KR100587556B1 - 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ) - Google Patents

신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ) Download PDF

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Abstract

본 발명은 Ret 리간드(RetL)를 암호하는 뉴클레오티드 서열과, RetL DNA 또는 단백질로 세포 및 포유동물 검체를 치료하여 신경 및 신장 증식을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 임의의 RetL의 뉴클레오티드 서열을 가지나, 특히 래트 retL1 cDNA(서열 번호 1), 부분 인간 retL1 cDNA(서열 번호 8), 전장 인간 retL1 cDNA(서열 번호 10), 인간 retL2 cDNA(서열 번호 12), 쥐 retL3 cDNA(서열 번호 12) 또는 인간 RetL3 cDNA(서열번호 16), 부분 인간 retL3 cDNA(서열 번호 18) 또는 인간 retL3 cDNA(서열 번호 20)를 포함하는, RetL을 암호하는 정제되고 분리된 DNA 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 아미노산 서열이 래트 RetL1(서열 번호 2), 부분 인간 RetL1(서열 번호 9), 전장 인간 RetL1(서열 번호 11), 인간 RetL2(서열 번호 13), 쥐 RetL3(서열 번호 17), 부분 인간 RetL3(서열 번호 19) 또는 인간 RetL3(서열 번호 21)의 아미노산 서열을 포함하는 RetL 단백질을 제공한다.

Description

신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ 리간드（ＲｅｔＬ){RET LIGAND (RetL) FOR STIMULATING NEURAL AND RENAL GROWTH}
도 1은 래트 RetL1의 cDNA 서열(서열 번호 1)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 2)이다. 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 염기쌍 201에서 염기쌍 1700으로 연장되며, 전체 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
도 2a는 인간 RetL1의 부분 cDNA 서열(서열 번호 8)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 9)이다. 서열은 ATCC 번호 97604로 기탁된 클론 HRL20의 삽입체의 서열이다.
도 2b는 인간 RetL1의 복합 전장 DNA 서열(서열 번호 10)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 11)이다.
도 3a는 인간 RetL1(서열의 윗줄)의 뉴클레오티드 서열과 래트 RetL1 서열(서열의 아랫줄)을 비교한 것이다. 뉴클레오티드 사이의 수직선은 그 위치에서의 동일성을 나타내며, 점은 그 위치에서의 차이를 나타낸다.
도 3b는 인간 RetL1(서열의 윗줄)의 아미노산 서열과 래트 RetL1 서열(서열의 아랫줄)을 비교한 것이다. 해당 아미노산 사이의 수직선은 잔기의 동일성을 보여주며, 점은 그 잔기에서의 보존적 치환을 나타낸다.
도 4a는 요관아 세포와 후신 간엽 세포 사이의 상호작용에서 Ret 및 RetL의 가능한 역할을 나타낸 개략도이다.
도 4b는 RetL을 발현하는 클론의 cDNA 라이브러리의 형질감염체를 선별하는 방법의 개략도이다. 형질감염체에서 발현된 RetL의 존재는 Ret/IgG 융합 단백질이나 Ret/알칼린 포스파타제 융합 단백질의 형질감염체에 의한 결합을 평가하여 검출한다.
도 5는 래트 Ret/IgG 융합 단백질을 발현하는 데 사용되는 플라스미드의 작제를 나타내는 개략도이다.
도 6은 인간 Ret/IgG 융합 단백질을 발현하는 데 사용되는 플라스미드의 작제를 나타내는 개략도이다.
도 7은 클론 DSW240에서 발견되는, 인간 retL2의 cDNA 서열(서열 번호 12)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 13)이다. 단백질 리딩 프레임은 뉴클레오티드 25 내지 1416 사이에 포함되어 있다.
도 8은 인간 RetL2의 아미노산 서열(서열의 윗줄)과 인간 RetL1 서열(서열의 아래줄)을 비교한 것이다. 해당 아미노산 사이의 수직선은 그 위치에서의 동일성을 보여주며, 점은 그 위치에서의 차이를 나타낸다.
도 9는 쥐 RetL3의 cDNA 서열(서열 번호 16)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 17)이다.
도 10은 인간 RetL3의 cDNA 서열(서열 번호 20)과 추론 아미노산 서열(서열 번호 21)이다.
본 발명은 Ret 리간드(RetL)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과, RetL DNA 또는 단백질로 세포 및 포유동물 검체를 처리하여 신경 및 신장 증식을 자극하는 방법에 관한 것이다.
세포 시그널링과 수용체 활성화에 대한 기존 연구의 목표중 하나는 세포 증식 및 생존에 연루된 과정을 치료학적으로 조절하는 것이다. 이 과정은 다른 것들 중에서도 기관 부전증, 태아 발육 및 종양 증식을 비롯한 다양한 의학 병태의 결과를 결정한다. 이들 각각의 상태는 전세계적으로 임상적인 중요성을 가지나, 효과적인 치료 선택법이 제한되어 있다. 본 발명의 목적은 손상 조직의 재생 또는 생존을 촉진하고, 조직의 이상 증식 및 발생과 연루된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
조직 손실 또는 말기 장기 부전증은 전세계적으로 매년 수백만 인구에게 발생하여, 건강 관리 비용을 상당히 증가시킨다. 일반적으로 기관 손실 또는 조직 손실은 공여자로부터 기관을 이식하거나, 복원 수술, 또는 기계 장치로 치료한다. 하지만, 이들 각각의 치료법에는 결점이 있다. 이식법은 공여자가 부족하다는 점에서 제한되고, 복원 수술은 장기간에 걸친 문제점을 유발할 수 있으며, 기계 장치는 단일 기관의 모든 기능을 수행할 수 없으므로, 진행성 퇴화를 예방할 수 없다. 따라서, 실제 의약 분야에서는 이들 문제점에 대한 새로운 해결책이 필요한 실정이다.
세포의 증식, 분화 및/또는 생존에 영향을 주는 단백질 인자는 응답성 세포 를 함유하는 기관의 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다. 이 경우 수용체 단백질 티로신 키나아제(RPTK) 패밀리의 수용체와 상호작용하는 인자 또는 리간드가 특히 관심의 대상이 된다. 이들 수용체는 세포 증식 및 분화를 비롯한 여러 세포 프로그램에 관여하며, 여러 종양 형성의 발생과도 관련이 있다. 따라서, 이들 수용체와 상호작용하는 인자 또는 리간드는 조직이 손상된 특정 기관의 질환을 치료하는 데 유용한 것으로 판명될 수 있다. 대안적으로, 종양 증식을 차단하기 위해서 수용체와 인자의 상호 작용을 차단하는 것이 유용할 수 있다.
Ret 원종양유전자는, 말초신경계 및 중추신경계와 신장을 비롯한 각종 조직의 발생 과정에서 발현되는 수용체 티로신 키나아제를 암호화한다. ret 눌(null) 마우스에 존재하는 이상(abnormality)은, Ret가 장관 뉴런의 후장으로의 이동 및 신경 분포에 중요하며, 신장 발생에서 요관아 상피세포의 증식 및 분지에도 중요하다는 것을 제안한다(Nature 367, 380-383, 1994). Ret 시그널링 경로의 중요한 성분, 즉 Ret 리간드에 대한 조사가 집중 연구되어 왔다.
발명의 개요
본 발명은 임의의 RetL의 뉴클레오티드 서열을 가지나, 특히 래트 retL1 cDNA(서열 번호 1), 부분 인간 retL1 cDNA(서열 번호 8), 전장 인간 retL1 cDNA(서열 번호 10), 인간 retL2 cDNA(서열 번호 12), 쥐 retL3 cDNA(서열 번호 16), 부분 인간 retL3 cDNA(서열 번호 18) 또는 인간 retL3 cDNA(서열 번호20)를 포함하는, RetL을 암호하는 정제 및 분리된 DNA 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 아미노산 서열이 래트 RetL1(서열 번호 2), 부분 인간 RetL1(서열 번호 9), 전장 인간 RetL1(서열 번호 11), 인간 RetL2(서열 번호 13), 쥐 RetL3(서열 번호 17), 부분 인간 RetL3(서열 번호 19) 또는 인간 RetL3(서열 번호 21)의 아미노산 서열을 포함하는, RetL 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 ATCC 번호 97604인 클론 HRL20의 삽입 DNA의 서열(부분 인간 retL1 cDNA(서열 번호 8)), 또는 ATCC 번호 98047인 클론 #230-5A-86-17의 삽입 DNA 서열(래트 retL1 cDNA(서열 번호 1))을 포함하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, 폴리펩티드 생성물의 원핵 숙주 세포나 진핵 숙주 세포에서 발현을 유지시키는 데 사용하기 위한 정제 및 분리된 DNA 분자는 RetL의 1차 구조 형태와 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유한다; DNA는 a) 래트 retL1 cDNA, 부분 인간 retL1 cDNA, 전장 인간 retL1 cDNA, 인간 retL2 cDNA, 쥐 retL3 cDNA 또는 인간 retL3 cDNA나, 또는 래트 retL1 cDNA, 부분 인간 retL1 cDNA, 전장 인간 retL1 cDNA, 인간 retL2 cDNA, 쥐 retL3 cDNA 또는 인간 retL3 cDNA의 상보성 가닥을 포함하는 DNA 분자; b) 엄중한(stringent) 조건하에서 a)에서 정의한 DNA 분자 또는 이의 단편에 하이브리드화하는 DNA 분자; 또는 c) 유전자 코드의 축퇴성이 없다면 a) 및 b)에서 정의한 DNA 분자에 하이브리드화하는 DNA 분자일 수 있다. RetL의 생물학적 활성을 보유하는 인간 RetL의 폴리펩티드 단편 또는 변이체를 암호화하는 정제 및 분리된 DNA 분자도 본 발명에 속한다.
본 발명의 임의의 재조합 DNA 분자를 발현 조절 서열에 작동 가능하게 결합 시킬 수 있다.
또한, 본원에서 정의한 DNA 분자 또는 작제물을 포함하는 벡터와 전달계도 본 발명에 포함된다. 벡터는 RetL 또는 RetL의 변이체를 암호화하는 DNA 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 천연 RetL 또는 변형 RetL을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 벡터에 의해 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 진핵 숙주 세포 또는 원핵 숙주 세포를 포함한다.
특히 기타 인간 단백질이 거의 없는 정제 및 분리된 인간 RetL도, RetL의 1차 구조 형태 및 생물학적 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 폴리펩티드 생성물을 생산하기 위한 공정과 마찬가지로, 본 발명에 속한다. 이러한 공정은 적절한 배양 조건하에서 폴리펩티드 생성물을 발현시키는 방식으로 본 발명의 임의의 DNA 분자로 형질전환 또는 형질감염시킨 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포를 증식시키는 단계, 및 RetL을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. DNA의 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드 생성물도 본 발명에 속한다.
또한, 본 발명은 가용성 또는 막 결합성 여부에 관계없이 단백질과 단백질 의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. 선택된 양태들에서, 단백질은 래트 RetL1, 부분 인간 RetL1, 전장 인간 RetL1, 인간 RetL2, 쥐 RetL3 또는 인간 RetL3을 포함하는 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 서열중 하나의 변이체이다. 또 다른 양태에서, 단백질은 면역글로불린, 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종 등의 기타 분자 또는 분자 단편에 융합된, RetL 또는 Ret를 포함하는 융합 단백질이다. RetL의 키메라 분자도 본 발명에 속한다.
본 발명의 기타 양태는 본 발명의 RetL에 대한 특이적 모노클로날 항체를 포함한다. 이 항체는 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종과 결합할 수 있다. 또한 본 발명은 AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 및 BH.G8을 비롯하여 Ret에 대한 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이들 하이브리도마의 서브클론과, 이들 하이브리도마 또는 하이브리도마의 서브클론에 의해 생성된 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포 Ret와 상호작용하여 Ret의 자가인산화를 유도하는 화합물의 치료 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하여 검체에서 새로운 조직의 증식을 촉진하거나, 손상 조직의 생존을 촉진하는 방법을 포함한다. 화합물은 RetL1, RetL2 또는 RetL3, 전장 RetL의 단편 또는 Ret와 결합하는 항체일 수 있다. 이 화합물을, GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor), 뉴트린(neurturin) 또는 GDNF 관련 분자와 같은 제2 화합물의 치료 유효량과 함께 동시에 투여할 수 있다. 이들 방법을 위한 해당 조직은 임의의 조직을 포함할 수 있으나, 신장 조직, 신경 조직, 심장, 위, 소장, 척수 또는 폐가 바람직하다. 일양태에서, RetL은 가용성 RetL이다. 이들 방법에서 검체는 인간일 수 있다.
본 발명의 다른 방법에 있어서, RetL을 발현하는 제1 세포와 제2 세포 사이의 Ret 시그널 변환은 가용성 Ret 단백질 또는 RetL에 대한 항체와 제 1 세포를 접촉시켜 억제한다. 이 가용성 Ret 단백질은 융합 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종에 접합시킨 항 Ret항체 또는 RetL 융합 단백질과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여, 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종을 Ret 발현 세포로 표적화시키는 방법을 포함한다. RetL은 RetL1, RetL2 또는 RetL3일 수 있다. 또 다른 방법에서, 독소나 방사핵종과 RetL의 융합 단백질, 또는 독소나 방사핵종에 접합된 항Ret 항체를 세포와 접촉시키는 단계로 Ret를 발현하는 종양 세포의 증식을 억제한다. 세포는 검체내에 있을 수 있으며, 단백질 또는 접합 항체를 검체에게 투여한다.
Ret와 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종을 포함하는 융합 단백질, 또는 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종에 접합된 항RetL 항체를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여 RetL을 발현하는 세포에 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종을 표적화시키는 방법도 본 발명에 속한다. 또 다른 일양태에서, 본 발명은 Ret와 독소나 방사핵종의 융합 단백질, 또는 독소나 방사핵종에 접합된 항RetL 항체를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여 RetL을 발현하는 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 포함하며; 세포는 검체내에 존재할 수 있으며, 단백질을 검체에게 투여할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에 사용하기 위한 RetL은 RetL1, RetL2 또는 RetL3이거나, 또는 RetL1, RetL2 또는 RetL3의 변이체 또는 단편일 수 있다.
유전자 치료 방법도 본 발명에 속한다. 일양태에서, 본 발명은 RetL을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 벡터를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여 Ret 대사 장애가 있는 검체를 치료하는 방법과, 이 벡터를 검체에게 투여하는 단계를 포함하여 검체의 새 조직의 증식을 촉진하는 방법을 제공한다. 또 다른 일양태에서, 본 발명은 RetL을 암호화하는 벡터의 치료 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 검체의 손상 조직의 생존을 촉진하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
서열 번호
본원의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 하기의 서열 번호로 나타낸다.
서열 번호 1 래트 retL1 cDNA
서열 번호 2 래트 RetL1 아미노산
서열 번호 3 올리고머 kid-13
서열 번호 4 올리고머 kid-14
서열 번호 5 올리고머 kid-15
서열 번호 6 세포외 래트 ret cDNA
서열 번호 7 세포외 래트 Ret 아미노산
서열 번호 8 부분 인간 retL1 cDNA
서열 번호 9 부분 인간 RetL1 아미노산
서열 번호 10 인간 retL1 cDNA
서열 번호 11 인간 RetL1 아미노산
서열 번호 12 인간 retL2 cDNA
서열 번호 13 인간 RetL2 아미노산
서열 번호 14 부분적인 쥐 retL3 cDNA (EST AA50083)
서열 번호 15 부분적인 쥐 RetL3 아미노산
서열 번호 16 쥐 retL3 cDNA
서열 번호 17 쥐 RetL3 아미노산
서열 번호 18 부분 인간 retL3 cDNA
서열 번호 19 부분 인간 RetL3 아미노산
서열 번호 20 인간 retL3 cDNA
서열 번호 21 인간 retL3 아미노산
정의
본원의 "RetL"은 수용체 단백질 Ret와 특이적으로 상호작용하고, Ret와 상호작용하는 경우 Ret의 티로신 키나아제 도메인의 자가인산화 및/또는 Ret의 이량체화를 촉발하는 임의의 단백질을 의미한다. RetL 및 Ret를 암호화하는 DNA 서열을 각각 "retL" 및 "ret"라고 칭한다. 리간드는 가용성일 수 있으며, 또는 자가인산화를 촉발하는 Ret 분자와 동일한 또는 상이한 세포상에 막결합 분자로서 존재할 수 있다. 특정 용도 또는 Ret와의 상호 작용에서, 리간드는 자가인산화를 촉발할 수 있는 추가의 분자를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 리간드는 공동수용체 또는 보조 리간드 조인자를 포함한다. 또한, 본 발명의 리간드는 Ret 길항물질로서 작용하는 항Ret mAb를 포함하며, 이는 Ret 이량체화 및 자가인산화를 촉발시킨다. 리간드는 각종 방법, 예컨대 독소나 방사핵종과의 융합 단백질의 일부로서 삽입시켜 변형시킬 수도 있다.
"서열 정렬"은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 중 하나를 다른 하나의 서열과 함께 배치하여 서로 관련된 부분의 서열을 비교할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이 과정의 한 방법의 예는 Needleman 등의 문헌[J.Mol.Biol. 48:443-453, 1970]에 개시되어 있다. 이 방법은 얼라인 프로그램(DNAstar 인코포레이티드)과 같은 컴퓨터 프로그램에 의해서 편리하게 실행할 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 동종 또는 기능적으로 등가인 서열은 시스테인의 직선 배열을 변경시키는 아미노산 삽입 또는 결실을 비롯하여 보존 시스테인 골격내의 시스테인 잔기의 기능적 등가 배열을 포함하나, 단백질의 폴딩된 구조에서 이의 관련성을 크게 손상시키지 않는다. 따라서, 후보 서열중 내부 차이와 아미노산 서열 삽입은 후보 서열과 기준 서열사이의 아미노산 서열 상동성 또는 동일성 정도를 계산하는 데 무시된다. 단백질의 상동성을 설정하는 데 자주 사용되는 특징은 한 단백질과 다른 단백질 사이의 시스테인 잔기의 수와 위치의 유사성이다.
"클로닝"은 시험관내 재조합 기술을 사용하여 특정 유전자 또는 기타 DNA 서열을 벡터 분자내로 삽입시키는 것을 의미한다. 원하는 유전자를 성공적으로 클로닝시키기 위해서, DNA 단편을 생성하는 방법, 단편을 벡터 분자에 연결하는 방법, 복합 DNA 분자를 복제가능한 숙주 세포내로 도입하는 방법 및 수용 숙주 세포중에서 표적 유전자를 보유하는 클론을 선택하는 방법을 사용해야 한다.
"cDNA"는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보성 DNA 또는 카피 DNA를 의미한다. 따라서, "cDNA 클론"은 클론 벡터내에 보유된 해당 RNA 분자에 상보적인 2본쇄 DNA 서열을 의미한다.
"cDNA 라이브러리"는 RNA 주형 공급원에 따라 전 유기체 또는 조직에 존재하 는 대표적인 mRNA 분자를 함께 포함하는 cDNA 삽입체를 함유하는 재조합 DNA 분자를 모아 놓은 것이다. 이 cDNA 라이브러리는 당업자들에게 알려진 방법과 예컨대 Maniatis 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌 참조]에 개시된 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 게놈으로부터 특정 유전자를 클로닝하기를 원하는 경우 유기체의 세포로부터 RNA를 먼저 분리한다. 본 발명의 목적을 위해서, 포유동물 세포주가 바람직하며, 인간 세포주가 특히 바람직하다. 대안적으로, RNA를 동물 종양, 특히 인간 종양으로부터 유도된 종양 세포로부터 분리할 수 있다. 따라서, 라이브러리는, 예컨대 인간 부신 종양으로부터 제조할 수 있으나, 임의의 종양을 사용할 수 있다.
본원에서 사용한 "DNA 다형성"은 2종 이상의 다른 뉴클레오티드 서열이 DNA의 특정 부위에 존재할 수 있는 상태를 의미한다.
"발현 벡터"는 내부에 함유된 DNA 서열을 발현할 수 있는 벡터, 즉 암호 서열이 발현을 실시할 수 있는 기타 서열에 작동가능하게 결합하고 있는 벡터를 의미한다. 이는, 항상 명백하게 설명할 수 있는 것은 아니지만, 이들 발현 벡터가 에피좀 또는 염색체 DNA의 내재성 부분으로서 숙주 유기체에서 복제 가능해야 한다는 뜻이다. 효과적인 발현 벡터의 필수적이지는 않지만 유용한 인자는 마커 암호 서열, 즉 세포를 쉽게 동정할 수 있도록 하는 단백질을 함유하는 세포의 표현형 특성(예, 테트라사이클린 내성)을 초래하는 단백질을 암호화하는 서열이다. 요컨대, "발현 벡터"는 기능적 정의이며, 특정 서열에 적용하는 경우, 특정한 포함된 DNA 코드를 발현시킬 수 있는 임의의 DNA 서열은 이 용어에 포함된다. 그러한 벡터는 종 종 플라스미드의 형태로 존재하며, 따라서 "플라스미드"와 "발현 벡터"는 종종 상호교환하여 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 파지를 비롯한 기타 발현 벡터의 형태를 포함하며, 이는 등가의 기능을 가지며 때때로 당업계에 알려져 있을 수 있다.
유사하게, 본 발명의 임의의 단백질의 유전자의 "기능적 유도체"는, 뉴클레오티드 서열이 "실질적으로 유사한" 것일 수 있고, 유사한 활성을 보유하는 분자를 암호화하는 유전자의 "단편", "변이체" 및 "유사체"를 포함한다.
"GDNF 관련 분자"는 GDNF 또는 뉴트린에 대해 40% 이상의 상동성이 있고 RetL에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다.
"유전자"는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"상동성"은, 펩티드 또는 DNA 서열에 관해 언급한 경우, 여러 고려사항 하에서 조성물에 존재하는 거의 모든 분자의 1차 분자 구조(즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열)가 동일하다는 것을 의미한다.
본원에서 프로브, 검출할 올리고머 단편, 올리고머 대조군, 표지되지 않은 블록킹 올리고머 및 서열의 증폭을 위한 프라이머를 언급하는 데 사용한 "올리고뉴클레오티드"는 3개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 분자를 의미한다. 정확한 크기는 여러 인자에 따라 다르며, 이 인자는 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 따라 다르다.
"프로브"는 표적 안티리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 알려진 특성의 리간드를 의미한다. 핵산에 사용한 경우, "프로브"는 표적 가닥에 상보적인 염기 서 열을 가지는 핵산의 가닥을 의미한다.
"재조합 숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제한 벡터로 형질전환시킨 세포를 의미한다. 본원에서 정의한 바와 같이, 재조합 숙주 세포에 의해 형성된 항체 또는 이의 변이체는, 소량, 더욱 일반적으로는 검출할 수 있는 것 미만의 양으로, 형질전환되지 않은 숙주에 의해 생성된 것 보다는 형질전환체에 의해 생성된 것이다.
본원에서 사용한 "제한 엔도뉴클레아제"와 "제한 효소"는 박테리아 효소를 의미하며, 각각은 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 부근에서 2본쇄 DNA를 절단시킨다.
"제한 단편 길이 다형성"("RFLP")은 특정 제한 단편의 길이가 각각 다른 것을 의미한다.
두 분자에서 아미노산의 서열이 거의 유사한 경우와 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 보유한 경우, 분자는 다른 분자에 대하여 "실질적으로 유사하다"라고 말한다. 따라서, 유사한 활성을 보유한 2개의 분자가 주어진 경우, 하나의 분자가 또 다른 분자에서는 발견되지 않는 아미노산 잔기를 더 포함하거나, 또는 아미노산 잔기 서열이 동일하지 않을 때에도 변이체라고 할 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, 보통 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 부분을 포함하는 경우 그 분자를 다른 분자의 "화학적 유도체"라고 말한다. 그러한 부분은 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 또한, 이 부분은 분자의 독성을 감소시키고 분자의 바람직하지 않은 임의의 부작용 등을 제거 또는 약화시킬 수 있다. 이 효과를 매개할 수 있는 부분은, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980)]에 개시되어 있다.
"벡터"는 DNA 단편을 삽입 또는 클로닝시킬 수 있는 플라스미드 또는 박테리오파지로부터 유도된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 하나 이상의 유일한 제한 부위를 포함하며, 정의한 숙주 또는 매개 유기체에서 자율적으로 복제할 수 있어 클로닝된 서열도 복제할 수 있다.
"실질적으로 순수한"은 각각 다른 단백질 또는 유전자가 거의 없거나, 또는 자연에서 보통 발견되는 기타 오염물질이 거의 없어서 자연에서는 발견되지 않는 형태로 존재하는 본 발명의 임의의 단백질 또는 임의의 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다.
본 발명의 화합물
본 발명은 래트 retL1 cDNA, 부분 인간 retL1 cDNA, 전장 인간 retL1 cDNA, 인간 retL2 cDNA, 쥐 retL3 cDNA 또는 인간 retL3 cDNA의 뉴클레오티드 서열 등의 RetL을 암호화하는 cDNA를 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물은 상기 서열을 포함하거나 또는 이들 서열중 하나의 서열의 유도체인 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 이들 서열 중 하나의 서열 또는 이들 서열 중 하나의 서열의 유도체를 포함하는 벡터, 리포좀 및 기타 캐리어 매개체를 포함한다. 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니지만 래트 RetL1, 부분 인간 RetL1, 전장 인간 RetL1, 인간 RetL2, 쥐 RetL3 또는 인간 RetL3을 비롯하여 래트 retL1 cDNA, 부분 인간 retL1 cDNA, 전장 인간 retL1 cDNA, 인간 retL2 cDNA, 쥐 retL3 cDNA 또는 인간 retL3 cDNA 로부터 전사 및 번역된 단백질과, 이의 유도체 및 변이체도 포함한다.
본 발명의 일양태는 RetL의 가용성 변이체를 포함한다. 가용성 변이체에는 천연 RetL의 최소한 일부의 막내(intramembrane) 부분이 결여되어 있다. 일부 예에서, 가용성 변이체는 천연 RetL의 포스파티딜이노시톨 글리칸 결합이 결여되어 있다. 가용성 변이체는 포스파티딜이노시톨 모티프가 결여된 RetL의 유도체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
변이체는, 아미노산 서열이 자연 발생적인 RetL과 다르거나 또는 서열을 포함하지 않는 방식으로 자연 발생적인 RetL과 다르거나, 또는 양자일 수 있다. 자연 발생적인 RetL의 하나 이상의 아미노산을 다른 자연 아미노산, 아미노산 유도체 또는 비자연 아미노산으로 치환시킨 경우 아미노산 서열의 변이체가 형성된다. 특히 바람직한 변이체는 자연 발생적인 RetL, 또는 자연 발생적인 RetL의 생물학적 활성 단편을 포함하며, 이의 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 야생형 서열과는 다르며, 단백질 또는 펩티드의 소수성과 2차 구조에 최소한의 영향을 주는 것이 통상적이다. 또한, 변이체는 RetL 생물학적 활성을 해지시키지 않는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 달라지는 서열을 포함할 수 있다. 통상 보존적 치환은, 예컨대 다음과 같은 군내에서의 치환과 같이 하나의 아미노산을 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다; 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소로이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 등이 있다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘 등이 있다. 음전하를 띤(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산 등이 있다.
기타 보존적 치환은 하기 표로부터 취하며, 기타의 것은 Dayhoff의 문헌[Atlas of Protein Sequence and Structure(1988)]에 개시되어 있다.
보존적 아미노산 치환
아미노산 코드 다음에서 선택한 임의의 것으로 치환
알라닌 A D-Ala, Gly, 베타-Ala, L-Cys, D-Cys
아르기닌 R D-Arg, Lys, 호모-Arg, D-호모-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
아스파라긴 N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
아스파르트산 D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인 C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민 Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산 E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신 G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, 베타-Ala, Acp
이소로이신 I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
로이신 L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
리신 K D-Lys, Arg, D-Arg, 호모-Arg, D-호모-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌 M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
페닐알라닌 F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp 트랜스 3,4 또는 5-페닐프롤린, 시스 3,4, 또는 5-페닐프롤린
프롤린 P D-Pro, L-I-티오아졸리딘-4-카르복실산, D-1-옥사졸리딘-4-카르복실산 또는 L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
세린 S D-Ser, Thr, D-Thr, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
트레오닌 T D-Thr, Ser, D-Ser, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
티로신 Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린 V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
본 발명의 기타 변이체는 펩티드 안정성이 증가되도록 변형시킨 것이다. 이 변이체는, 예컨대 펩티드 서열내에 하나 이상의 비펩티드 결합(펩티드 결합을 대체함)을 포함할 수 있다. 또한, 자연 발생적인 L-아미노산 이외의 잔기, 예를 들어 D-아미노산 또는 비자연 발생적인 아미노산 또는 합성 아미노산, 예컨대 베타 아미노산 또는 감마 아미노산 등을 포함하는 변이체와 환형 변이체도 포함한다. L-아미노산 대신에 D-아미노산을 폴리펩티드내로 혼입시키면 프로테아제에 대한 내성을 증가시킬 수 있다. 참고, 예컨대 미국 특허 5,219,990호.
본 발명의 펩티드는, 삽입, 결실 및 치환 등의 변화가 그 용도에 특정한 장점을 제공한다면 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환 등의 각종 변화에 의해 변형시킬 수도 있다. 특히 스플라이스 변이체는 본 발명에 포함된다.
실질적인 전장 폴리펩티드 외에, 본 발명은 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편을 제공한다. RetL 폴리펩티드 또는 단편이 자연 발생적인 RetL의 생물학적 활성을 나타내는 경우 이는 생물학적 활성이다. 이 생물학적 활성은 Ret의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 포함하며, Ret의 세포외 부분에 대한 자연 발생적인 RetL의 친화도의 50% 이상, 바람직하게는 적어도 거의 같은 친화도를 나타낸다. 또 다른 생물학적 활성은 자연발생적 RetL에 존재하는 에피토프에서 유도되는 항체에 결합할 수 있는 능력이다.
또 다른 일양태에서, 덜 보존적인 아미노산 치환체를 가지는 변이체는, 예컨대 전하, 구조 및 기타 생물학적 특성을 변화시켜 원하는 유도체를 형성할 수 있다. 이 치환은, 예컨대 소수성 잔기의 친수성 잔기로의 치환, 다른 잔기의 시스테인 또는 프롤린으로의 치환, 큰 측쇄를 가지는 잔기의 작은 측쇄를 가지는 잔기로의 치환 또는 순 음전하를 가지는 잔기의 순 양전하를 가지는 잔기로의 치환을 포함할 수 있다. 주어진 치환의 결과를 확실히 예측할 수 없는 경우, 유도체는 본원에 개시된 방법에 따라 쉽게 분석하여 원하는 특성의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
일반적으로, Ret 폴리펩티드의 기능적 특성에 변화를 유발할 것으로 예상할 수 있는 치환은 (i) 친수성 잔기, 예컨대 세린 또는 트레오닌을 소수성 잔기, 예컨대 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌 또는 알라닌으로 치환시킨 것; (ii) 시스테인 잔기를 임의의 기타 잔기 대신(또는 잔기에 의해) 치환시킨 것; (iii) 양전기 측쇄를 가지는 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘을 음전기 전하를 가지는 잔기, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산 대신(또는 이에 의해) 치환시킨 것; 또는 (iv) 큰 측쇄를 가지는 잔기, 예컨대 페닐알라닌을 이러한 측쇄를 가지지 않은 잔기, 예컨대 글리신 대신(또는 이에 의해) 치환시킨 것이다.
본 발명의 변이체는 래트 RetL1(서열 번호 2), 부분 인간 RetL1(서열 번호 9), 전장 인간 RetL1(서열 번호 11), 인간 RetL2(서열 번호 13), 쥐 RetL3(서열 번호 17), 부분 인간 RetL3(서열 번호 19) 또는 인간 RetL3(서열 번호 21)과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 보유한 단백질 및 펩티드를 포함한다. 서열 상동성은 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상인 것이 더욱 바람직하다. 상동성을 결정하기 위한 비교 서열의 길이는 일반적으로 8개 이상의 아미노산 잔기, 통상 20개 이상의 아미노산 잔기이다. 본 발명의 화합물의 변이체는 1) 본 발명의 RetL 단백질에 대해 40% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 가지며, 2) RetL 서열과 최적 정렬로 배치시킨 후(도 8에 RetL1 및 RetL2에 도시된 바와 같음), 본 발명의 RetL 단백질의 시스테인과 정렬된 시스테인 잔기의 80% 이상을 가지는 임의의 단백질을 포함한다.
골격의 치환체를 교체할 수 있는 것과 마찬가지로, 골격에 결합된 작용기를 유사한 특징으로 특성화된 기로 치환할 수 있다. 이 변형은 1차 서열을 변경시키지 않는다. 초기에 이들은 보존적이다. 즉, 대체기가 본래의 기와 동일한 크기, 형상, 소수성 및 전하를 가진다. 비서열 변형은, 예컨대 생체내 또는 시험관내 자연 발생적인 RetL 부분의 화학적 유도체화와, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 카르복실화 또는 글리코실화의 변화를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질, 이 단백질의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 제제를 포함한다. 이들 제제는 Ig 융합 단백질과 항체(천연의 것, 인간화시킨 것, 감작시킨 것 또는 키메라성인 것과 무관하게 1본쇄, 2본쇄, Fab 단편 또는 기타의 것을 포함)를 포함한다. 제제의 이들 범주는 본원에서 참고로 인용한 PCT 출원 95/16709호에 상세히 설명되어 있다.
[실시예]
개략적인 방법
RetL1을 클로닝시키는 데 사용한 일반적인 방법은 도 4a 및 도 4b에 나타나있다. 이 방법은 최소한 RetL이 막 단백질로서 발육 신장의 후신 간엽에서 발현된다는 전제(리간드를 가용성 형태로 발현시키는 것도 가능하지만; 도 4a)를 기초로 하였다. RetL은 요관아 세포상에서 Ret 수용체와 상호작용하여 티로신 키나아제 세포질 도메인을 활성화시키고 핵으로 시그널을 보내어, 요관아 세포의 증식과 분지에 관련된 유전자를 활성화시킨다. 따라서, 알칼린 포스파타제(AP) 또는 인간 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 부분에 융합된 Ret의 세포외 도메인을 함유하는 단백질은 도 4b에 도시된 바와 같이 RetL을 클로닝시키는 방법의 일부로서 사용할 수 있다. RetL1의 클로닝에 사용된 융합 단백질, 발현 라이브러리 및 기타 제제는 다음에 기술되어 있다.
본 발명자들은 먼저 래트 RetL1의 cDNA를 분리한 후 이를 프로브로 사용하여 인간 RetL1에 대한 cDNA를 분리한다. 이어서, RetL2 및 RetL3에 대한 cDNA를 분리한다.
Ret 리간드의 직접적인 발현 클로닝에 필요한 시약의 제조
1. 래트 Ret 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA의 분리
RetL1을 동정하기 위해서, 단백질, 즉 한 예에서는 IgG1의 인간 Fc 부분과 다른 예에서는 알칼린 포스파타제에 융합된 래트 또는 인간 Ret의 세포외 도메인으로 구성된 융합 단백질을 형성한다. 융합 파트너는 쉽게 분석되어 도 4b에 예시된 바와 같이 리간드를 발현하는 세포를 검출할 수 있다.
래트 Ret를 암호화하는 cDNA는 개시되어 있지 않기 때문에, 역전사 효소-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 사용하여 래트 Ret 수용체의 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 분리한다. 인간(진뱅크 수탁 번호 M57464 및 X15262)과 쥐(진뱅크 수탁 번호 X67812) ret의 2개의 뉴클레오티드 서열을 비교하고, 2개의 서열 사이의 높은 동일성 영역으로부터 얻은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인한다. kid-013(서열 번호 3; 진뱅크 서열 X15262의 뉴클레오티드 150-169 포함)이라고 불리우는 센스 올리고머를 ATG 개시 코돈과 중복되는 인간 ret cDNA 서열의 5' 말단으로부터 선택한다. 이는 클로닝을 위한 Not1 제한 부위를 암호화하는 5' 말단상의 뉴클레오티드를 포함한다. kid-014(서열 번호 4; 진뱅크 서열 M57464의 뉴클레오티드 1819-1839의 보체를 포함) 및 kid-015(서열 번호 5; 진뱅크 서열 X67812의 뉴클레오티드 1894-1914의 보체를 포함)라고 불리우는 2개의 안티센스 올리고머를, 경막 도메인을 암호화하는 서열의 바로 5'에 있는 인간 및 쥐 cDNA 서열로부터 각각 선택한다. 올리고머 kid-014 및 kid-015는 클로닝을 위한 Sal1 제한 위치를 암호화하는 5' 말단에 추가의 뉴클레오티드를 포함한다.
총 RNA를 14일된 배(胚) 래트 신장으로부터 분리하고, mRNA는 올리고-dT 크로마토그래피로 정제한다. mRNA는 AMV 역전사 효소를 사용하여 cDNA로 전환시키고, cDNA는 2본쇄 cDNA로 전환시키고 올리고머 kid-013과 kid-105를 이용한 표준 폴리머라제 연쇄 반응에서 Taq 폴리머라제를 이용하여 증폭시킨다. 1942 bp PCR 단편의 합성은 1% 아가로스 겔상에 PCR 반응물의 분액을 전개하여 확인한다. 남은 PCR 단편을 Not1 및 Sal1으로 분해하고, Not1 및 Sal1으로 미리 분해시킨 pSAB132내로 클로닝시킨다. 생성 플라스미드를 pJC011이라고 부른다. Not1 및 Sal1 위치 사이에 포함된 플라스미드 pJC011의 전체 삽입체를 서열 결정하고 세포외 래트 ret cDNA(서열 번호 6)로서 나타낸다. 이 서열의 번역은 세포외 래트 Ret에 대한 펩티드 서열(서열 번호 7)을 나타낸다. RCR용 올리고머가 ret의 인간 서열과 마우스 서열로부터 선택되었기 때문에, 세포의 래트 ret cDNA의 것으로 도시된 뉴클레오티드 서열 및 세포외 래트 Ret의 것으로 도시된 펩티드 서열은 kid-013 및 kid-015 서열의 영역에서 천연 래트 ret 뉴클레오티드 및 Ret 펩티드 서열과 다를 수 있다. 따라서, ret cDNA 클론을 18일된 배 신장 cDNA 라이브러리로부터 분리하고, 2개의 아미노산 변화를 초래하는 수개의 뉴클레오티드 변화가 프라이머 영역에서 관찰된다. 한가지는 시그널 서열의 변화이고(위치 5에서 아르기닌의 트레오닌으로의 변화), 또 하나는 세포외 도메인의 말단 부근에서의 변화이다(위치 633에서 글루탐산의 알라닌으로의 변화). 이들 변화는 모두 리간드 결합에 영향을 주지 않는다.
2. Ret/IgG 융합 단백질
인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 래트(아미노산 잔기 #1-637)과 인간(아미노산 잔기 #1-636) Ret 수용체의 세포외 도메인으로 구성된 융합 단백질을 형성한다.
래트 Ret/IgG 융합 단백질을 발현하는 데 사용한 플라스미드의 작제는 도 5에 개략적으로 도시되어 있다. 래트 Ret/IgG 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 작제하기 위해서, 래트 Ret 세포외 도메인을 함유하는 pJC011(전술)을 Sal1으로 분해하고, 이를 플라스미드 2-4로부터 얻은 700 bp Sal1 단편에 결찰시켜 플라스미드 pJC012를 만든다. 이 Sal1 단편은 본래 플라스미드 pSAB144로부터 유도된 인간 IgG1의 Fc 도메인의 일부를 포함한다. 플라스미드 2-4는 다음과 같은 3가지 방법의 결찰을 통하여 미리 제조하였다: 토끼 TGF-베타 II형 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 PCR에 의해 생성된 Not1-Sal1 단편; 인간 IgG1의 Fc 도메인 부분을 포함하는 pSAB144로부터의 693 bp Sal1-Not1 단편; Not1로 분해된 pSAB132. 도 5에 도시된 바와 같이, 700 bp Sal 단편과 같이 Fc 도메인을 포함하는 단편은 2-4 플라스미드로부터 방출시킬 수 있다. pJC012를 COS 세포내로 형질감염시키고, 래트 Ret/IgG 융합 단백질은 단백질-A 세파로스 크로마토그래피를 사용하여 48 시간 후에 배지로부터 정제한다. 래트 Ret/IgG 단백질을 생산하는 안정한 세포주를 만들기 위해서, 전체 래트 Ret/IgG 융합 단백질을 함유하는 pJC012로부터 2612 bp Not1 단편을 분리하고, 발현 벡터 pMDR901의 Not1 위치로 클로닝시킨다. 생성 플라스미드를 pJC022라고 부른다. 플라스미드 pJC022를 CHO 세포내로 형질감염시켜 안정한 세포주를 형성한다. 최고의 생산 세포주를 현탁액에 적용시킨다. 래트 Ret/IgG CHO 주의 전형적인 수율은 75 ㎎/ℓ이다.
인간 Ret/IgG 융합 단백질을 발현하는 데 사용되는 플라스미드의 작제법은 도 6에 개략적으로 도시되어 있다. 인간 Ret/IgG 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 작제하기 위해서, M. Takahashi 박사(일본 나고야에 소재하는 나고야 대학의 약학대학 병리과)로부터 인간 Ret 수용체를 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 얻었다. PCR 단편은 올리고머 kid-013과 kid-014를 사용하여 이 플라스미드로부터 제조한다. PCR 단편을 클레노우 단편으로 처리한 후 Not1으로 분해하여 점착 Not1 말단과 하나의 평활 말단을 가진 RCR 단편을 형성시킨다. 이 단편은 미리 EcoR1으로 분해한 벡터 pGEM11zf(+) 내로 클로닝시키고, 클레노우 단편으로 처리하고, Not1으로 분해하여 점착 Not1 말단과 하나의 평활 말단을 형성한다. 생성 플라스미드를 pJC013이라고 부른다. pJC013으로부터 얻은 1916 bp Not1-Sall 단편은 Not1으로 완전히 분해하고 Sal1으로 부분 분해한 후 분리하고, 인간 IgG1의 Fc 도메인의 일부를 포함하는 pSAB144로부터 693 bp Sal1-Not1 단편과 Not1으로 분해한 pSAB132 발현 벡터에 결찰시킨다. 생성 플라스미드를 pJC015라고 부른다. 플라스미드 pJC013내의 삽입체를 서열결정하여, 이 삽입체가 인간 Ret의 세포외 도메인에 있는 하나의 아미노산을 변화시킨 단일 뉴클레오티드 차이를 포함하는 것을 밝혀냈다(진뱅크 서열 M57464는 위치 812에 C를 가지는 반면, pJC013은 해당 위치에 T를 가진다; 이는 인간 Ret 단백질 서열의 위치 294에서 알라닌으로부터 발린으로의 아미노산 변화를 초래한다). 이 뉴클레오티드를 플라스미드 pJC013의 위치 특이적 돌연변이 유발에 의해 진뱅크 서열 M57464에 의해 특정화된 C 잔기로 다시 보정하여 플라스미드 pJC023을 생성한다. 수복된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pJC023으로부터 유래한 585 bp BstE2 단편을 분리하고, 변형 뉴클레오티드를 포함하는 585 bp BstE2 단편을 제거한 플라스미드 pJC015내로 클로닝시킨다. 새로운 플라스미드를 pJC024라고 부른다. 전체 인간 Ret/IgG 융합 단백질을 포함하는 pJC024로부터 얻은 2609 bp Not1 단편을 분리하고 발현 벡터 pMDR 901의 Not1 위치내로 클로닝시킨다. 생성 플라스미드를 pJCO25라고 부른다. 플라스미드 pJC025를 CHO 세포내로 형질감염시켜 안정한 세포주를 형성한다. 최고 생산 세포주를 현탁액에 적용시킨다. 인간 Ret/IgG CHO 세포주의 전형적인 수율은 6 ㎎/ℓ이다.
본 발명의 방법에 사용한 벡터의 제조에 대한 상세한 설명은, 본원에서 참고로 인용한 PCT 출원 94/01456 및 92/02050에 개시되어 있다.
3. Ret/IgG 융합 단백질의 생활성
본 발명자들이 제조한 Ret/IgG 융합 단백질이 생활성이며, 따라서 RetL의 클로닝을 위한 우수한 스크리닝 시약인 지를 결정하기 위해서, 생활성에 대한 몇가지 기관 배양물 분석을 수행한다. 기관 배양 분석은 50 ㎍/㎖의 농도에서 Ret/Ig 융합 단백질의 존재하에 3∼5일 동안 기관 배양물중 13일∼14일 배 래트 신장을 성장시키는 것으로 구성된다. 또한 신장은 LFA-3TIP/IgG 또는 매개체 완충액의 존재하에 배양한다. 배양 기간 후에, 일부 신장은 요관아 세포로부터 유래한 상피세포인 집합관 조직을 염색하는 형광 렉틴 돌리쵸스 비플로러스 어글루티닌(Dolichos Biflorus Agglutinin)(DB 렉틴)으로 염색한다. Ret가 요관아세포와 이의 상피 세포 유도체에서 발현되기 때문에, 이들 "DB" 양성 세포는 Ret 양성 세포를 나타낸다. 이것으로 배 신장의 증식 및 발육에 대한 Ret/IgG 융합 단백질의 영향을 전반적으로 평가할 수 있다. LFA-3TIP와 함께 배양한 신장과 래트 Ret/IgG 융합 단백질과 함께 배양한 신장 사이의 증식과 집합관 형태에는 명백한 차이가 있다. Ret/IgG 처리한 신장은 상당히 덜 분지되고 일반적으로 더 작은 집합관을 가진다.
조직학 검사를 위해 기타 신장으로부터 파라핀 부분을 제조한다. 배 신장을 대조 완충액 또는 Ret/IgG로 처리한 후, 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다. Ret/Ig로 처리한 배 신장은 대조 완충액으로 처리한 배 신장보다 집합관이 덜 분지되어 있다. 또한, Ret/IgG로 처리한 신장은 세관이 거의 없다. 또한 본 발명자들은 인간 Ret/IgG 융합 단백질을 사용하여 이 효과를 관찰하였다. 이들 관찰 결과는 융합 단백질이 간엽과 요관아 세포 사이의 유도성 시그널을 차단한다는 것과 일치한다. 따라서, 본 발명자들은 융합 단백질이 RetL을 클로닝하기 위한 우수한 시약이라고 결론지었다.
4. Ret/알칼린 포스파타제 융합 단백질
수용체/알칼린 포스파타제(AP) 융합 단백질을 사용하여 c-kit(Cell 63:185, 1990)에 대한 리간드, orphan 수용체의 eph 패밀리의 구성원(Cell 79:157, 1994)에 대한 리간드를 성공적으로 동정 및 클로닝하였으며, 최근에 ob 유전자(Cell 83:1263, 1995)의 생성물인 렙틴의 수용체를 클로닝하였다. 래트 Ret/AP 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 작제하고, 래트 Ret/AP 단백질을 세포 공장의 COS7세포에서 제조한다. 이어서, 평균 10 ㎎/ℓ의 융합 단백질을 발현하는 안정한 NIH3T3 세포주를 제조한다. 래트 Ret/AP 단백질의 SDS-PAGE 분석으로 이 단백질의 크기가 추정 분자량과 일치한다는 것을 알았으며, 겔 여과 분석으로 단백질이 이량체로서 생성된다는 것을 알 수 있다. 항AP 칼럼상에서 친화도 크로마토그래피를 행하여 부분적인 정제를 수행한다.
5. 항Ret 항체
래트 Ret/IgG 융합 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 제조한다. 항체에 대해 웨스턴 블롯, Ret 양성 세포주의 FACS 분석 및 배 신장부의 면역조직화학을 수행한다.
햄스터 항래트 Ret 모노클로날 항체의 패널을 형성한다. 단백질 A 세파로스에 커플링된 래트 Ret/IgG 융합 단백질을 사용하여 아르메니아산 햄스터를 면역화시킨다. 융합 후에 316개 클론을 얻고, ELISA 분석법으로 래트 Ret 융합 단백질 및/또는 인간 IgG와 결합하는 능력을 스크리닝한다. 11개의 클론이 래트 Ret/IgG(및 래트 Ret/AP)에만 결합하고 인간 IgG에는 결합하지 않는 항체를 생산한다. 인간 Ret에 대한 교차 반응도는 FACS로 분석한다; 4개의 클론은 Ret 양성 인간 세포주 THP-1에 결합할 수 있는 항체를 생산한다. 다음 표에 12개의 모노클로날 항체의 Ret 결합 특성이 요약되어 있다.
클론 ELISA 래트 Ret/Ig FACS 인간 THP-1
AA.FF9.5 + -
AA.HE3.7 + +
AF.E9.5 + -
BA.B1.16 + -
BB.B6 + -
AA.GE7.3 + -
CD.F11.2 + -
AH.E3.11 + +
CD.G4.2 + +
AG.E7.9 + -
BD.G6 + +
BH.G8 - -
6. cDNA 발현 라이브러리
본 발명자들은 증폭을 위해 SV40 원점을 이용하는 CDM8 벡터와, 증폭을 위해 EBV 원점을 이용하는 변형된 인비트로겐 벡터인 pCEP4에서 래트 배 신장으로부터 cDNA 라이브러리를 제조한다. 변형 벡터인 CH269는 EBNA-1 유전자 서열이 제거되어 있다. EBNA-1 단백질은 EBV 원점과 상호작용하지만 EBNA 단백질을 안정하게 발현하는 세포가 사용되는 경우 이 유전자는 벡터상에 필요하지 않다. CDM8 벡터의 라이브러리는 평균 삽입체 크기가 1.18 kb인 1.5×106 클론을 포함하는 반면, CH269 벡터내의 라이브러리는 평균 삽입체 크기가 1.5 kb인 약 1×106 클론을 포함한다.
Ret 리간드 RetL1의 발현 클로닝
A. 래트 Ret 리간드 RetL1의 클로닝
1. Ret 리간드 RetL1의 발현 클로닝의 초기 시도
각종 직접적인 발현 방법을 시도하여 RetL1을 클로닝하였다. 이들 모든 방법은 도 4B에 예시한 구상을 기본으로 한 것이다. cDNA 라이브러리로부터의 cDNA를 포유동물내로 도입한다; RetL1을 수용하는 세포는 Ret 융합 단백질을 사용하여 동정할 수 있다. 후술할 3가지 접근법이 성공하지는 못했지만, 중요한 지식과 경험을 얻었으며, 성공할 수 있는 접근법으로 발전하였다.
a. Ret/IgG를 사용한 패닝(panning)법
패닝법을 사용하여 직접적인 발현 클로닝에 의해 RetL1을 분리하고자 하는 시도에 래트 Ret/IgG 융합 단백질을 사용한다(Aruffo 및 Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:8753-8757 (1987)). CDM8중 18일된 배 래트 신장 cDNA 라이브러리를 패닝에 사용한다. 이 라이브러리로부터의 cDNA 푸울(푸울당 5,000∼10,000 cDNA)을 DEAE-덱스트란법을 사용하여 COS 세포내로 도입한다. 48 시간 후에, EDTA를 사용하여 평판으로부터 세포를 제거하고, 융합 단백질과 함께 항온처리한 후, 항-인간 IgG 항체로 피복한 플레이트상에서 선별한다. 부착 세포로부터 DNA를 회수하고, 이. 콜리(E. Coli)내로 다시 형질전환시킨 후, 제2회 패닝을 위해 분리한다. 제3회 패닝 후에 임의의 세포가 결합하는 것을 관찰할 수 없었고, 이.콜리내로 다시 Hirt DNA를 형질 전환시킨 후에 매우 극소수의 클론을 얻는다. 양성 대조군으로서 항VCAM 모노클로날 항체와의 접합에 사용되는 VCAM cDNA를 1:100의 비율로 희석하여도 여전히 검출되었으며, 이는 푸울 크기가 너무 크다는 것을 의미한다. 제2회 패닝 후에 얻은 일부 클론의 분석 결과는 클론이 재배열 및 결실을 진행한다는 것을 나타낸다.
b. Ret/IgG를 사용한 예비용 FACS법
18일된 배 래트 신장 라이브러리(CDM8 벡터)로부터 얻은 80,000 cDNA 클론을 COS7 세포내로 도입하고, 래트 Ret/IgG 단백질을 사용한 후 형광체로 태그된 2차 항체를 사용하여 예비용 FACS를 수행한다. 형광 세포의 상부 0.5%와 0.9%를 회수하고, 플라스미드 DNA를 Hirt 세포 용해하여 회수한다. DNA를 이.콜리내로 다시 일렉트로포레이션(electoporation)시킨다: 0.5% 푸울에 대해 228 개의 클론을 얻고 0.9% 푸울에 대해 752개의 클론을 얻는다. DNA를 박테리아 클론으로부터 회수하고, 2차 예비용 FACS를 수행한다. 2차 FACS 수행 후에 박테리아 클론으로부터 회수한 플라스미드를 분석하여 거대 결실과 재배치를 포함하는 것을 밝혀냈다.
c. Ret/AP를 이용한 비색 검출법
COS 세포를 18일된 래트 배 신장 cDNA 라이브러리(CDM8 벡터)로부터 얻은 cDNA 클론의 400 푸울(푸울당 1000 클론)로 형질감염시키고, Ret/AP 단백질과 알칼린 포스파타제에 대한 비색 기질을 사용하여 염색한다. 형질감염된 세포를 양성 시그널에 대해 현미경하에서 조사한다. 한 실험에서, 5개의 가능한 양성물을 재분석하였으나, 모두 음성이었다.
Ret/AP 단백질의 대조군으로서, 태반 AP의 N 말단에 인간 VCAM의 처음 2개의 도메인을 융합시켜 VCAM/AP 단백질을 제조한다. (VCAM은 2개의 쇄, 즉 α-4와 β-1로 구성된 인테그린 VLA4에 결합한다). COS 세포의 일시적인 형질감염은 대조군 실험을 위한 충분한 VCAM/AP 단백질을 생산한다. VCAM/AP 단백질을 AP에 직접 커플링시킨 VCAM/IgG 및 AP에 커플링시킨 2차 항체 + VCAM/IgG와 비교하여 α-4 쇄 cDNA로 형질감염시킨 COS 세포(COS 세포는 이미 β-1 쇄를 발현함) 상에서 VLA4를 검출하는 능력을 평가한다. 이 결과는 VCAM/AP 단백질이 형질감염된 세포 상에서 VLA4를 검출할 수 있으나, AP 커플링된 2차 항체와 함께 VCAM/IgG 단백질을 사용하여 가장 우수한 검출 결과를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
d. 방법론적 결론
이들 초기 클로닝 연구로부터 3가지 주요한 결론을 얻었다.
1) 플라스미드 DNA를 후속 라운드에서 회수할 필요가 있는 방법(즉, 패닝 및 예비용 FACS)은, 표적 cDNA가 풍부하지 않은 경우 적절하지 않은 데, 이는 후속 라운드에서 발생하는 재배열과 결실 때문이다. Ret의 저 발현을 기초로, RetL1의 발현도 낮다는 것을 추측하게 되었다. 바람직한 접근법은 푸울에서 형질감염시키고, 양성 푸울을 동정할 수 있는 검출법을 사용하는 것이다. 이어서, 기존 푸울을 분류시킬 수 있으며, 형질감염된 세포로부터 일시적으로 발현된 DNA를 회수할 필요는 없다.
2) 2차 시약에 커플링시킨 경우 Ret/IgG 단백질은 Ret/AP 단백질보다 더 우수한 검출 능력을 나타낸다.
3) VCAM/IgG 대조군 단백질(및 AP 커플링시킨 2차 항체)과 α-4 인테그린 cDNA(CDM8 벡터내로 희석시키고 COS 세포내로 형질감염시킴)를 이용한 대조 실험은 본 발명자들의 검출 능력이 약 1/1000(즉 푸울 크기는 1000 클론을 초과할 수 없다)이라는 것을 나타낸다. 민감도 레벨을 증가시키기 위해, SV40 원점계 벡터(COS 세포에서 발현)로부터 EBV 원점계 벡터(EBNA 양성 세포주)로 변화시킨다. EBV 원점계 벡터는 에피좀으로서 유지하였으며, 증폭 후에 SV40 원점계 벡터와 같이 세포에 대해 독성을 나타내지 않는다. 유전자가 이들 벡터에서 다량 발현될 수 있고, cDNA를 더 희석(즉, 최대 1:80,000)하여도 검출할 수 있다는 명백한 증거가 있다.
2. EBV 원점계 cDNA 라이브러리로부터의 푸울 검색
래트 Ret/IgG 융합 단백질을 이용하여 18일된 래트 배 신장 cDNA 라이브러리(EVB 원점을 가진 CH269 벡터)로부터 얻은 클론의 푸울을 스크리닝한다. 실험에서, 각각의 푸울이 라이브러리 유래의 5000 클론을 함유하는 256개의 푸울을 생성한다. 간단히 요약하면, cDNA 라이브러리의 분액을 적정하고, 5000 세포를 평판배양하고(256 회), 밤새 증식시킨다. 콜로니를 배지내로 넣는다: 일부 배양물을 사용하여 푸울에 대한 글리세롤 스톡을 형성하고(-70℃에서 저장), 일부는 플라스미드 제조에 사용한다. 256 푸울로부터 얻은 DNA는 각각 리포펙션법(lipofection method)을 사용하여 293/EBNA 세포(60 mm 평판상에 8×105)내로 형질감염시킨다. 48 시간 후에, 세포를 HBHA 완충액(0.5 ㎎/㎖ BSA, 0.1% NaN3 20 mM HEPES(pH 7.0))으로 2회 세척하고, 실온에서 60분 내지 90분 동안 트리스 완충 염수와 1mM MgCl2 및 CaCl2중 20 ㎍/㎖ 래트 Ret/IgG와 함께 항온처리한다. 항온처리 후, 세포를 HBHA 완충액으로 4회 세척한 후 30 초 동안 60% 아세톤/3% 포름알데히드/20 mM HEPES(pH 7.0)로 고정시킨다. HBS 완충액(150 mM NaCl, 20 mM HEPES(pH7.0))으로 2회 세척한 후에, AP-커플링된 2차 항체(염소 항-인간 IgG Fc-감마-특이적 F(ab')2)(Jackson Immuno Research Laboratories; 카탈로그 # 109-056-098; 트리스 완충 염수와 1 mM MgCl2 및 CaCl2중 1:5000 희석액)와 함께 실온에서 60분 동안 항온처리한다. 이어서, HBS 완충액으로 세포를 2회 세척한 후, 2X Pierce Immuno PureR 포스파타제 억제제(카탈로그 # 35002)를 함유하는 AP 기질 완충액(100 mM 트리스-HCl(pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)으로 2회 세척한다. 최종 세척은 15분 동안 유지한다. 그 후 AP 기질 NBT(0.33 ㎎/㎖) 및 BCIP(0.17 ㎎/㎖)를 Pierce AP 억제제를 함유하는 AP 기질 완충액에 첨가하고 5 내지 20분 동안 세포와 함께 항온처리한다. 그 후, 평판을 물로 2회 세척한다. 이어서, 평판을 해부 현미경하에서 검사하여 자색으로 염색된 세포의 존재를 확인한다.
256 푸울의 분석으로부터, 17개 양성 푸울을 1차 스크린에서 동정한다. 각 양성 푸울로부터 얻은 DNA를 293/EBNA 세포내로 재형질감염시키고, 일부 추가적인 대조 실험과 함께 상기 과정을 반복하여 관찰된 염색이 Ret/IgG 특이적이라는 것을 확인한다. 17개의 양성 푸울중 10개 만이 Ret/IgG 융합 단백질과의 염색을 나타내었으며, 다른 IgG 융합 단백질과의 염색을 나타내지 않았다.
3. 푸울 #230의 분해
예로서, 전술한 양성 푸울중 하나를 #230이라고 명명하고, 더 작은 서브푸울로 분류하여 Ret/IgG 융합 단백질에 결합을 부여하는 푸울 내에서 cDNA를 동정한다. 푸울 #230용 글리세롤 스톡으로부터 600개의 세포를 평판배양하고(10 회) 밤새 증식시킨다. 이들 평판의 콜로니를 배지에 넣는다: 배양물의 1/10을 사용하여 글리세롤 스톡을 만들고 남은 부분을 DNA 제조에 사용한다. 600개 클론의 10개 서브 푸울을 230-1A에서 230-5A와 230-1B에서 230-5B로 명명한다. 이들 서브푸울의 DNA를 293/EBNA 세포내로 형질감염시키고 Ret/IgG 융합 단백질로 염색하기 위해 전술한 과정을 반복한다. 하나의 서브푸울 #230-5A는 Ret/IgG 단백질과의 염색에 대해 양성이다.
푸울 #230-5A를 더 분류하여 Ret/IgG 융합 단백질에 결합을 부여하는 서브푸울로 cDNA를 동정한다. 푸울 230-5A의 글리세롤 스톡으로부터의 세포를 평판배양하고 밤새 증식시킨다. 콜로니를 취해 7개의 96웰 바이오블록(Bioblocks) (등록 상표)의 웰내로 옮기고 밤새 증식시킨다. 각각의 96웰 바이오블록으로부터 20개 클론의 4개의 푸울과 16개 클론의 1개의 푸울을 만든다. 따라서, 7개의 바이오블록으로부터 230-5A-71 내지 230-5A-105라고 명명한 35개의 푸울이 형성된다. DNA를 이들 각각의 푸울로부터 제조하고 293/EBNA 세포내로 형질감염시키고 전술한 바와 같이 Ret/IgG 융합 단백질을 사용하여 재분석한다. 푸울 #230-5A-86이 양성이다.
푸울 #230-5A-86은, 다시 바이오블록으로 보내고 이 푸울을 제조하기 위해 함께 혼합되는 20개의 클론을 동정함으로써 분류한다. DNA는 모두 20개의 클론으로부터 만들고 각각 293/EBNA 세포내로 형질감염시키고 전술한 바와 같이 Ret/IgG에 대해 재분석한다. 푸울 #230-5A-86-17이 양성인 것으로 밝혀졌다.
4. 클론 #230-5A-86-17의 특성규명
클론 #230-5A-86-17(retL-17 또는 클론 17이라고 불리우며, ATCC 98047로 기탁됨)을 DNA 서열 결정으로 더 분석한다. 이 클론의 삽입체의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1(래트 retL1 cDNA)이며, 뉴클레오티드 서열의 일부는 도 1에 도시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열내에서, 468 아미노산의 단백질(래트 RetL1)을 암호화하는 리딩 프레임이 발견된다. 예상 단백질은 아미노산 24 뒤에서 절단된 것으로 추정되는 시그널 서열을 가진다(Von Heijne 등, Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986)). 소수성 C-말단은 단백질이 포스파티딜이노시톨 글리칸 결합을 통해 세포에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 3개의 예상 N-결합된 글리코실화 위치가 있다. 이들 특성은 Ret의 리간에 대해 기대한 것과 일치한다.
본 발명자들은 소수성 C 말단 전에 유전자를 절두시켜 래트 RetL1 단백질의 가용성 형태를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 이는 리신 435(래트 RetL1) 뒤에서 절두하여 수행할 수 있다. 아미노산의 상류에서의 절두는 래트 RetL1 단백질의 가용성 형태를 발현시킬 수 있다. 가용성 래트 RetL1 단백질은 스스로 발현되거나, 또는 항체에 의해 인식되는 작은 에피토프, 히스티딘 태그 또는 인간 면역글로불린과의 융합체의 일부로서 발현될 수 있다.
B. 인간 Ret 리간드 RetL1의 클로닝
벡터 람다 gt10내의 인간 배 신장 cDNA 라이브러리를 클론테크(카탈로그 #HL5004A)로부터 구입한다. 파지 스톡으로부터 백만 플라크를 형성하는 유니트를 10 NuncTM 평판에 평판배양한다. 복제 플라크 리프트를 쉬라이허 및 슈엘 OptitranTM 필터상에서 만든다.
제한 효소 PvuII로 플라스미드 래트 RetL1을 분해한 후 래트 RetL 뉴클레오티드 서열(래트 retL1 cDNA)의 뉴클레오티드 242-1582에 해당하는 1.34 kb 단편의 아가로스 겔 분리에 의해 프로브를 형성한다. 이 암호 영역 프로브를 랜덤 프라이밍으로 P32 표지한다(Feinberg 및 Vogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267, 1984). 여과물은 55℃에서 10% 덱스트란 설페이트, 100 ㎍/㎖ tRNA 및 래트 프로브 6.7×107 CPM을 함유하는 300 ㎖ 플라크 스크린 PBS 완충액(50 mM 트리스 pH 7.5, 1M NaCl, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 0.2% PVP 및 0.2% 피콜)내에서 밤새 하이브리드화시킨다. 이를 55℃에서 플라크 스크린 완충액으로 2회 세척하고 2XSSC/1%SDS로 2회 세척한 후 감도 강화 스크린을 사용하여 -70℃에서 필름에 노출시킨다.
복제 양성을 마스터 평판에서 SM(100 mM NaCl, 10 mM SO4, 50 mM 트리스 pH 7.5)과 젤라틴내로 빼낸다. 이들 양성물중 24개를 플라크 정제한다. 정제된 후보 플라크로부터 얻은 람다 미니플렙 DNA를 Not1으로 분해하고, 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 서던 블롯한다. 서던 블롯은 래트 RetL1을 암호화하는 영역 프로브와 하이브리드화시킨다. 클론 HRL20은 래트 프로브에 강하게 하이브리드화하는 가장 긴 삽입체(4.4 kb)를 가진다. DNA 서열(부분 인간 retL1 cDNA; 서열 번호 8; 도 2A)과 추론 펩티드 서열(부분 인간 RetL1; 서열 번호 9; 도 2a)을 이 클론으로부터 얻었으며, 인간 동족체임을 확인하였다. 이 클론은 암호 영역의 3' 말단을 비롯하여 대부분의 암호 영역을 암호화한다.
인간 cDNA의 5' 말단을 얻기 위해서, 인간 태아 신장 Marathon-ReadyTM cDNA 키트를 클론테크(카탈로그 #7423-1)로부터 구입한다. 서열 번호 8(부분 인간 retL1 cDNA)의 뉴클레오티드 62-81의 보체에 해당하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 Kid-155와, 서열 번호 8(부분 인간 retL1 cDNA)의 뉴클레오티드 17-43의 보체에 해당하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 Kid-154를 합성한다. MarathonTM cDNA 시약과 올리고뉴클레오티드 Kid-155 또는 Kid-154와 조합된 AdvantageTM cDNA PCR 키트(클론테크 카탈로그 #8417-1)를 사용하여 PCR을 수행한다. 제1 PCR 반응은 다음과 같이 설정한다: 35.5 ㎕ H2O; 5.0 ㎕ 10X Klen Taq 완충액; 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 혼합; 1.0 ㎕ 50X AdvantageTM Klen Taq 폴리머라제 혼합. 이들 시약을 배합 및 혼합한다. 이어서, 5.0 ㎕의 Marathon-ReadyTM 태아 신장 cDNA; 1.0 ㎕ 10μM AP1 프라이머 및 1.5 ㎕ 6.4 μM Kid-155를 첨가한다(최종 부피=50 ㎕). PCR을 다음과 같은 사이클 조건으로 퍼킨-엘머 세투스 DNA 써머 사이클러 480에서 수행한다: 1분 동안 94℃에서 1 사이클; 30 초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 4분 동안 68℃에서 30 사이클. 제1 PCR 반응의 생성물을 사용하여 네스트(nested) PCR을 수행한다. 먼저, 5 ㎕의 PCR 생성물 #1을 TE로 50배 희석한다(최종 부피 250 ㎕). 네스트 PCR 반응물은 35.5 ㎕ H2O; 5.0 ㎕ 10X Klen Taq 완충액; 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 혼합; 1.0 ㎕ 50X AdvantageTM Klen Taq 폴리머라제 혼합을 포함한다. 이들 시약을 전술한 바와 같이 혼합한다. 이어서, 5.0 ㎕의 희석된 PCR 생성물 #1, 1.0 ㎕ 10μM AP2 프라이머 및 1.5 ㎕ 6.9 μM kid-154를 첨가한다. 사이클 조건은 전술한 바와 동일하다. 약 700 bp의 생성물을 1% 저용융 아가로스 겔에서 정제하고 페놀 추출한다. 정제된 DNA를 pZErOTM(인비트로겐 카탈로그 #K2510-01)의 EcoR5 위치내로 클로닝시킨다. 서열 정보는 HRL7G6 및 HRL7G8이라고 불리우는 클론을 비롯하여, 여러개의 분리물로부터 얻는다.
도 2b에 도시된 바와 같이 클론 HRL7G8로부터 얻은 서열은 클론 HRL20(부분 인간 retL1 cDNA)의 서열과 중복되는 것으로 밝혀졌으며, 인간 RetL1(전장 인간 retL1 cDNA)의 전장 서열을 형성하는 데 사용한다. 클론 HRL7G8로부터 얻은 뉴클레오티드 서열은 전장 인간 retL1 cDNA의 뉴클레오티드 1 내지 502를 나타낸다; 클론 HRL20으로부터 얻은 뉴클레오티드 서열은 전장 인간 retL1 cDNA의 뉴클레오티드 460 내지 1682를 나타낸다. 클론 HRL7G8로부터 얻은 서열은, 클론 HRL7G6으로부터 유도된 프로브를 사용하여 전술한 인간 배 신장 람다 gt10 cDNA 라이브러리로부터 분리한 또 다른 cDNA 클론(GJ102)을 서열 결정하여 확인한다. 뉴클레오티드 118 내지 1497은 전장 인간 retL1 cDNA의 단백질 리딩 프레임을 포함한다.
인간 RetL1의 완전한 아미노산 서열은 도 2b에 도시되어 있다. 도 3a에 도시된 BESTFIT 분석에 의해 나타나는 바와 같이, 인간 retL1 cDNA는 래트 retL1 cDNA와 88.2% 동일하다. 펩티드 비교(도 3b)는 인간 추정 펩티드 서열이 래트의 것과 93.3% 동일하며, 97.2% 유사하다는 것을 보여준다.
Ret 리간드 RetL2의 클로닝
A. 인간 RetL2의 클로닝
관련 단백질(즉, 동급체; isologue)을 동정하기 위해서 프로그램 BLAST를 이용한 진뱅크 데이터베이스 조사에 래트 RetL1의 펩티드 서열(래트 RetL1)을 사용한다. BLAST(즉, Basic Local Alignment Search Tool)는 Altschul 등의 방법[J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]을 이용하여 서열 데이터베이스에서 모든 서열과 미지 서열과의 유사성을 찾는다. 미지 서열과 검색할 데이터베이스는 임의로 조합한 펩티드 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 발현된 서열 태그(EST) 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 래트 RetL1 펩티드 서열을 알 수 없는 경우, 2가지 중요한 정합물을 얻는다. 하나는 진뱅크 수탁 번호 R02249인 혼합된 인간 태아 간과 비장 cDNA 라이브러리로부터 얻은 229bp EST이고, 다른 하나는 진뱅크 수탁 번호 H12981인 인간 유아 뇌 cDNA 라이브러리로부터 얻은 521 bp EST이다. 2가지 EST는 중복 영역에서 99% 동일성을 가지며, 이는 동일한 cDNA로부터 유래한다는 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 H12981 EST: KID-228(GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; 서열 번호 12의 뉴클레오티드 38-67과 534-563에 해당)과 안티센스 올리고뉴클레오티드 KID-229(GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; 서열 번호 12의 뉴클레오티드 156-175의 보체와 뉴클레오티드 652-771의 보체에 해당)로부터 형성한다.
클론테크 인간 태아 간 5'-스트레치 플러스 람다 GT10 cDNA 라이브러리(카탈로그 #HL5003a)로부터 얻은 1×106 플라크 형성 유니트를 OPTITRANTM 필터에서 중복 스크리닝한다. 10% 덱스트란 설페이트와 100 ㎍/㎖ tRNA를 함유하는 400 ㎖의 플라크 스크린 완충액(50 mM 트리스 pH 7.5, 1M NaCl, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 0.2% 폴리비닐피롤리딘 및 0.2% 피콜)중에 32P-표지된 올리고뉴클레오티드 KID-228과 KID-229(각 32P-표지된 올리고뉴클레오티드는 80 pmol)와 여과물을 밤새 65℃에서 하이브리드화시킨다. 2×SSC/1% SDS로 2회 세척하고 1×SSC/1%SDS로 2회 세척한 후 필름에 노출시킨다. 11개의 복제 양성물을 정제한다. 각 클론으로부터 얻은 DNA를 제한 효소 분해 후 아가로스 겔 전기영동과 서던 블롯으로 분석한다. 여과물을 KID-228 및 KID-229와 하이브리드화시켜 삽입체가 프로브에 하이브리드화되었는지를 확인한다. 클론 DSW240의 삽입체를 완전히 서열 결정하였으며(인간 retL2 cDNA, 서열 번호 12), 이는 도 7에 도시되어 있다.
뉴클레오티드 25-1416은 464 아미노산의 단백질(인간 RetL2; 서열 번호 13)을 암호화하는 인간 retL2 cDNA의 단백질 리딩 프레임을 포함하며, 이는 도 7에 도시되어 있다. 도 8에 도시한 BESTFIT 분석으로 알 수 있는 바와 같이, 인간 RetL2 단백질은 인간 RetLl 단백질과 49.1% 동일하고 63.7% 유사하다. 이는 시그널 서열을 나타내는 소수성 N-말단과 포스파티딜이노시톨 글리칸 결합 모티프를 나타내는 소수성 C-말단을 인간 RetL1과 공유한다. 또한, 각 단백질에 존재하는 31개중 30개의 시스테인은 보존된다.
B. RetL2가 Ret에 대한 리간드임의 입증
본 발명자들은 클론 DSW240의 삽입체를 포함하는 발현 플라스미드로 293/EBNA 세포를 형질감염시키고 그 세포가 가용성 Ret/IgG 융합 단백질과 결합할 수 있다는 것을 보여주므로써 RetL2가 Ret에 대한 리간드임을 입증한다.
DSW240의 삽입체는 Not1을 사용하여 제거하고 EBV 원점을 포함하고 EBNA 양성 세포주에서 높은 발현을 나타내는 발현 벡터 CH269내로 클로닝시킨다. 제한 분해를 수행하여 정확한 방향을 가지는 클론을 동정한다. 플라스미드 DNA는 정확한 방향을 가지는 클론으로부터 제조한다.
플라스미드 DNA(retL2 발현 플라스미드, 양성 대조군용 retL1 발현 플라스미드 및 음성 대조군용 비관련 단백질을 포함하는 발현 플라스미드)는 리포펙션법을 사용하여 293/EBNA 세포(60 mm 평판상에 8×105)내로 형질감염시킨다. 48 시간 후에, 세포를 HBHA 완충액(0.5 ㎎/㎖ BSA, 0.1% NaN3, 20 mM HEPES(pH 7.0))으로 2회 세척하고 실온에서 60∼90분 동안 트리스 완충 염수 + 1 mM MgCl2 및 CaCl2중에서 20 ㎍/㎖ 래트 Ret/IgG와 함께 항온처리한다. 항온처리 후에, 세포를 HBHA 완충액으로 4회 세척한 후 60% 아세톤/3% 포름알데히드/20 mM HEPES(pH 7.0)로 30초 동안 고정시킨다. HBS 완충액(150 mM NaCl, 20 mM HEPES(pH7.0))으로 2회 세척한 후에, AP-커플링된 2차 항체(염소 항-인간 IgG Fc-감마-특이적 F(ab')2)(Jackson Immuno Research Laboratories; 카탈로그 # 109-056-098; 트리스 완충 염수와 1 mM MgCl2 및 CaCl2중 1:5000 희석액)와 함께 실온에서 60분 동안 항온처리한다. 이어서, HBS 완충액으로 세포를 2회 세척한 후, 2× Pierce Immuno PureR 포스파타제 억제제(카탈로그 #35002)를 함유하는 AP 기질 완충액(100 mM 트리스-HCl(pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)으로 2회 세척한다. 최종 세척은 15분 동안 유지한다. 그 후 AP 기질 NBT(0.33 ㎎/㎖) 및 BCIP(0.17 ㎎/㎖)를 Pierce AP 억제제를 함유하는 AP 기질 완충액에 첨가하고 5 내지 20분 동안 세포와 함께 항온처리한다. 이어서, 평판을 물로 2회 세척한다. 이어서, 평판을 해부 현미경하에서 검사하여 자색으로 염색된 세포의 존재를 확인한다. 자색으로 염색된 세포의 존재는 Ret/융합 단백질이 세포에 결합하고 RetL2 단백질이 Ret에 대한 리간드임을 의미한다. 또한 자색으로 염색된 세포는 retL1 발현 벡터로 형질감염시킨 후에 관찰되나 음성 대조 벡터로 형질감염시킨 후에는 관찰되지 않는다.
Ret 리간드 RetL3의 클로닝
A. 쥐 RetL3
래트 RetL1 아미노산 서열을 이용한 EST 데이터베이스 조사는 Ret 리간드에 대해 동일성을 가지는 2개의 쥐 EST를 밝혀낸다. 이들 EST는 AA049894와 AA050083(이는 부분적인 쥐 retL3 cDNA, 서열 번호 14)이다. 이들 EST를 암호화하는 플라스미드는 게놈 시스템즈 인코포레이티드(카탈로그 #475791과 #475497)로부터 박테리아 천자배양물(stabs)로서 얻었다. 플라스미드 DNA는 LB Amp 평판상에 천자배양물을 도말하여 얻은 단일 콜로니로부터 제조한다. 이들 플라스미드 유래의 삽입체를 전체적으로 서열 결정한다. 2개의 서열을 비교하여 1.4 kb 삽입체를 가지는 AA049894가 1.9 kb 삽입체를 가지는 AA050083내에 포함되어 있다는 것이 입증된다. AA050083으로부터 얻은 DNA 서열의 번역은 NT205로부터 NT1242(부분적인 쥐 RetL3; 서열 번호 15)의 연속 오픈 리딩 프레임이 있다는 것을 나타낸다. 이 ORF는 래트 retL1의 것과 37.5% 동일성을 나타내며 래트 retL2의 것과는 40.2%의 동일성을 나타낸다. 그러나, 오픈 리딩 프레임은 5' 말단의 Met 또는 시그널 서열을 암호하지 않는다. 이 영역의 5' ORF 상류를 검사하고 번역 개시를 위한 코자크 공통(Kazak consensus) 서열에서의 Met와 표면 발현/분비를 위한 유효 시그널 서열을 발견하였다. 이 ORF는 하류 OFR를 갖는 틀 외부에 있으며, 이는 EST AA050083이 유효 돌연변이, 예컨대 삽입, 결실, 인트론 또는 클로닝 인공물을 5' 말단에 포함한다는 것을 의미한다.
정확한 5' 말단을 얻기 위해서, 마라톤 RACE를 사용한다. 마우스 11일된 배 Marathon-ReadyTM cDNA(카탈로그 #7458-1)과 AdvantageTM 키트(카탈로그 8417-1)를 클론테크로부터 구입한다. 서열 번호 14의 뉴클레오티드 847-866의 보체에 해당하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 Kid-366과, 서열 번호 14의 뉴클레오티드 589-615의 보체에 해당하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 Kid-365를 합성한다. MarathonTM cDNA 시약 및 올리고뉴클레오티드 Kid-366과 함께 조합된 AdvantageTM cDNA PCR 키트(클론테크 카탈로그 #8417-1)를 사용하여 PCR을 수행한다. 제1 PCR 반응은 다음과 같이 설정한다: 35.3 ㎕ H2O; 5.0 ㎕ 10X Klen Taq 완충액; 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 혼합; 1.0 ㎕ 50X AdvantageTM Klen Taq 폴리머라제 혼합. 이들 시약을 함께 배합 및 혼합한다. 이어서, 5.0 ㎕의 Marathon-ReadyTM 마우스 11일된 배 cDNA; 1.0 ㎕ 10μM AP1 프라이머 및 1.7 ㎕ 5.88 μM Kid-366을 첨가한다(최종 부피=50 ㎕). PCR을 다음과 같은 사이클 조건으로 퍼킨-엘머 세투스 DNA 써머 사이클러 480에서 수행한다: 1분 동안 94℃에서 1 사이클; 30초 동안 94℃, 4분 동안 72℃에서 5 사이클; 30초 동안 94℃, 4분 동안 70℃에서 5 사이클; 30초 동안 94℃, 4분 동안 68℃에서 25 사이클. 제1 PCR 반응의 생성물을 사용하여 네스트(nested) PCR을 수행한다. 먼저, 5 ㎕의 PCR 생성물 #1을 TE로 50배 희석한다(최종 부피 250 ㎕). 네스트 PCR 반응물은 35.5 ㎕ H2O; 5.0 ㎕ 10X Klen Taq 완충액; 1.0 ㎕ 10 mM dNTP 혼합; 1.0 ㎕ 50X AdvantageTM Klen Taq 폴리머라제 혼합을 포함한다. 이들 시약을 전술한 바와 같이 혼합한다. 이 후 5.0 ㎕ 희석된 PCR 생성물 #1; 1.0 ㎕ 10μM AP2 프라이머 및 3.6 ㎕ 2.8μM Kid-365를 첨가한다. 사이클 조건은 전술한 바와 동일하다. 약 665 bp의 생성물을 1% 저용융 아가로스 겔에서 정제하고 QiaexII(퀴아겐 카탈로그 #20021) 추출한다. PRIME PCR CLONERTM 클로닝 시스템(5 프라임 → 3 프라임 카탈로그 # 1-725029)을 사용하여 정제된 DNA를 pNoTA/T7TM내로 클로닝시킨다. 서열 정보는 DSW252 및 DSW253이라고 불리우는 클론을 비롯하여, 여러개의 분리물로부터 얻는다.
DSW252의 서열은 추가의 T가 서열 번호 14 서열의 NT252 및 NT253사이에 존재하는 것 외에는 서열 번호 14와 중복되는 것으로 확인된다. 또한 이 T는 다른 분리물 DSW251 및 DSW253에 존재한다. 추가의 염기를 삽입시켜 ORF를 보정하여 397개 아미노산을 암호화하는 단일 1191 bp ORF(제1 Met로부터 계수)를 얻는다. 이 ORF는 특징적인(canonical) 번역 개시 공통 서열(코자크)하에서 Met를 암호하고 표면 발현/분비에 대한 시그널 서열을 포함한다.
발현할 수 있는 전장 쥐 클론을 얻기 위해서, DSW252의 630 bp Not1-BamH1 단편과 AA050083의 1308 bp BamH1-Not1 단편을 정제하고 Not1 분해 발현 벡터 CH269에 결찰시킨다. 이 결찰물을 이 콜리 XL1-블루(스트라트젠 카탈로그 #200236)내로 형질전환시킨다. 퀴아웰 울트라 미니프렙을 생성 형질전환체에서 수행한다. 이들을 제한 분해와 겔 전기영동으로 정확한 방향과 크기에 대해 분석한다. 이 작제물을 DSW254로 명명한다. DSW254의 삽입체를 전체 서열 결정하고(쥐 retL3; 서열 번호 16), ORF는 397개 아미노산의 단백질(쥐 RetL3; 서열 번호 17)을 암호화하는 것으로 확인된다. 서열은 도 9에 도시되어 있다. RetL3의 C 말단은 소수성이고 이는 포스파티딜이노시톨 글리칸 결합 모티프를 나타낸다.
B. 인간 RetL3
인간 RetL3을 클론하기 위한 후보 조직을 찾기 위해서, 마우스 조직의 노던 블롯을 이용하여 쥐 RetL3의 발현 패턴을 결정한다. 조사한 조직 중, RetL3의 발현은 심장 조직에서 가장 높았다. 벡터 람다 gt10중 인간 성인 심장 cDNA 라이브러리는 클론테크(카탈로그 #HL3026a)로부터 구입한다. 파지 스톡으로부터 얻은 100만 플라크 형성 유니트를 10 Nunc 평판에서 평판배양한다. 복제 플라크 리프트는 쉬라이허 및 슈엘 OptitranTM 필터상에서 만든다.
AA050083 서열의 뉴클레오티드 397-420에 해당하는 프라이머 Kid-366 및 Kid-367로 PCR을 수행하여 프로브를 형성한다. PCR 반응은 다음과 같이 설정한다; 10 ㎕ 10X PFU 완충액, 2.0 ㎕ 10mM dNTP 혼합, 72.1 ㎕ H2O, 3.1 ㎕ 13.2 μM Kid-367, 6.8 ㎕ 5.88 μM Kid-366, 5.0 ㎕ 0.1 ㎍/㎕ AA050083 DNA 및 2.0 ㎕ 2.5 유니트/㎕ PFU(스테이트젠 카탈로그 #600154)를 혼합한다. PCR을 다음과 같은 사이클 조건으로 퍼킨-엘머 세투스 DNA 써머 사이클러 480에서 수행한다: 1분 동안 94℃, 1분 동안 53℃, 4분 동안 72℃에서 25 사이클. 생성물은 50:49:1의 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올로 추출한 후 저용융 아가로스 겔 전기영동과 절제한 단편의 QiaexII 정제를 수행하여 정제한다. 이 암호 영역 프로브는 랜덤 프라이밍으로 P32 표지한다(Feinberg 및 Vogelstein). 필터를, 65℃에서 10% 덱스트란 설페이트, 100 ㎍/㎖ tRNA 및 마우스 프로브 1.8×108 CPM을 함유하는 200 ㎖ 플라크 스크린 PBS 완충액내에서 밤새 하이브리드화시킨다. 이를 65℃에서 플라크 스크린 완충액으로 2회 세척하고, 2XSSC/1%SDS로 2회 세척하고, 1XSSC/1%SDS로 2회 세척한 후 감도 강화 스크린을 사용하여 -70℃에서 필름에 노출시킨다. 복제 양성물을 플라크 정제한다. 정제된 후보 플라크로부터 얻은 람다 미니플렙 DNA를 EcoR1으로 분해하고, 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 서던 블롯한다. 서던 블롯은 마우스 프로브와 하이브리드화시킨다. 1.3 kb의 삽입체를 가지는 클론 GJ128은 마우스 암호 영역 프로브에 강하게 하이브리드화한다. DNA 서열(부분 인간 retL3 cDNA; 서열 번호 18)과 추론 펩티드 서열(부분 인간 RetL3; 서열 번호 19)을 이 클론으로부터 얻었으며, 인간 동족체임을 확인하였다. 이 클론은 암호 영역의 3' 말단을 비롯하여 대부분의 암호 영역을 암호화한다.
5' 말단을 가진 클론을 얻기 위해서 GJ128로부터 얻은 1.3 kb 삽입체를 정제하고 P32로 표지하고, 클론테크 인간 성인 심장 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용한다. 이 라이브러리 유래의 2×106 플라크의 스크린에서는 5' 말단을 함유하는 클론이 없다. 제조자가 공급한 프로토콜을 사용하여 동일한 프로브와 하이브리드화시킨 인간 성인 조직 mRNA 블롯(클론테크 카탈로그 #7760-1, 7759-1 및 7767-1)의 노던 분석은 인간 RetL3이 인간 성인 척수, 위, 심장, 췌장, 소장, 결장, 전립선 및 고환에서 발현한다는 것을 보여준다. 클론테크 인간 성인 척수 cDNA 라이브러리(카탈로그 #5001a)를 GJ128 삽입체를 사용하여 스크리닝한다. 3개의 독립적인 클론을 정제하고 가장 긴 GJ135를 서열결정한다. GJ135의 삽입체 서열은 GJ128의 삽입체와 중복되며, 이로 인해 전장 인간 retL3 cDNA(서열 번호 20)의 복합 서열의 형성과 전장 인간 RetL3(서열 번호 21)의 결정이 가능해진다. 이들 서열은 도 10에 도시되어 있다. 인간 RetL3은 각각 인간 RetL1 및 인간 RetL2에 대해 34.3%와 34.9% 동일하다. 인간 RetL3은 쥐 RetL3에 대해 76.8% 동일하다.
본 발명의 화합물의 치료 용도
Ret 시그널링 경로의 활성화 또는 차단, 세포가 손실되거나 손상된 질병 상태에서 신장 및/또는 신경 세포 증식이나 생존의 자극, 또는 Ret나 RetL을 발현하는 종양 세포와 같은 바람직하지 않은 세포의 증식 억제 또는 그러한 세포의 사멸이 바람직한 경우 천연 및 변형 RetL, 항-RetL 항체, 항-Ret 항체, 및 Ret와 RetL의 융합 단백질은, 치료적 유용성을 가질 수 있다.
일반적으로, Ret의 이량체화 및/또는 자가인산화를 유도하는, Ret에 결합하는 본 발명의 화합물은 Ret 발현 조직의 증식을 촉진하거나 또는 손상을 제한하는 데 유용하다. 본 발명의 화합물은 신장 조직의 증식 및/또는 생존 자극, 신장 기능 지지 및 각종 손상 후에 신장 조직에 대한 손상을 최소화하는 데 유용하다. 본 발명의 화합물을 이용한 치료가 유용할 수 있는 특정 병태는 급성 신부전, 급성 신염, 만성 신부전, 신증 증후군, 세뇨관 결손, 신장 이식, 독성 손상, 저산소 손상 및 외상을 포함한다. 세뇨관 결손에는 유전성 또는 후천성 질환이 있으며, 그 예로는 다낭성 신장 질환, 수질 낭종성 질환 및 수질 해면 신장을 포함한다. 이 예에만 한정되는 것은 아니며, 기타 많은 신질환을 포함할 수 있다(예, Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th ed., 1994, 본원에 참고인용됨).
기타 용도로서, 본 발명의 유전자 및 단백질은 신경의 증식과 재생이 필요한 병태를 치료하는데 이용할 수 있다. 그 예로는 예컨대 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 투렛병, 근위축성 외측 경화증과 같은 신경변성 질환, 뿐만 아니라 운동 뉴런 질환, 다발성 경화증과 같은 탈수질 질환, 수막염, 농양 또는 축농증과 같은 세균성 질환, HIV 관련 척수증과 같은 바이러스 질환, 크루쯔펠트 자콥 질환과 같은 프리온 질환을 비롯한 임의의 병태를 포함한다. 또한, 그 원인 인자가 종양 침범, 외상, 또는 출혈이나 색전과 같은 뇌혈관 사건에 의한 것인지에 관계없이 신경 조직에 대한 손상 질환을 포함한다. 구체적으로, 자율신경계에 영향을 미치는 질환인, 외상성, 염증성, 선천적 또는 혈관계 병인과 관련된 질환을 비롯하여 두개 신경 질환 또는 척수 질환을 포함한다. 또한, 정신 지체, 자폐증, 태아 알콜 증후군, 다운 증후군 및 뇌성 마비와 같은 발생 신경 질환도 포함한다. 본 발명의 화합물은 말초신경계와 관련된 증후군을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 질환으로는 전술한 병인들에 의해 일어나는 질환을 포함하며, 구체적으로 라임병, HIV 관련 신경병, 다발성근염, 근영양장애 및 중증근무력증을 예로 들 수 있다.
래트 RetL, 부분 인간 RetL1, 전장 인간 RetL1, 인간 RetL2, 쥐 RetL3 또는 인간 RetL3의 단백질이나 이 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 본 발명에 기재된 항-RetL 항체 및 Ret 융합 단백질은 여러 가지 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 Ret 수용체 시그널링을 억제하거나 차단하는 데, 예컨대 성장시 Ret 시그널링의 활성화에 의존적인 종양 성장을 차단하는데 치료적으로 사용할 수 있다. 이와 같은 제제는 X선 투시검사 또는 방사선촬영용 불투명 물질과 같은 검측용 마커에 융합시켜, 검체에 투여하므로써 RetL을 발현하는 조직을 영상화할 수 있다. 또한, 이 제제는 조직 단편 상에서 RetL 양성 세포 영역을 가시화하기 위하여 면역조직화학 염색제로서 사용할 수 있는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 물질에 결합시켜 사용할 수도 있다. 이 방법에는 특정 항체를 단독으로 사용할 수 있는데, 이 항체가 결합하는 부위는 검측용 마커에 결합된 항면역글로불린 항체를 사용하여 샌드위치 분석법으로 가시화할 수 있다. 임의의 RetL에 대한 특정 항체 역시 이 항체에 대해 특이성을 나타내는 물질을 정량하기 위한 면역분석에 유용하다. RetL에 특이적인 항체는 비드 또는 접시와 같은 고체 지지체에 결합시켜, 용액 중에서 리간드를 제거하는 데 사용하여 용액으로부터 단백질을 정제하거나 또는 용액으로부터 단백질을 제거하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 기법들은 모두 면역학 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 일반적인 방법이다.
본 발명의 기타 다른 방법으로는 항Ret 모노클로널 항체와 Ret를 접촉시켜 Ret-RetL 시그널링을 조절하는 것을 포함한다. 이러한 mAb-Ret 접촉은 Ret와 각각의 특정 mAb의 상호작용 특성에 따라 Ret 시그널링 경로의 활성화를 차단하거나 자극하는 효과를 나타낼 수 있다. 특정 mAb는 작동물질로서 Ret와 상호작용하는 데, 이와 같은 작동물질 mAb-Ret의 결합은 Ret의 이량체화 및 자가인산화를 촉발한다. 기타 다른 mAb는 Ret 길항물질로서 작용한다. Ret가 길항물질인 mAb와 상호작용하면 Ret 시그널링 활성화가 Ret 시그널링 경로를 통상적으로 활성화시키는 기타 다른 RetL이나 RetL을 함유하는 복합체에 의해 차단된다.
Ret 또는 Ret 융합 단백질에 대한 RetL 및/또는 항체는 Ret를 발현하는 조직을 영상화하는데 사용하거나 RetL에 대한 항체에 대하여 전술한 면역조직학 또는 정제 방법에 사용할 수 있다.
RetL 및/또는 항Ret 항체를 함유하는 융합 단백질을 사용하여 Ret를 발현하는 암 및 종양에 대한 의학적 치료제를 특이적으로 표적화할 수 있다. 이러한 종양에는 Ret 중의 돌연변이와 관련된 여러 가지 다른 종양 표현형을 포함한다(N.Engl.J.Med. 335:943-951, 1996; Nature 367: 319-320, 1996; Trends Gen. 12: 138-144, 1996). RetL을 발현하는 종양에 대한 치료적 개입은 Ret 및/또는 항RetL 항체를 함유하는 융합 단백질을 이용한다. 항Ret 항체 또는 항RetL 항체는 그 자체가 Fc 도메인에 의해 매개되는 항체 의존적 세포용해 및 보체 의존적 세포용해를 통해 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 하이브리드 리간드 및 항체를 종양억제 약물, 독소 및 이트륨 90과 같은 세포파괴성 방사핵종의 전달 매개체로서 사용하면 더욱 효과적인 암 치료제를 얻을 수 있다. 세포독성 작동인자 세포는, 종양에 의해 발현되는 Ret 또는 RetL에 대해 특이적인 항체를 NK 세포 또는 CTL과 같은 세포독성 작동인자 세포 상의 표면 단백질에 대하여 유도된 항체에 공유 결합시킨 이종접합 항체를 사용하여 종양 세포를 표적화할 수 있다.
항Ret 항체 또는 RetL 치료법의 일례는 리신(ricin)의 독성 A 쇄 또는 리신의 변형된 전장 형태(더이상 세포에 결합할 수 없음)를 RetL 또는 악성종양 세포의 표면 상에서 발현되는 Ret 폴리펩티드에 대하여 유도된 항체에 접합시키는 것이다. 또 다른 양태로서, 독소를 Ret 또는 항RetL 항체에 결합시켜 RetL 양성 세포, 예컨대 RetL을 발현하는 종양을 선택적으로 표적화하여 치사시킬 수 있다. 이러한 방법은 대부분의 종양 세포 상에서 발현되는 CD19 항원에 대한 모노클로날 항체에 접합시킨 차단된 리신을 사용하면 성공적인 것으로 입증되었다(Grossbard 등, Blood 79:576, 1992). 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 기타 다른 독소들도 모두 똑같이 유용하다. 그 예로는 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소 및 사포린을 포함하나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이 방법은, 공지의 항CD19 항원의 경우와 달리, RetL 또는 항Ret 항체를 사용하면 더욱 성공적인 것으로 관찰되는데, 그 이유는 Ret가 매우 제한된 수의 조직에서 발현되기 때문이다.
리신이나 기타 다른 독소의 융합체를 이용한 전술한 방법은 RetL 또는 항Ret 항체의 독소 접합체에도 동등하게 사용할 수 있다. 즉 Ret를 발현하는 종양 세포와 같은 Ret 양성 세포를 선택적으로 표적화하여 사멸시키는데 유용하다.
이러한 의학적 치료의 또 다른 방법으로는 방사능동위원소 표지된 RetL 또는 항Ret 항체를 이용하는 것이다. 이러한 방사능표지된 화합물은 정상 조직에는 영향을 미치지 않으면서 Ret를 발현하는 세포 중에 존재하는 종양 부위에 대해서만 방사능을 우선적으로 표적화한다. 이용된 방사능 동위원소에 따라서, 종양 세포에 결합된 방사능표지 항체로부터 방출된 방사능이 Ret를 발현하지 않는 악성 종양 세포 부근의 세포를 사멸시킬 수도 있다. 다양한 방사핵종을 사용할 수 있다. α 입자를 방출하는 동위원소(예컨대, 131I)는 B 세포 림프종 상에 존재하는 CD20에 대한 모노클로날 항체를 이용할 때 성공적이다[Kaminski 등, N.Engl.J.Med. 329:459(1993); Press 등, N.Engl.J.Med. 329:1219(1993)]. α 입자를 방출하는 방사핵종은 여러 세포 직경에 해당하는 거리에 대하여 종양파괴성인 방사능 방출물을 발생하여 항원 음성 세포를 근절시키고 종양 중에 항체 또는 리간드의 비균질성 침착의 결과를 감소시킨다.
α 입자를 방출하는 방사핵종도 이용할 수 있다. 방사핵종 표지된 RetL 또는 항Ret 항체에 의해 발생되는 저 선량의 방사선은 종래의 방사선 치료법에서 즉각적으로 외부에서 전달되는 방사선보다 치료 측면에서 더 효과적이다. 저 선량의 방사선은 특정 세포주에서 고사(계획적인 세포 사멸)를 유도할 수 있다[Macklis 등, Radiat.Res. 130:220(1992); Maklis 등, Radiopharm. 5:339(1992)].
본 발명의 화합물은 치료적 유효량, 즉 의학적으로 목적하는 결과를 나타내거나 또는 치료할 특정 질환에 영향을 미치는 화합물의 양으로 투여한다.
본 명세서에 기재된 "검체"라는 용어는 Ret 리간드 또는 유전자가 투여되는 임의의 포유동물을 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 치료하고자 하는 특정 검체는 인간, 비인간 영장류, 양, 말, 소, 염소, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 래트와 마우스 뿐만 아니라 이 숙주들에서 유래하거나 발생하는 기관, 종양 및 세포를 포함한다.
유전자 치료법에 사용되는 본 발명의 화합물의 용도
본 발명의 RetL 유전자는 손상 조직에 도입시키면 형질감염된 세포에 의해 RetL 생성을 자극하고, Ret를 발현하는 세포의 증식 및/또는 생존을 촉진할 수 있다.
유전자 치료법의 구체적인 양태로서, RetL 유전자를 선택한 신장 또는 신경 표적 조직 중으로 도입시킬 수 있다. 그 다음 RetL을 안정하게 발현시켜 Ret 수용체 양성 세포의 성장, 분열, 분화 및/또는 세포 생존 증강을 자극할 수 있다. 또한, RetL 유전자는 바이러스계 또는 비-바이러스계 절차를 이용하는 공지의 각종 방법을 사용하여 표적 세포 중으로 도입시킬 수 있다.
비-바이러스 방법으로는 일렉트로포레이션, 리포좀과의 막 융합법, DNA 피복된 미량사출물을 이용한 고속 충격법, 인산칼슘 DNA 침전물과의 항온처리법, DEAE 덱스트란 매개의 형질감염법 및 단세포로의 직접적인 미량주입법을 포함한다. 예컨대, RetL 유전자는, 인산칼슘 동시침전법[Pillicer 등, Science, 209: 1414-1422(1980)]; 기계적 미량주입법 및/또는 입자 가속화법[Anderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5399-5403(1980)]; 리포좀계 DNA 전달법[예, LIPOFECTIN 매개의 형질감염법 - Fefgner 등, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84: 471-477, 1987; Gao and Huang, Biochim.Biophys.Res.Comm., 179: 280-285, 1991]; DEAE 덱스트란 매개의 형질감염법; 일렉트로포레이션[미국 특허 4,956,288]; 또는 DNA를 접합시켜 간세포로 DNA를 우선적으로 전달하는 폴리리신계 방법[Wolff et al., Science, 247: 465-468, 1990; Curiel 등, Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992]으로 세포에 도입할 수 있다.
본 발명의 유전자를 사용하여 직접적인 유전자 전달법으로 표적 세포를 형질감염시킬 수 있다. 예컨대, Wolff 등, "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247: 1465-1468, 1990 참조. 대부분의 경우에는 벡터 매개의 형질감염이 바람직하다. 벡터 중으로 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 당해 기술 분야에 공지된 모든 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 본원에 참고 인용된 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, J.Wiley & Sons, NY(1992) 참조. 프로모터 활성화는 대사 산물이나 투여된 물질에 의해 유도되거나 조직 특이적일 수 있다. 이러한 프로모터/인헨서의 예로는 천연 RetL 프로모터, 시토메갈로바이러스 직초기형 프로모터/인헨서[Karasuyama 등, J.Exp.Med., 169: 13(1989)]; 인간 베타 액틴 프로모터[Gunning 등, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 84: 4831(1987)]; 마우스 유방암 바이러스 장말단 반복서열(MMTV LTR) 중에 존재하는 글루코코르티코이드 유도성 프로모터[Klessig 등, Mol.Cell.Biol., 4: 1354(1984)]; 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스의 장 말단 반복 서열(MuLV LTR)[Weiss 등, RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1985)]; SV40 초기 영역 프로모터[Bernoist and Chambon, Nature, 290:304(1981)]; 라우스 육종 바이러스(RSV)의 프로모터[Yamamoto 등, Cell, 22:787(1980)]; 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 티미딘 키나제 프로모터[Wagner 등, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 78: 1441(1981)]; 아데노바이러스 프로모터[Yamada 등, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 82: 3567(1985)]를 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다.
또한, RetL 유전자는 현재 잘 알려진 유전자 전달계에 사용하기 위한 특정 바이러스 벡터를 통해 도입될 수 있다. 그 예는 다음과 같은 문헌에 개시되어 있으며, 본원에서 참고로 인용한 것이다. Madzak 등, J.Gen.Virol., 73: 1533-1536, 1992(파포바바이러스 SV40); Berkner 등, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:39-61, 1992(아데노바이러스); Hofmann 등, Proc.Natl.Acad.Sci. 92:10099-10103, 1995(바큘로바이러스); Moss et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158: 25-38, 1992(종두 바이러스); Muzyczka, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158: 97-123, 1992(아데노 관련 바이러스); Margulskee, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158: 67-93, 1992[헤르페스 단순 바이러스(HSV) 및 엡스타인 바르 바이러스(HBV); Miller, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 158: 1-24, 1992(레트로바이러스); Brandyopadhyay 등, Mol.Cell.Biol., 4: 749-754, 1984(레트로바이러스); Miller 등, Nature, 357:455-450, 1992(레트로바이러스); Anderson, Science, 256:808-813, 1992(레트로바이러스), Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14(Ausubel 등, Eds.), Greene Publishing Associates, 1989.
바람직한 벡터는 아데노바이러스(바람직하게는 Ad-2 또는 Ad-5계 벡터), 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스(바람직하게는 헤르페스 단순 바이러스계 벡터) 및 파르보바이러스(바람직하게는 "결손" 또는 비자율성 파르보바이러스계 벡터, 보다 바람직하게는 아데노-관련 바이러스계 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2계 벡터)를 포함하는 DNA 바이러스이다. 예컨대, Ali 등, Gene Therapy 1: 367-384, 1994; 미국 특허 제4,797,368호 및 제5,399,346호와, 이하에 논의된 내용을 참조.
예컨대, RetL 서열을 전달하기 위한 특정 벡터계는 여러 가지 인자에 따라 선택한다. 그 중에서 중요한 1가지 인자는 표적 세포군의 특성이다. 레트로바이러스 벡터가 심도있게 연구되어 있고 많은 유전자 치료 용도에 사용되고 있지만, 이 벡터는 일반적으로 분열하지 않는 세포를 감염시키는 데에는 적합하지 않으나 복제 세포 중에서 자신의 유전자를 단지 통합시켜 발현하기 때문에 암치료법에는 유용하다. 이 벡터는 생체외 방법에도 유용하고, 표적 세포 게놈 중으로 안정하게 통합된다는 점에서 관심의 대상이 된다.
아데노바이러스는 각종 세포 유형으로 치료용 또는 리포터 이식유전자(transgene)를 효과적으로 전달할 수 있도록 변형될 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 인간의 호흡 질환을 일으키는 일반적인 아데노바이러스 2형과 5형(각각 Ad2와 Ad5)은 현재 뒤시엔 근위축증(DMD) 및 낭포성 섬유증(CF)을 유전자 치료하기 위해 개발되고 있다. Ad2와 Ad5는 인간 악성종양과 관련이 없는 아데노바이러스의 아과에 속한다. 아데노바이러스 벡터는 유사 분열 단계에 관계없이 사실상 모든 세포 유형에 이식유전자를 상당히 높은 레벨로 전달할 수 있다. 재조합 바이러스의 높은 역가(1013 플라크 형성 유니트/㎖)는 293 세포(아데노바이러스 형질전환된 상보성 인간 배 신장 세포주: ATCC CRL 1573) 중에서 쉽게 얻어질 수 있으며, 상당한 손실량 없이 장기간 동안 저온보관될 수 있다. 유전자 불균형을 보완하기 위한 치료적 이식유전자의 생체내 전달 반응에 있어서 이 시스템의 효능은 각종 질환의 동물 모델에서 입증되었다. Y.Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268(1986); K.Tanzawa 등, FEBS Letters, 118(1): 81-84(1980); J.L.Golasten 등, New Engl.J.Med., 309(11983):288-296(1983); S. Ishibashi 등 J.Clin.Invest., 92: 883-893(1993); 및 S.Ishibashi 등, J.Clin.Invest., 93: 1889-1893(1994) 참조. 이들은 모두 본원에 참고인용된다. 실제로, 낭종성 섬유증 경막 조절인자(CFTR)에 대해 재조합 복제 결손 아데노바이러스를 암호화하는 cDNA는 2 이상의 인간 CF 임상적 시도에서의 사용이 허가되어 왔다. J. Wilson, Nature, 369: 691-692(Oct., 21, 1993). 또한, 유전자 치료용 재조합 아데노바이러스의 안전성은 인간에 대하여 아데노바이러스 생백신을 사용한 경험으로부터 뒷받침된다.
인간 아데노바이러스는 길이가 각각 360 bp인 100 지도 단위(m.u.)로 나뉘는 약 36 kb의 선형 2본쇄 DNA 게놈으로 구성된다. 이 DNA는 게놈의 각 말단에 바이러스 DNA 복제에 필요한 짧은 역 말단 반복서열(ITR)을 포함한다. 이 유전자 생성물은 바이러스 DNA 합성의 개시 이전 또는 이후의 발현에 근거하여 초기형(E1 내지 E4) 및 후기형(L1 내지 L5) 영역으로 나뉜다. 예컨대, Horwitz, Virology, 2d edit., ed. B.N.Fields, Raven Press Ltd., New York(1990) 참조.
DMD 및 기타 다른 유전 질환의 유전자 치료법으로 개발된 1세대 재조합 복제 결손 아데노바이러스는 E1a의 전영역과 E1b의 일부 영역의 결손을 갖고 있다. 이 복제 결손형 바이러스는 트랜스작용성 E1a 단백질을 제공하는 작용성 아데노바이러스 E1a 유전자를 함유하는 293 세포 중에서 증식한다. E1 결실 바이러스는 트랜스 방식으로 E1a 및 E1b 영역의 유전자 생성물을 제공하는 293 세포 중에서 감염 바이러스를 복제 및 생성할 수 있다. 얻어지는 바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고 도입 유전자를 발현할 수 있지만(자신의 프로모터를 보유하는 경우), 세포가 매우 높은 감염 다중도로 감염되지 않는 경우에는 E1 영역 DNA를 보유하지 않는 세포 중에서는 복제할 수 없다. 아데노바이러스는 숙주 범위가 넓고, 뉴런과 같은 휴지기 세포 또는 말단 분화 세포를 감염시킬 수 있으며, 실질적으로 비종양원성으로 관찰되는 장점을 갖고 있다. 아데노바이러스는 숙주 게놈 중으로 통합되는 것으로 관찰되지 않는다. 이 바이러스는 염색체외적으로 존재하기 때문에 삽입 돌연변이유발의 위험성이 크게 감소한다. Ali 등, 상기 문헌 참조, p.373. 재조합 아데노바이러스(rAdV)는 역가가 매우 높고, 바이러스 입자의 안정성은 중간 정도이며, 발현률은 높고 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. 이들의 천연 숙주 세포는 기도 상피 세포이며, 따라서 폐암 치료에 유용하다.
바큘로바이러스 매개 전달은 여러 가지 장점을 갖고 있다. 바큘로바이러스 유전자 전달은 복제 세포 및 비복제 세포 중에서 일어날 수 있으며, 신장 세포, 간세포, 신경 세포, 비장, 피부 및 근육에서도 일어날 수 있다. 바큘로바이러스는 비복제성이므로 포유동물 세포에 대하여 비병원성이다. 인간에게는 감염을 차단할 수 있는 재조합 바큘로바이러스에 대한 예형된 항체가 없다. 또한, 바큘로바이러스는 매우 큰 DNA 삽입체도 병입하여 형질도입시킬 수 있다.
또한, 아데노 관련 바이러스(AAV)는 체세포 유전자 치료의 벡터로서 이용되었다. AAV는 유전자 조작의 이상적인 기질로 만드는 단순한 게놈 구성(4.7 kb)을 가진 작은 1본쇄(ss) DNA 바이러스이다. 2개의 오픈 리딩 프레임은 일련의 rep 및 cap 폴리펩티드를 암호화한다. rep 폴리펩티드(rep78, rep68, rep62 및 rep40)는 AAV 게놈의 복제, 구제 및 통합과 관련이 있다. cap 단백질(VP1, VP2 및 VP3)은 비리온 캡시드를 형성한다. rep 및 cap 오픈 리딩 프레임은 145 bp의 역위 말단 반복서열(ITR)의 5' 말단과 3' 말단에 인접하고 있는데, 이 반복 서열 중 처음 125 bp는 Y형과 T형의 2본쇄 구조를 형성할 수 있다. AAV 벡터의 개발에 있어서 중요한 것은 전체 rep 및 cap 도메인을 잘라내고 치료용 또는 리포터 이식유전자로 치환할 수 있다는 점이다. B.J.Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P.Tijsser, CRC Press, pp. 155-168(1990) 참고. ITR은 AAV 게놈의 복제, 구제, 팩키징 및 통합에 필요한 최소 서열인 것으로 밝혀졌다.
AAV 생활환은 잠복기와 용균기로 구성된 2 단계형이다. 잠복 감염 동안에 AAV 비리온은 캡실화된 ssDNA로서 세포로 유입되고, 그 후 즉시 핵으로 전달되어 명백한 숙주 세포의 분열없이도 AAV DNA가 숙주 염색체 중으로 안정하게 통합된다. 헬퍼 바이러스의 부재하에, 통합된 AAV 게놈은 잠복상태를 유지하지만 활성화되어 구제될 수 있다. 생활환의 용균 단계는, AAV 프로바이러스를 함유하는 세포가 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스(AAV에 의해 소집되어 숙주 염색질로부터 절단되는 것을 돕는 헬퍼 기능을 암호함)에 의하여 2차 감염될 때 개시된다(B.J.Carter, 상기 문헌 참조). 감염성의 어버이 ssDNA는 rep 의존적인 방식으로 2본쇄의 복제형(RF) DNA가 된다. 구제된 AAV 게놈은 예형된 단백질 캡시드(직경이 약 20 nm인 대칭 20면체)로 팩키징되고, 세포 용균 후 + 또는 - ssDNA 게놈을 팩키징한 감염성 비리온으로서 방출된다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 유전자 치료법에 매우 중요하다. 이 바이러스 입자는 매우 안정하고, rAAV는 CsCl 구배 밴드화 또는 펠릿화로 정제할 수 있다는 점에서 재조합 AAV(rAAV)는 "약물-유사" 특성을 갖고 있다. 이 입자들은 열에 안정하고 분말로 동결건조된 뒤 재수화되어 완전한 활성을 나타낼 수 있다. 이 입자들의 DNA는 숙주 염색체 중으로 안정하게 통합되어, 그 발현이 장기적이다. 이 입자들의 숙주 범위는 광범위하며, AAV가 어떤 질환을 유발한다고 알려진 바 없기 때문에 이들의 재조합 벡터도 비독성이다.
일단 표적 세포에 도입되면, 벡터 중에 삽입된 유전자 서열과 상동성/상보성인 서열을 함유하는 프로브를 사용하여 핵산 하이브리드화 같은 종래 기법으로 해당 서열을 확인할 수 있다. 다른 방법으로서, 표적 세포 중으로 발현 벡터를 도입하면 나타나는 "마커" 유전자 기능(예, 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성 등)의 존재 또는 부재로 서열(들)을 확인할 수도 있다.
제제화 및 투여 방법
본 발명의 화합물은 의학적으로 허용되는 모든 방법으로 투여할 수 있다. 그 예로는 정맥내, 혈관내, 동맥내, 피하, 근육내, 종양내, 복강내, 심실내, 경막내 등과 같은 비경구 경로를 통한 주사제 뿐만 아니라 경구, 비측, 안구, 직장 또는 국소 투여제를 포함한다. 또한, 지속 방출 투여 형태로서, 데포(depot) 주사제 또는 부식성 이식체와 같은 수단도 본 발명에 포함된다. 국소 전달 형태가 특히 바람직한데, 그 예로는 1 이상의 동맥, 예컨대 신장 동맥 또는 국소 종양에 위치하는 혈관과 같은 1 이상의 동맥으로 카테터를 통한 전달과 같은 수단을 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 돌연변이 원종양유전자 또는 돌연변이 종양단백질과 혼합되어 적용을 용이하게 하는 천연 또는 합성된 1종 이상의 유기 성분 또는 무기 성분을 의미한다. 적합한 담체로는 당업자에게 약학적 허용성인 것으로 알려진 수성 및 비수성의 등장성 멸균 용액 및 멸균 현탁액이 있지만 멸균 식염수가 좋다. 또한, "담체"라는 용어에는 리포좀 및 HIV-1 tat 단백질(Chen 등, Anal.Biochem. 227: 168-175, 1995 참조) 뿐만 아니라 모든 플라스미드 및 바이러스 발현 벡터도 포함된다. "유효량"이란 질병, 퇴화 또는 손상된 상태의 진행을 경감시키거나 지연시킬 수 있는 양을 의미한다. 유효량은 개개인마다 다르지만 부분적으로는 처치되는 증후와 목적하는 결과를 고려하여 결정한다. 이러한 요인을 고려하여 당업자라면 더 이상의 일반적인 실험 없이도 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
리포좀 시스템으로는 다양한 단층라멜라 소포, 복층라멜라 소포 또는 안정한 다중층라멜라 소포 등이 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법, 예컨대 미국 특허 제5,169,637호, 제4,762,915호, 제5,000,958호 또는 제5,185,154호에 기재된 교시 내용에 따라 제조하여 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 신규 폴리펩티드 뿐만 아니라 기타 다른 선택된 폴리펩티드는 리포좀에 대한 결합성을 향상시키기 위하여 지단백질로서 발현시키는 것이 바람직할 수도 있다. 예컨대, 리포좀 캡슐화된 RetL을 이용한 인간 급성 신부전증 치료는, 이러한 치료가 필요한 세포 중으로 리포좀을 이용하여 RetL을 도입시켜 생체내에서 실시할 수 있다. 이 리포좀은 카테터를 통해 신장 동맥으로 전달될 수 있다. 재조합 RetL 단백질은, 예컨대 면역친화성 크로마토그래피 또는 기타 다른 통상적인 방법으로 CHO 세포로부터 정제한 다음, 리포좀과 혼합하면 높은 효율로 리포좀 중으로 병입될 수 있다. 캡슐화된 단백질은 시험관내에서 세포 성장의 자극에 미치는 효과에 대해 시험할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 신규 폴리펩티드를 안정성 및/또는 면역원성을 향상시키기 위하여 리포좀 전달 시스템을 통해 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 리포좀을 통한 신규 폴리펩티드의 전달은, 리포좀이 치료 동물 중의 식세포에 의해 내면화되기 때문에 특히 바람직하다. 이러한 세포들은 리포좀 막을 소화하면 후속적으로 강한 면역 반응을 유도하는데 필요한 다른 분자와 함께 면역계로 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 신규 RetL 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 염 형태로 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 염을 형성할 수 있는 적합한 산과 염기는 당해 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 무기 및 유기의 산과 염기를 포함한다.
전술한 발명은 명확한 이해를 돕기 위하여 예시 및 실시예를 통해 다소 상세히 기술하였지만, 첨부되는 특허청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위 내서 일부 변화 및 변형을 실시할 수 있다는 것은 당업자에게는 자명할 것이다.
본 발명에 따르면 Ret 리간드(RetL)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, RetL DNA 또는 단백질로 세포 및 포유동물 검체를 처리하여 신경 및 신장 증식을 자극할 수 있다.
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 바이오겐 인코오포레이티드
(ii) 발명의 명칭 : 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 Ret 리간드(RetL)
(iii) 서열의 수 : 21
(iv) 서신 주소:
(A) 성명 : 바이오겐 인코오포레이티드
(B) 스트리트 : 캠브리지 센터 14
(C) 도시 : 캠브리지
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가 : 미국
(F) 우편번호(ZIP) : 02142
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원 일자 : 1997년 5월 7일
(C) 분류 기호:
(vii) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 미국 08/999,999
(B) 출원 일자 : 1996년 1월 1일
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 레빈 레슬리 엠.
(B) 등록번호 : 35,245
(C) 참조번호 : A008 PCT CIP
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : 617-679-2400
(B) 팩스 : 617-679-2838
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 3616 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 257..1660
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1a]
Figure 112005022615195-pat00001
[서열 1b]
Figure 112005022615195-pat00002
[서열 1c]
Figure 112005022615195-pat00003
[서열 1d]
Figure 112005022615195-pat00004
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 468 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 2 :
[서열 2a]
Figure 112005022615195-pat00005
[서열 2b]
Figure 112005022615195-pat00006
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3]
Figure 112005022615195-pat00007
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4]
Figure 112005022615195-pat00008
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5]
Figure 112005022615195-pat00009
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1926 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 10..1920
(xi) 서열 번호 6:
[서열 6a]
Figure 112005022615195-pat00010
[서열 6b]
Figure 112005022615195-pat00011
[서열 6c]
Figure 112005022615195-pat00012
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 637 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 7:
[서열 7a]
Figure 112005022615195-pat00013
[서열 7b]
Figure 112005022615195-pat00014
[서열 7c]
Figure 112005022615195-pat00015
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1223 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1..1038
(xi) 서열 번호 8:
[서열 8a]
Figure 112005022615195-pat00016
[서열 8b]
Figure 112005022615195-pat00017
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 346 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 9:
[서열 9a]
Figure 112005022615195-pat00018
[서열 9b]
Figure 112005022615195-pat00019
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1682 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 118..1497
(xi) 서열 번호 10:
[서열 10a]
Figure 112005022615195-pat00020
[서열 10b]
Figure 112005022615195-pat00021
[서열 10c]
Figure 112005022615195-pat00022
[서열 10d]
Figure 112005022615195-pat00023
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 460 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 11:
[서열 11a]
Figure 112005022615195-pat00024
[서열 11b]
Figure 112005022615195-pat00025
[서열 11c]
Figure 112005022615195-pat00026
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1888 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 25..1416
(xi) 서열 번호 12:
[서열 12a]
Figure 112005022615195-pat00027
[서열 12b]
Figure 112005022615195-pat00028
[서열 12c]
Figure 112005022615195-pat00029
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 464 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 13:
[서열 13a]
Figure 112005022615195-pat00030
[서열 13b]
Figure 112005022615195-pat00031
[서열 13c]
Figure 112005022615195-pat00032
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1878 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 205..1242
(xi) 서열 번호 14:
[서열 14a]
Figure 112005022615195-pat00033
[서열 14b]
Figure 112005022615195-pat00034
[서열 14c]
Figure 112005022615195-pat00035
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 346 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 15:
[서열 15a]
Figure 112005022615195-pat00036
[서열 15b]
Figure 112005022615195-pat00037
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1889 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 41..1231
(xi) 서열 번호 16:
[서열 16a]
Figure 112005022615195-pat00038
[서열 16b]
Figure 112005022615195-pat00039
[서열 16c]
Figure 112005022615195-pat00040
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 397 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 17:
[서열 17a]
Figure 112005022615195-pat00041
[서열 17b]
Figure 112005022615195-pat00042
[서열 17c]
Figure 112005022615195-pat00043
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1271 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 2..946
(xi) 서열 번호 18:
[서열 18a]
Figure 112005022615195-pat00044
[서열 18b]
Figure 112005022615195-pat00045
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 315 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 19:
[서열 19a]
Figure 112005022615195-pat00046
[서열 19b]
Figure 112005022615195-pat00047
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1699 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 175..1374
(xi) 서열 번호 20:
[서열 20a]
Figure 112005022615195-pat00048
[서열 20b]
Figure 112005022615195-pat00049
[서열 20c]
Figure 112005022615195-pat00050
(2) 서열 번호 21 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 400 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 21:
[서열 21a]
Figure 112005022615195-pat00051
[서열 21b]
Figure 112005022615195-pat00052

Claims (21)

  1. 서열 번호 17 또는 서열 번호 21의 서열에 대한 서열 상동성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 수용체 단백질 Ret와 상호작용하여 수용체 단백질 Ret의 이량체화 또는 수용체 단백질 Ret의 티로신 키나제 도메인의 자가인산화를 촉발하는 것인 분리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호 21의 서열과 함께 정렬시킬 때 시스테인의 80% 이상을 보유하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호 17 또는 서열 번호 21의 서열과 서열 상동성이 90% 이상인 폴리펩티드.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드, 및 (ii) 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
  8. 제6항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  9. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제10항의 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    숙주 세포 내의 벡터로부터 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
  12. 독소, 영상화 가능한 화합물 또는 방사핵종에 융합된 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  13. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
  14. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제6항의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
  15. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제7항의 핵산을 포함하는 약학 조성물.
  16. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제9항의 벡터를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제8항의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항의 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    숙주 세포 내의 벡터로부터 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
  20. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제8항의 핵산을 포함하는 약학 조성물.
  21. 신장 또는 신경 병태의 치료 또는 진단용으로 사용하기 위한, 제17항의 벡터를 포함하는 약학 조성물.
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US60/021,859 1996-07-16
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