反応は、抗原が高い選択性でその対応する抗体と反応するが、他の抗原により 喚起され得る他の多数の抗体とは反応しないことを示そうとするのもである。

ポリクローナル抗体は、ある抗原で免疫感作された動物の血清から誘導される抗 体分子の異種個体群である。

モノクローナル抗体は、特異性抗原に対する抗体の実質的に同種の個体群である 。ＭＡｂは、当業者に知られている方法により得ることができる。例えば、コー ラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ、 　２５６：４９５−４９７　（１９７５）及び米国特許第４，３７６．１１０号 を参照のこと。また、例えば、アウスベルら編。

Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　 Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎ、Ｙ、、　（１９８７，１９９２ ）　；及びバーローとレーン（Ｌａｎｅ）、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）　；コリガンら編、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ ｎｃｅ、Ｎ、Ｙ、、（１９９２，１９９３）　を参照のこと。かかる抗体は、Ｉ 　ｇＧ、Ｉ　ｇＭ、Ｉ　ｇＥ、Ｉ　ｇＡ。

及びそれらのあらゆるサブクラスを含むあらゆるイムノグロブリンクラスのもの であってもよい。この発明のｍＡｂを産生ずるハイブリドーマは、ｉｎ　Ｖｉｔ ｒＯでもｉｎ　ｖｉｖｏでも培養することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏ産生での高 力価ｍＡｂの産生は、これを現時点で好ましい産生方法にする。簡単に説明する と、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタン感作したＢａ１ｂ／ｃマウス に腹腔的注射して、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を生成させる。当業者 に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧ のｍＡｂを、かかる腹水から、又は培養上澄み液から精製することができる。

キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変部とヒトイムノグロブリンネ変部とを有 するものの如き、その異なる部分が異なる動物種から誘導された分子である。キ メラ抗体及びそれらの産生方法は当該技術分野で既知である（例えば、モリソン （Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、肌Ｓ、へ、、　８１：６８５１ −６８５５　（１９８４）　；ヌーバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　３１４：２８８−２７０　（１９８５）　；サン（Ｓｕｎ）　ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４：２１４−２１８ （１９８７）　、ペター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０：１ ０４１−１０４３　（１９８８）；ペター（Ｂｅｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｄ、）国際特 許公開ＷＯ９１０７４９４を参照のこと、なお、これら文献は参照により全体が ここに組み入れられるものとする）。

抗イデイオタイプ（抗１ｄ）抗体とは、ある抗体の抗原結合部位に広く関連する 独特な決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの供給源と同じ種及び 遺伝型（例えば、マウス株）の動物を、それに対する抗１ｄを調製しようとする ｍＡｂで免疫感作することによって調製することができる。免疫感作された動物 は、その免疫感作抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そしてこれらイディオ タイプ決定基に対する抗体（抗１ｄ抗体）を産生することによって応答するであ ろう。

抗Ｉｄ抗体を“免疫原”として用いて、更に他の動物に免疫応答を誘発させ、い わゆる抗抗１ｄ抗体を産生させることもできる。

この抗抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを誘発したもとのｍＡｂに対して構造的類似性を有 し得る。かくして、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることに よって、特異性が同一の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能であ る。

従って、本発明の単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリ ペプチドに対して生成したｍＡｂを用いて、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの如き適当な動 物内で抗Ｉｄ抗体を誘発させることができる。かかる免疫感作マウスからの膵臓 細胞は、抗１ｄｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生させるために用い られる。更に、この抗ＩｄｍＡｂをキーホールリンペットヘモンアニン（Ｋ　Ｌ 　Ｈ）の如きキャリヤーにカップリングさせて、更なるＢａ１ｂ／ｃマウスを免 疫感作するのに用いることができる。これらマウスからの血清は、キメラ受容体 ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドエピトープに特異的なもとのｍＡｂ の結合特性を有する抗抗Ｉｄ抗体を含有するであろう。

かくして、抗ＩｄｍＡｂは、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ 受容体ポリペプチドのエピトープの如き評価されるエピトープと構造的に類似す るそれら自身のイディオタイプエピトープ又は“イディオタイプを有する。

上で示した“抗体”という用語は、無傷分子並びに例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’ ）ｚの如き抗原と結合できるそのフラグメントの両方を含めようとするものであ る。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）＝フラグメントは、無傷抗体のＦｅフラグメントを 欠いており、無傷抗体よりも急速に循環系から消え、そして無傷抗体よりも少な い非特異的組織結合性を有することができる（ウオール（Ｗａｈｌ）ら。

Ｊ、　ＮｕｃｌｏＭｅｄ、、　２４：３１６−３２５　（１９８３））。

抗体診断検定法 本発明に有用な抗体のＦａｂ及びＦ　（ａｂ’）２及びその他のフラグメントを 、無傷抗体分子についてここに開示した方法に従って、単独のキメラ受容体ポリ ペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの検出及び定量に用いることがで きるということが分かるであろう。かかるフラグメントは、典型的には、パパイ ン（Ｆａｂフラグメントを生成させる）又はペプシン（Ｆ　（ａｂ’）、フラグ メントを生成させる）の如き酵素を用いるタンパク質分解によって作られる。

本発明の抗体、又は抗体のフラグメントは、それらの表面上又は細胞内で単独の キメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞 の存在を定量的に又は定性的に検出するのに用いることができる。これは、光学 顕微鏡、フロー・サイトメトリ、又は蛍光光度検出法を結び付けた、蛍光標識抗 体を用いる免疫蛍光法（以下を参照のこと）によって行うことができる。

単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのｉｎ　 ５ｉｔｕ検出のために、本発明の抗体を免疫蛍光法又は免疫電気顕微鏡法におけ るように組織学に用いてもよい。そのような操作を用いることで、単独のキメラ 受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存在のみならず、検 査組織上でのその分布も測定することが可能になる。

更に、治療で用いた単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポ リペプチドの存在及び量を追跡する手段の如き、本発明の抗体を用いて、生体サ ンプル中の可溶性単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリ ペプチドの存在を検出することができる。

単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドについて のかかる免疫検定法は、典型的には、体液、組織抽出物、採取したばかりのリン パ球又は白血球の如き細胞、又は組織培養液中でインキュベートした細胞の如き 生体サンプルを、Ｈ１３タンパク質を同定できる検出できるよう標識した抗体の 存在下でインキュベートし、そして当該技術分野において周知の幾つかの技術の うちのいずれかによってその抗体を検出することを含む。

生体サンプルをニトロセルロースの如き固相支持体又はキャリヤー（この用語は ここでは相互に交換可能に用いられる）、又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパ ク質を免疫感作できる他の固体支持体で処理することができる。次いで、この支 持体を適当な緩衝液で洗浄した後、検出できるよう標識した単独のキメラ受容体 ポリペプチドに特異的な抗体又は複数のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗 体で処理することができる。次いで、この固相支持体を緩衝液で２回洗浄して未 結合抗体を除去することができる。

次いで、前記固体支持体上に結合した標識の量を、慣用的手段によって検出する ことができる。

“固相支持体”又は“キャリヤー”により、抗原又は抗体に結合できるあらゆる 支持体が意図される。周知の支持体、又はキャリヤーには、ガラス、ポリスチレ ン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天 然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑槙岩、及び磁鉄鉱が含まれる。

所与のロフトの抗キメラ受容体ポリペプチド又は抗キメラ受容体ポリペプチド抗 体の結合活性は、周知の方法に従って測定することができる。当業者は、日常的 な実験を用いることによって、それぞれの測定について効力がありかつ最適な検 定条件下で測定できるであろう。

単独のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗体又は複数のキメラ受容体ポリペ プチドに特異的な抗体を検出できるよう標識できる１つの方法は、それを酵素に 連結して、既知の方法による酵素免疫検定法（ＥＩＡ）に用いることによる方法 である。

検出は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ワーク　（Ｗｏｒｋ ）ら、　Ｎｏｒｔｈ　ＨｏｌｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）、特にチャード（Ｔ。

Ｃｈａｒｄ）により　“Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉ ｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″と題 された章に関する如き、他の種々の免疫検定法のいずれかを用いて行うことがで きる。なお、上記文献は参照により全体がここに組み入れられるものとする。

この抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。

この抗体を１１２Ｅ、又はランタン系列のその他のものの如き蛍光放出性金属を 用いて検出できるよう標識することもできる。これら金属は、ジエチレントリア ミン五酢酸（Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ）又はエチレンシアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のよう な金属キレート化群を用いて抗体に結合させることができる。

この抗体を化学発光性化合物にカップリングさせることによって検出できるよう 標識することもできる。次いで、この化学発光面識抗体の存在を、化学反応の間 に発生するルミネセンスの存在を検出することによって測定する。特に有用な化 学発光性標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（ｔｈ ｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩 及びシュウ酸エステルである。

同じく、生物発光性化合物を用いて本発明の抗体を標識してもよい。生物発光は 、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系内に見出され る化学発光の１タイプである。

生物発光性タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって測 定される。標識に重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及 びエクオリンである。

本発明の抗体分子を“二部位（ｔｗｏ　５ｉｔｅ）”又は“サンドイッチ”検定 法としても知られている免疫測定法での利用に適合させることができる。

典型的で好ましい免疫測定法には、固相に結合させた抗体を試験されるサンプル とまず接触させ、二成分の固相抗体−抗原複合体の形成によってそのサンプルか ら抗原を“抽出”する“フォワード”検定法が含まれる。適当な時間インキュベ ーションした後、固体支持体を洗浄して、未反応抗原がもしあればそれを含む液 体サンプルの残渣を除去してから、未知量の標識抗体（これは“受容体分子”と して機能する）を含有する溶液と接触させる。未標識抗体を介して固体支持体に 結合した抗原とこの標識抗体が複合化できる時間だけ２回目のインキュベーショ ンをした後、固体支持体を２回洗浄して未反応の標識抗体を除去する。

本発明の抗原でやはり有用である他のタイプの“サンドイッチ”検定法では、い わゆる“同時”及び“リバース”検定法が用いられる。同時検定法は、固体支持 体に結合した抗体及び標識抗体が両方とも、試験されるサンプルに同時に添加さ れる単一のインキュベーション工程を包含する。インキュベーションが終わった 後、固体支持体を洗浄して液体サンプルの残渣と未複合化標識抗体とを除去する 。次いで、固体支持体と結合した標識抗体の存在を慣用的な“フォワード”サン ドイッチ検定法の通りに測定する。

“リバース”検定法では、まず標識抗体の溶液を液体サンプルに段階的に添加し てから、適当な時間インキュベーションした後に、固体支持体に結合した未標識 抗体を添加する。２回目のインキュベーション後に、慣用的なやり方で固相を洗 浄して試験されるサンプルの残渣と未反応標識抗体の溶液とを除去する。次いで 、固体支持体に結合した標識抗体の測定を“同時”及び“フォワード”検定法に おける通りに行う。

本発明により治療方法も提供される。その方法は、キメラ受容体ポリペプチドを コードする少なくとも１種の発現可能な核酸を有する組織又は細胞を、キメラ受 容体ポリペプチドを発現するか又はそれが表面上に結合した細胞だけを認識する 組換え非ヒト特異性レトロウィルスベクターによる感染に付するものであり、そ のレトロウィルスベクターは、そのベクターの非ヒト特異性のために及び複製コ ンピテンスを提供するための復帰突然変異、突然変異又は組換え能力が比較的欠 如しているために、他のヒト細胞を感染できない。本発明によれば、キメラ受容 体ポリペプチドをコードする核酸を有する組換えレトロウィルスにより感染させ ることによって、キメラ受容体ポリペプチドが標的細胞に選択的に会合できるか 又は標的細胞上で発現される。この一時的及び／又は永久の会合が、特定の受容 体を有する病的な細胞の如き標的細胞、並びに構成的にキメラ受容体ポリペプチ ドが発現される場合におけるかかる病的な細胞の子孫に、キメラ受容体ポリペプ チドを選択的に曝させるか又はそれを選択的に発現させる結果、本発明に従い、 かかる標的細胞及び／又はそれらの子孫への治療薬の特異的運搬が可能となるの である。

かくして、本発明により、キメラ受容体ポリペプチドを細胞表面受容体の如き標 的細胞特異性細胞表面分子と一時的又は永久に会合させ、次いでこのキメラ受容 体ポリペプチドと結合して標的細胞を感染する組換えレトロウィルスを投与する ことによる、特異型の標的細胞を（随意に組換え体、キメラ受容体ポリペプチド の染色体発現、それらの子孫で）マーキングする方法が提供される。感染性ウィ ルスベクターは、■又は２以上の機能を付与するあらゆる多様な治療用核酸又は 治療性遺伝子を保持していてもよい。

１つの非限定的な例においては、キメラ受容体ポリペプチドを、抗体、リポソー ム又は標的細胞特異性受容体リガンドの如き標的細胞特異性ベクターとの会合に よって第一の種の標的細胞に特異的に運搬する。そうすると、このキメラ受容体 ポリペプチドが標的細胞と十分な時間会合して、このキメラ受容体ポリペプチド と結合することができる第一の秤取外の種に特異的なウィルスの受容体結合又は ｅｎｖドメインと会合した治療薬又は診断薬を用いる治療又は診断が可能になる 。こうして、治療性又は診断性核酸の如き治療薬又は診断薬が、標的細胞に優先 的に運搬され、例えば、この核酸が標的細胞の染色体中に組み込まれる場合は、 非標的細胞が排除される。

他の非限定的な例として、ウィルスベクターが細胞の中に修飾レトロウィルス受 容体遺伝子を運べるかも知れない。標的細胞が感染されると、その標的細胞はキ メラ受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡと一体となる。そうして、続いて標 的及び細胞及び全ての子孫が標的細胞表面上でキメラ受容体ポリペプチドを発現 するであろう。本発明に従ってキメラ受容体ポリペプチドでかかる標的細胞及び それらの子孫をマーキングすることにより、遺伝子治療を用いて病気を患ってい る動物被験体を治療することができる。この場合、遺伝子治療ベクターは、キメ ラ受容体ポリペプチドに特異的に結合して標的細胞に治療薬又は診断薬を運搬す る。

本発明のかかる方法を用いると、非特異性レトロウィルスベクター感染及び染色 体内への遺伝子挿入の危険を実質的に低下させて又は低下させないで、特定の病 気を治療することができる。

本発明によれば、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を、特定のタイプ の標的細胞に特異的な受容体に特異的に結合するポリペプチドをコードする配列 と結合させる。組換え宿主内でそのような核酸を発現させると、治療的投与に適 する融合タンパク質を回収可能な量で得られる。次いで、この薬学的に許容でき る融合タンパク質を病気の被験体に投与することができる。そうすると、この融 合タンパク質は標的細胞に特異的に結合して、本発明による非ヒト特異性ウィル スのｅｎｖ結合ドメインとして作用するであろう。続いて、多様な遺伝子のいず れがをコードする核酸を有する非ヒト特異性ウィルスを投与すると、感染細胞に １又は２以上の機能を与えることができ、その細胞に正又は負の治療効果をもた らすであろう。

更なる非限定的な例として、ヒト腫瘍細胞表面受容体に特異的な抗体の抗体フラ グメントへの融合タンパク質としてキメラ受容体ポリペプチドを用いて、ヒト腫 瘍を治療することができる。薬学的に許容できる形でのそのような融合タンパク 質を動物モデル又はヒト被験者に投与して、キメラ受容体ポリペプチドをコード するＤＮＡを有する非ヒト特異性レトロウィルスによる感染用に腫瘍細胞をマー キングする。この融合タンパク質が標的細胞としての腫瘍細胞に結合したら、第 ２段階はこのレトロウィルスの投与からなるものであって、腫瘍細胞に感染する と、その感染した腫瘍細胞のサブサール（ｓｕｂｓａｌｌ）並びにそれらの子孫 によるキメラ受容体ポリペプチドの発現がもたらされる。腫瘍細胞がキメラ受容 体ポリペプチドを構成的に発現すると、実質的に非標的細胞に感染することなし に遺伝子治療を安全に用いて、標的細胞としての腫瘍細胞に治療薬を運搬するこ とができる。しかしながら、この細胞が第２段階を介してこの受容体を発現する 必要はない。

事実、第２段階は、当業者によって決定されるときは、全体として省略してもよ い。

非限定的な副次的例として、ヒト腫瘍細胞に特異的なり３抗体フラグメントを用 いて融合タンパク質と遺伝子治療を提供することができる。この場合、特異性病 的細胞特異性抗体又は結合タンパク質は、まず融合タンパク質として発現され、 （ａ）病的細胞に結合して、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を有す る非ヒト特異性ウィルスによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでの感染を 可能にする結果、そのウィルス感染病的細胞の表面上でキメラ受容体ポリペプチ ドが発現され、（ｂ）キメラ受容体ポリペプチドに結合する運搬ベクターとして のｅｎｖ結合ドメインと会合した少なくとも１種の治療薬により、ウィルス感染 標的細胞がｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏで死滅する。好ましくは、既知 の方法に従い、ヒトの臨床治療の前に動物モデル系を用いてもよい。

エコトロピック又はアンフォトロピックウィルスの如き組換え非ヒト特異性ウィ ルスにより感染されることになる動物又はヒトの細胞若しくは組織へのキメラ受 容体ポリペプチドをコードする核酸の選択的導入は、既知の方法に従って行うこ とができる。非限定的な例には、（幹細胞又は間質細胞のような）骨髄細胞、白 血球、及び分化した又は分化していない顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ 球、赤血球、巨核球、中枢神経系の細胞、及び神経組織の如き組繊細胞、肝細胞 、腎細胞、筋肉細胞、心臓細胞又は心筋細胞、動脈又は静脈細胞又は組織、眼細 胞、結合組織又は細胞、肺組織又は細胞、膵臓細胞又は組織、内分泌組織又は細 胞、Ｃ３Ｆ、又は中枢神経系の細胞の如きヒト細胞又は組織の、キメラ受容体ポ リペプチドをコードする核酸でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ形質転換、その後のヒト被験 者内への再導入；又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の、筋肉、心 臓、肝臓、腎臓、脳、神経、膵臓、膵臓、精巣、卵巣、脳下垂体、視床下部、胆 嚢、眼、肺、又は骨髄の如き組織内へのｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　５ｉｔｕでの 直接注射が含まれる。

かくして、本発明の一側面においては、少なくとも１種の治療薬又は診断薬をキ メラ受容体保有細胞又は組織に移す方法が提供される。この方法は、本発明によ るキメラ受容体細胞又は組織を得ること及びそのキメラ受容体細胞又は組織を、 非ヒトウィルスのｅｎｖ結合ドメイン及び少なくとも１種の治療薬又は診断薬を 含む運搬ベクターと　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、　ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　５ｉｔｕ で接触させることを含む。その結果、この運搬ベクターがキメラ修飾細胞に結合 して、その治療薬又は診断薬がそのキメラ受容体細胞に治療又は診断効果をもた らす。

治療薬又は診断薬は、本発明の方法に従い、キメラ受容体細胞又は組織としての 標的細胞に、このキメラ受容体細胞上で細胞外発現されるキメラ受容体ポリペプ チドのキメラ受容体に特異的であるウィルス外膜タンパク質のｅｎｖ結合ドメイ ンを含む運搬ベクターによって選択的に運搬される。

運搬ベクター 運搬ベクターは、ウィルスベクター、リポソーム、又は診断薬若しくは治療薬と 会合したｅｎｖ結合ドメインの複合体であってもよい。

運搬ベクターは、更に、その運搬ベクターの標的細胞としてのキメラ受容体細胞 に治療又は診断効果をもたらす何らかの診断薬又は治療薬を含んでもよい。

診断薬又は治療薬 診断薬又は治療薬は、核酸、化合物、タンパク質、元素、脂質、抗体、サツカラ イド、アイソトープ、炭水化物、画像形成剤、リポタンパク質、糖タンパク質、 酵素、検出可能なプローブ、及び抗体又はそのフラグメント、又はそれらの組み 合わせから選択される少なくとも一種であってもよいが、これらに限定されない 。

なお、抗体の標識については、ここに記載したようにして、検出できるように標 識することができる。かかる標識には、酵素標識、ラジオアイソトープ又は放射 性化合物又は元素、蛍光化合物又は金属、化学発光性化合物及び生物発光性化合 物が含まれるが、これらに限定されない。また、本発明の方法では、他のあらゆ る既知診断薬又は治療薬を用いることができる。

治療薬の標的細胞 本発明で用いる治療薬は、キメラ受容体細胞としての標的細胞への治療効果を有 することができ、その効果は、欠損遺伝子又はタンパク質の矯正、薬物作用、毒 性効果、成長刺激効果、成長抑制効果、代謝効果、異化作用、同化効果、抗ウイ ルス効果、抗菌効果、ホルモン効果、神経液性効果、細胞分化刺激効果、細胞分 化抑制効果、神経修飾効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インシュリン刺激又は 抑制効果、骨髄刺激効果、多能性幹細胞刺激効果、免疫系刺激効果、及び本発明 による運搬ベクターを介してキメラ受容体細胞に運搬される治療薬によって与え られ得る他のあらゆる既知の治療効果から選ばれるが、これらに限定されない。

治療用核酸 治療薬としての治療用核酸は、キメラ受容体細胞に次の治療効果のうちの少なく とも１種を有することができるが、これらに限定されない：　ＤＮＡ配列の転写 を抑制すること；　ＲＮＡ配列の翻訳を抑制すること、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列の 逆転写を抑制すること；タンパク質の翻訳後修飾を抑制すること、ＤＮＡ配列の 転写を誘発すること；　ＲＮＡ配列の翻訳を誘発すること、ＲＮＡ又はＤＮＡ配 列の逆転写を誘発すること；タンパク質の翻訳後修飾を誘発すること、ＲＮＡの ような核酸の転写；タンパク質又は酵素のような核酸の翻訳；及び治療用核酸の 構成的又は一過的発現のためのキメラ受容体細胞の染色体への核酸の組み込み。

治療効果 かかる治療効果は、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡの如き欠損遺伝子の消去又は その発現のプロセシング；ウィルス複製又は合成の抑制；治療用タンパク質をコ ードする異種核酸の発現又は欠損タンパク質の矯正のような遺伝子治療；　ｈｎ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ。

ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡの如きＲＮＡの欠損体又は不十分発現体の修飾；ドラッ グ若しくはプロドラッグ、又はキメラ受容体を発現する病的又は正常細胞内でド ラッグ又はプロドラッグとしての化合物を生成する酵素をコードすること：チミ ジンキナーゼ水痘−帯状庖疹ウィルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ　ＴＫ）（例え ば、ツーバー　（Ｈｕｂｅｒ）　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８８：８０３９−８０４２　（１９９２）を参照のこ と、なお、この全内容はそこでの引用文献を含めて参照により組み入れられるも のとする）を新生物細胞の如き病的細胞内でコードして、かかる病的細胞を直接 又は間接に死滅させること；及び他のあらゆる既知の治療効果を含むことができ るが、これらに限定されない。かくして、上記の如き変異型核酸を遺伝子治療に 用いることができる。

病的細胞への運搬のために既知のあらゆる毒素、プロドラッグ又はドラッグ遺伝 子をコードするか又は治療効果を提供する本発明の治療用核酸は、新生物細胞の 如き病的細胞に特異的な組織特異的転写調節配列（ＴＲ８）（α−胎児性タンパ ク質ＴＲ８又は肝臓関連アルブミンＴＲ３を含む）（例えば、ダイナン（Ｄｙｎ ａｎ）とチアン（ＴＪｉａｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１６二 ７７４−７７８　（１９８５）を参照のこと）の制御の下で遺伝子を含むことも できる。かかるＴＲ３は、本発明のキメラ受容体ポリペプチドを発現する癌細胞 のような標的細胞内の細胞死滅性毒素、ドラッグ又はプロドラッグの発現を更に 制限するであろう。

キメラ受容体細胞内に運搬されて発現される本発明の治療用核酸の更なる例は、 脳腫瘍細胞の如き真核性デバイディング（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞を選択的に死 滅させるチミジンキナーゼをコードする治療用核酸である。なお、この腫瘍細胞 を囲む脳細胞はデバイディングではない。従って、キメラ受容体ポリペプチドを コードする本発明の核酸を脳細胞に注射し、又はその核酸で脳細胞を形質移入又 はｉｎ　ｖｉｖｏでウィルスベクター形質転換した後に、チミジンキナーゼをコ ードする組換えエコトロピックレトロウィルスでそのキメラ受容体脳腫瘍細胞を 治療処理すると、その脳腫瘍細胞がチミジンキナーゼの発現によって選択的に死 滅するであろう。例えば、アンダーソン（Ｆ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、　５ｃ ｉｅｎｃｅ。

Ｊｕｎｅ、　１９９２を参照のこと。

また、疾患に対し高い罹患率をもたらす異常Ｈ１３分子を、変異型Ｈ１３タンパ ク質の如きキメラ受容体ポリペプチドで形質移入された所望の系列の細胞（例え ば、造血幹細胞）の注入によって、その注入された細胞が内因性の細胞個体群と 優先的に置き換わるような条件下で置き換えてもよい。

本発明の方法では、運搬ベクターが組換え非ヒト特異性ウィルスであるのが好ま しい。そうすれば、その非ヒト特異性ウィルスのキメラ受容体細胞又は組織への 結合が、その修飾受容体細胞の感染とキメラ受容体細胞内の治療用核酸の治療効 果をもたらす。

他の好ましい態様においては、運搬ベクターが、リンカ−によって治療薬又は診 断薬に結合していて、その結合又は接触が所望の治療的又は診断効果をもたらす 、非ヒト特異性ｅｎｖ結合ドメインを含む複合融合タンパク質又はそれをコード する核酸を含む。

なお他の好ましい態様においては、運搬ベクターは、ｅｎｖ結合ドメインと治療 薬を含有するリポソームを更に含んでもよい。そうすれば、ｅｎｖ結合ドメイン がキメラ受容体細胞のキメラ受容体結合部位と結合できる。

他の好ましい態様においては、運搬ベクターのキメラ受容体細胞又は組織との接 触が、治療用核酸の治療的有効量の発現産物を発現するキメラ受容体細胞又は組 織をもたらすことができる。

他の好ましい態様においては、治療用核酸は、キメラ受容体含有細胞又は組織を 選択的に死滅させるように作用する毒素をコードする。病的細胞は癌細胞であっ てもよい。他の態様においては、治療用核酸は、上皮増殖因子、インターロイキ ン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、組織増殖因子−α、イ ンシュリン増殖因子＝１、又は線維芽細胞増殖因子から選択される増殖因子を更 にコードしてもよい。

毒素は、精製されても又は組換え型毒素であってもよく、又は、例えば、リジン 、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、内毒素、毒液毒素、及びそれらに類 したものの少なくとも１種から選択された毒素の少なくとも１つの機能性細胞毒 性ドメインを含む毒素フラグメントであってもよい。

治療用核酸は、キメラ受容体細胞又は組織内での異常タンパク質の発現を遮断す るように作用する単鎖リポソーム阻害性タンパク質から選択された少なくともｌ メンバー；サイトカイン；又は増殖因子をコードしてもよい。

本発明の他の側面によれば、細胞毒性又は化学療法性物質を、標的キメラ受容体 細胞としての病的細胞に優先的に結合する、ｅｎｖ結合ドメインを有する運搬ベ クターに又は抗体若しくはそのフラグメント又は増殖因子に直接に結合させても よい。このタイプの治療のための標的は、増殖因子受容体、分化抗原、又は他の 病的細胞と特異的に会合した他のあまり特徴付けされていない細胞表面抗原であ ってもよい。今日では、多くの癌は、オンコ遺伝子として又はオートクリン（ａ ｕｔｏｃｒｉｎｅ）な様式で癌細胞の増殖を促進するよう機能できる増殖因子受 容体を過剰産生ずることが確認されている（パスタン（Ｐａｓｔａｎｅ）とフイ ツゲラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、　１９９１　；ベル（Ｖｅｌｕ）ら、　 １９８７；カワノら。

１９８８；ベルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｔｏｍ）　＆へルストロム、　１９８９ ）　、例えば、上皮増殖因子受容体は、多くの偏平上皮細胞及び類表皮癌、ダリ ア芽細胞腫、及び幾つかの転移性卵巣及び膀胱癌に大量に存在する（細胞当たり ３Ｘ１０’受容体まで）（ベクター（Ｈｅｎｄｅｒ）　ら、１９８４；ジョーン ズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９０；ラウ（Ｌａｕ）ら、　１９８８）。対照的に、 正常細胞は、細胞当たりより少ない量を含有できるに過ぎない（デュン（Ｄｕｎ ｎ）ら、　１９８６）。他の例では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体 が、正常Ｔ細胞におけるよりも成人Ｔ細胞白血病の患者の細胞上に相当多くの数 で存在する（ＡＴＬ；細胞当たり３Ｘ１０’受容体）。

Ｂリンパ球の如き正常細胞上に存在する他の分化抗原も、Ｂ細胞リンパ腫の如き 腫瘍細胞上に存在することが多い。かかる抗原はＢ細胞を産生ずる幹細胞上に存 在しないので、標的療法によって死滅させられるあらゆる成熟Ｂ細胞は、幹細胞 個体群から置き換えられるであろうが、一方、癌細胞は置き換えられないであろ う（ゲティー（Ｇｈｅｔｉｅ）ら、　１９８８）。最後に、その機能が未だ分か っていない癌細胞上で優先的に発現される抗原がある。癌胎児性抗原（ＣＥＡ） （ムラ口（Ｍｕｒａｒｏ）ら、　１９８５）の如きこれらの幾つかのものは、胎 児性抗原であって、正常成人組織上に存在しないか又は少量だけ存在するかのい ずれかである。このグループは、モノクローナル抗体とのそれらの反応性によっ て規定されるに過ぎない未知の起源の抗原も含有する（フリーンケル（Ｆｒａｅ ｎｋｅｌ）ら、１９８５；バルキ（Ｖａｒｋ　ｉ　）ら、１９８４；ライリンガ ム　（Ｗｉ　ｌｌｉｎｇｈａｍ）　ら、１９８７）。

本発明の治療用又は診断用運搬ベクターの成分として用いることができる単鎖抗 原結合タンパク質は、それらの大きさが小さいために臨床応用において数多くの 利点を有している。これらタンパク質は、モノクローナル抗体又はＦａｂフラグ メントよりも速く血清から除去される。それらは細胞受容体により認識される抗 体のＦｃ部分を欠いているので、それらは画像形成に応用した場合のバックグラ ンドが低く、免疫原性も低い。それらは、モノクローナル抗体よりも良好に固体 腫瘍を取り囲む微小循環に浸透するとも考えられる。

そのような治療用運搬ベクターでは、治療薬は毒素又は毒素フラグメント若しく はドメインであり、リジン、シュードモナス・エキソ毒素、ジフテリア毒素、チ ミジンキナーゼ、及びそれらに類したものの少なくとも１つから選択された毒素 の少なくとも１種の機能性細胞毒性ドメインを含む精製された又は組換え型毒素 又は毒素フラグメントの如きものである。例えば、癌治療に組換え型毒素を用い ることは当該技術分野で知られている（例えば、パスタンとフィツゲラルド５ｃ ｉｅｎｃｅ、　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２２．１９９１．　ｐｐ。

１１７３−１１７７、及びそこに引用された文献、これら文献は参照によりその 全体がここに組み入れられるものとする）。

ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子治療にとってより安全なベクターの獲得ｉｎ　ｖｉｖｏ遺 伝子治療処理の安全限界を高めるのに用いることができる３つの異なる手段を使 用することが、本発明により提供される。これら手段は：　（ａ）異なるパッケ ージング細胞株の使用：　（ｂ）アンフォトロピックよりむしろエコトロピック を基礎とするベクターの使用：及び（（）　ｉｎ　ｖｉｖｏでレトロウィルスベ クターの標的を所望の細胞個体群に設定する方法を提供することアンフォトロピ ックウィルスを基礎とするベクターを退かせることの安全性に関する問題は、高 力価エコトロピックレトロウィルスベクターの産生のための新規な系を発見する 動機を提供してきた。この戦略は、ヒト細胞はハムスター白血病ウィルスにより 感染され得ないという事実（ステンバック（Ｓ　ｔｅｎｂａｃｋ）ら、　Ｐｒｏ ｃ。

ＳＯＣ，ＥＸＩ）、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１２２：１２１９−１２２３．１ ９６６）に依拠している。

ハムスター白血病ウィルスは、マウス、ラット、ネコ、サル及びヒト細胞を感染 しようと試みたが失敗に終わったので、ハムスター細胞しか感染しないと報告さ れている（リーバ−（Ｌｉｅｂｅｒ）ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１８２：５Ｂ−５８９１９７３）　Ｏハムスター細胞でのマ ウスエコトロピックウィルスの複製も用いることができる。これは、マウス又は 修飾ヒトエコトロピック受容体をこれら細胞内に形質移入してから感染させるこ とによって行われた。この戦略は、アンフォトロビックウィルスを複製するこれ ら細胞の天然の抵抗性を更に利用するものであり、これら細胞内でのマウスエコ トロピックウィルス配列の増幅を繰り返すことによって高力価のエコトロピック 発現を達成するものである。

関連する特定の方法 ベストウィック（Ｂｅｓｔｗｉｃｋ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、、　８５：５４０４−５４０８．１９８８）のいわゆる“ビンボン”戦略に 実質的に手を加える。どちらもヒト細胞内で正常に複製することができない２種 のレトロウィルスを用いる。ψ−ＨａＬＶを発現し；マウスエコトロピックウィ ルス受容体を安定に発現するチャイニーズハムスター細胞（細胞株Ａ）を用いて ヘルパーウィルスを得、そしてす−エコトロピックＭｕＬＶを発現するがマウス エコトロピックウィルス受容体を発現しない第２チヤイニーズハムスター細胞（ 細胞株Ｂ）と共に同時培養する。このように細胞株Ａ内で増殖したウィルスは、 ＨａＬＶ受容体を介して細胞株Ｂに感染することができる。この細胞内で複製さ れたウィルスは、マウスエコトロピックｇｐ７０を有し、そして細胞株Ａに感染 することができる。このプロセスは、理論最大数（約１０’〜１０”ＰＦＵ）の 粒子の産生が達成されるまで続くと考えられる（ボデイン（Ｂｏｄｉｎｅ）　ら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８７：３７３８− ３７４２゜１９９０）。ここで説明するように、混合パッケージング系同時培養 でのレトロウィルス配列の増幅は、組織培養時間で割った増加コピー数と関係す ることが分かった（ヘソルファ−（Ｈｅｓｏｒｆｆｅｒ）ら、Ｈｅｍａｔｏｌｏ ｇｙｌｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｃ１１ｎｉｃ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ　 ５：４２３−４３２、１９９１）。更に、レトロウィルスベクターＤＮＡは、そ れが細胞中に形質移入されたときは、プロウィルス組み込み後に得られるレベル に比較して相対的に発現が乏しいようなので（ベストウィックら、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８５：５４０４−５４ ０８゜１９８８　、ヒュアング（Ｈｕａｎｇ）とギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）、　 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、。

５０：　４１７−４２４．１９８４）　、このアプローチは好ましい。

このアプローチに従えば、ゲノム内に組み込まれた多コピーのエコトロピックウ ィルス配列を含有し、そして少なくとも約１０７〜１ｏ１０、好ましくは約１０ ９〜１０Ｉ０を産生ずるチャイニーズハムスター細胞株が提供されるが、それら のウィルス受容体が本発明に従って修飾されなければ、組換えで又は他の方法で ヒト細胞に感染できる粒子は産生されない。この結果が得られたことを確認する ために、ウィルス感染性を検出するために普通に用いられる種々のヒト及びマウ ス細胞株で適切なウィルス感染性検定を行う。このアプローチは、これまで利用 可能であったよりも遥に安全なパッケージング系を生み出すと考えられる。

ＨａＬＶをクローン化してそのパッケージングシグナル内に欠失を生じさせる。

パッケージングシグナルの除去は、既知の方法に従って得ることができる。次に 、ＣＨＯハムスター細胞内へのマウスエコトロピックウィルス受容体の形質移入 及び安定発現を既知の方法、例えば、ヨシモトら（１９９３）に記載されたよう な方法に従って行う。随意に、クローン化したヘルパーウィルスを追加の安全性 のためのスプリットゲノム（ｓｐｌｉｔ　ｇｅｎｏｍｅ）としてこれら細胞内に 導入してもよい。マウスエコトロピックウィルスヘルパーの場合、Ｗパッケージ ング配列の１３４塩基対が欠失したエコトロピックモロニーマウス白血病ウィル スに相当する３ＰＯプラスミドから誘導したプラスミドｐｇａｇ−ｐｏ　Ｉ　ｇ ｐｔ及びｐｅｎｖは、商業的供給機関から又はここに示した公表された研究者か ら容易に得ることができる。かかるプラスミドをうまく用いて、アンスブリット （ｕｎｓｐｌｉｔ）へルバーウィルスゲノムを用いるものよりも幾分高い安全性 を有するＰＣＬを生成させた。

ＨａＬＶをクローン化するために、既知の操作、例えば、組換え型チャイニーズ ハムスター卵巣細胞株からの欠損レトロウィルス粒子のクローニングに類似する アンダーソンら（１９９２）の操作を用いる。例えば、かかるクローンは、アン ダーソンによって同定されたｐＣＨＯＣ，ＭＬ　１０配列又は内因性のポリトロ ピックマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）分離株、ＭＸ２７（ストイ（Ｓｔｏｙ ｅ）及びコフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）、　１９８７）を含む。後者のプローブは、 完全９．３　ｋ　ｂプロウィルスゲノムを包含する１　２．３　ｋ　ｂマウスゲ ノミックフラグメントからなる。ハムスターＣ型関連配列をＩｇｔｌＯ内の粒子 ＲＮＡのランダムにプライムしたｃＤＮＡから単離する。後者のプローブを用い る場合、低ストリンジエンシーハイブリダイゼーションを用いて興味の対象であ るプラークを同定する。細胞外粒子は、培養液組換え型ＣＨＯ細胞サブクローン 、３−３０００−４４　（ラスキイ　（Ｌａｓｋｙ）ら、１９８６）から調製さ れる。このサブクローンは、マウスｄｈｆｒの遺伝子とｌ型ヒト免疫不全ウィル ス（ＨＩＶ−１）の組換え型外膜糖タンパク質（ｇｐ１２０）を含有する発現ベ クターで形質移入した後のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠乏ＣＨＯ− ＤｕｘＢ１１細胞（シモンセン（Ｓ　ｉｍｏｎｓｅｎ）とレビンソン（Ｌｅｖｆ ｎｓｏｎ）。

１９８３　、ウルラブ（Ｕｒｌａｂ）とチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、　１９８０ ）から誘導した。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＸＢ　１１細胞株の祖先） は、もとは成熟チャイニーズハムスターの卵巣バイオプシー（ブック（Ｐｕｃｋ ）ら、　１９５８）から誘導されたものであるが、アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の如き商業的供給機関から容易に入手できる。

また、ハムスター配列をマウスエコトロピックウィルスの同等部分で修復する。

アンダーリンらによって観察されたようにして、ウィルス粒子が産生されると考 えられる。ｐＣＨＯＣ，ＭＬ　１０配列は、そのエンドヌクレアーゼ遺伝子の３ つ全てのリーディングフレーム内に潜在的コーディング配列の複数の中断を含ん でいるので、もしもそのクローンが無傷エンドヌクレアーゼをコードしないなら ば、そのエンドヌクレアーゼ領域は、エコトロピックＭｕＬＶの如き同種レトロ ウィルスゲノムのそれで置き換えられることができる。ＨａＬＶ表面外表面外膜 タンパクモの粒子が他のハムスター細胞を感染できるように適度に発現されるが 、他の全てのＨａＬＶ遺伝子は必須ではないので（ＬＴＲはおそらく排除される ）、同種ＭｕＬＶ配列によって置換可能である。クローンＨａＬＶのＷ領域を欠 失させるには、マージ（Ｍａｎｎ）らの方法を用いる（Ｃｅｌｌ　３３：１５３ −１５９．１９８３）。

（ｂ）キメラ受容体ポリペプチドの使用非限定的な例として、遺伝子運搬のため に修飾されたエコトロピックレトロウィルス受容体（ＭＥＲＲ）は、遺伝子治療 中の癌及び関連する疾患の潜在的な発生率を低下させる筈である。

本発明の方法には幾つかの利点がある。第１に、マウスエコトロピックウィルス はヒト細胞内で複製できないので、思い浮かべられるどの組換えウィルスもヒト 細胞に感染することはできないであろう。更には、遺伝子治療をする者は、感染 されるのが望ましい標的細胞に対してだけ精巧な特異性で感染を限定できるであ ろう。種々のタイプの器官内のヒトゲノム全てにわたるウィルスの可能なランダ ム挿入が起こることは、ヒト感染性アンフォトロビックレトロウィルスを基礎と するベクターが用いられる時はいっても考えられるようには、考えられず又示さ れもしないであろう。更に、本発明の方法は、修飾を最小限に止めたヒトウィル ス受容体タンパク質を用いるので、感染したヒト細胞の免疫系による拒絶反応の 可能性は、相当に低下されているか又は排除される。

特にｉｎ　ｖｉｖｏ法についての本発明の好ましい側面は、標的細胞に治療効果 を提供する組換え型非ヒト特異性エコトロピックウィルスによって感染される細 胞の特異的標的化を可能にする運搬ベクターを用いて動物を治療する方法である 。そのような物質の非限定的な例には、適当なリンカ−ペプチド及びマウスエコ トロピックウィルス受容体又は修飾ヒトエコトロピック受容体と結合した細胞表 面分子（ＭＨＣクラスｌ抗原の如きもの）に特異的な抗体のＶｕ及びＶＬ領領域 包含する融合タンパク質が含まれる。

また、膜受容体（上皮増殖因子受容体の如きもの）のリガンドは、マウスエコト ロピックウィルス受容体又は修飾ヒトウィルスエコトロピック受容体と融合した 。デザインは、その特異性が比較的簡単に修飾できるよう十分に柔軟なものとな ろう。

医薬組成物： 少なくとも１種のキメラ受容体ポリペプチド又は抗体の如き本発明のタンパク質 、ペプチド又は抗体を含む医薬組成物は、少なくとも１種の治療薬がその意図す る目的を達成するに有効な量で含まれる全ての組成物を包含する。更に、少なく とも１種の治療薬を含有する医薬組成物は、活性化合物を薬学的に用いることが できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適当な薬学的に許 容できる担体を含有してもよい。

医薬組成物は、注射による投与又は経口投与に適する溶液を含み、約０．００１ 〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性成分（即ち、治療薬）を賦形剤と共 に含有する。経口投与のための医薬組成物は、錠剤及びカプセル剤を含む。直腸 に投与することができる組成物は座薬を含む。

治療薬の担体 活性成分のための担体は、噴霧てきるものであっても噴霧てきないものであって もよい。噴霧できない形態は、局所投与に助けとなる担体を含みそして好ましく は水の粘度よりも大きな動的粘度を有する半固体又は固体であってもよい。適す る製剤には、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ ）、散剤、塗布剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）及びそれらに類したものが含まれるが これらに限定されない。所望により、これらを滅菌しても又は補助剤、例えば、 保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、又は浸透圧に影響を及ぼす塩及びそれらに類 したものと混合してもよい。噴霧できない局所製剤に好ましいビヒクルには、軟 膏ベース、例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）； ＨＥＢクリームの如き慣用的なりリーム；ゲル；並びに石油ゼリー及びそれらに 類したものが含まれる。

全身適用にも局所適用にも適するが、特に粘膜及び肺への適用に適するのは、活 性成分が好ましくは固体又は液体の不活性な担体物質と組み合わさった噴霧可能 なエアゾール製剤である。このエアゾール製剤は、本発明のタンパク質又はペプ チドに加えて溶媒、緩衝剤、界面活性剤、香料、及び／又は酸化防止剤を含有し てもよい。エアゾール投与については、本発明による治療薬をスクィーズボトル 内に、又はバルブとアクチュエーターの適当な系を有する与圧容器内に包装して もよい。当該技術分野では全く周知であるが、計量バルブを用い、そのバルブチ ャンバーは駆動又は投与の間に再装填されるのが好ましい。

治療薬の投与 本発明の治療薬は、その意図する目的、例えば、感染を有しているか又は受け易 い被験体における局所感染の治療又は全身感染の治療、を達成するあらゆる手段 によって投与することができる。

例えば、免疫抑制された個体は、レトロウィルス感染及び疾患を特に受け易い。

例えば、投与は、皮下、静脈内、陵内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、頭蓋内、経皮 、又は舌下ルートの如き種々の非経口ルートによることができる。別に又は同時 に、投与は経口ルートによってもよい。非経口投与は、−回の注射により又は時 間をかけて徐々に潅流することによってもよい。

本発明の治療薬を用いる更なる様式は、局所投与によるものである。本発明の治 療薬を、皮膚上への平滑効果並びに患部に直接活性成分を投与する手段の両方を 有する軟膏剤（ｓａｌｖｅ。

ｏｉｎｔｍｅｎｔ）の如き局所用に適用されるビヒクルに混和してもよい。

局所適用については、本発明による有効量の治療薬を感染、例えば、皮膚表面、 粘膜等に投与するのが好ましい。この量は、一般に、治療すべき面積、その用途 が予防のためであるが治療のためであるか、症状の重さ、及び用いる局所ビヒク ルの性質に依存して、１回の適用で約０．０００１ｍｇ〜約１ｇである。好まし い局所製剤は、軟膏剤ベースＣＣ当たり約０．００１〜約５０ｍｇの活性成分が 用いられる軟膏剤である。軟膏剤ベースは好ましくはＰＥＧ−１０００である。

治療又は予防のための局所療法は、１日又は数日間、１週間〜約６か月まで及び １週間〜約６か月を包含する期間にわたって有効量を投与することを含む。

ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで投与される本発明の治療薬の投与量は、 レシピエンドの年齢、性別、健康状態、及び体重、もしあるとすれば同時に行っ ている治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存するであろうと理 解される。以下に示す有効投与量の範囲は、限定することを意図したものではな くて好ましい投与量の範囲を表わすものである。しかしながら、最も好ましい投 与量は、個々の被験体に適するように決められるであろうが、当業者によって理 解されかつ決定可能であろう。

それぞれの治療に要求される総投与量は、複数投与あるいは１回投与で投与され てもよい。治療薬は、単独で投与してもウィルス感染に向けられた又はウィルス 性疾患の他の症状に向けられた他の治療薬と共に投与してもよい。

本発明の治療薬の有効量は、約ｏ、　ｏ　ｏ　ｉμｇ〜約１０約１００ｍｇ体重 であり、好ましくは約ｌμｇ〜約ｓｏｍｇ／ｋｇ体重である。

非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液又は非水溶液剤、懸濁剤、及び乳濁剤がふ くまれ、当業者に知られている補助剤又は賦形剤を含有してもよい。錠剤及びカ プセルの如き医薬組成物も慣用的方法に従って調製される。

診断的検定法： 本発明は、被験体の正常な若しくはキメラな受容体又はＨ１３タンパク質又はｍ ＲＮＡの存在及びレベルを評価する方法を提供する。個体中のＨ１３遺伝子の不 存在、又はより典型的には、Ｈ１３遺伝子の低発現又は変異型Ｈ１３の存在は、 レトロウィルス感染に対する抵抗性及びかくしてエイズ又は一定のタイプの白血 病又は他のレトロウィルス媒介疾患の発症の重要な予測材料として役立ち得る。

また、ＨＩ３の過剰発現は、レトロウィルス感染を受け易くなったことの重要な 予測材料として役立つ。

更に、ウィルスに誘発された腫瘍細胞株では、ＥＲＲ又はＨ１３ｍＲＮＡ発現が 増加するが、これはｍＲＮＡ又は受容体タンパク質発現のレベルが、他の方法で は検出できないウィルス感染の有用な指標として役立ち得ることを示している。

従って、Ｈ１３ｍＲＮＡ　（以下を参照のこと）又はタンパク質（上記のような 免疫検定法を用いる）の量を測定する手段を提供することによって、本発明は、 被験体内のヒトレトロウィルス感染又はレトロウィルス形質転換細胞を検出する 手段を提供する。

キメラ受容体ポリペプチドの種々の部分をコードするオリゴヌクレオチドプロー ブ又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を用いて、キメラ受容体 ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの存在につ いて被験体からの細胞を試験する。好ましいプローブは、キメラ受容体ポリペプ チド又はキメラ受容体ポリペプチド配列の少なくとも１２、好ましくは少なくと も１５ヌクレオチドをコードする核酸配列に向けられたものであろう。定性的又 は定量的検定法は、かかるプローブを用いて行うことができる。例えば、ノーザ ン分析（以下を参照のこと）を用いて、細胞又は組織試料中のキメラ受容体ポリ ペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドｍＲＮＡの発現を測定する。

かかる方法は、選択的増幅技術の使用が知られているので、個体から得られた非 常に少量の核酸を使用して用いることができる。

精製核酸フラグメントを増幅てきる組換え核酸法が、長い間認められてきた。典 型的には、かかる方法は、核酸フラグメントのＤＮＡ又はＲＮＡベクター内への 導入、そのベクターのクローン増幅、及び増幅した核酸フラグメントの回収を包 含する。かかる方法の例は、コーエンら（米国特許第４．２３７．２２４号）、 サムブルーフらの前記文献等によって示されている。

最近になって、かかる所望の核酸分子の濃度を増加できる１ｎｖｉｔｒｏ酵素的 方法が記載された。この方法は、′ポリメラーゼ連鎖反応”又は“ＰＣＲ”と言 われている（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、　５１：２６３−２７３（１ ９８６）　；　ｘルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ、　Ｈ，）、　ＥＰ５０．４２４　； 　ＥＰ８４．７９６　、ＥＰ２５８．０１？　、ＥＰ２３７，３６２　；ムリス 、ＥＰ２０１．１８４．ムリスら、米国特許第４，６８３，２０２号；エルリッ ヒ、米国特許第４，５８２，７８８号；及びサイキ（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ）ら。

米国特許第４．６８３，１９４号）。これら全ては、参照により全体がここに組 み入れられるものとする。

このポリメラーゼ連鎖反応は、特定のＤＮＡ配列がそれまでに精製されておらず かつ特定のサンプル中に単一のコピーが存在するに過ぎない場合でも、そのＤＮ Ａ配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。この方法は、一本鎖又は二本 鎖ＤＮＡのいずれを増幅するのにも用いることができる。この方法の真髄は、所 望のＤＮＡ分子の鋳型依存性ポリメラーゼ媒介複製のためのプライマーとして役 立つ２つのオリゴヌクレオチドの使用を包含することである。

ＰＣＲの委細は、ムリス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、 　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、　５１：２６３−２７３　（１９８６）　：サイキら（Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：１００８−１０１２　（１９８５））　；及びムリスら （Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５：３３５−３５０（１９８７）により 示されている。

ここまで本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することによっ て本発明をより容易に理解できるであろう。この実施例は、説明のために示した ものであって本発明を限定しようとするものではない。

実施例■ 一般的な材料及び方法 細胞株 次の細胞株を以下に記載した検討に用いた：ＣＣＬ１２０（ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ １２０）、！：：トＢリンパ芽球様細胞株、ＣＣＬ１１９　（ＣＥＭ、ＡＴＣＣ ＃　ＣＣＬＩ　１９）、ヒトＴリンパ芽球様細胞株；５ｕｐＴｌ、ヒト非ホジキ ン下リンパ腫細胞株；Ｈ９、ＨＵＴ７８由来単−由来クー細胞クローン膚Ｔ細胞 リンパ腫細胞株、ＭＯＬＴ４（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ１５８２）、ヒト急性リンパ 芽球白血病細胞株、ＨＯＳ　（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬｌ　５４３）、ヒト骨肉腫細 胞株；ＨｅＬａ　（ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ２）。

ヒト類上皮癌細胞株；ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣ＃　６１）、チャイニーズハムス ター卵巣細胞株；ＢＩ　０Ｔ６Ｒ，Ｂ１０．Ｔ　（６Ｒ）マウスの放射線誘発胸 腺腫；及びＲＬ１２．Ｃ５７ＢＬ／６Ｋａマウスの放射線誘発胸腺腫。

スクリーニング ヒトＣＥＭ及びＨＵＴ７８Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌ）をクロー ンチック・ラボラトリーズ社（パロアルト、カルフォルニア）から入手した。ヒ トリンパ球コスミドライブラリ−（ｐＷＥ１５）をストラタジエン（ラジョラ、 ＣＡ）から入手した。これらライブラリーをマニアチスらの方法（マニアチスら 。

Ｃｅ１ｌ、　１５：８８７−７０１　（１９７８））によってスクリーニングし た。ＥＲＲｃＤＮＡ　（＋）ＪＥＴ）の金縁オープンリーディングフレームを含 有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、アルブリットン（Ａｌｂｒｉｔ ｔｏｎ）及びクニンハム（Ｃｕｎｎ　ｉ　ｎｇｈａｍ）の両博士（バーバード医 学校、ボストン、ＭＡ）から提供して貰った。このＤＮＡをニックトランスレー ションにより＄２ｐで約２Ｘ１０’　ｃｐｍ／μｇの比活性に標識して、ハイブ リダイゼーションプローブプリン（Ｂｌｉｎ、　Ｎ、）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　３：２３０３−２３０８（１９７６））により記載され 、パンペノ　（Ｐａｍｐｅｎｏ、　Ｃ，Ｌ、）とメロイｏ　（Ｍｅｒｕｅｌｏ） 　（パンベノら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５８：２９６−３０６　（ｔ９８６ ）により手を加えられた通りにして、高い相対質量のＤＮＡを細胞から調製した 。制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動、ニトロセルロースへ の写し取り（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１社、キーン、ニューハ ンプシャー）、ハイブリダイゼーション及び洗浄は記載されているとおりであっ た（バンペノらの前記文献；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、Ｄ、）、　Ｉｍｍｕ ｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２７：２３９−２５１（１９８８））。

ノーサンプロット分析 全細胞ＲＮＡを酸性グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホル ム法（コムクジンスキイ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、）ら、　Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６２：１５６−１５９　（１９８７））によって細胞 から単離した。そのＤＮＡ−１−１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気 泳動してナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ ｃｈｕｅｌｌ　＞ｌ　キーン、ニューハンプシャー）に写し取った。ハイブリダ イゼーション及び洗浄は、アマリ　（Ａｍａｒｉ、　Ｎ、Ｍ、Ｂ、）ら（Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　７：４１５９−４１６８　（１９８７））に従 って行った。

ＤＮＡ配列分析 陽性ファージからのｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ　（ストラタジェン）のＥｃｏＲＩ部位に再クローン化した。このプラスミ ドの一方向欠失体をエキソヌクレアーゼ１１１及びＳ１ヌクレアーゼを用いるこ とによって構築し、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）試薬（Ｕ、Ｓ、バイオ ケミカル社、クリーブランド、オハイオ）でのジデオキシチェインターミネータ −法（サンが−（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、Ｓ、）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、、　７４：５４６３−５４６７　（１９７７）によって配列決定した。他で 記載された部分消化コスミドＤＮＡを探り出すＴ３又はＴ７プロモーター特異性 オリゴヌクレオチドを用いて（エバンス（ｌＥｖａｎｓ、　Ｇ、Ａ、）ら、　Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５２：６０４−６１０　（１９８７）、陽性コ スミド挿入体の制限酵素地図を決定した。このコスミドのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ Ｉ又はＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントをｐＥ３１ｕｅＳｃｒｉｐｔ又 はｐ　Ｓ　ｐ　ｏ　ｒ　ｔ　ｌ　（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ガイセルスブルグ、ＭＤ ）内にサブクローン化した。そのエキラン同志及びエキソンーイントロン接合部 を、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて配列決定した。配列は、 ジエネティックス（Ｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）コンピューターグループ配列分析ソフ トウェア−パッケージを用いて編集及び分析した（デベロークス（Ｄｅｖｅｒｅ ｕｘ。

Ｊ、）　ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１２：３８７−３９５ 　（１９８４））。

実施例ＩＩ Ｂ１３のＤＮＡ及び推定タンパク質配列コーディング配列の５°及び３′末端に おいて非コーディング配列を含むＢ１３の全ヌクレオチド配列（配列番号ニア） を図１に示す。この配列は、クローン７−２（配列番号：ｌ）からもともと得ら れる部分配列を含む。配列番号；１のヌクレオチド１〜６及び１０９９〜１１０ ２は、もともと誤って決定されたものであった。図１は、このヌクレオチド配列 から推定される全アミノ酸配列（配列番号：８）も示している。この配列は、こ のヌクレオチド配列からもともと誤って推定されたＮ−末端Ｐｒｏ−Ｇｌｙ及び Ｃ−末端Ｐｒｏを除いては、ちとから記載されていた部分アミノ酸配列（配列番 号＝２）を含む。

Ｂ１３とＥＲＲのヌクレオチド配列の比較を図２に示し、Ｂ１３、ＥＲＲ及びＴ ＥＡのアミノ酸配列の比較を図３に示す。

これら比較した配列間の相同性は非常に高く、例えば、Ｂ１３とＥＲＲのＤＮＡ 間の相同性は８７．６％であり、Ｂ１３とＴＥＡのアミノ酸間の相同性は５２． ３％である。

種々の種の細胞から採取したＤＮＡのサザーン分析により、マウスＥＲＲｃＤＮ Ａプローブ（図４）及びＢ１３ｃＤＮＡ（図５）とハイブリダイズできるＤＮＡ が、ＣＣＬ　ｌ　２０、ＣＣＬ　１１９．５ｕｐＴｌ、Ｈ−９及びＭＯＬＴ−４ を含む５つのヒト細胞株内に、及びハムスター細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ）とマウス細 胞（正常Ｂａ１ｂ／ｃマウス胸腺細胞）内に存在することが分かつた。Ｈ１３１ ３遺伝子は、ノーサン分析を用いて、Ｈ１ａｃＤＮＡプローブを用いて検査した 。このプローブは、ＨｅＬａ５ＳｕｐＴｌ、ＨＯ３及びＣＣＬ１１９細胞からの ＲＮＡ内中に約９ｋｂの転写産物を検出した（図６）。このＲＮＡは、マウスＥ ＲＲｃＤＮＡプローブを用いても検出できた（図７）。

マウスレトロウィルス受容体（ＥＲＲ）ｃＤＮＡを、選択可能マーカープラスミ ドＤ　Ｎ　Ａ　Ｐ　、Ｉ）　Ｓ　Ｖ　２　Ｎ　ｅ　ｏで、リン酸カルシウムを用 いて、マウスエコトロピックレトロウィルスによっては感染され得ないハムスタ ーＣＨＯ細胞内に同時形質移入した（ライブナ−（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、）ら、 　Ｃｅ１１．１４＋７２５−７３１　（１９７８））。次いで、この受容体遺伝 子を発現する形質移入体をマウス放射線白血病ウィルス（ＲａｄＬＶ）により感 染した。感染後２週間してその上澄み液の逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定しくス テフェンセン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｎ、Ｊ、Ｒ，）　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４ ８ニア４９−７５６　（１９７２））　、ノーサンプロット分析をウィルスプロ ーブを用いてそのＲＮＡの調製後に行った。

図８に示すように、この受容体遺伝子を発現しない未形質移入ＣＨＯ細胞内で検 出されたＲＴ活性は、組織培養培地の活性（バックグランド）と区別できなかっ た。これは、この細胞がＭｕＬＶによって感染されなかったことを示している。

このＥＲＲｃＤＮＡで形質移入した後は、その形質移入細胞上澄み液のＲＴ活性 はバックグランドよりも大いに高かった（図８）。

ＭｕＬＶウィルスプローブは、この形質移入体から調製したＲＮＡ中に転写産物 を検出したが、未形質移入ＣＨＯ細胞から調製したＲＮＡ中では検出しなかった 。これらの結果は、ＥＲＲｃＤＮＡで形質移入された細胞は、エコトロピックマ ウス白血病ウィルスに対する感受性を与えることができることを示している。

（本頁以下余白） 実施例■ ト１３に対する抗体の作製および使用 予測される全タンパク質（配列番号２）を有するＨ−１３含有融合タンパク質を 作製することは非常に困難である。というのは、図９に示されるように、予測さ れるタンパク質は疎水性が高いからである。従って、このタンパク質中に存在す る抗原エピトープを予測するために、ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥのプロ グラム（Ｊａｍｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　’ＣＡＢＩＯ５４：　１８１−’１ ８’６　（１９８８））を用いてコンピューター分析を行った。図１０は、Ｈ− １３タンパク質配列の抗原性プロフィールを示す。

’１８０　ｂｐのＡｃｃｌ−Ｅｃ’ｏＲＩ断片を生じる制限酵素Ａｃｃ　ＩとＥ ｃｏＲＩで切断することにより、・抗原性の高い部分をコードするＤＮＡ配列（ 配列番号２、アミノ酸残基３０９−３６７）を作製した。オーブンリーディング フレームの発現を可能にする配向（Ｓｍｉｔｈ、　Ｄ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｇｅｎｅ　６７：　３１−４０　（１９８８））で、Ｈ−１３ｃＤＮＡのこの断 片をｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドベクター（ファルマシアＬＫＢ　バイオテクノロ ジー）のクローニング部位に連結した。なお、このプラスミドベクターはグルタ チオン−８−トランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）との融合タンパク質として抗原 を発現することができる。

イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養物に添加して融 合タンパク質を誘導し、グルタチオンセファロース４Ｂクロマトグラフイー（フ ァルマシアＬＫＢ　バイオテクノロジー）を用いて精製した（図１１参照）。精 製した融合タンパク質をフロイント完全アジュバントとともにウサギに筋肉内お よび皮下注射して抗血清を得た。

この抗血清は、）Ｉ−１３タンパク質およびそのエピトープ断片への特異的な結 合を示す。

ヒト細胞由来の膜タンパク質を標準的な手法に従って作製し、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分離し、ウェスタンプロット分析用ニトロセルロース上にプロ ットした。このＨ−１３特異的抗体は、これらのプロット上のタンパク質への結 合を示す。

実施例ＶＩ Ｈ−１３の遺伝地図作製 Ｈ−１３遺伝子の染色体上の位置をヒト−ハムスタ一体細胞ハイブリッド（Ｋｏ ｕｒｉ、　Ｒ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅ ｎｅｔ、　５Ｊ：１０２５（１９８９））のパネルからのＤＮＡを含む染色体プ ロット（Ｂｉｏｓ　Ｃａｒｐ、。

Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を用、いて決定した。ヒト− ハムスターハイブリッド細胞中に残っているヒト染色体と旧３　ｃＤＮＡの発現 を比較することにより、このＨ−１３遺伝子はヒト染色体１３にマツピングされ た（図１２参照）。染色体１３に結合しているヒト遺伝子（あるいはその中の変 異により生じる疾患）には、以下のものが含まれる。網膜芽細胞腫、骨肉腫、ウ ィルソン病、レテラーージーヴ工病、デユービン−ジョンソン症候群、凝固因子 ＶｉｉおよびＸ、コラーゲンＩＶα１およびα２鎖、Ｘ線感受性、リンパ球細胞 質ゾルタンパク−１１頚動脈小体腫瘍−１、プロピオルＣｏＡカルボキシラーゼ （αサブユニット）等。

実施例ＶＩＩ キメラ旧３／ＥＲＲＤＮＡによりコードされたキメラ受容体ポリペプチドおよび タンパク質分子 マウスＥＲＲ配列およびヒト旧３配列間の数個のキメラ分子を作製し、キメラニ ーキメラＩＶと命名した。詳細には、図１３に示される共通の制限部位の使用に 基づいて、Ｈ２Ｓ　ｃＤＮＡの４つの領域を置換した。

ｐＳＧ５またはｐＣＤＭ８発現ベクターを用いて、これらのＤＮＡ配列をチャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインに一過的にトランスフェクトした。

２日後、これらのトランスフェクタントの［！−ＭｕＬＶ感染を支持する能力を 試験した。細胞を２８ＡＧと命名された組換えモロニーＥ−ＭｕＬＶ（Ｐｒｉｃ ｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８４：１５６−１６０（１９８７））に感染させた。この組換えウィ ルスはまた、選択可能なマーカーおよび検出可能な産物を提供するβ−ガラクト シダーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ印些す遺伝子を含んでい た。その後、前記細胞を０．６　ｍｇ／ｍｌの濃度の抗生物質６４１８の存在下 、選択的な条件下で増殖させて、ｎｅｏＲ−発現トランスフェクトントを選択し た。２週間後、０４１８−耐性コロニーの数を計測した。

これらの結果は、Ｅ−ＭｕＬＶ感染に必須のＥＲＲ遺伝子の部分がＮｃｏ　１− ＢｓｔＸＩ制限部位内に位置し、細胞外ドメイン３を含むものであることを示し ている。（図１３の上段に示されるような）細胞外ドメイン３は、図１４に示さ れるように、ヒトおよびマウス配列間で非常に異なる受容体タンパク質の領域で ある。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ＣＯｍｐｕｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　 ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｐａｃｋａｇｅ　（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、 　Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３８７−３９５　 （１９８４））を用いて、（図１〜３に示される配列から誘導された）図１４の 配列を整列させた。

次に、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（ｏｌ　ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｌ ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、細胞外ドメイン３ 内の個々のアミノ酸置換を含むキメラ分子を作製した。これらを上記のようにし てトランスフェクトし、上記のようにしてトランスフェクタント細胞のＥ−Ｍｕ ＬＶによる感染に対する感受性の試験を行った。

上記の検討の結果は、本来のアミノ酸配列をマウスＥＲＲタンパク質の対応する 位置由来の１〜４個のアミノ酸で置換することにより、ヒト旧３分子がＥ−Ｍｕ ＬＶに結合する能力を獲得することを示す。

実施例ＶＩＩＩ エコトロピックのマウス白血病レトロウィルスの感染性を与えることができるＨ １３誘導体としてのキメラ受容体ポリペプチド図１８に記載のように、ヒト旧３ アミノ酸残基をマウスＥＲＲ残基で置換した。細胞外ドメイン３および／または ４が重要なアミノ酸残基を含んでいることを明らかにしている共通の制限部位を 利用した置換により、マウス−ヒトキメラ受容体分子を作製した。その後、オリ ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、上記の２つの細胞外ドメイン内に１ 個または２個のアミノ酸の置換または挿入を有する１３個の個々の変異体ＥＲＲ 分子を創製した。ヒトＨ１３の２４２および２４４アミノ酸残基のＰｒｏおよび Ｖａｌの少なくとも２個のアミノ酸を対応するアミノ酸残基ＴｙｒおよびＧｌｕ で置換したり、あるいはヒト旧３のＧＩＹ２４０およびＰｒｏ２４２をＶａｌお よびＴｙｒ　（ＥＲＲのＶａ１２３３およびＴｙｒ２３５に対応する。）で置換 すると、得られる変異体旧３はマウスエコトロピックレトロウィルス受容体とし て機能する能力を持つようになる。この変異体Ｈ１３は、遺伝子治療に利用でき るであろう。

マウスＥＲＲおよびヒト旧３がＭｕＬＶ−Ｅの受容体として機能する相対的な能 力を比較するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋｌ）セルライン をマウスＥＲＲまたはヒトＨ１３のいずれかを発現するベクターで一過的にトラ ンスフェクトした（図１６の文字を参照）。２日後、これらのトランスフェクタ ントを大腸菌１ａｃＺβ−ガラクトシダーゼおよびＴｎ５　ｎｅｏ耐性遺伝子を 含む組換えＭｕＬＶ−Ｅ、ＷＣＲＥ／ＢＡＧピリオンに感染させ（Ｐｒｉｃｅ　 ｅｔ　１．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１ ５６−１６０　（１９８７）；　Ｄａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：６４６０−６４６４　（１９ ８８））、Ｇ４１８で選択した。１０〜１４日後、０４１８耐性コロニーの数を 計測した（図１６）。旧３トランスフエクタントでは陽性クローンは得られなか ったが、［！ＲＲトランスフェクタントでは１０”個以上のコロニーが得られた 。このことは、アミノ酸の置換または欠失により改変されなかった旧３分子がＭ ｕＬＶ−Ｈの受容体として機能する能力を欠いていることを示している。

図１８に表されているような、ＭｕＬＶ−Ｅ感染のためのアミノ酸残基の改変を 同定するために、共通でかつ単一の制限部位であるＫｐｎｌを利用した置換によ り旧３改変タンパク質を作製し、それらのＭｕＬＶ−Ｅの受容体として機能する 能力を測定した（図１６）。前半部分がＥＲＲの対応する領域で置換されている キメラ■のトランスフェクトントについては約１０”個のコロニーが得られたが 、後半部分がＥＲＲの対応する領域で置換されているキメラＩ＋のトランスフェ クタントについてはコロニーは得られなかった。このことは、重要なアミノ酸残 基が前半部分に位置していることを示している。必須の領域をより狭く特定する ために、Ｎｃｏ　Ｉ−Ｎｅｏ　Ｉ断片がＥＲＲの対応する領域で置換されている キメラＩＩＩを作製し、その受容体として機能する能力を測定した（図１６）。

約１０”個のコロニーが得られたが、このことは、感染に重要な領域がＮｃｏ［ −Ｎｃｏｌ制限部制限部位置していることを示している。

図１７は、マウスＥＲＲおよびヒト旧３における細胞外ドメイン３および４の配 列の比較を示すものであるが、それらの配列はＧｅｎｅｔｉｃｓ　ｃｏｍｐｕｔ ｅｒ　ｇｒｏｕｐ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　 ｐａｃｋａｇｅ　（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄ　Ｒｅｓ、　１２：３８７−３９５　（１９８４））を用いて整列させであ る。細胞外ドメイン３は、上記の２つのドメイン内に１個または２個のアミノ酸 置換または挿入を有するマウスＥＲＲ分子（変異体１−１１）間で最も異なる領 域である（図１７および表２）。各置換については、ＥＲＲのアミノ酸残基をＨ １３１００同じ位置に見いだされるものと置換した。各挿入については、Ｈ２Ｓ のアミノ酸残基を図１７に示されるように整列させたＥＲＲ配列の同じ位置に付 加した。

変異型ＥＲＲタンパク質を発現するＣＨＯ−Ｋｌ細胞のＭｕＬ、Ｖ−Ｅの受容体 として機能する能力を試験した。驚くべきことに、変異体７のみについてはコロ ニーが得られなかったが、他の変異体については約５００個のコロニーが得られ 、このことは、これらの１１個の変異体のうち、変異体７だけが前記受容体とし て機能する能力を失っていることを示している（表２）。変異体７は２個のアミ ノ酸置換を有しており、Ｔｙｒ　（ＥＲＨの２３５アミノ酸残基）がＰｒｏ　（ Ｈ２Ｓのアミノ酸残基２４２に相当する。）に、Ｇｌｕ　（ＥＲＲのアミノ酸残 基２４４に対応する。）がＶａｌ　（Ｈ２Ｓの２４４アミノ酸残基）に置換して いる。従って、たった１個のアミノ酸置換を含む（変異体７　Ａ　：　Ｔｙｒか らＰｒｏ　、変異体７　Ｂ　：　ＧｌｕからＶａｌ　）変異体７ＡおよびＢを作 製し、前記受容体として機能するそれらの能力を試験した。変異体７Ｂは、もと のＥＲＲとほぼ同じ程度で、前記受容体として機能する能力を有しているが、変 異体７Ａはこの能力をほぼ完全に失っていることが見いだされた（表２）。これ らの結果は、ＥＲＲ配列の２３５アミノ酸残基に位置するＴｙｒがＭｕＬＶ−Ｅ の受容体タンパク質として機能するためには極めて重要であり、このアミノ酸残 基を置換するとＥＲＲが該受容体として機能する能力を失うことを示唆している 。

ＨＩ３のあるアミノ酸残基がＥＲＲの対応するアミノ酸残基で置換されると、８ １３分子が前記受容体として機能する能力を獲得するか否かを決定するために、 １１１３の８個の変異体を図１８に示されるように作製し、前記受容体として機 能するそれらの能力を測定した。例えば、Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏ ｎ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１８：３４３９−３４４３　（１ ９９０）に提示されているように、ファージミドベクターｐＳＥＬＥＣＴ−１（ Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる変法部位特異的突然変異誘発（ａｌｔｅｒｅｄ　５ｉ ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の方法により、前記Ｈ１３ １３変異創製した。この突然変異誘発は、一本鎖ＤＮＡおよび２個のプライマー の使用に基づくものである。前記２個のプライマーは、ひとつが突然変異誘発性 プライマーで、もう一つは第２の修正プライマー（ベクター中のアンピシリン耐 性に対する欠損を修正する。）である。

ｐＳＧ５）＋１３の挿入物をＢａｍ１（Ｉで完全に、ＥｃｏＲＩで部分的に消化 し、ｐＳＥＬＥＣＴ−１のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１部位にサブクローニングして 、ｐＳＥＬＥＣＴ−１アンチセンスＩ（１３を得た。ＰＳＧ５Ｈ１３変異体５お よび８の挿入物をＥｃｏＲＩで切り出し、ｐｓＢＬＥｃＴ−１のＥｃｏＲ１部位 にサブクローニングして、ｐｓＥＬＥｃＴ−１アンチセンスＨ１３変異体５およ び８を得た。鋳型としてのｐｓＲＬＥｃＴ−１アンチセンス８１３およびオリゴ ヌクレオチド： ＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＴＡＣＧＧＲＧＲＲＧＧＲＧＧ　（配列番号９　）　 （［１３変異体１　）　；ＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧ冗燕 魚　（配列番号１０）　（Ｈ１３１３変異）： ＡＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＴＴＧＧπ℃　（配 列番号１１）（）ｌ１３変異体３）；および ＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧ　（配 列番号１２　）　（Ｈ１３１３変異） を用いて、Ｈ１３１３変異〜３および５を作製した。ｐｓＥＬＥｃＴ−１アンチ センスＨ１３変異体８およびオリゴヌクレオチド：ＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＴ ＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡπ　（配列番号１３　）を用いて、Ｈ１３１３変異を作 製した。ｐｓＥＬＥｃＴ−１アンチセンスＨ１３変異体５およびオリゴヌクレオ チド：ＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＡ（ＧＧＴＧＡ　（配列番号１４ 　）　（Ｈ１３変異体６　）　。

ＡＡＴＧＡＣＡＣＡに部品ＣＧＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡ　（配列番号１５） （Ｈ１３１３変異）；および ）ＪｙＣｊＵ５ＴＧＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧ　にＭα死℃ＡＩ ＴＣＡＴＧ　（配列番号１６）（Ｈ１３１３変異） を用いて、Ｈ１３１３変異〜８を作製した。

例えば、Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１８：３４３９−３４４３　（１９９０）に提示されているよう に、ファージミドベクターｐｓＥＬＥＣＴ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる変法 部位特異的突然変異誘発の方法により、前記ＥＲＲ変異体を創製した。この突然 変異誘発は、一本鎖ＤＮＡおよび２個のプライマーの使用に基づくものである。

前記２個のプライマーは、ひとつが突然変異誘発性プライマーで、もう一つは第 ２の修正プライマー（ベクター中のアンピシリン耐性に対する欠損を修正する。

）である。

ｐｓＧ５ＥＲＲの挿入物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで部分的に消化し、ｐｓ ＥＬＥＣＴ−１のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１部位にサブクローニングして、ｐ ｓＥＬＥＣＴ−１センスおよびアンチセンスＥＲＲを得た。一本鎖ＤＮＡ　＠ｐ ＳＥＬＥＣＴ−１センス（変異体２および６の作製用）およびアンチセンス（他 の変異体の作製用）　ＥＲＲから調製し、製造元の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従 って突然変異誘発を行った。５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（ＵＳＢ）およびプライマー としての２つのＥＲＲ特異的アンチセンスオリゴヌクレトチド（変異体１〜７用 の　ＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡ（配列番号１７）および変異体８〜１ １用のＴ’ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡ（配列番号１８）） を用いる直接配列決定により、正しく突然変異させたクローンを選択した。ミニ ブレツブにより作製したファージミドの突然変異した挿入物をＥｃｏＲＩで切り 出し、ｐＳＧ５のＥｃｏＲ［部位にサブクローニングした。上記で使用したもの と同じプライマーを用いて各プラスミドの配列決定を行うことにより、突然変異 の存在を確認した。その後、リポフエクチン試薬を用いる方法により、各変異体 をＣＩ（Ｏ−Ｋｌ細胞に一過的にトランスフェクトし、ＭｕＬＶ−Ｅによる感染 に対するそれらの感受性を上記のようにして測定し、図１８に示されるような結 果を得た。

その結果、Ｔｙｒ２４２並びにＶａｌ　２４０およびＧ１ｕ２４４の少なくとも １つを含む本発明の変異型旧３ポリペプチドは、そのようなキメラ受容体ポリペ プチドがヒト細胞の細胞外表面に発現されることによりマウスエコトロピックレ トロウィルスによる結合および感染が可能となるように、ＭｕＬＶ−Ｈのような マウスエコトロピックレトロウィルスにより機能的に認識される変異型旧３受容 体結合領域を与えることが示された。従って、このような方法を本発明に従って 、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　５ｉｔｕの遺伝子治療の方 法として用いることができる。あるいはまた、本発明のこのような方法を用いて 、マウスエコトロピックレトロウィルスベクターを使用してヒト細胞または組織 に異種または外来遺伝子を導入することができる。従って、本発明の旧３変異体 を使用することにより、アンフォトロビックレトロウィルスベクターを使用する より、はるかに安全な遺伝子治療の手段が提供され、これによりアンフォトロピ ックレトロウイルスによる非標的細胞の意図しない感染の問題の他、組換えエコ トロピックウィルスを比較的低い投与量で使用するための免疫抗原性の減少の問 題が解決された。

以上をまとめると、ヒトエコトロピックレトロウィルス受容体がクローニングさ れ、マウスエコトロピックウィルスは、分子改変の導入がなければ、通常ヒト細 胞を感染できないことが認識されると、レトロウィルスを包含する遺伝子治療の 安全性が劇的に改良される状態となる。第１工程において、エコトロピックレト ロウィルス受容体の改変された遺伝子は標的細胞に運ばれ、一過的に発現される であろう。その後、マウスエコトロピ・ツクウィルスベクターを使用して感染さ せ、安定に組み込んで、所望の治療用遺伝子を発現させることとなろう。感染の 第１工程には、時間が全くかからないか、いくらかかがるがもし７れない。

使用すべきエコトロピックウィルスベクターは、構造遺伝子の欠失を有しており 、安全性を付加するための“安全な“パッケージングセルライン中で増殖するで あろう。１ｏ＠〜ＩＱＩＯ粒子／ｍｌの範囲のウィルス力価を産する新規なパッ ケージングラインが構築されると予想されるが、この構築においては、ヒト細胞 を感染できる組換えウィルスが欠けている。さらに、ウィルスの外膜糖タンパク 質の改変により、ｉｎ　ｖｉｖｏのウィルス感染性を妨げるか、または、ウィル ス力価を減少させるようなあらゆる決定基が排除されよう。また、ヒトエコトロ ピックウィルス受容体相同体を研究することにより、その正常な遺伝子機能を決 定したり、遺伝子治療プロトコールがその正常な機能に有害な影響を及ぼす可能 性を排除するためのそのタンパク質に関する十分な理解が得られる実施例ＩＸ ヒトアンフォトロビックウィルス受容体のクローニング遺伝子治療ベクターの開 発のために、アンフォトロピック受容体をクローニングする。公知の工程（例え ば、Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０；　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 　１９９１）に従い、テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ　ａｐｅ）白血病ウィルスおよ びマウスエコトロピックウィルス（Ｅ−ＭＬＶ）の受容体をクローニングするの に用いられるものと類似の戦略により、アンフォトロピックＭＬＶの受容体をク ローニングする。その戦略は、ヒト細胞がＡ−ＭＬＶに感染されうるがハムスタ ー細胞は感染され得ないという事実に依るものである。ハムスター細胞を感染で きないのは、それらが適当な受容体を欠いているからであり、そのヒト遺伝子を ハムスター細胞にトランスフェクトすれば、八−ＭＬＶに感染可能とすることが できる。これらの細胞を抗生物質耐性の組換えウィルスに感染させることにより 単離し、次いで、抗生物質含有培地の選択を行う。前記の受容体遺伝子はヒト反 復ＤＮＡと会合するのでクローニングしやすい。アンフォトロピック受容体遺伝 子をクローニングして、種々のアッセイおよび種々の手法で前記エコトロピック ウィルス受容体との類似性および非類似性を検討する（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｏ ｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９３）。

方８　ＣＨＯ細胞をトランスフェクションの朝にプレートした。

切断しタヒトケノムＤＮＡ（５０μｇ）およびＩ）ＳＶ２ｇｐ＋　ＤＮＡ　（ｌ μｇ）をＷｉｇｌｅｒら（１９７８）の方法によりリン酸カルシウムで共沈させ 、ＣＨＯｌｆａ胞に適用した。翌日、トランスフェクトした細胞をｇｐｔ選択培 地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣ８、ヒボキサンチン１５μｇ、キサンチンｕ　ｇ／ｍ ｔ、チ′　ミジン１０　μｇ／ｍｌ、グリシン１０　μｇ／ｍｌ、メトトレキセ ート０．１μＭ、およびミコフェノール酸２５μｇ／ｍｌ）中でプレート当たり ２Ｘ１０’細胞で継代培養した。選択下２１日後、コロニーをトリプシン／ＥＤ ＴＡに簡単に晒して分散させ、ウィルスに晒す前に置換して、ヒトＤＮＡを獲得 した細胞を富化した。

ＰＡ３１７／ＬＮＬ６アンフオトロピツクレトロウイルス産生線維芽細胞をコン フルエンスになるまで増殖させ、新鮮な培地で再培養した。１２〜２０時間後、 培養培地を濾過しく０．４５μｍ　、　Ｎａｌｇｅ）、ポリブレン（ｐｏｌｙｂ ｒｅｎｅ）　８　μｇ／ｍｌとし、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞とともにイ ンキュベートした。４〜１２時間後、新鮮な培地を添加し、感染プロトコールを その翌日繰り返した。３日後、これらの細胞をｌ　ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有 するＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で８２　ｍｍプレート当たり２Ｘ１０’細胞で再 プレートし、選択培地を３日毎に１５日間置換した。２０．０００個のトランス フェクシントのうち、数個（１０〜２０個）だけがｇ４１８耐性コロニー中に発 生することが予想された。クローンがこのアンフォトロピックウィルスに感染可 能で、実際にこのアンフォトロピックウィルス受容体を発現することを証明する ために、それらをまた第２のアンフォトロピックウィルス（Ｖ　−２−ＡＭ−Ｚ 　ＩＰ−ＤＨＰＲ）に感染させた。細胞は前記ウィルス受容体を含まない効率の 低い経路により前記ウィルスを獲得することが可能である。６４１８耐性コロニ ーを細胞クローニングシリンダーで単離し、ネオマイシンウィルスについて上記 したように各々を１１’−２−ＡＭ−ＺＩＰ−ＤＨＦＲウィルスに晒した。前記 ウィルスへの暴露に続いて、細胞をメトトレキセーｈ（１５０ｎＭ）を含有する ＤＭＥＭ／１０％透析ＦＣ３中で選択した。１４日後、プレートを１％クリスタ ルバイオレットで染色して、メトトレキセート耐性コロニーの存在を調べた。

その後、ＤＮＡをこの最初にトランスフェクトしたセルライン（１’　ＴＦ）か ら調製し、トランスフェクション／感染プロトコールの第２のサイクルにおいて 使用した。第２のトランスフエクタントセルライン中の前記受容体遺伝子を同定 するために、ヒト反復配列のパネルをプローブとして用いるササンプロットを行 った。ＤＮＡトランスフェクションの効率が低いために（０，１！％ゲノム／サ イクル）、数サイクルのトランスフェクション／選択はマウスゲノムの残りから 前記受容体遺伝子を分離するに足るものであった（Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８１）。所望の断片を単離するために、ラムダファージライブラリーを 二次トランスフェクシントＤＮＡから作製し、ササンプロットスクリーニングか ら非常に適していると思われる放射性標識した反復プローブとハイブリダイズさ せた。アンフォトロピック受容体遺伝子の部分をコードするタンパク質を含む分 子クローンを同定するために、前記のアンフォトロビックウィルスを増殖させて いる２６ＴＦｓに存在するＲＮＡ転写物を同定した。問題の遺伝子の特定の転移 により、アンフォトロピックウィルス感染に対する感受性も同じように移動する ことが予想され、この分子を発現するこれらのウィルスに感染しうる大パネルの 細胞が提供される。

実施例Ｘ 本発明の治療用運搬ベクターの発現 抗体８３　（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）からの 相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を用いて、本発明のキメラ受容体ポリペプチドに融 合しているＦｖ断片を構築した。この一本鎖組換え受容体を用いれば、標的ヒト 細胞のレトロウィルス感染が可能となる。多くの癌腫の表面に発現されている炭 水化物抗原に結合する、Ｂ３に対する抗体を用いてマウスにおいてヒト腫瘍の完 全な退縮を起こす単鎖組換え毒素が製造されてきた（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９１）　ｏ単鎖Ｆｖおよび２種の異なる（Ｂ３（Ｆｖ）イムノ トキシン、Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＨ４０およびＢ３（Ｆｖ）ＰＥ３８ＫＤＥＬ）ベク ターを標準的な組換えＤＮＡ手法で使用して、核酸をコードするキメラ受容体ポ リペプチドに挿入したり、その組換え毒素を前記ヒトエコトロピックウィルス受 容体の改変領域をコードする遺伝子のウィルス結合ドメインで置換した。得られ たプラスミド（Ｂ３（Ｆｖ）−ｍＨ１３）およびイムノトキシンベクターＢ３（ Ｆｖ）　ＰＥ３８ＫＤＥＬを大腸菌のような宿主で発現させ、−末鎖免疫受容体 および一本鎖イムノトキシンを当業界で知られているように均質になるまで精製 した。

Ｂ３（Ｆｖ）−ｍＨ１３の抗腫瘍活性をまずｔｎ　ｖｉｔｒｏで測定した。この Ｂ３抗体は結腸、胃、および卵巣の多くのムチン癌腫の表面と、また、胃腺、気 管および膀胱の上皮、食道の分化した上皮、および小腸ムチンのような正常組織 とよく反応する（Ｐａｓｔａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５ １：３７８１−３７８７．１９９１））　。また、このＢ３抗体は、ＭＣＦ？、 ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、および！１ＴＢ２０（胸）、八４３１（エビデルモイド ）　、ＴＩ＋２９（結腸’）　、ＨＴＢ３３（頚部）、およびＤＵ１４５（前立 腺）を含む多くのヒト腫瘍セルラインとよく反応する。Ｂ３（Ｆｖ）−＋ｎＨ１ ３から誘導された融合タンパク質を用いて改変した受容体ペプチドを細胞にまず 運んだ後、Ａ４３１のような、これらの細胞のいくつかまたは全てにおける、ネ オマイシン耐性遺伝子を有するマウスエコトロピックレトロウィルスベクターの ような、非ヒト特異的組換えレトロウィルスベクターの感染が予想される。チミ ジンキナーゼ遺伝子を有するマウスエコトロピックレトロウィルスベクターのよ うな、前記キメラ受容体ポリペプチドおよび治療薬を結合するｅｎｖ結合ドメイ ンを有するウィルスベクターを予め使用して、細胞培養物にガンシクロビル（ｇ ａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を添加することにより、Ａ４３１細胞のような培養腫瘍 細胞の細胞死を生ぜしめる。

そのような細胞が培養中に作用することがわかったら、ウサギモデルまたはラッ トモデルのような動物モデル系で致死的な病的な細胞を使用する。その結果、キ メラ受容体ポリペプチドまたはマウスエコトロピックウィルス受容体の対応する 領域が選択した動物モデル細胞表面上に本明細書に提示した運搬ベクターによっ て発現されない限り、本発明のマウスエコトロピックウィルスをベースとするベ クターはこれらの細胞を感染できないことが予想される。融合タンパク質注入後 に種々の時間間隔で、チミジンキナーゼ遺伝子を有するウィルスベクターを用い て、選択した標的細胞上の前記キメラ受容体ポリペプチドを発現している動物モ デルを感染させる。この発現の後、動物にガンシクロビルを投与する。このプロ トコールにより、ガンシクロビルが腫瘍細胞内でその毒性のある形態にリン酸化 され、関連する“パイスタンダー効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ）” と共同して、腫瘍が減少することが予想される。

実施例Ｘｔ キメラ受容体ポリペプチドと、腫瘍または病的な細胞または組織を認識する一本 鎖抗原結合タンパク質との融合タンパク質の発現用ベクターの構築 導入の適切な方法論の一例を図４に示す。発現プラスミドｐＵＬ１はイムノトキ シンＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ４０の遺伝子を含んでいるが、該イムノトキシンは、癌 腫細胞に特異的なり３に対する抗体に対する抗体断片を含み、毒素ＰＥ４０に結 合した融合タンパク質である。ＰＲ４０毒素をコードする部分を本発明のキメラ 受容体ポリペプチドまたはマウスエコトロピックウィルス受容体の対応する領域 で置換して、キメラ受容体ポリペプチドを発現するようにｉｎ　ｖｉｖｏ　、ｉ ｎ　５ｉｔＵまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで癌腫細胞をトランスフオームする運搬ベ クターを提供するように、前記ｐＵＬ１発現プラスミドを改変した。

Ｂ３（Ｆｖ）は、Ｂ３に対するモノクローナル抗体から誘導された一本鎖抗原結 合タンパク質である。このＢ３抗体断片は、多くのムチン癌腫の表面に見いださ れる炭水化物抗原を認識する。しかしながら、この抗体断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏ で癌腫細胞を優先的に結合するように、限られた数の正常組織のみと反応する。

ＰＥ４０は、シュードモナス外毒素の切り出された誘導体である。ＰＨ４０コー ド領域は、５°末端に旧ｎｄｌｌ＋制限部位、Ｂ３（Ｆｖ）をコードするＤＮＡ に接続する部位、および３゛末端を少し越えたところにＥｃｏＲ１部位を有する 。

ＰＥ４０をコードするこの旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＬｌから 除き、直線化したｐＵＬｌの両末端を部分的にｄＡＴＰでｆｉｌｌ−ｉｎ　Ｌ、 粘着末端−ＡＡとする。Ｂ３（Ｆｖ）コード領域の３°末端の−ＴＴＣＧＡおよ び直線化したプラスミドの他の末端のＡＡＴＴＣ−を以下のように同様に改変し て、前記のキメラ受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡを補足した。

本発明のキメラ受容体ポリペプチドのＮｒｕ　１−Ｐｓｔ　１断片は、改変期３ 　ｃＤＮＡのように、改変期３の全コード領域を含んでいるが、これをＴｆｉｌ で消化し、改変期３の第３の細胞外ドメインをコードする領域を含む８５０　ｂ ｐの断片を１．５％アガロースゲル上で精製した。その後、この精製した８５０ 　ｂｐのＴｆｉｌ断片をＢｓｒｌで消化し、改変１１１３の全第３細胞外ドメイ ンをコードする８５　ｂｐのＢｓｒ　１−ＴｆＩＩ断片をＥｘ３ｍＨ１３と命名 した。得られた制限断片ＥＸ３ｍ１３を２．　Ｏ％アガローズゲル上で精製した 。この精製した８５　ｂｐのＢｓｒ　１−Ｔｆｉ１断片は５°末端に粘着末端　 ＡＧＣ−を、ＧＴＣＧ− ３゛末端に　−ＧＧを有する。

ＣＣＴＡＡ この３“末端をｄＡＴＰて部分的にｆｉｌｌ−ｉｎ　Ｌ、３′末端を−ＧＧＡ　 −ＣＣＴＡ八とする。

部分的にｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎした後、アダプターＣＧＣＴＴｒＣＡＡＣＴＧＧ Ｃ（配列番号１ｇ）ＡＡＧ實αＣ および　ＴＴＣＴＡＡＴＴＡＧ　（配列番号２０）ＧＡＴＴＡＡＴＣＴＴ　（配 列番号２１）（これらは、いかなるフレームシフトも妨げるように特別にデザイ ンされている。）を用いて、前記の８５　ｂｐのＢｓｒ　１−Ｔｆｉ断片を直線 化したｐＵＬｌの部分的にｆｉｌｌ−ｉｎ　したＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲ１部 位に連結した。得られたプラスミドをｐＢｌ（３０と命名する。

Ｂ３（Ｆｖ）をコードする上記の遺伝子は５°末端にＮｄｅ１部位を有している 。その後、得られたプラスミドｐＢＨ３０をＮｄｅｌで消化し、その末端をｄＡ ＴＰおよびｄＴＴＰでｆｉｌｌ−ｉｎ　Ｌ、平滑末端とした。次いで、前記の直 線化してｆｉｌｌ−ｉｎ　Ｌ、たプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、Ｂ３（Ｆｖ ）−Ｅｘ３ｍＨ１３コード領域を含む断片をアガロースゲル上で精製した。

いかなるフレームシフトも妨げられるように、アダプターＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ 　（配列番号２２）ＧＧＣＣＣ を用いて、前記の精製した断片をＢｇｌｌｌ−ＥｃｏＲ１部位で発現ベクターｐ ＴｒｃＨｉｓＢに組み込んだが、該部位は、一連のＴｒｃプロモーター、ＡＴＧ 開始コドン、ポリヒスチジンコード領域およびエンテロキナーゼ切断部位コード 領域の下流に位置する。

得られたプラスミドをｐＢｌ（３と命名する。

Ｂ３（Ｆｖ）−Ｅｘ３ｍＨ１３融合タンパク融合タンパ上質精製上記の発現プラ スミドｐＢＨ３は、Ｂ３（Ｆｖ）−Ｅｘ３ＭＨ１３をポリヒスチジン金属結合ド メイン、エンテロキナーゼ切断部位およびＢ３（ＦＶ）−Ｅｘ３ｍＨ１３から構 成される融合タンパク質として発現させることができる。

その後、大腸菌ＨＢＩＯＩをｐＢＨ３でトランスフオームした。イソプロピルβ −ｄ−チオガラクトシドで発現を誘導し、細胞を回収して緩衝液に懸濁させた。

懸濁液を音波処理して、上清をＮｌ”金属アフィニティー樹脂カラムにかけた。

樹脂に結合したタンパク質をグリシンとの競合により溶離させた。

その後、溶離したタンパク質を除去すべきポリヒスチジン配列用のエンテロキナ ーゼで処理した。

得られた融合タンパク質は、上記の病的な細胞を特異的に結合することが予想さ れ、本明細書中に記載したように治療の標的としてのキメラ細胞を提供するのに 適している。

実施例Ｘ１１ 本発明のキメラ受容体ポリペプチドのような受容体に結合するウィルス外膜の重 要な領域を決定することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏのウィルス複製の効率を増加さ せる 背景 前記受容体に結合するウィルス外膜の重要な領域を理解することは、改良された ベクターを開発するというゴールにとって等しく重要である。本発明により、新 規なベクターを工学的に作製することが劇的に改良され、それらのｉｎ　ｖｉｖ ｏ力価が効果的に増加する。その結果、本発明により、両受容体への結合に必要 なウィルス外膜要素、および、当該受容体を結合する能力を失うことなくこれら のタンパク質を許容するであろうという改変の程度のキャラクタリゼーションの 詳細な分析であって、ウィルスの結合を可能にするヒトおよびマウスエコトロピ ック受容体間の限られた相違を検討するための詳細な分析が提供された。第２の 目的は、ヒトにおけるウィルスの溶解を導くかもしれないウィルス外膜上のあら ゆる潜在的な補体結合領域を排除することである。これは、おそらくマウスレト ロウィルスをベースとする治療用ベクターのｉｎ　ｖｉｖｏの感染能力を制限す ると何人かの研究者により議論されてきた問題である。

非特異的不活性化およびマウス、ネコ、サルＣ型ウィルスの溶解に関する知見は 最初にＷｅｌｓｈら（１９７５，１９７６）により公表された。この溶解は、ｇ ｐ７０へのヒトＣ１ｑ補体成分の抗体非依存性結合によるものであり、古典補体 経路の活性化につながるものである（Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６ ）　、　ｇｐ７０分子は免疫グロブリンのＦｃ断片上のＣ１ｑ認識部位に類似し たドメインを有するので、Ｃ１ｑはｇｐ７０を認識すると考えられている。ヒト 補体によるレトロウィルスの非特異的溶解は、ウィルス血症から保護し、その表 面上にｇｐ７０を発現する細胞の溶解を引き起こすかもしれない適応防禦系であ ることが示唆された（Ｗｅｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７５；　Ｃｏｏｐｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６）　、しかし、補体欠乏患者は霊長類レトロウィル スに対する交差反応性抗体のレベルの上昇を示し、このことは、これらの患者に おいてはレトロウィルス感染に対する感受性がこれ以上上がることはないことを 示しているということを予備的な知見は示唆している（Ｋｕｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９７９ｂ）　、さらに、Ｇａｌ　ｌａｇｈｅｒら（１９７８）により、 レトロウィルス外膜に対するテナガザル血清の類似の溶解活性が示されだが、同 じテナガサルの何匹かはＧＡＬＶに感染し抗ＧＡＬＶ抗体を合成した。従って、 レトロウィルスの補体依存性溶解の保護効果については議論の余地があるところ である。

マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）表面糖タンパク質（ｇｐ７０”）の結合パラ メータを定義するひとつの方法は、ｇｐ７０ｓＵのどの領域が細胞表面受容体と の特異的相互作用に関与しているかを決定することである。種々の研究により、 受容体特異性の決定基はｇｐ７０ｓＵのＮ末端の３分の２にあることが示唆され ている（Ｏｔｔ　ａｎｄ　Ｒｅ１ｎ　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　６６：４６３２−４６ ３８．１９９２−一引用文献１３．１６）　、事実、最近ＨｅａｒｄおよびＤａ ｎｏｓ　（１，９９１）により、フレンドＭＵＬＶ　ｇｐ７０ＳＵのこの領域の 大半を含むＥｎｖ断片がＮ１１ｌ　３Ｔ３細胞における前記のエコトロピック受 容体に結合できることが示された。また、最近、０１１およびＲｅ１ｎは、モｏ ニーＭＣＦ　（Ｍｏ−ＭＣＦ）、１０Ａ１、およびアンフォトロピックｇｐ７０ ５ｕ配列を用いて、一連のキメラｅｎｖ遺伝子を構築することにより、ｇｐ７０ ５′″における受容体特性をマツピングすることを試みた。これらのキメラｇｐ ７０ｓＵを含むＭｕＬＶｓの分析により、単純な結果および複雑な結果の両方が 得られた。ある場合には、受容体特異性はｇｐ７ｏｓＬＩの一つの領域にマツピ ングできた。最後に、いくつかの組合せは、ひとつの受容体と完全に機能的に相 互作用することができるが、ひとつまたは２つの受容体とは部分的に相互作用す るかあるいは全く相互作用できないようであった。

ＨｅａｒｄおよびＤａｎｏｓ　（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５：４０２６−４０３ ２．１９９１）により、干渉アッセイ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ａｓｓａｙ ）により、ｇｐ７０アミノ末端ドメインは、この分子のカルボキシ末端部分に関 係なく、前記のエコトロピック受容体を認識する構造に折り畳まれることが示さ れた。彼らは、ウィルスエントリーアッセイを用いることにより、外膜糖タンパ ク質に導入された、構造改変の機能的結果を解釈することは難しいかもしれない と論じている。一方、外膜糖タンパク質を構成的に発現している細胞において、 干渉現象は外膜−受容体相互作用のみによるものである。従って、同じ受容体を 結合するウィルス粒子のさらなるエントリーに対する細胞耐性の描写は、機能性 受容体結合アッセイを提供する。

実験 干渉アッセイを使用して、受容体への結合に重要であるマウスエコトロピックエ ンベロープ糖タンパク質（ＭｕＬＶＢ−ｇｐ７０）の領域を更に正確に特定する 。エコトロピック受容体への結合に関する構造上の要件を更に正確に確立するた めに、アミン末端ドメイン内のイン・フレーム（ｉｎ−ｆ　ｒａｍｅ）欠失によ り、そしてオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりＭｕＬＶＥ−ｇｐ７０ を修飾する。エンベロープ配列を比較すると、ＭＬＶｇｐ７０はそれらのアミノ 末端ドメインが二つの限定領域において異なることがわかる。これらはアミノ酸 ５０〜１１６および１７０〜１８３である。また、それらはプロリンに富むセグ メント、アミノ酸２４４〜２８３が異なっている。トリ肉腫および白血病ウィル スエンベロープ糖タンパク質（この場合、受容体相互作用の決定因子が短い超可 変配列に帰せられた（）ＩｅａｒｄおよびＤａｎｏｓ　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６ ５：４０２６−４０３２．１９９１））から類推すると、これらの三つの超可変 領域の一つ以上が受容体結合細胞を含むものと予測される。修飾Ｅ、ｃｏｌｉ　 ＩａｃＺ遺伝子を導入する欠陥レトロウィルスベクターを使用して、野生型また は修飾ＭｕＬＶＥ−ｇｌ）７０を発現する細胞を感染させる。感染に対する感受 性を、Ｘ−Ｇａ１陽性フオーカスをカウントすることにより測定する。

エコトロピックエンベロープＮ末端ドメインベクターを、外在性マウスエコトロ ピックレトロウィルス受容体遺伝子（Ａｌｂｒ−ｉｔｔ。

ｎら、　１９８９）を発現するサルのＣｏ５−７細胞に一過性にトランスフェク トする。ｐＳＧ５ベクターは初期ＳＶ４０真核生物プロモーターを使用するので 、Ｃｏｓ細胞（Ｔ抗原遺伝子を発現する）は高レベルのｅｎｖ遺伝子発現を可能 にする（Ｇｌｕｚｍａｎ、　１９８１）。トランスフェクト細胞をエコトロピッ ク偽型曹ＣＲＥ／ＢＡＧ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１８５０）ウィルス粒子（Ｐｒｉ ｃｅら、　１９８７）で感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌ）フォー カスの数を分析する。β−ｇａｌフォーカスの数を減少する修飾ｅｎｖフラグメ ントを、ＥＲＲと相互作用するそれらの能力につき更に調べる。

１、　Ｃｏ５−７細胞へのＥＲＲ遺伝子のトランスフェクションＥＲＲ遺伝子を ｐｃＤＮＡ／ｎｅｏ発現ベクター（インビトロゲン）にクローン化し、ＣａＰＯ ｚ法（ストラタジーン）によりＣｏ５−７細胞にトランスフェクトした。Ｃｏ５ −７細胞は高力価のＭｕＬＶレトロウィルスを産生じ得ることがわかっている（ ＬａｎｄａｕおよびＬｉｔｔｍａｎ、　１９９２）。

トランスフェクト細胞を　５００μｇ／ｍ　ＩのＧ４１８に対するネオマイシン 耐性につき選択する。耐性クローンを、Ｗ　ＣＲＥ／ＢＡＧウィルス粒子（Ｐｒ ｉｃｅら、　１９８７）により感染されるそれらの能力につき試験する。細胞を 生理緩衝塩類液中０．５％のグルタルアルデヒドで固定し、そしてｌ　ｍｇ／ｍ ｌのＸ−ｇａｌ　（Ｓａｎｅｓら、　１９８６）を含む組織化学液で染色する。

最大数のβ−ｇａｌフォーカスを有する細胞を干渉アッセイに使用する。

２、　受容体結合配列を更に概説するための修飾ｅｎｖ遺伝子の構築この実験は 、エコトロピックウィルス感染を阻止する最小のＮ末端フラグメントを決定する 。Ａｋｖ内在性マウス白血病ウィルスからのｇｐ７０遺伝子をこれらの研究に使 用する。Ａｋｖゲノムは活性ウィルス粒子を産生ずることができ、そしてｅｎｖ 配列が決定されている（Ｌｅｎｚら、　１９８２）。

Ａｃｃ＋制限部位とＸｂａｌ制限部位の間に含まれる完全ｇｐ７０遺伝子をｐｓ Ｇ５真核生物発現ベクター（ストラタジーン）にクローン化する。

また、ｅｎｖ遺伝子のフラグメントをクローン化して下記のＮ末端ペプチドを産 生する。Ａｃｃｌ／Ａｌｕｌ　２４７　ａａフラグメントはＨｅａｒｄおよびＤ ａｎｏｓ　（１９９１）の結果を生じ、そして感染を機能的に阻止する。

受容体結合特異性を決定すると考えられる領域を含む１２２ａａ　Ａｃｃ１／Ｓ ｍａ　１フラグメントが特に興味がもてる（Ｂａｔｔｉｎｉら、　１９９２）。

３、　修飾ｅｎｖ遺伝子構築物の干渉アッセイ組換えｅｎｖ遺伝子構築物を、マ ウスＥＲＲを含むＣｏ５−７細胞に一過性にトランスフェクトする。この系はマ ウス細胞中に存在し得る内在性ｅｎｖ転写産物によりひき起こされる潜在的な問 題を排除すると予測される。Ｃｏｓ細胞は、ＳＶ４０プロモーターを含む発現プ ラスミド（Ｇｌ−ｕｚｍａｎ、　１９８１）の高度の発現を可能にすると予測さ れる。細胞をストラタジーンのプロトコルに従ってＤＨＡＥデキストラン法によ りトランスフェクトする。ｅｎｖ遺伝子トランスフェクションの約４８時間後に 、２ｘｌＯ’の細胞を６ウ工ル培養皿にまき、そしてＨｅａｒｄおよびＤａｎｏ ｓ　（１９９１）の方法に従って８μｇのポリブレン／ｍｌの存在下で１０２〜 １０’のｔＦ　ＣＲＥ／ＢＡＧウィルス粒子を感染させる。細胞が集密まて増殖 した後、それらをＰＢＳ中０．５％のグルタルアルデヒド中で固定し、そして１ ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含む組織化学液（Ｓａｎｅｓら、　１９８６）で染色 する。β−ｇａｌフォーカスの数を、ｐｓＧ５ベクター単独でトランスフェクト した細胞に対して評価する。

β−ｇａｌフォーカスの減少した数がｐＳＧ５ベクター単独でトランスフェクト した細胞に対して評価されると予測される。β−ｇａｌフォーカスの減少した数 は、トランスフェクトされたｅｎｖ構築物がおそら＜　ＥＲＲを結合でき、かつ ウィルス粒子相互作用を阻止できることを表している。

４、トランスフェクト細胞中の修飾ｅｎｖ生合成の分析組換えｅｎｖ遺伝子産物 がトランスフェクト細胞により産生されるか否かを決定するために、タンパク質 分析を行う。細胞をｓｉ３メチオニンと３６３システインの混合物（ＩＣＮ）で 代謝標識する。何となれば、ｅｎｖタンパク質は対象の領域が比較的システィン 残基に富むからである。３０〜６０分間標識した後、細胞をペレットにし、ベレ ットと上澄みの両方をポリクローナルヤギ抗ローシャー（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）　 ｇｐ７０抗体（Ｎ［）ｌレボジトリイ）または非マウス血清、続いてＳ、　ａｕ ｒｅａｕｓＡ細胞による免疫沈殿のために処理する。免疫沈殿物を５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲルで分析する。免疫沈殿タンパク質の不在は、ｅｎｖタンパク 質が分解されるか、または抗ｇｐ７０抗体により認識され得ないことを意味する と予測される。この現象では、ｅｎｖ　ＲＮＡ転写産物の存在がトランスフェク ト細胞から全ＲＮＡを抽出し、続いてＡＫｖ　ｅｎｖ配列プローブを使用してノ ーサンプロット分析により測定される。　免疫沈殿により検出でき、かつＷ　Ｃ ＲＥ／［ＩＡＧウィルス粒子感染を阻止するフラグメントが本発明の更に別の実 施例および方法に使用される。

５．１修飾ｅｎｖフラグメントの突然変異数種のエコトロピックおよび非エコト ロピックレトロウィルスｇｐ７０遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。これらの配列 の比較は、受容体相互作用に重要である領域を示唆するであろう。例えば、図１ ９は、受容体特異性に関与すると考えられる、Ｎ末端領域内の、３つのエコトロ ピックおよび非エコトロピックｇｐ７０アミノ列島列の比較を示す。３種のエコ トロピックレトロウィルスが強い配列相同性を示す。エコトロピック配列と非エ コトロピック配列にはかなりの相違があり、最も顕著な相違は位置６８〜９７に 存在する約３０のアミノ酸のギャップである（ＢａｔＬｉｎｉら、　１９９２） 。この領域はエコトロピック結合部位を含みうるが、レトロウィルスの異なるサ ブグループに異なるコンホメーションを与えることもあるらしい。

Ｎ末端ｅｎｖタンパク質の限定領域がウィルス−受容体相互作用を阻止すること がわかったら、重要な残基を同定するためにアミノ酸を系統的に修飾することが 可能である。次に突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ突然変異誘発を行い、そしてＥＲＲの修飾につき先に記載されたプロメガのｐ ｓｅｌｅｃｔｅａ（ｐＡｌｔｅｒ）系（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、　１９９３）を 使用する。

点突然変異を生じることが実施可能となるように受容体結合ドメインの位置を制 限することができない場合、異なるウィルスサブグループの制限ｇｐ７０領域の 間の欠失分子またはキメラ分子が作製される。

ａ）欠失変異体の作製の基準およびプロトコル！、　組換えプラスミド中の対象 の領域および比較的少ない他の領域内に部位を有する酵素による消化。

２、　読み取り枠が変更される場合、エキソヌクレアーゼＩ１１を使用してヌク レオチドを次第に除去する。

３．３１ヌクレアーゼを使用して平滑末端をつくる（１３）。欠失分子を連結し 、そして形質転換する。

４、　欠失クローンの配列を決定して正確な読み取り枠を維持するものを見出す 。

ラグメントを切り出し、精製し、モしてＲｓａ１部位でアンフォト口このフラグ メントは、アンフォトロビック配列から欠失される３゜のアミノ酸を含む（図１ ９および２０）。この配列の単純な除去は不正確な読み取り枠を生じるであろう 。何となれば、一つの５ｌｌｌ＆　１部位（４０４ｂｐ）がアミノ酸トリブレッ トの一つのヌクレオチドを欠いているからである。

ｂ）挿入の作製 標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲；　Ａｕ５ｕｂｅ１．前掲）に従って 対象の配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより特 定の配列の挿入を行う。ＰＣＲプライマーを、ｅｎｖタンパク質の適切な読み取 り枠を維持するように設計する。

例えば、アンフォトロビックウィルス配列へのエコトロピックウィルスの３０ア ミノ酸領域の挿入を下記の工程により行う。

１、　位置３２５におけるＲｓａｌによるアンフォトロビックｅｎｖ配列の消化 は平滑末端部位を生じ、そしてチロシンに関するアミノ酸コドンの第二および第 三のヌクレオチド（Ａ、Ｃ）から第一ヌクレオチド（Ｔ）を分離する。

２、　エコトロピック配列を挿入するために、チロシン残基を保持するために５ ′末端に追加のＡＣを含むプライマーを合成する。チロシン残基を追加し、そし て読み取り枠を保持する追加のＴをその５′末端に有する３°プライマーを合成 する。Ａｋｖ配列に対する提案されたプライマーの位置を表Ｉ１１に示す。

表ｌｌｌ ５′プライマー＝５°ＡＣＣＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＣＣＣＴＧＣ３’　（配列番 号＝２３）３′プライマー＝５°Ａ　ＧＧＧ　ＡＧＴ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ 　３’　（配列番号：２４）ＰＣＲ後に、生成物を２％のアガロースゲルで処理 して、９０ｂｐフ８）　ＲＴ活性について分析する。

ピックｅｎｖ配列につなぐ。組換えクローンの配列を決定してＰＣＲフラグメン トの正しい方向を有するものを決定する。

７、　ウィルスエンベロープ配列結合Ｃ１ｑの同定ｇｐ７０分子は免疫グロブリ ンのＦｃフラグメントのＣ１ｑ認識部位に類似しているドメインを有することが 提起されていた。これが正しければ、そしてこの領域がウィルス結合および侵入 にとってその分子の不必要な部分にあるならば、その除去および置換は遺伝子治 療用のレトロウィルスベクターの直接的なｉｎ　ｖｉｖｏ使用に対する血清オン コルナウイルス溶解活性（ＳＯＬＡ）の潜在的影響を軽減すると予測される。Ｃ １ｑ結合に重要なアミノ酸残基を同定するために、そのドメインが免疫グロブリ ンのＦｃフラグメントのＣ１ｑ認識部位に類似している場合には、インフレーム 欠失により、そしてオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発によりＭｕＬＶＥ−ｇ ｐ７０を修飾する。Ｃ１ｐ認識が一旦同定されると、本発明者らは、非Ｃ１ｑ結 合配列により置換されたこの領域を有する修飾ＭｕＬＶＩｌ！−ｇｐ７０ｅｎｖ 遺伝子を構築しようと試みるであろう。

血清中の５ＯＬＡ活性、およびウィルス感受性について分析するために、スクロ ースで分画化し、そして精製したクローン化放射線白血病ウィルスをＰＢＳで基 準化濃度に希釈し、少なくとも１００．０００ｃｐｍが本発明者らの標準逆転写 酵素アッセイ（Ｂｒｏｗｎら、　１９９０）で検出できるようにする。種々の希 釈率のヒト血清をウィルス調製物に添加し、そして通常の実験室照明条件下で３ ０分間インキュベートする。対照試料を０．５％のトリトンＸ−１００（シグマ ）で処理する。次に全ての試料を以前に記載されたように（Ｍｅｒｕｅｌｏら、 １９８雑誌または抄録、公開され、もしくは相当する米国もしくは外　・国の特 許出願、発行された米国もしくは外国の特許、またはあらゆるその他の文献を含 む本明細書で引用された全ての文献は、引用文献中に示された全てのデータ、表 、図、および本文を含み、本明細書に参考としてそのまま組み入れるものとする 。更に、本明細書で引用された文献中に引用されている文献の内容も参考として そのままま組み入れられる。

公知方法の工程、慣用方法の工程、公知の方法または慣用の方法に関する言及は 、本発明のあらゆる面、説明または実施態様が関連技術において開示され、教示 され、または示唆されるということをいかなる場合も容認するものではない。

特定の実施態様の以上の説明は、当業者の知識（本明細書で引用された文献の内 容を含む）を適用することにより、他の当業者が、無用な実験を行わないで、本 発明の全概念から逸脱しないで、このような特定の実施態様を容易に改良し、か つ／または種々の用途に採用するのに充分なほど、本発明の一般的な特質を明ら かにするであろう。それ故、このような適用および改良は、本明細書に示された 教示および指針に基いて、開示された実施態様の均等物の意味および範囲内に包 含されるものとする。本明細書中の表現または用語は説明のためであり、限定の ためではないことを理解するべきであり、それ故、このような用語または表現は 本明細書に示された教示および指針に鑑みて当業者により解釈されるべきである 。

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Ｙｅｅ、　Ｊ、に、らＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑ ｕａｎｔ、、Ｂｉｏｌ、、　５１：１０２１、　１９８６； Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔ、ら“マウスエコトロピックレトロウィルス受容体に 相同の新規なヒト遺伝子の分子クローニングおよび特性決定″Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、　１８５：１０−１７．１９９１　；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔ、ら“エコト ロピックマウス白血病レトロウィルスによる感染に重要なアミノ酸残基の同定” Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、印刷中、１９９３； Ｙｕ、　Ｓ、Ｆ、ら“哺乳類細胞への完全遺伝子の移入に設計された自己不活化 レトロウィルスベクター”Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 Ａ、。

８３：３１９４−３１９８．１９８６　。

表２ 突然変異によるＭｕＬＶ−Ｈの受容体として機能するＥＲＲの能力の無効化 突然変異誘発のための ＥＲＲオリゴヌクレオチドの使用　ＡＡ変化　感染力４　ＡＡＡＡＡＴＴｒＣＴ ＣＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＳＥＱＩＤＮｏｉ２２１　−　Ｉ Ｌ　＊＊＊これは３つの異なる実験の代表的な結果の１つである。

１それぞれのオリゴヌクレオチド配列の上の文字はもとのＥＲＲ配列のものであ り、整列（図　）によるＥＲＲ配列中の対応ヌクレオチド配列の不在を意味する 。

０これらの２つはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、その他はセンスオリ ゴヌクレオチドである。

配列表 配列番号：】 配列の長さ・１１０２ 配列の型：　ＤＮＡ 鎖の数ニー末鎖 トボロノー；直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位１！　：　１．．１１０２ 配列 配列番号−２ 配列の長さ、３６７ 配列の型、アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　Ａｓｎ　Ａｉａ　 Ｐｒｏ　（ｆｌｙ　Ｖａｎ　Ｌｅｕ　Ａｉａ　ＧＬｕ　Ａｍ■ ２０　２５　コ０ ｐｒｏ　Ａｘｌ；ｌ　工ｌ＠　Ｐｈａ　Ａｉａ　Ｖａｌ　工１ｍ　工１ｅ　Ｘｉ ｓ　Ｌａｕ　工ｉｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　ＬSＬ１ Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｊｕａ　Ｍａｔ　 ＶａｌＡａｎ　Ｌｙｅ　Ｘ１ａ　Ｐｈａ　’！Ｔｈｒ　Ｃ’凾■ ＳａｒＧ１ｙＡｚｇＬａｕＣｙ＠ＬａｕＭｎｋｓｎＡｍｐτｈｒＬｙｓＧｌｕＧ ｌｙＬｙｅＰｒｏＧｌｙ１ｏｏ　１０５　ＬＬＯ Ｖａｌ　ＧＬｙ　Ｇｕｙ　ＰｈａＭａｔ　９ｔｏ　Ｐｈｅ　Ｇｕｙ　ｔｈ＠Ｓ＠ ｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｆｌｕ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　ＡｌａＡｕａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｍ　 Ｐｈ＠ＴＶ？　ＡＩＪＬ　Ｐｈｅ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｊｌｕｐ　Ｃｙｓ 　Ｘｉｓ　Ｊム笥ｒ記エコ０１３５１４０ １−ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　Ｍａｔ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ 　Ｌａｕ　ＡＪｐ　Ｊｕｉｎ　Ａｇｎ　Ｓｓｔ　９ｒＯＬ＠■ Ａｇｏ　１８５　１９０ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　ＬＹｍ　Ｈｚｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　 ＧＬｕ　ＧＩＹ　Ａｉａ　Ｌｙｅ　Ｔｙｔ　Ａｌａ　ＶａＬ１９５　２（ｔｏ　 ２０５ Ａｌａ　ｖａｌ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｌ、ｅｕ　Ｃ１／ｌ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　５＊ ｒ　Ｊｕａ　Ｓａｔ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｓａｒ　ｍ■ ２工０　２１５　２ス０ ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈ１ｌ　ｔ４０ムＡＪｕ　ＶａＬ　ＪＬｌｌｌ呻ｊｇ９　Ｔ ｈｔ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　９ｒＣ１工１１１　Ｘ１８Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＬＪｕ　Ａ ｌａ　Ｓｉｒ　ＧＬｙ　ＡＬａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｘ４ａ　Ｖａλ―ζＪｕＡ　 Ｐｈａ　Ｌａｕ　１ｌｈａＡｓｐＬａｕＬｙｓＡｓｐＴＡｕＶａＬＡｍｐＬａｕ Ｈ＠ｅＳａｔＫＬ・ａｘｙτｈｒＬａｕＬ４ｕ＾１ｍ２７５　２ＩＯ２８％ 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ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＣＣ　ＴＧＧ　 Ａｌ：πＧＣＧ　ＡＣ’ｒ　ＴＴｒ　Ｇｊｊ：　ＧＡＧ　ＣsＧ　６１５ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ａユａ　Ａｒｇ　Ａよ’　Ｔｒｐ　 Ｓｅｒ　ａユ＆　Ｔｈｒ　Ｐｈｌｌ　Ａｓｐ　Ｇλｕ　Ｌ４■ １２５λ３０Ｌコ５ ＡＴＡ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　ＡＴＣ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　τ〒Ｃ　ＴＣＡ　 ＣＧ’Ｔ　ＣＡｆｌ；　ＣＡＣ　ＡＴＯ　Ｇｅｅ　Ｃ’ｒＧ@ＡＡ丁　６６３ 工ＬＩＩＧｌｙＬｙｅＰｒｏ工１ｅＧｌｙＧｌｕＰｈ＠Ｓ＠ｒＡｒｇＧ１ｎＨｉ ｓＭｅセＡユ１１ＬＪｕＡＪｎ１４０　工４５　１５０　Ｌｓｓ ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＣＡＡ　ｋｃｃ　ＣＣＧ　 ＧｋＣ　ＡＴＡ　ＴＩＴ　ＧＣτ　ＧＴＯ　ＡＴＴ　ＡＴＡ@７１１ Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＧＩＹ　Ｖ＆Ｌ　ｔａｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　９ｔｃｓ 　ｋｓｐ　Ｘ”ｔ＠　Ｐｈｅκ．ａ　Ｖａｌ工１ｅ工１ｅＡＴＴ　ＡＴＣ　ＡＴ Ｃ　’ＩＴＡ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　Ｃ丁ＧＴＴＡ　ＡＣＴ　ＣＴｒ　ＧＧＣ　ＧＴ Ｇ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＧＣＣ@７５９ ＩＬＩＩ　Ｉｌ＠Ｘ１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅ＋ｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ＶａＩＬｙｍ　ＧＬｕ　５ａｒ　Ａｌａ１フｓ　ｚａｏ　ｘ ｓｓ Ａ丁Ｇ　（；ＴＣ　ＡＡＣ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣ　Ａｃｅ　’ｒＧＴ　ＡＴ （　ＡＡＴ　ＧＴＣ　ＣＴＧ　ＧＴＣ　ＴｒＧ　ＴｌｆｆＣ@ＴＴＣ　１１０７ Ｍｅｔ　Ｖａｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｇ　工ｉｓ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｘｉｓ　Ａ ａｎ　Ｖｄ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌ４ｕ　Ｃｙｓ　ｔｈｅＬ９０　’ｔ９ｓ　２０ ０ ＡＴＣ　ＧＴＧ　（ＷＧ　Ｔ（Ｃ　ＧＧＧ　ＴＴＣ　Ｃｍ；　ＡＡＡ　ＧＧＣ　 ＴＣＣ　Ａ實ＡＭ　ＡＡＣ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣ　１１T５ ｍｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ工１１１　ＬＹＭ　Ｍｎ　Ｔ卯Ｇｉｎ　ＬａｕＡｃＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　Ａ ＡＴ　ＴＴＣ　ＴＣＣ　ＴＧＴ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　Ｑ＆Ｃ　入（ＪＡＡ Ｃ　σＴＧＡ入入τＡＣ　９Ｑh Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ａａｎ　Ａｇｎ　 Ａｇｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｊｕｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒｃａ’ｒ　ＱＮ３　 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３４Ｑ　３４５　３５０ 配列番号　６ 配列の長さ：４５３ 配列の型　アミノ酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー　直鎖状 配列の種類二タンパク質 配列 ＧＬｙ’　Ｐｈ＠Ａｇｐ　Ｃｙｇ　！Ｌ＠Ａｌａ　Ｔｈｒ　’ｎｉｒ　ＧＬｙ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｍｎ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ６５　７０　７５　＠ ０ ＬＹｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　工１ｓ　Ｇｌｙ　工ｌ＠　ＶａＩＴｈｔ　５ ｅｌ”　Ｉａｕ　Ｉａｕ　Ｖａｌ　ＣＹｓ　Ｐｈａ　ＭａｃＩＩｓ　９０　５５ Ｌｓｕ工ｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　ＴｙＴ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　シｕ　ＣＹ ｓ　ＴＹＴ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ｔ■コｒＰτ６　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　−ｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　ＣＹｓ　’ｒｈｒ　Ａｊｎ　Ａｈ ａ　’ｎ’＋ｒ　Ｌａｕ　ＬＹ！Ｚｌ＊　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔ’Ｆｓｔ　Ｔｙｒ 　Ｇｕｙ　ＶａＬ　ＧＬｎ　ｊムエＬ＊　Ｉｕａ　ｍｇ　Ｌｓｕ　（Ｌｕ　Ａｌ ａ　？ｒｐ１０５　１１０　３ＬＳ　）２０ Ｖａｌ　ｐｒｏ　ｐｈ＠　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　 ｐｈ＠　ｓ＠ｒ　工１＠　ｕｕ　ＶａＬ　Ａｇｏ　ＸＬａ１５５　３６０　：１ ６Ｓ 配列番号・７ 鎖の数・−末鎖 トポロジー、直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置　１４８．　、２０３４ Ａ！　ＡＴＣＧＧＴ　ＭゴＴＣＡ　ＡＧＣ口’Ａ　ＧＣＯＡＧＧ　Ｇｅｅ　ＴＯ ＯＡＧＣＧＣＣにｃ’ｒｒｃｃａｃ　５５５ｍ１＠工ｉ＠ＧＬｙＴｈｅＳａｒ５ ａｒＶａｌＡＬａＡｒｇＡＬａτｒｐＳ＠ｒ＾工ａＴｈｒＰｈ＊Ａｍｐ１２５１ コ０１コＳ ＧＷ；　ＣＴＴ：ｉ　ＡＴＡ　ＧＧＣＡ１１ａ　Ｃ（ＣＡＴＣαＸ　ＧＡＧ　’ ＩＴＣ’Ｉ’ＣＡ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　（ＩＪｃ　ＡＴ’Ｏｒ@６０６ Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ工ｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐ ｈｅ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｈｚｍ　Ｍａｃ　Ｔｈｒ１４０　１４５　Ａ５ ０ ａ℃ＭＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧ　ＣＴＣＧＣＴ　（ＪＬＡ　ＡＡＣＣＣＣＧ ＡＧ　ＡＴＡ　Ｔｉ℃ＧＣＡＧＴＧ　Ｇ５４Ｌｅｕ　ｋｊｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｙ　ＶａＩ−ｕ　Ａｉａ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　１１１１　Ｐ ｈａに、＠　Ｖａｎ１５５　１Ｓｏ　Ｌ６Ｓ ＧＴＣｋｋＴ　ＯＡＴ　ＡＧＧ　ｋｃｃ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＡ　Ａ ＴＣＧＣ（：　ＡＣＡ　ｆｒＡ　Ｃ５ＣＣ？’ＣＧαｉＴ　k３２Ｇ ＶａＬ　Ａｊｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　９ｒｏ　Ｉｌａ　 Ｘｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙコ８０　１１１５　 ３９０ ＴＧ？Ｇτａ’ｒｒａ　ＣＴＣＴｒＡ　ＣＧＧ　ＴＭ：　ＣＸ１ｉ　Ｃ（Ｊ　Ｇ ＡＧ　Ｃｊｊ３　Ｃ１：’ｒ　ＡＡＩ：　ＣＴＣＧＴＡ　〒`Ｃ１４７０ ｃＹｍＶａｌＬｅｕＶａｌＬａｕＡｒｇ了’ｆｒＧｉｎＰｒｏＧＬｕＧｉｎＰｒ ｏＡｊｆｉＬ４ｕＶａｌＴＹτＣＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣｅ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＴＣ ＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴｒＡ　ＩＪＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＣＭ　ＡＡＴ　 ｆｆｌ　Ｌ堰■ Ｇｉｎ　Ｍａｃ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＴｈＸ’　Ｓａｔ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｌａｕ 　ａａｐ　ｐｒｏ　Ａｉａ　Ａｍｐ　Ｇｉｎ　Ａｊｎ　ＧＬ■ ４４５　４５０　４％！ ｋｃｃ　ＡＡＡ　ＧＣ６ＱＣＧ　Ｃ’１℃’ＴＯＧ　Ｇ（：Ａ　ｆｆｒＣＴ！Ｔ 　ＣＴＱ　ＣＴＣｅ　ＧＧＧ　？ＣＴ　ＧＣＣＣｉ　１７Ｓ■ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　ＶａＩＰｈ＠−ｕ 　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｂａｔ　ＡＬａ　ｕｕＳＯ５５１０５３％ ＣＣＡｃｃＣＴｃｃｃ　ＣＡＣＣＡＧＴＧＣＡ　にに品ｘＣＪＬ　ＣＣＴＧＣノ ℃ＣＡ　ＣＡＣＣｅＴＣＡＣＴ　ＧＣＡ　２１５配列番号、８ 配列の長さ：６２９ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類、タンパク質 Ａａｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　ＡＪｐＸＡｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｖ ａＩＧｌｙ　ｋｒ　Ｔｈｒ　ｋｕ　ＧＬｙ　ｊｕａ３５　４０　４Ｋ Ｇａｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＶａＩ　Ｌａｕ　Ａｉａ　Ｇｌｙ　Ａｉａ　ＶａＩ　 Ａｌａ　ｊ！９　Ｇｌｕ　ＡＪｎ　ＡＡＡ　ＧＬｙ　Ｄｌ：U Ｓｏ　５５　６０ Ｊｕａ　工Ｌ＠　ＶａＬ　Ｘｈ＊　Ｓｓｒ　ｌ１ｈｓ　Ｌａｕ　工１−　Ａｌ１ 　Ａｉａ　Ｌ−ｕ　Ａｌａ　５ｓｒ　Ｖａｌ　！ａｕ　ＡｌP１ ６５　７ｏ　７Ｓ　ａ。

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ふ３− ＦＩＧ、８ ウィルス　−　＋−＋ ｂ ５、〇− ２，０− １，７− 培地　２１４６ １ド パネルｌ　パネル２ パネル３　パネル４ １２３４ｓ１７８１ｍｍ　１２３４　＄４７０１−ｕＦＩＧ、１２Ａ ［相］！　Ｏ哨 さ８−羽　客；　エｑ へロ　ｃｈヘ ロ噴　ロロ　ロ哨　！・ ＆に　認＆　＝８　ミ８ 〜 八 ｖ ＬＬＩ　ｚ　・　−Ｚ　！　、、Ｚ　Ｚｑ＋　ヘ　ロ　臂　膿　ψ　ト　ロ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号　。

Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｃ９２８４−４Ｃ４８１００８３１４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　１／１９　８８２８−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ ／／　Ｃ０７Ｋ　１４／７０５　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　７１００　８９３１ −４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｈ７０５５−２Ｊ９４５５−４Ｃ Ｆ’Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＹ

Claims (65)

【特許請求の範囲】
1. １．第一の種に特異的なウイルスに対する受容体のアミノ酸配列を有するポリペ プチドから本質的になり、該受容体の配列が第二の種に特異的なウイルスのウイ ルスｅｎＶ結合ドメインと結合する少なくとも１つのキメラウイルス受容体結合 部位を含むように修飾されているキメラ受容体ポリペプチドであって、ここで（ ａ）第一の種が第二の種と異なっており、そして（ｂ）該キメラ受容体結合部位 が、該ポリペプチドに第二のウイルスｅｎｖ結合ドメインに対する結合活性を付 与する、少なくとも第一のアミノ酸残基および第二のアミノ酸残基を含有する、 ことを特徴とするキメラ受容体ポリペプチド。
2. ２．前記のウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノウイルス 関連ウイルスから選ばれる、請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
3. ３．前記のレトロウイルスが白血病ウイルスである、請求項２に記載のキメラ受 容体ポリペプチド。
4. ４．前記の白血病ウイルスがマウス白血病ウイルス、ハムスター白血病ウイルス 、およびヒト白血病ウイルスから選ばれる、請求項３に記載のキメラ受容体ポリ ペプチド。
5. ５．第一の種がヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ヒヒ 、およびサルよりなる群から選ばれる、請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプ チド。
6. ６．第一の種がヒトである、請求項５に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
7. ７．第二の種がヒト以外である、請求項６に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
8. ８．第二の種がマウス、ラット、ハムスター、ヒヒ、ウサギ、モルモット、およ びサルよりなる群から選ばれる、請求項７に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
9. ９．第二の種がヒト、マウス、ラット、ハムスター、ヒヒ、ウサギ、モルモット 、およびサルよりなる群から選ばれる、請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプ チド。
10. １０．少なくとも第一および第二の残基が配列番号：８のアミノ酸２１０−２５ ０に対応するアミノ酸を置換する、請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチド 。
11. １１．（ｉ）第一の残基がＨ１３（配列番号：８）のＰｒｏ２４２に対応する前 記の変異型アミノ酸配列中のアミノ酸を置換するチロシンであり、そして （ｉｉ）第二の種に特異的なウイルスの受容体の第二の残基が配列番号：８のＶ ａｌ２４４、Ｇｌｕ２３９、Ｇｌｙ２４０、Ｇｌｙ２２５よりなる群から選ばれ るアミノ酸を置換する、 請求項１０に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
12. １２．（ｉ）第二の残基がＨ１３（配列番号：８）のＧｌｙ２４０に対応するア ミノ酸を置換するバリン、およびＨ１３（配列番号：８）のＶａｌ２４４に対応 するアミノ酸を置換するグルタミンから選ばれる、請求項１１に記載のキメラ受 容体ポリペプチド。
13. １３．前記の変異型アミノ酸配列がＨ１３（配列番号：８）の膜貫通ドメインに 対応するアミノ酸配列を有する少なくとも１つの膜貫通ドメインペプチドをさら に含む、請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチド。
14. １４．キメラ受容体ポリペプチドは、宿主細胞により発現されると、細胞外で前 記のウイルス結合ドメインと結合することができる、請求項１に記載のキメラ受 容体ポリペプチド。
15. １５．前記のポリペプチドの配列がＨ１３（配列番号：８）の対応するアミノ酸 配列２１０−２５０に対して少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１に記 載のキメラ受容体ポリペプチド。
16. １６．前記のポリペプチドの配列が配列番号：８の対応するアミノ酸配列２１０ −２５０に対して少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１５に記載のキメ ラ受容体ポリペプチド。
17. １７．真核細胞または組織を、第二の種に特異的なウイルスのウイルス結合ドメ インによる結合を受けやすくする方法であって、（ａ）該真核細胞または組織を 、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｓｉｔｕで、請求項１に記載のキメ ラ受容体ポリペプチドをコードする発現可能な変異型核酸により形質転換して、 キメラ受容体細胞または組織をつくり、そして （ｂ）該キメラ受容体ポリペプチドの少なくとも１つのキメラウイルス受容体結 合部位が該キメラ受容体細胞により発現されて、第二の種に特異的なウイルスの 細胞外ウイルス結合ドメインと結合できるような条件を付与する、 ことを含む方法。
18. １８．ｉｎｖｉｖｏ形質転換を、 （ｉ）キメラ受容体細胞または組織への変異型核酸のインジェクション、 （ｉｉ）キメラ受容体組織または細胞に対して特異的な組織特異的調節配列の制 御下に変異型核酸を含む組換えレトロウイルスを用いたレトロウイルス感染、 （ｉｉｉ）キメラ受容体組織または細胞への変異型核酸のリボソーム運搬、 （ｉｖ）変異型核酸に結合させた、前記の細胞または組織に特異的な抗体をキメ ラ受容体組織または細胞に接触させること、または （ｖ）変異型核酸に結合させた、前記の細胞または組織に特異的な抗体を前記の 組織または細胞に接触させること、から選ばれた方法により行う、請求項１７に 記載の方法。
19. １９．ｉｎｓｉｔｕまたはｉｎｖｉｔｒｏ形質転換を、（ｉ）キメラ受容体細胞 または組織への変異型核酸のインジェクション、 （ｉｉ）キメラ受容体組織または細胞に対して特異的な組織特異的調節配列の制 御下に変異型核酸を含む組換えレトロウイルスを用いたレトロウイルス感染、 （ｉｉｉ）変異型核酸のリボソーム運搬、（ｉｖ）前記の核酸を含む前記の組織 または細胞のトランスフェクション、または （ｖ）変異型核酸に結合させた、前記の細胞または組織に特異的な抗体を前記の 組織または細胞に接触させること、から選ばれた方法により行う、請求項１７に 記載の方法。
20. ２０．真核細胞または組織が哺乳類、昆虫、鳥類および酵母よりなる群から選ば れる、請求項１７に記載の方法によりつくられたキメラ受容体細胞または組織。
21. ２１．哺乳類の細胞または組織がヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、■歯類、 ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、またはネコ由来のものである、請求項 ２０に記載のキメラ受容体細胞。
22. ２２．キメラ受容体細胞または組織に少なくとも１種の治療薬または診断薬を伝 達する方法であって、 （ａ）請求項２０に記載のキメラ受容体細胞または組織を用意し、（ｂ）該キメ ラ受容体細胞または組織を、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｓｉｔｕ で、非ヒトウイルスのｅｎＶ結合ドメインおよび少なくとも１種の治療薬または 診断薬を含む運搬ベクターと接触させ、これにより該運搬ベクターが該キメラ修 飾細胞または組織と結合し、かつ治療薬または診断薬が該キメラ受容体細胞また は組織に対して治療または診断効果を及ぼすようにする、ことからなる方法。
23. ２３．治療薬が治療用核酸であり、そしてキメラ受容体細胞に対する治療効果が （ｉ）ＤＮＡ配列の転写を阻止すること、（ｉｉ）ＲＮＡ配列の翻訳を阻止する こと、（ｉｉｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の逆転写を阻止すること、（ｉｖ）タ ンパク質の翻訳後修飾を阻止すること、（ｖ）ＤＮＡ配列の転写を誘導すること 、（ｖｉ）ＲＮＡ配列の翻訳を誘導すること、（ｖｉｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡ配 列の逆転写を誘導すること、（ｖｉｉｉ）タンパク質の翻訳後修飾を誘導するこ と、（ｉｘ）該核酸をＲＮＡとして転写すること、（ｘ）該核酸をタンパク質と して翻訳すること、および（ｘｉ）キメラ受容体細胞の染色体へ該核酸を組み込 むこと、よりなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．運搬ベクターが組換え型の非ヒト特異的ウイルスであり、その結果、キメ ラ受容体細胞または組織への非ヒト特異的ウイルスの結合が該修飾受容体細胞の 感染を引き起こし、かつ該キメラ受容体細胞において治療用核酸の治療効果を生 じさせる、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．運搬ベクターが（ｉ）ｅｎｖ結合ドメインと、該ドメインにリンカーによ って結合された（ｉｉ）治療薬または診断薬を含み、その結果、前記の接触が治 療または診断効果をもたらすものである、請求項２２に記載の方法。
26. ２６．運搬ベクターがさらにリボソームからなり、該リボソームがｅｎｖ結合ド メインと治療薬または診断薬を含み、その結果、ｅｎｖ結合ドメインがキメラ受 容体細胞のキメラ受容体結合部位に結合することができる、請求項２２に記載の 方法。
27. ２７．前記の接触が治療上有効な量の治療用核酸の発現産物を発現する前記の修 飾受容体細胞または組織をもたらす、請求項２３に記載の方法。
28. ２８．治療用核酸が異常な形のタンパク質に関連した疾病を治すように作用する 正常な形のタンパク質をコードしている、請求項２３に記載の方法。
29. ２９．治療用核酸がキメラ受容体細胞または組織を選択的に死滅させるように作 用する毒素をコードしている、請求項２３に記載の方法。
30. ３０．前記のキメラ細胞が病的な細胞である、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．治療用核酸が上皮増殖因子、インターロイキン−２、インターロイキン− ４、インターロイキン−６、組織増殖因子−α、インスリン増殖因子−１または 繊維芽細胞増殖因子から選ばれた増殖因子をコードしている、請求項３０に記載 の方法。
32. ３２．前記の毒素がリシン、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素およびチミ ジンキナーゼの少なくとも１種から選ばれる毒素の少なくとも１つの機能的な細 胞毒性ドメインを含む組換え型の毒素または毒素フラグメントである、請求項３ ０に記載の方法。
33. ３３．治療用核酸がキメラ受容体細胞または組織における異常なタンパク質の発 現を阻止するように作用するアンチセンスヌクレオチドをコードしている、請求 項２３に記載の方法。
34. ３４．治療用核酸がキメラ受容体細胞または組織における異常なタンパク質の発 現を阻止するように作用する一本鎖のリボソーム阻害タンパク質をコードしてい る、請求項２３に記載の方法。
35. ３５．治療用核酸がサイトカインをコードしている、請求項２３に記載の方法。
36. ３６．治療用核酸が増殖因子をコードしている、請求項２３に記載の方法。
37. ３７．前記のウイルスが組換え白血病レトロウイルスである、請求項２２に記載 の方法。
38. ３８．前記の治療薬が病的な細胞または組織としてのキメラ受容体細胞または組 織を死滅させるように作用する毒素である、請求項２２に記載の方法。
39. ３９．病的な細胞が腫瘍細胞である、請求項３８に記載の方法。
40. ４０．前記の毒素がリシン、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素の少な くとも１種から選ばれる毒素の少なくとも１つの機能的な細胞毒性ドメインを含 む組換え型の毒素または毒素フラグメントである、請求項３８に記載の方法。
41. ４１．前記の診断薬がｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｓｉｔｕまたはｉｎｖｉｔｒｏで検出 可能な標識である、請求項２２に記載の方法。
42. ４２．検出可能な標識が放射性標識、酵素標識または蛍光標識である、請求項４ １に記載の方法。
43. ４３．請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配 列を含む組換え核酸。
44. ４４．請求項４３の核酸を含有する宿主細胞。
45. ４５．宿主細胞が哺乳類、酵母、鳥類または昆虫の細胞から選ばれるものである 、請求項４４に記載の宿主細胞。
46. ４６．前記の核酸が宿主細胞において前記の受容体ポリペプチドとして発現され 、前記のｅｎｖ結合ドメインを含む受容体結合分子が該受容体ポリペプチドと結 合する、請求項４４に記載の宿主細胞。
47. ４７．哺乳類の細胞がヒト、霊長類または齧歯類の細胞から選ばれるものである 、請求項４５に記載の宿主細胞。
48. ４８．請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチドに特異的なエピトープと結合 するキメラ受容体抗体、その抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。
49. ４９．モノクローナルである、請求項４８に記載のキメラ受容体抗体、その抗イ ディオタイプ抗体またはフラグメント。
50. ５０．ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｓｉｔｕまたはｉｎｖｉｔｒｏで検出可能な標識によ り標識されている、請求項４８に記載のキメラ受容体抗体、その抗イディオタイ プ抗体またはフラグメント。
51. ５１．検出可能な標識が放射性標識、酵素標識または蛍光標識である、請求項５ ０に記載の抗体。
52. ５２．請求項１に記載のキメラ受容体ポリペプチドの生産方法であって、 （ａ）請求項１のキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を発現可能な形態 で含む組換え宿主を培養し、（ｂ）該組換え宿主を培養することにより、該キメ ラ受容体ポリペプチドを回収可能な量で発現させ、そして（ｃ）該宿主または培 養物から該キメラ受容体ポリペプチドを回収する、 ことからなる方法。
53. ５３．（ｄ）前記のキメラ受容体ポリペプチドを精製する、ことをさらに含む、 請求項５２に記載の方法。
54. ５４．試料中に含まれる請求項１のキメラ受容体ポリペプチドのエピトープに特 異的な抗体の検出方法であって、（ａ）該試料を、固体の担体に付着させた請求 項１のキメラ受容体ポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させ、これによ り該抗体を該ポリペプチドと結合させ、そして（ｂ）該担体に付着させた該キメ ラ受容体ポリペプチドと結合している試料中の該抗体を検出する、 ことからなる方法。
55. ５５．試料中に含まれる請求項１のキメラ受容体ポリペプチドのエピトープに特 異的な抗体の回収方法であって、（ａ）該試料を、固体の担体に付着させた請求 項１のキメラ受容体ポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させ、これによ り該抗体を該キメラ受容体ポリペプチドと結合させ、そして（ｂ）該担体に付着 させた該キメラ受容体ポリペプチドと結合している試料中の該抗体を回収する、 ことからなる方法。
56. ５６．生殖細胞と体細胞の実質的にすべてが請求項１のキメラ受容体ポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列を含有する組換え核酸を含んでいるトランスジ ェニック非ヒト哺乳動物。
57. ５７．前記の組換え核酸が胚形成期に前記の哺乳動物または該哺乳動物の祖先に 導入されたものである、請求項５６に記載のトランスジェニック哺乳動物。
58. ５８．配列番号：８のＨ１３ポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に相当するア ミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、単離したまたは組換え型のＨ１３ポ リペプチド。
59. ５９．少なくとも１種の請求項１のキメラ受容体ポリペプチド、ならびに製剤上 許容される担体を含有してなる、レトロウイルス感染を予防または治療するのに 有用な医薬組成物。
60. ６０．レトロウイルス阻止量の請求項５９に記載の医薬組成物を投与することか らなる、被験者におけるレトロウイルス感染の予防または治療方法。
61. ６１．レトロウイルスを、細胞をレトロウイルス感染から防御するのに十分な量 の請求項１のキメラ受容体ポリペプチドと接触させることからなる、レトロウイ ルスの感染性を抑制する方法。
62. ６２．レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項６１に記載の方法 。
63. ６３．前記の接触をｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｓｉｔｕで行う、 請求項６１に記載の方法。
64. ６４．検出可能に標識されたキメラ受容体ポリペプチドと結合し得る、試料中に 含まれるヒトレトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはそれから誘導さ れるペプチドの検出方法であって、（ａ）試料を、検出可能に標識された請求項 １のキメラ受容体ポリペプチドと接触させ、これにより該標識されたキメラ受容 体ポリペプチドを該レトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはレトロウ イルスペプチドと結合させて、検出可能に標識されたレトロウイルス、レトロウ イルスタンパク質またはレトロウイルスペプチドを形成させ、そして （ｂ）該標識されたキメラ受容体ポリペプチドに結合している、該試料中の標識 されたレトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはレトロウイルスペプチ ドを検出する、ことからなる方法。
65. ６５．検出可能に標識されたＨ１３ポリペプチドと結合し得る、試料中に含まれ るヒトレトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはそれから誘導されるペ プチドの検出方法であって、（ａ）試料を、検出可能に標識された請求項５８の キメラ受容体ポリペプチドと接触させ、これにより該標識された受容体ポリペプ チドを該レトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはレトロウイルスペプ チドと結合させて、検出可能に標識されたレトロウイルス、レトロウイルスタン パク質またはレトロウイルスペプチドを形成させ、そして （ｂ）該標識されたヒト受容体ポリペプチドに結合している、該試料中に含まれ る標識されたレトロウイルス、レトロウイルスタンパク質またはレトロウイルス ペプチドを検出する、ことからなる方法。