KR100498530B1 - 조직재생조절물질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손상된 조직 또는 재생중인 조직에서 상향조절된 단백질, 이들 단백질을 암호화하는 DNA, 이들 단백질을 포함하는 치료 조성물 및 이를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

조직 재생 조절 물질

본 발명은 손상된 조직 또는 재생중인 조직에서 상향조절되는 단백질 및 이들 단백질을 암호화하는 DNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 단백질을 포함하는 치료 조성물 및 이들 단백질을 이용하는 치료 방법에 관한 것이다.

조직 구조의 동적 개편은 발생중 및 손상후의 조직 복원중에 일어난다. 이 과정을 연구하기 위해, 본 발명자들은 국소빈혈-재관류 손상에 의한 신장 장애에 관심을 기울였다.

신장은 세포 사멸, 생존하는 인접한 관 상피 세포의 증식, 노출되지 않은 기저막 위의 불충분하게 분화된 재생성 상피의 형성 및 충분히 기능성인 인접한 관 상피 세포를 형성하기 위한 재생성 상피의 분화를 포함하는 일련의 복잡한 과정을 통해 인접한 관 상피에 대한 손상을 치유할 수 있다[참조: Wallin 등, Lab. Invest. 66: 474-484 (1992); Witzgall 등, Mol. Cell. Biol. 13: 1933-1942 (1994); Ichimura 등, Am. J. Physiol. 269: F653-662 (1995); Thadhani 등, N. Engl. J. Med. 334: 1448-1460 (1996)]. 이와 같은 조직 복원 과정에는 IGF, EGF 및 HGF와 같은 성장 인자 뿐만 아니라 내피 세포 부착 분자 ICAM-1이 연루되어 왔다. 그러나, 관 상피 세포가 회생되는 메카니즘은 아직까지 밝혀지지 않고 있다.

관 상피의 손상 과정과 복원에 관련된 분자를 규명하기 위해, 본 발명자들은 표현 차이 분석(representational difference analysis: RDA)을 이용하여 손상된 신장/재생중인 신장과 정상적인 신장 사이의 mRNA 군집의 차이를 분석하였다. RDA는 반복적인 제거와 증폭에 의해 표적 조직 또는 세포 특이성 cDNA 단편을 산출하는 제거를 위한 PCR-기초한 방법이다[참조: Hubank 및 Schutz, Nucl. Acids Res. 22: 5640-5648 (1994)].

도 1은 추정적인 단백질 리딩 프레임인 615 내지 1535 서열과 함께 래트 클론 cDNA 3-2의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 도면이다.

도 2는 추정적인 단백질 리딩 프레임인 145 내지 1065 서열과 함께 래트 클론 1-7의 cDNA 서열의 목록을 나타내는 도면이다.

도 3은 추정적인 단백질 리딩 프레임인 107 내지 1822 서열과 함께 래트 클론 4-7의 cDNA 서열의 목록을 나타내는 도면이다.

도 4는 추정적인 단백질 리딩 프레임인 1 내지 1002와 함께 인간 클론 H13-10-85의 cDNA 및 추론된 아미노산 서열의 목록을 나타내는 도면이다. 상기 목록의 윗줄은 cDNA 서열(서열 번호 6)을 나타내며, 아랫줄은 추론된 아미노산 서열(서열 목록 7)을 나타낸다.

도 5는 인간 클론 H13-10-85의 뉴클레오티드 서열과 래트 클론 3-2의 뉴클레오티드 서열과의 BESTFIT비교 자료를 나타는 도면이다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 표현 차이 분석(RDA)을 이용하여 재생중인 신장과 정상 신장에서 mRNA 발현의 차이를 분석하므로써 KIM 유전자를 확인하였다. RDA는 반복적인 제거(subtraction) 및 증폭에 의해 표적 조직 또는 세포-특이성 cDNA 단편을 산출하는 제거를 위한 PCR에 기초한 방법이다. 국소빈혈이 발생하고 48시간이 경과한 성숙 래트 신장 RNA의 cDNA 표현은 정상적인(모의-조작된) 성숙 래트 신장에서 취한 샘플로 제거한다. 이 과정에서, 국소빈혈이 발생한 후의 신장 샘플과 정상적인 신장 샘플에 공통적인 서열은 제거하고, 단지 손상된 신장 조직에서만 현저히 발현되는 서열은 남겨둔다. 이러한 유전자들은 신장 장애에 대해 치료학적으로 유익할 수 있거나 손상 과정에 관련될 수 있는 단백질을 암호화한다. 수개의 클론이 얻어졌고, 서열결정되었으며, 특성 규명되었다. 이후, 이들 클론은 노던 분석 및 RNA 인시추(insitu) 하이브리드화에 의해 신장 복원, 발생 및 조직 분포중 그들의 발현 패턴에 대해 조사하였다.

서열 번호

본 명세서에서 언급한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기와 같은 서열 번호를 부여하였다:

서열 번호 1: 래트 3-2 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 2: 래트 1-7 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 3: 래트 3-2 cDNA 및 1-7 cDNA에 의해 암호화된 래트 KIM-1의 아미노산 서열

서열 번호 4: 래트 4-7 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 5: 래트 4-7 cDNA 삽입물에 의해 암호화된 아미노산 서열

서열 번호 6: 인간 cDNA 클론 H13-10-85의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 7: 인간 cDNA 클론 H13-10-85에 의해 암호화된 아미노산 서열

용어의 정의

본 명세서에서 "KIM" 과 동의어로 사용된 "KIM 단백질"은 신장 손상 이후 선택적으로 상향조절된 mRNA에 의해 암호화된 단백질이다. 소정의 일군의 KIM 단백질은 신장 조직에 대한 손상으로 귀착되는 임의의 손상이 있은지 1주일 내의 임의 시간에 선택적으로 상향조절된 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 포함한다. 이러한 상향조절이 확인될 수 있는 시간의 예로는 손상이 있은후 10 시간, 24 시간, 48 시간 또는 96 시간을 들 수 있다. 이러한 손상의 예로는 국소빈혈, 중독으로 귀착되는 손상 또는 기타 손상을 들 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "KIM 작용물질"은 KIM과 KIM 리간드의 상호작용에 의해 정상적으로 촉발되는 세포성 반응을 특이적으로 촉발시킬 수 있는 분자를 의미한다. KIM 작용물질은 KIM 변이체, 또는 KIM에 대한 특이 항체, 또는 KIM 리간드의 가용성 형태일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "KIM 길항물질"은 KIM 리간드 또는 KIM에 특이적으로 결합하므로써 KIM 리간드에 대한 KIM의 결합을 차단하거나 억제하는 분자를 의미한다. 이러한 길항물질의 결합은 KIM 리간드와 KIM 또는 KIM 작용물질과의 결합에 의해 촉발되는 세포성 반응을 차단 또는 억제한다. KIM 길항물질의 예로는 KIM 변이체, KIM 융합 단백질 및 KIM 리간드 또는 KIM에 대한 특이 항체를 들 수 있다.

본 명세서에 사용한 용어 "KIM 리간드"는 KIM 단백질에 비공유적이면서 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 의미한다. 이러한 리간드는 단백질, 펩티드, 스테로이드, 항체, 아미노산 유도체, 또는 기타 임의 형태의 분자들일 수 있는데, 이들 임의 형태의 분자들은 자연발생하는 것일 수도 있고, 재조합에 의해 생성된 것일 수도 있고, 합성된 것일 수도 있다. KIM 리간드는 임의 형태일 수 있는데, 가용성일 수도 있고, 막-결합된 것일 수도 있고, 면역글로불린, 지방산 또는 기타 부분과의 융합 구성물의 일부일 수도 있다. 이 KIM 리간드는 인테그린일 수도 있다. 막-결합된 KIM 리간드는, KIM에 결합하거나 KIM과 연합하는 경우, 세포성 반응을 촉발하는 수용체로서 작용할 수 있다. 몇몇 상호작용에서, KIM은 일종 이상의 단일 KIM 리간드와 연합하거나, 일종 이상의 기타 분자 또는 보조 인자와 이룬 복합체의 일부로서 KIM 리간드와 연합할 수 있다. KIM과 KIM 리간드 둘 다가 세포 막에 결합하는 상황에서, KIM은 KIM과 동일한 세포에 결합된 KIM 리간드와 연합 및 반응하거나, 제2 세포에 결합된 KIM 리간드와 연합 및 반응할 수 있다. KIM 연결이 상이한 세포에 결합된 분자 사이에서 발생하는 경우, 상기 두 세포는 세포 형태 또는 기원, 표현형 또는 대사 조건, 또는 주어진 자극에 대한 세포성 반응의 형태와 정도 (예를 들어, 성장, 분화 또는 세포사멸)의 관점에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 명세서에 사용한 용어 "KIM 연결"은 KIM과 KIM 리간드와의 접촉 및 결합을 의미한다.

본 명세서에 사용한 용어 "서열의 정렬"은 한 서열의 관련있는 부분의 서열과 다른 서열의 관련 있는 부분의 서열의 비교를 가능하게 하기 위해 뉴클레오티드이든 아미노산 이든 한 서열과 다른 서열과 위치시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 이러한 과정을 수행하는 한 방법은 문헌[참조: Needleman 등, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)]에 기재되어 있다. 이 방법은 정렬 프로그램(DNA스타 인코포레이티드)과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 상동성이거나 기능적으로 등가인 서열은 보존된 시스테인 골격내의 시스테인 잔기의 선형 배열을 변경시키지만 단백질의 접힌 구조 내에서 이들의 관계를 실질적으로 방해하지 않는 아미노산 삽입 또는 결실을 포함하여, 상기 시스테인 골격내의 시스테인 잔기의 기능적으로 등가인 배열을 포함한다. 따라서, 후보 서열내의 내부 갭 및 아미노산 삽입은 후보 서열과 참조 서열 사이의 아미노산 서열 상동성 또는 동일성의 수준을 계산할 목적을 위해서는 무시된다. 단백질의 상동성을 확립하기 위해 빈번하게 사용되는 한 특징은 한 단백질과 다른 단백질 사이의 시스테인 잔기의 수와 위치의 유사성이다.

본 명세서에서 사용한 용어 "안티센스 DNA"는 전사되는 염색체 DNA의 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "안티센스 프로브"는 관심의 핵산 부분에 대해 안티센스 DNA의 적어도 일부분을 포함하는 프로브를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "클로닝"은 특정 유전자 또는 기타 DNA 서열을 벡터 분자에 삽입하기 위한 시험관내 재조합 기법의 이용을 의미한다. 목적 유전자를 성공적으로 클로닝하기 위해서는 DNA 단편을 생성하기 위한 방법, 벡터 분자에 단편을 연결하기 위한 방법, 합성 DNA 분자를 이 분자를 복제할 수 있는 숙주 세포 내로 도입하기 위한 방법 및 수용체 숙주 세포 중에서 표적 유전자를 보유하는 클론을 선별하는 방법을 이용하는 것이 필요하다.

본 명세서에서 사용한 용어 "cDNA"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 DNA 또는 사본 DNA를 의미한다. 따라서, "cDNA" 클론은 클로닝 벡터 내에 보유된 소정의 RNA 분자에 상보적인 이중 DNA 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "cDNA 라이브러리"는 RNA 주형의 기원에 따라 전체 유기체 또는 조직 내에 존재하는 mRNA 분자의 표현을 함께 구성하는 cDNA 삽입물을 함유한 재조합 DNA 분자의 군집을 의미한다. 이러한 cDNA 라이브러리는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 문헌[참조: Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 참조]에 기술된 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 특정 유전자를 클로닝하기 원하는 게놈을 가진 유기체의 세포로부터 RNA가 먼저 분리된다. 본 발명의 목적을 위해서는 포유류, 특히 인간 세포주가 바람직하다. 별법으로 RNA는 동물 종양, 바람직하게는 사람 종양으로부터 유도된 종양 세포로부터 분리할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 예를 들어, 인간 부신 종양으로 제조하는 것이 바람직하나, 임의의 종양을 사용할 수도 있다.

본 명세서에 사용한 용어 "DNA 다형성"은 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 DNA의 특정 위치에 존재할 수 있는 상태를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "발현 벡터"는 내부에 함유된 DNA 서열을 발현할 수 있는, 즉 코딩 서열이 그들의 발현을 수행할 수 있는 기타 서열에 작동가능하게 연결된 벡터를 포함한다. 항상 분명하게 서술되는 것은 아님에도 불구하고, 이들 발현 벡터는 에피좀 또는 염색체 DNA의 내부 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제가능하여야만 한다. 필수적인 것은 아니지만 효과적인 발현 벡터의 유용한 요소는 카머암호화 서열인데, 이는 단백질을 함유하는 세포의 용이한 식별을 가능하게 하는, 상기 세포의 표현형 특성(예를 들어, 테트라사이클린 내성)으로 귀착되는 단백질을 암호화하는 서열이다. 요컨대, "발현 벡터"는 기능적인 정의이며, 특정 서열에도 적용되기 때문에, 특정되고, 함유된 DNA 코드를 발현시킬 수 있는 임의의 DNA 서열이 이 용어의 정의에 포함된다. 현재, 이러한 벡터는 플라즈미드의 형태로 빈번하게 사용되며, 따라서 "플라즈미드" 및 "발현 벡터"는 종종 상호변환가능한 용어로 사용된다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 발휘하며, 때로는 당업자에게 공지된 것일 수 있는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명에서 사용한 용어 "작용 유도체"는 임의 분자의 "단편", "변이체", "유사체" 또는 "화학적 유도체"를 의미한다. 본 발명의 항원중 임의 항원과 같은 임의 분자의 "단편"은 상기 분자의 임의의 폴리펩티드 부분군을 의미한다. 이러한 분자의 "변이체"는 전체 분자 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 자연 발생하는 분자를 의미한다. 임의 분자의 "유사체"는 전체 분자 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 비천연 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "유전자"는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "균일성"은 펩티드 또는 DNA 서열을 지칭하는 경우, 고려 대상인 조성물 내에 존재하는 거의 모든 분자의 일차 분자 구조(즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드의 서열)가 동일함을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "분리된"은 본 발명의 단백질 또는 다른 유전자 또는 자연계에서 정상적으로 확인될 수 있는 기타 오염물질 및 자연계에서 발견되지 않는 형태로 존재하는 오염물질을 실질적으로 함유하지 않는 본 발명의 단백질 또는 이러한 임의의 단백질을 암호화하는 임의의 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "표지"는 예를 들어, 제한 없이 방사성 동위원소, 효소, 발광제 및 염료를 포함하는 검출가능한 분자 부분을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 "프로브"는 표적 항리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 공지된 특성의 리간드를 의미한다. 핵산에 적용될 때, 상기 용어 "프로브"는 표적 스트랜드에 상보적인 염기 서열을 보유하는 핵산의 임의 스트랜드를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "재조합 숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용하여 구성된 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. 본 명세서에서 정의한 바와 같이, 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 항체 또는 이의 변형물은 형질 전환에 의해 생성물의 양이 더 적거나, 더 일반적으로는 검출가능한 양보다 적으며, 비형질전환된 숙주에 의해 생성되는 경우도 그러하다.

본 명세서에 사용한 용어 "실질적으로 순수한"은 각각 다른 단백질 또는 유전자 또는 자연계에서 정상적으로 확인될 수 있는 기타 오염물질 및 자연계에서 확인되지 않는 형태로 존재하는 오염물질을 실질적으로 함유하지 않는 본 발명의 임의의 단백질 또는 이런 임의의 단백질을 암호화하는 임의의 유전자를 의미한다.

한 분자가 다른 분자와 "실질적으로 유사하다"라는 용어는 양 분자의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 경우, 및 양 분자가 유사한 생물학적 활성을 보유하는 경우에 사용하였다. 따라서, 2개의 분자가 유사한 활성을 보유한다면, 이들은 상기 분자중 한 분자가 다른 분자에서 발견되지 않는 부가의 아미노산 잔기를 함유하는 경우, 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않은 경우에도 본 명세서에서 사용한 용어인 변이체로 간주된다. 본 명세서에서 사용한 바와 같은 한 분자가 다른 분자의 "화학적 유도체"라는 용어는 상기한 한 분자가 그 분자의 정상적인 일부분이 아닌 부가적인 화학적 부분을 함유하는 경우에 사용하였다. 이러한 부분들은 상기 분자의 가용성, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기 부분들은 상기 분자의 독성을 감소시키고, 상기 분자의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키는 등을 개선점을 제공할 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 부분들은 예를 들어, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, 미국 펜실베니아주 이스톤에 소재하는 맥 출판사 (1980)]에 개시되어 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "벡터"는 DNA의 단편이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 플라즈미드 또는 박테리오파지로부터 유도된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 하나 이상의 독특한 제한 위치를 보유할 것이며, 클로닝된 서열을 재생할 수 있는 정의된 숙주 또는 비히클 유기체 내에서 자발적인 복제가 가능하다.

본 발명의 화합물

본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 cDNA 및 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 서열을 포함하는 서열 및 이들 서열의 유도체를 포함한다. 또한, 본 발명은 이들 서열 또는 이들의 유도체를 포함하는 벡터, 리포좀 및 기타 담체 비히클을 포함한다. 또한 본 발명은 서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7(이로 제한되지는 않음)을 포함하는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6으로부터 전사된 단백질과 이들의 유도체 및 변이체를 포함한다.

본 발명의 한 구체예는 손상이후에 상향조절되고, 보편적으로 막 관련 단백질로서 합성되는 KIM 단백질의 가용성 변이체를 포함한다. 가용성 변이체는 천연 KIM 단백질의 횡막 또는 내막 부분의 적어도 일부분이 결여되어 있다. 몇몇 예에서, 가용성 변이체는 천연 KIM 단백질의 전체 횡막 또는 내막 부분이 결여되어 있다. 가용성 변이체는 쳔연 KIM 단백질의 횡막 또는 내막 부분의 적어도 일부분이 결여된 KIM 단백질의 유도체를 함유하는 융합 단백질을 함유한다. 모든 타입의 KIM 융합 단백질은 특히 상기 분자의 his-태그, Ig-태그 및 myc-태그 형태를 혼입하는 것들을 포함한다. 이들 KIM 융합물은 Ig-태그에 의해서 부여되는 증가된 반감기와 같은 치료학적으로 유용한 특성을 보유할 수 있다. 또한, KIM 단백질의 선택된 도메인의 부분을 혼입한 융합 단백질도 포함된다.

변이체는 아미노산 서열에서 또는 서열이 연루되지 않는 방식, 또는 양자 모두에서, 자연 발생하는 KIM 단백질과 상이할 수 있다. 아미노산 서열에서의 변이체는 자연 발생하는 KIM 단백질의 하나 이상의 아미노산이 다른 천연 아미노산, 아미노산 유도체 또는 비-천연 아미노산으로 치환되는 경우에 생성된다. 특히 바람직한 변이체는 자연 발생하는 KIM 단백질 또는 자연 발생하는 KIM 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는데, 이들의 서열은 단백질 또는 펩티드의 2차 구조와 소수성에 일반적으로 최소한의 영향을 미치는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 야생형 서열과는 상이하다. 또한, 변이체는 KIM 단백질의 생물학적 활성을 상실시키지 않는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 다른 서열을 보유할 수 있다. 일반적으로 보존적 치환은 한 아미노산의 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다. 이와 같은 보존적 치환의 예로는 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신을 들 수 있다. 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

기타 보존적 치환은 하기 표 1에 기술하였으며, 기타 사항은 문헌[참조: Dayhohh in the Atlas of Protein Sequence and Structure (1988)]에 기재되어 있다.

[표 1]

본 발명의 기타 변이체는 펩티드 안정성을 증가시키는 변형을 가한 것들이다. 예를 들어, 이러한 변이체는 펩티드 서열내에 하나 이상의 비-펩티드 결합(이는 펩티드 결합을 대체한 것임)을 함유할 수 있다. 또한, 자연적으로 발생하는 L-아미노산 이외의 잔기, 예를 들어 D-아미노산 또는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 또는 합성 아미노산, 예컨대 베타 또는 감마 아미노산을 포함하는 변이체 및 시클릭 변이체도 포함된다. 폴리펩티드 내에 L-아미노산을 대신한 D-아미노산이 혼입되므로써 상기 폴리펩티드의 프로테아제에 대한 내성이 증가될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,219,990호).

일반적으로, KIM 폴리펩티드의 기능적 특성을 변화시킬 수 있는 것으로 생각되는 치환은 (1) 친수성 잔기, 예를 들어 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어 루신, 이소루신, 페닐알라닌 또는 알라닌으로 치환되는 것; (2) 시스테인 잔기가 다른 임의의 잔기로 치환되는 것(또는 이의 역); (3) 양으로 하전된 측쇄를 보유하는 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이 음전하를 보유하는 잔기, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치한되는 것(또는 이의 역); 또는 (4) 커다란 측쇄를 보유하는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 그러한 측쇄를 보유하지 않는 잔기, 예를 들어 글리신으로 치환되는 것(또는 이의 역)이다.

또한, 본 발명의 펩티드는 삽입, 결실 및 치환과 같은 여러 가지 변화에 의해 변경될 수 있는데, 이러한 변화는 상기 펩티드를 사용할때 어떤 장점을 제공할 수 있다면, 보존적이도 비보존적이어도 무방하다. 특히, 스플라이스 변이체가 본 발명에 포함된다.

다른 구체예에서, 덜 보존적인 아미노산 치환이 이루어진 변이체는 예를 들어, 전하, 형태 및 기타 생물학적 특성에 변화를 야기시키므로써 소정의 유도체로 귀착시킬 수 있다. 이러한 치환은 예를 들어, 소수성 잔기의 친수성 잔기로의 치환, 다른 잔기의 시스테인 또는 프롤린으로의 치환, 큰 측쇄를 가진 잔기의 작은 측쇄를 가진 잔기로의 치환 또는 알짜 음전하를 가진 잔기의 알짜 양전하를 가진 잔기로의 치환을 포함한다. 소정 치환의 결과가 그 확실히 예상될 수 없는 경우, 유도체는 의도한 특성의 존부를 결정하기 위해 본 명세서에 기재한 방법에 따라 용이하게 분석할 수 있다.

본 발명의 범주내에 있는 변이체는 KIM 단백질과 아미노산 서열 상동성이 80% 이상인 단백질 및 펩티드를 포함한다. 상기한 아미노산 서열 상동성은 90% 이상 또는 95% 이상이 더 바람직하다. 상동성을 측정하기 위해, 비교 서열의 길이는 일반적으로 8개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로 20개 이상의 아미노산 잔기일 것이다. 또한, 본 발명의 화합물의 변이체는 1) 본 발명의 KIM 단백질과 아미노산 서열 상동성이 40% 이상인 임의의 단백질 및 2) KIM 서열(인간 및 래트 KIM-1에 대해 도 5에 나타냄)과 최적 정렬된후, 80% 이상의 시스테인 잔기가 본 발명의 KIM 단백질 내의 시스테인과 정렬된 임의의 단백질을 포함한다.

골격의 치환물을 대체하는 것이 가능한 것과 같이, 유사한 특징으로 특정화된 기에 의해 상기 골격에 결합된 작용기를 치환하는 것도 가능하다. 이들 치환은 초기에는 보존적일 것이다. 즉, 치환기는 원래의 기와 거의 동일한 크기, 형태, 소수성 및 전하를 가질 것이다. 비서열 변형은 예를 들어 시험관내 또는 생체내에서 수행하는 자연 발생하는 KIM 단백질의 부분들의 화학적 유도 뿐만아니라 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 카르복실화 또는 글리코실화에서의 변화를 포함한다.

또한, 단백질(서열 번호 3, 5 또는 7) 또는 이 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 제제도 본 발명에 포함된다. 이들 제제는 리간드 및 항체(모노클로날, 1본쇄, 2본쇄, Fab 단편 및 기타를 포함하며, 천연 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 영장류화 항체이거나 또는 키메라 항체임)를 포함한다. 상기 제제의 범위에 대한 추가 기술은 본 명세서에 참고 인용한 PCT 출원 95/16709에 기재되어 있다.

발명의 개요

본 발명은 일반적으로 신장에 대한 손상후 신장 조직내에서 상향조절된 신장 손상-관련 분자(Kidney Injury-related Molecules; 이하 KIM이라 칭함)을 제공한다. 본 발명의 KIM 단백질 및 펩티드와 이들의 작용물질 및 길항물질, 그리고 이들의 상응하는 물질은 다양한 치료적 중재에 유용하다.

본 발명은 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기술된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 정제되고, 분리된 DNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 서열의 상보적 스트랜드, 엄한 조건하에서 상기한 DNA 분자와 하이브리드를 형성하는 DNA 분자 및 유전 암호의 퇴화성이 아니라면 상기한 DNA 분자중 임의의 DNA 분자와 하이브리드를 형성하는 DNA 분자를 포함한다. 이들 DNA 분자들은 재조합체일 수 있으며, 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6에 기술된 뉴클레오티드 서열을 갖는 정제되고, 분리된 DNA 분자 또는 기타 상기한 DNA 분자중 임의의 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 생물학적으로 기능적인 플라즈미드 또는 바이러스 DNA 벡터일 수 있다. 본 발명의 한 구체예는 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6의 DNA 분자를 포함하는 임의의 벡터에 의해 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기한 바와 같은 DNA 분자에 의해 암호화되는 KIM 폴리펩티드 산물을 생성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 적합한 배양 조건 하에서 상기 DNA 분자의 발현을 가능하게 하는 방식으로 상기 DNA 분자로 형질전환 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 성장시키는 단계와 상기한 발현에 의한 산물을 회수하는 단계를 포함한다.

다른 인간 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 정제되고, 분리된 인간 KIM 단백질은 특히 본 발명의 범주 내에 있으며, KIM 단백질의 일차 구조 형태와 생물학적 활성의 일부분 또는 모두를 보유하는 폴리펩티드 산물을 생성하는 방법도 본 발명의 범주내에 있다. 본 발명의 KIM 단백질은 서열 번호 3; 서열 번호 5; 또는 서열 번호 7을 포함하는 아미노산 서열을 보유할 수 있거나, 서열 번호 3; 서열 번호 5; 또는 서열 번호 7의 변이체일 수 있거나, 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6의 DNA에 의해 암호화된 정제되고, 분리된 단백질일 수 있다. 이들 단백질은 다른 인간 단백질을 실질적으로 함유하지 않는다. 또한, 본 발명은 가용성 변이체 또는 융합 단백질과 같은 이들 단백질의 변이체를 포함한다. 본 발명의 KIM 융합 단백질은 면역글로불린, 독소, 영상화가능한 화합물 또는 방사성핵종을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 KIM 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 제공한다. 이러한 항-KIM 항체는 독소, 영상화가능한 화합물 또는 방사성핵종과 결합할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 특이성 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 교시한다.

또한, 약학 조성물도 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명의 약학 조성물은 치료 유효량의 KIM 단백질 또는 항-KIM 항체와 함께 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

신장 질병을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 환자의 소변, 혈청 또는 소변 침강물 내의 KIM의 농도를 측정하므로써 신장 손상의 소산의 존재 또는 과정을 평가하는 것과 같은 진단 방법도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 치료 방법은 치료 유효량의 KIM, KIM 변이체, KIM 유사체, KIM 융합 단백질, KIM 작용물질 및 KIM 또는 KIM 리간드에 대한 항체를 이용하여 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 기타 치료학적 화합물은 KIM 리간드, 항-KIM 항체 및 KIM 리간드의 융합 단백질을 포함한다. 이들 화합물은 KIM의 기능에 의존하는 세포성 반응을 자극하거나 억제하는 치료 방법에 유용하다.

본 발명의 또 다른 방법은 KIM 리간드와 독소 또는 방사성핵종의 융합 단백질과 KIM-발현 종양 세포를 접촉시키므로써, 또는 독소나 방사성핵종에 접합된 항-KIM 항체와 KIM-발현 종양 세포를 접촉시키므로써 상기 KIM-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이다. 유사하게, KIM 리간드를 발현하는 종양 세포의 성장은 이 세포와 KIM과 독소 또는 방사성핵종의 융합 단백질을 접촉시키거나, 독소 또는 방사성핵종에 접합된 항-KIM 리간드 항체를 접촉시키므로써 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 치료법을 포함한다. 이들 치료법은 신장 장애를 가진 환자를 치료하는 방법, 환자에서 새로운 조직의 성장을 촉진시키는 방법 및 환자에서 손상된 조직의 생존을 촉진시키는 방법을 포함하는데, 이들 방법은 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA를 포함하는 벡터를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물은 시험관내 또는 생체내에서 조직을 영상화하는데 유용하다. 한 방법은 서열 번호 3; 서열 번호 5; 또는 서열 번호 7의 단백질을 발현하는 세포에 영상화가능한 화합물을 표적화하는 것에 관한 것인데, 이 방법은 상기 세포와 본 발명의 모노클로날 항체 또는 영상화가능한 화합물에 융합된 상기한 바와 같은 단백질을 포함하는 융합 단백질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 생체내 방법에 있어서, 상기 세포는 환자 내부에 존재하며, 단백질 또는 모노클로날 항체가 상기 환자에게 투여된다.

또한, 본 발명은 환자의 신장 세포의 손상 또는 재생을 확인하는 방법과 같은 진단 방법을 포함하는데, 이 방법은 환자의 신장 세포 내에서 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6의 발현 수준과 대조용 신장 세포 내에서 상기 서열의 대조용 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 진단 방법은 세포 내에서 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 4; 또는 서열 번호 6의 상향조절을 확인하는 방법인데, 이 방법은 상기 세포와 안티센스 프로브를 접촉시키는 단계와 상기 세포내에서 RNA에 대한 하이브리드화를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 진단 방법에서 또 다른 구체예는 소변, 혈청 또는 기타 체액 또는 소변 침강물 또는 조직 샘플 내에서 본 발명의 분자의 존재 또는 농도를 평가하는 방법을 포함한다. 이와 같이 측정된 손상-관련된 분자는 병리학적 과정의 존재, 정도 또는 추이와 관련이 있을 수 있다. 또한, 이러한 상관관계는 치료 방법의 효율성을 평가하는데 사용할 수 있다.

실험 방법

1. 국소빈혈성 래트와 정상적인 래트 성체 신장으로부터 RNA의 생성

국소빈혈성 손상된 래트 신장은 문헌[참조: Witzgall 등, J. Clin Invest. 93: 2175-2188 (1994)]에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략히 요약하면, 성숙 스프라그-달리 래트의 한 신장으로부터 신장 동맥과 정맥을 40분 동안 클램핑한후, 재관류시켰다. 손상된 신장은 재관류후 24간 및 48시간째에 상기 래트로부터 수거하였다. 또한, 모의 조작한 정상적인 성숙 스프라그-달리 래트로부터도 신장을 수거하였다.

전체 RNA는 문헌[참조: Glisin 등, Biochemistry 13: 2633 (1974)]에 기재된 프로토콜에 따라 신장으로부터 제조하였다. 간략히 요약하면, 수거한 장기는 즉시 GNC 완충액(4M 구아니딘 티오시아네이트, 0.5% SDS, 25mM 시트르산 나트륨. 0.1% 시그마 소포제)에 위치시키고, 폴리트론을 이용하여 얼음위에서 분쇄하였다. 세포 파편은 임상 원심분리기에서 저속 회전으로 제거하고, 상청액은 5.7M CsCl, 25mM 아세트산 나트륨, 1mM EDTA 쿠션에 위치시켰다. RNA는 SW40Ti 로터에서 22K로 15시간 동안 상기 쿠션을 통해 펠릿화하였다. RNA는 멸균 DEPC-처리수내에 재현탁시키고, 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨과 2.5 부피의 EtOH로 2회 침전시켰다. 폴리A+RNA는 mRNA 정제 키트(파마시아 카탈로그 번호 27-9258-02)를 이용하여 분리하였다.

2. 1-7, 3-2 및 4-7 RDA 단편을 분리하기 위한 표현 차이 분석(RDA)법

2본쇄 cDNA는 지브코 비알엘의 "수퍼스크립트 초이스(등록상표) 시스템 cDNA 합성 키트"(카타로그 번호 18090)를 이용하여 모의 조작된 래트의 신장 및 국소빈혈후 48시간이 경과한 래트 신장 폴리A+RNA로부터 합성하였다. 제1 스트랜드는 올리고dT를 이용하여 프라이밍하고, 수퍼스크립트 II(등록상표) 역전사효소 이용하여 합성하였다. 제2 스트랜드는 비알엘에서 추천하는 조건하에서 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I과 RNase H를 이용한후, T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 생성하였다.

RDA 분석은 기본적으로 문헌[참조: Hubank와 Schatz, Nucleic Acid Research 22: 5640-48 (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히 요약하면, 국소빈혈후 48시간이 지난 신장 cDNA는 제한 효소 DpnII로 분해하고, R-Bgl-12/24 올리고뉴클레오티드(정확한 서열은 문헌을 참조할 것)에 연결하였다. cDNA에 연결된 링커의 PCR 증폭(퍼킨 엘머 Taq 폴리머라제와 그에 상응하는 PCR 완충액을 이용하여 수행함)을 이용하여 초기 표현을 생성하였다. 이 PCR 생성물은 "테스터 앰플리콘"이라 칭한다. 동일한 과정을 수행하여 모의 조작된 래트 신장 cDNA로부터 "드라이버 앰플리콘"을 생성하였다.

테스터 앰플리콘과 드라이버 앰플리콘의 하이브리드화에 이어서, 선택적인 증폭을 3회 수행하여 감별 생성물 1(DP1), 감별 생성물 2(DP2) 및 감별 생성물 3(DP 3)을 생성하였다. DP1 생성물의 생성은 문헌[참조: Hubank와 Schatz, Nucleic Acid Research 22: 5640-48 (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, DP2와 DP3 생성물도 Hubank와 Schatz의 문헌(상기참조)에 기재된 바와 같이 수행하였으나, 드라이버:테스터 비를 DP2의 경우에는 5,333:1로 DP3의 경우에는 40,000:1 또는 4,000:1로 변경하였다.

3개의 RDA 생성물은 DP3으로부터 클로닝 벡터 pUC18내로 클로닝하였는데, 40,000:1의 비를 이용하여 DP3을 생성하는 경우 RDA 생성물 1-7(252bp)을 클로닝하였으며, 4,000:1의 비를 이용하여 DP3을 생성하는 경우 생성물 RDA 3-2(445 bp)와 4-7(483 bp)을 클로닝하였다. DNA 단편은 클리나우 효소로 PCR 단편의 단부를 수복하고, 상기 단편의 pUC 18 벡터내로의 평활 말단 연결을 용이하게 하는 파마시아 슈어클론(등록상표) 키트(카탈로그 번호 27-9300-01)를 이용하여 서브클로닝하였다.

3. 노던 분석

래트의 정상적인 성숙 신장(모의 조작된)과 국소빈혈후 48시간이 경과된 손상된 성숙 신장 및 18일된 배(embryo) 신장으로부터 취한 폴리 A+RNA(2.5㎍)를 전기영동하고, 진스크린(등록상표) 막(듀퐁)에 노던 블로팅하였다[참조: Cate, Cell 45: 685 (1986)]. 10% 덱스트란 설페이트와 100㎍/ml tRNA를 함유하는 PBS 완충액(50mM 트리스 7.5, 1M NaCl, 0.1% Na 피로포스페이트, 0.2% PVP, 0.2% 피콜, 0.2% BSA, 1% SDS) 내에서 65℃의 온도에서 3개의 상이한 프로브, 즉 1-7 RDA 생성물, 3-2 RDA 생성물 및 4-7 RDA 생성물을 이용하여 하이브리드화를 수행하였다. 모두는 파마시아의 "레디 투 고(등록상표)" 랜덤 프라이밍 표지 키트(카탈로그 번호 27-9251-01)를 이용하여 방사능표지하였다. RDA 생성물 1-7, 3-2 및 4-7은 3개의 모든 샘플에 존재하는 mRNA와 하이브리드를 형성하였으나, 국소빈혈후 48시간이 경과된 래트에서 취한 신장 RNA 샘플내의 mRNA와 가장 강한 하이브리드를 형성하였다.

성숙 래트 조직의 노던 블로트 분석 결과 1-7 유전자는 정상적인 성숙 신장, 고환, 비장 및 폐에서 매우 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다. 3-2 유전자는 간, 신장, 비장 및 뇌에서 발현되었다. 4-7 유전자는 비장, 신장, 폐, 고환, 심장, 뇌, 간 및 골결근에서 발현되었다. 1-7 및 3-2 블로트에서, 몇몇 조직에서 상이한 크기의 mRNA의 존재는 1-7 유전자와 3-2 유전자의 주 전사 생성물이 교호(alternate)스플라이싱 및/또는 폴리아데닐화를 수행할 수 있음을 나타내는 것이다.

4. 3-2 및 4-7 cDNA 클론의 분리

cDNA 라이브러리는 cDNA 합성용 BRL 수퍼스크립트 초이스(등록상표) 시스템의 시약과 스트라타진(등록상표) 람다 ZapII 클로닝 키트(카탈로그 번호 236201)를 이용하고, 제조사의 지시에 따라 국소빈혈후 48시간이 경과한 손상된 신장으로부터 얻은 폴리A+RNA 4㎍으로 생성하였다.

10⁵ 클론은 프로브(상기한 바와 같이 랜덤 프라임 표지됨)로 3-2 RDA를 이용하여 선별하였다. 8개의 양성 클론을 선택하고, 순수한 파지 플라크를 얻기 위한 2차 분석을 위해 4개를 무작위로 선택하였다. 3차 선별후, 4개의 순수한 파지 클론을 분리하였다. 파지로부터의 클로닝된 삽입물은 스트라타진(등록상표) 람다 Zap II 키트를 이용하여 생체내 절단 과정에 의해 분리되었다. 약 2.6 kb의 가장 큰 삽입물(cDNA 클론 3-2라 칭함)은 DNA 서열을 결정하였다. 이 삽입물의 서열(서열 번호 1)은 도 1에 나타냈다. cNDA 클론 3-2(이. 콜리 K-12, SOLR/p3-2#5-1)은 ATCC 수탁번호 98061로 기탁되어 있다. cDNA 클론 3-2의 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 136-605가 삽입물을 나타내는 것을 제외하고는 클론 1-7 cDNA의 서열(서열 번호 2)과 동일하다. 따라서, 서열 번호 2는 서열 번호 1의 스플라이스 변이체 형태를 나타낸다. 1-7에 대한 클론(이. 콜리 K-12, SOLR/p1-7#3-1)은 ATCC 수탁번호 98060으로 기탁되어 있다.

10⁵ 클론은 프로브(상기한 바와 같이 랜덤 프라임 방사성 표지됨)로 1-7 RDA 생성물로 선별하였다. 8개의 양성 클론을 선택하고, 순수한 파지 플라크를 얻기위한 2차 분석을 위해 4개를 무작위로 선택하였다. 3차 선별후, 4개의 순수한 파지 클론을 분리하였다. 파지로부터의 클로닝된 삽입물은 스트라타진(등록상표) 람다 Zap II 키트를 이용하여 생체내 절단 과정에 의해 분리되었다. 약 2.0 kb의 가장 큰 삽입물(cDNA 클론 1-7이라 칭함)은 DNA 서열을 결정하였다; 이 삽입물의 서열(서열 번호 2)은 도 2에 나타냈다.

10⁵ 클론은 프로브(상기한 바와 같이 랜덤 프라임 표지되고, 65℃의 PBS 내에서 하이브리드화함)로 4-7 RDA 생성물로 선별하였다. 8개의 양성 클론을 선택하고, 순수한 파지 플라크를 얻기위한 2차 분석을 위해 4개를 무작위로 선택하였다. 2차 선별후, 4개의 순수한 파지 클론을 분리하였다. 파지로부터의 클로닝된 삽입물은 스트라타진(등록상표) 람다 Zap II 키트를 이용하여 생체내 절단 과정에 의해 분리되었다. 약 2.4 kb의 가장 큰 삽입물(cDNA 클론 4-7이라 칭함)은 DNA 서열을 결정하였다. 이 삽입물의 서열(서열 번호 4)은 도 3에 나타냈다. cDNA 클론 4-7(이. 콜리 K-12, SOLR/p4-7#1-1)은 ATCC 수탁번호 98062로 기탁되어 있다.

5. 1-7, 3-2 및 4-7 cDNA 클론의 특성규명

A) DNA 및 단백질 서열

3-2 cDNA(도 1; 서열 번호 1) 서열은 307개의 아미노산으로 이루어지는 오픈 리딩 프레임(도 1; 서열 번호 3)을 함유한다. 21개 아미노산의 시그날 서열은 Von Heijne 분석법[참조: Von Heijne 등, Nucl. Acid Res. 14: 14683 (1986)]으로 추론하였으며, 대략 아미노산 235-257에 걸치는 횡막 부위는 3-2 단백질이 세포 표면 단백질임을 나타내고 있다.

1-7 cDNA의 서열(도 2; 서열 번호 2)는 307개의 아미노산으로 이루어진 오픈 리딩 프레임을 함유하는데, 이는 3-2 cDNA(서열 번호 3)에 함유된 오픈 리딩 프레임과 동일하였다. 4-7 cDNA의 서열(도 3; 서열 번호 4)은 572개의 아미노산으로 이루어진 오픈 리딩 프레임(서열 번호 5)을 함유한다. 횡막 부위는 대략 아미노산 501-521에 위치한다.

B) 국소빈혈후 성숙 래트 신장과 대측 신장에서 1-7, 3-2 및 4-7 mRNA의 인시추 분석

인시추 하이브리드화는 문헌[참조: Finch 등, Dev. Dynamics 203: 223-240 (1995)]에 기술된 방법으로 수행하였다. 간략히 요약하면, 국소빈혈 신장과 대측 신장 둘다 PBS 내의 4% 파라포름알데히드로 관류 고정시켰다. 신장들은 4℃에서 하룻밤 동안 더 고정시키고, 처리하였다. 파라핀 박편은 파라핀을 제거하고 재수화하고, PBS내의 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 프로테이나제 K로 분해하고, 재고정시킨후, 트리에탄올아민 완충액내의 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. 이어서, 박편은 탈수하고, 55℃에서 밤새 ³²P-표지된 리보프로브, pGEM-11Z의 BamH1 위치내에 서브클로닝된 3-2 RDA 또는 1-7 RDA 생성물로부터 생성된 33P-표지된 리보프로브와 하이브리드화시켰다. 하이브리드화후, 박편은 매우 엄한 조건(2XSSC, 65℃에서 50% 포름알데히드) 하에서 세척하였다. 최종적으로 박편은 탈수시키고, 자동방사능사진법을 위해 에멀젼(NBT-2) 피복하고, 1주일 이상 노출시켰다. 은 입자는 현상하고, 박편은 톨루이딘 블루로 대응염색하고, 현미경사진을 촬영하였다.

인시추 하이브리드화에 의한 1-7 및 3-2 mRNA 발현 분석 결과, 이들 유전자는 정상적인 신장 박편에서의 발현과 비교하여 손상된 신장 세포에서 크게 상향조절되는 것을 확인하였다. 상기 발현은 피질과 외골수의 재생 세포에서 나타나며, 이들 대부분은 인접한 관 세포인 것으로 생각된다.

또한, 4-7 인시추 RNA 발현 패턴의 분석은 정상적인 성숙 신장과 비교하여 손상된 국소빈혈 신장에서 이 유전자의 대량 발현을 의미한다. 발현 위치는 침윤 세포인 것으로 생각된다.

6. 래트 3-2 cDNA에 교차 하이브리드화하는 인간 cDNA 클론의 분리

도 1에 나타낸 클론 3-2의 삽입물의 뉴클레오티드 546-969를 포함하는 ³²P-표지된 DNA 프로브를 생성하고, 이를 이용하여 인간 태아 간 람다 gt10 cDNA 라이브러리(클론테크 카탈로그 번호 HL5003a)를 선별하였다. 1 X 10⁶ 플라크는 상기한 바와 같은 표준 조건을 이용하여 이중 선별하였다. 선별 온도는 55℃였다. 매우 엄중한 세척을 위해, 필터는 55℃의 2X SSC로 세척하였다. 50개의 양성 파지를 동정하고 플라크를 정제하고, DNA를 제조하였다. 파지 DNA는 상기한 바와 동일한 프로브를 이용하는 서던 분석을 수행하였다. 서던 블로트 필터는 55℃의 0.5X SSC로 최종 세척하였다. 2개의 클론은 양성으로 동일하였다. 클론 H13-10-85의 삽입물은 서열결정하였으며, 도 3에 도시한 3-2 단백질에 대해 높은 수준의 동일성을 보유하는 단백질을 암호화하는 어떤 영역을 확인하였다.

인간 3-2 관련 단백질의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 6)과 예상된 아미노산 서열(서열 번호 7)은 도 4에 나타냈다. 도 5에 나타낸 베스트핏(bestfit) 분석에 의해 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 3-2 관련 단백질은 래트 3-2 단백질과 43.8% 동일하며, 59.1% 유사하였다. 상기 단백질은 둘 다 IgG 도메인, 뮤신 도메인, 횡막 도메인 및 세포질 도메인을 함유하였다. 상기 단백질 둘 다 IgG 도메인내 6개의 시스테인은 보존되었다.

7. KIM-1 Ig 융합 단백질의 생성

KIM의 세포외 도메인과 면역글로불린(Ig)의 Fc 영역의 융합 단백질은 손상된/재생중인 신장의 분자생물학과 세포생물학 연구를 위해 유용한 도구이며, 치료 분자로서도 유용하다. 인간 및 래트 KIM-1 단백질의 세포외 도메인을 갖는 KIM Ig 융합 단백질을 제조하기 위해, KIM-1 cDNA의 세포외 도메인의 단편을 PCR로 증폭시키고, COS 세포 내에서의 일시적인 발현을 위해 바이오겐 발현 벡터 pCA125내에 클로닝하였다. 상기 발현 벡터 pCA125는 N-말단에 클로닝된 유전자로부터의 일정 구조와 C-말단의 인간 Ig Fc 영역을 보유하는 융합 단백질을 생성한다. COS 세포는 플라즈미드 SJR 103 또는 104로 형질감염시키고; 이들 플라즈미드는 인간 Ig Fc 영역에 융합된 세포외 도메인의 인간 KIM 서열 263-1147(서열 번호 6; SJR 103) 또는 래트 KIM 서열 599-1319(서열 번호 1; SJR 104)를 함유하는 융합 단백질을 발현한다. 이들 세포들은 세포 공장(미국 일리노이 네이퍼빌에 소재하는 눈크)의 DMEM 내의 10% FBS 내에서 성장시켰다. 형질감염하고 2 내지 3일이 경과한후, 배지를 수거하고, 아미콘 농축기를 이용하여 농축하고, 단백질-A 세파로즈 칼럼을 이용하여 융합 단백질을 정제하였다. 정제후, 융합 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 평가하였다.

본 발명의 화합물의 진단적 용도

서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7의 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항-KIM 항체는 몇몇 진단 방법에 유용하다. 이들 제제는 형광투시법이나 방사능사진법적으로 불투명한 물질과 같은 검출가능한 마커로 표지하고, 이를 환자에 투여하여 KIM이 발현되는 조직을 영상화하는 것이 가능하다. 또한, 이들 제제는 조직학적 박편상에 KIM 단백질-양성 세포의 면적을 가시화하는 것이 가능한 면역세포화학적 염료로서 사용할 수 있는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 물질에 결합할 수도 있다. 특이 항체는 이러한 방식으로 단독 사용할 수 있으며, 특이 항체가 결합한 위치는 샌드위치 분석법에서 검출가능한 마커에 결합한 항-면역글로불린 항체를 이용하여 가시화할 수 있다.

또한, KIM 단백질에 대한 특이 항체는 체 조직 또는 체액 샘플 내에서 KIM의 존재 또는 농도를 측정하는 면역 분석법에 유용하다. 이러한 농도는 다른 질병 상황과 관련이 있을 수 있다. 특히 관심이 있는 구체예로서, 본 발명은 환자의 소변, 혈장 또는 혈청 내에서 KIM 또는 KIM 단편의 농도를 측정하므로써 신장 손상을 진단하는 방법 또는 신장 수복의 과정을 모니터링하는 방법을 포함한다. 유사하게, KIM은 소변 침강물, 특히 소변 침강물 내의 세포성 파편 내에서 측정할 수 있다. 신장 질환이 진행중인 환자의 소변 침강물 내에 존재할 수 있는 신장 관 세포의 캐스트(cast)는 증가된 수준의 KIM 단백질 및 mRNA를 함유할 수 있다.

또한, KIM 단백질에 대한 특이 항체는 비드 또는 디쉬와 같은 고형 지지체에 결합할 수 있으며, 측정 또는 단백질의 정제와 단백질과 그 속성(예를 들어, 해독후 변형)의 특성규명을 위해 용액으로부터 리간드를 제거하기 위해 사용할 수도 있다. 이와같은 환자의 KIM 단백질의 특정규명은 유해한 돌연변이체의 동정 또는 KIM 기능을 방해하고 비정상적인 환자 표현형과 관련된 프로세싱 결함을 확인하는데 유용할 수 있다. 이들 각각의 기법은 면역학 분야의 당업자에게는 일반적인 것이다.

또 다른 영상화 방법은 KIM 리간드를 발현하는 조직 특히 종양의 진단적 영상화를 위해 영상화가능한 부분에 융합된 KIM 또는 KIM 단편을 이용하는 것이다.

또한, 진단 기법은 손상과 관련된 과정의 징후로서 조직내에서 상향조절된 KIM mRNA의 존재에 기초한다. 이 기법은 테스트되어 왔으며, 하기하는 바와 같이 래트의 국소빈혈 손상 모델에서 적용할 수 있는 것으로 확인되었다.

KIM-1 단백질의 양이 손상후 증가하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각의 래트에 대해 대측 신장과 단일 신장의 신장 동맥과 신장 정맥을 40분 동안 클램핑한후 24 시간 및 48 시간이 경과한 국소빈혈후 신장의 신장 균질화물을 조사하였다. 이 신장 균질화물은 KIM-1 단백질의 존재에 대해 평가하였다. 웨스턴 블로트 분석은 국소빈혈 손상에 노출되지 않은 대측 신장의 균질화물에서 검출할 수 없는, 국소빈혈 손상후 2개의 상이한 항체에 의해 검출된 3개의 단백질을 확인하였다. 이들 밴드의 겉보기 분자량은 약 40kDa, 50kDa 및 70-80kDa 였다. 웨스턴 블로팅에 의해 검출된 3개의 단백질 종은 잠재적인 N 및 O 연결된 글리코실화 위치의 존재로 인해 동일한 단백질의 글리코실화된 형태를 나타낼 수 있다. 이들 단백질이 각각 2개의 상이한 세트의 폴리크로날 항체와 반응한다는 사실은 이들이 KIM-1과 관련되어 있으며, 교차 반응성 밴드가 아니라는 생각을 지지해 준다. 이러한 예상은 3개의 단백질의 부분적인 CNBr 절단의 결과로 확인되었는데, 이들 3개의 단백질은 절단 결과 공통적인 CNBr 절단 단편을 공유하였다. KIM-1 단백질의 세포질성 도메인은 임의의 주요한 해독후 변경을 함유하지 않는 것으로 생각되지 때문에, KIM-1의 세포질성 도메인에 대해 유도된 항체로 검출된 2개의 최소 분해 생성물(4.7kDa과 7.4kDa)은 동일한 단백질에서 유래하는 경우 3개의 상이한 KIM-1 단백질 밴드에 대해 크기가 동일하여야만 한다. 본 발명자들은 KIM1 40kDa 및 70-80kDa 단백질이 예상된 크기로 이동하는 단편을 산출하는 것을 확인하였다. 또한, 50kDa 단백질 밴드의 분해는 동일한 C-말단상 밴드 펩티드를 산출하였다.

KIM-1 서열은 N-글리코실화를 위한 2개의 추정 위치와 O-글리코실화가 폴리펩티드 쇄를 커버하는 뮤신 도메인을 제공하였다. 국소빈혈후 신장에서 검출된 3개의 KIM-1 밴드는 동일한 코어 단백질의 글리코실화 변이체와 상응하였다. PNGase F를 이용하는 탈-N-글리코실화는 모두 3개 밴드의 더 낮은 분자량으로의 이동으로 귀착되었는데 이는 약 3kDa의 손실과 상응하는 것이었으며, 이는 모두 3개의 단백질이 N-글리코실화되었음을 의미하는 것이다. O-글리콜실화에서의 차이는 이들 3개 밴드 크기에서의 차이를 설명한다.

본 발명의 화합물의 치료적 용도

본 발명의 치료 방법은 KIM 연결에 의존하는 세포성 반응을 선택적으로 촉진 또는 억제하는 것과 관련된다. KIM 및 KIM 리간드가 둘다 막 결합되어 있고, 상이한 세포에 의해 발현되는 경우, 시그날 전달은 KIM-발현 세포, KIM-리간드 발현 세포 또는 양자에서 일어날 수 있다.

KIM 리간드-발현 세포에서 KIM 연결-촉발된 반응은 생체내 또는 시험관 내에서 상기 세포와 외인성 KIM, KIM 융합 단백질 또는 KIM 리간드에 대한 활성화 항체를 접촉시키므로써 생성할 수 있다. 또한, 내인성 KIM에 의해 촉발된 KIM 리간드-발현 세포의 반응은 KIM 리간드-발현 세포와 KIM 리간드 길항물질(예를 들어, KIM 리간드에 결합하는 길항물질 항체)을 접촉시키거나, 내인성 KIM과 항-KIM 항체 또는 KIM과 KIM 리간드의 효과적인 연결을 방해하는 기타 KIM-결합 분자를 접촉시키므로써 차단할 수 있다.

유사하게, KIM-발현 세포에서 KIM 연결에 의해 촉발된 반응은 외인성 화합물에 의해 촉진되거나 억제될 수 있다. 예를 들어, KIM-발현 세포 내에서 KIM 연결-촉발된 반응은 상기 세포와 가용성 KIM 리간드, 또는 특정 항-KIM 활성화 항체와 접촉시키므로써 생성할 수 있다. 또한, 내인성 KIM 리간드와의 상호작용에 의해 촉발되는 KIM-발현 세포의 반응은 KIM-발현 세포와 KIM에 대한 길항물질(예를 들어, 효과적인 시그날 생성 KIM 연결을 방해하는 방식으로 KIM에 결합하는 차단 항체)을 접촉시키거나, 내인성 KIM 리간드와 항-KIM 리간드 항체 또는 KIM과 KIM 리간드의 효과적인 연결을 방해하는 기타 KIM 리간드-결합 분자를 접촉시키므로써 차단할 수 있다.

상기한 중재들 중에서 어느 것이 치료적 용도로 유용한가 하는 것은 억제하려고 하는 병리적 과정 또는 촉진시키려고 하는 의학적으로 바람직한 과정의 관련있는 병인학적 메카니즘에 의존하며, 이는 의학 분야의 당업자에게는 공지된 사항이다. 예를 들어, KIM 연결이 바람직한 세포 성장, 분화된 표현형의 유지, 여러 가지 손상에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성 또는 기타 의학적으로 유용한 반응으로 귀착되는 경우, 상기한 중재들중 연결-촉발된 반응을 촉진하는 것을 사용할 수 있다. 별법으로, KIM 연결이 종양의 성장, 세포 기능의 유해한 손실, 세포사멸에 대한 민감성 또는 염증의 촉진과 같은 바람직하지 않은 결과를 촉발시키는 경우에 억제성 중재들중 하나를 사용할 수 있다.

이하, 이미 기술한 본 발명의 치료 방법의 예를 설명한다. 본 발명의 KIM-관련 화합물의 한 치료적 용도는 신장 질환을 가진 환자를 치료하는 것, 환자에서 새로운 조직의 성장을 촉진시키는 것, 또는 환자에서 손상된 조직의 생존을 촉진시키는 것이며, 이들 방법은 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 KIM 단백질 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법에 사용된 단백질은 전장 KIM-단백질의 단편, 가용성 KIM 리간드 단백질 또는 융합 단편 또는 KIM 작용물질일 수 있다. 또한 이들 방법은 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 작용물질 항체 또는 본 발명의 작용물질 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하므로써 수행할 수도 있다. KIM 단백질은 의학적으로 바람직한 보조 효과를 발휘하는 치료 유효량의 제2 화합물과 함께 투여할 수도 있다. 이들 방법을 위한, 관심 조직은 임의의 조직을 포함할 수 있지만, 바람직한 조직은 신장 조직, 간, 신경 조직, 심장, 위, 소장, 척수 또는 폐를 포함한다. 본 발명의 화합물로 유익하게 치료할 수 있는 신장 질환은 급성 신장 장애, 급성 신장염, 만성 신장 장애, 신장 증후군, 신장 관 결함, 신장 이식, 독성 손상, 저산소증 손상 및 외상을 들 수 있다. 신장 관 결함은 유전적이거나 후천적인 것들을 포함하는데, 그 예로는 다낭포성 신장 질환, 골수성 낭포 질환 및 골수성 스폰지 신장을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 많은 기타 신장 장애를 포함한다[참조: Harrison's principles of Internal Medicine 13판 (1994); 본 명세서에 참고 인용함]. 상기 방법들의 환자는 인간일 수 있다.

환자에서 바람직하지 않은 KIM 리간드-발현 조직의 성장을 억제하는 치료적 중재는 상기 환자에게 치료 유효량의 KIM 길항물질(예를 들어, KIM 리간드에 결합하는 길항물질 항체) 또는 치료 유효량의 항-KIM 항체 또는 KIM 리간드-발현 조직에 대한 KIM 결합을 차단하는 기타 KIM-결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 관심있는 구체예에서, KIM 길항물질 또는 항-KIM 항체는 성장을 위해 KIM 단백질에 의존하는 종양의 성장을 억제 또는 차단하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 방법은 KIM 리간드-발현 종양 세포를 사멸시키거나, 이들의 성장을 억제하는 것을 포함하는데, 이 방법은 상기 세포와 KIM과 독소 또는 방사성핵종의 융합 단백질, 또는 독소나 방사성핵종에 접합된 항-KIM 리간드 항체를 접촉시키므로써 수행된다. 상기 세포는 환자 내에 존재할 수 있으며, 이 환자에게 단백질 또는 접합된 항체를 투여한다.

또한, 본 발명은 독소 또는 방사성핵종을 KIM-발현 세포에게 표적화하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 상기 세포와 KIM 리간드 및 독소 또는 방사성핵종을 포함하는 융합 단백질, 또는 독소나 방사성핵종에 접합된 항-KIM 항체를 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예는 KIM을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 상기 세포와 KIM 리간드와 독소 또는 방사성핵종의 융합 단백질, 또는 독소나 방사성핵종에 접합된 항-KIM 항체를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 세포는 환자내에 존재할 수 있으며, 상기 환자에게 단백질을 투여한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "환자"는 KIM을 투여할 수 있는 임의의 포유류를 의미한다. 환자는 특히 본 발명의 방법을 이용하는 치료를 위해 의도되는데, 예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 양, 말, 소, 염소, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 햄스터, 게르빌, 래트 및 마우스 뿐만 아니라 이들 숙주로부터 유도되거나 기원하는 장기, 종양 및 세포일 수 있다.

유전자 치료법에서 본 발명의 화합물의 용도

본 발명의 KIM 유전자는 손상된 조직, 또는 자극된 성장이 요구되는 조직내로 도입된다. 이러한 유전자 치료법은 형질감염된 세포에 의한 KIM 단백질의 생성을 자극하고, KIM 단백질을 발현하는 세포의 세포 성장 및/또는 생존을 촉진한다.

유전자 치료법의 특정 구체예에서, KIM 단백질을 암호화하는 유전자는 신장 표적 조직내로 도입될 수 있다. KIM 단백질은 안정하게 발현되며, 조직 성장, 분열 또는 분화를 자극하거나 세포 생존을 가능하게 한다. 더욱이, KIM 유전자는 바이러스에 기초하거나 바이러스에 기초하지 않은 여러 가지 공지된 방법을 이용하여 표적 세포내로 도입할 수 있다.

바이러스에 기초하지 않은 방법은 전기적천공법, 리포좀을 이용한 막 융합, DNA-피복된 미세입자의 고속 투하, 인산칼슘-DNA 침전물로의 항온처리, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염 및 직접 단일 세포내로의 미세주입을 포함한다. 예컨대, KIM 유전자는 인산칼슘 동시침전법[Pillicer 등, Science 209: 1414-1422(1980)]; 기계적인 미세주입 및/또는 입자 가속[Anderson 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 5399-5403(1980)]; 리포좀에 기초한 DNA 이전[리포펙틴-매개된 형질감염-Fefgner 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 471-477(1987); Gao와 Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285(1991)]; DEAE 덱스트란-매개된 형질감염; 전기적천공법(미국 특허 4,956,288); 또는 DNA가 간세포에 우선적으로 전달하기 위해 DNA가 접합된 폴리라이신 기초한 방법[Wolff 등, Science 247: 465-468(1990); Curiel 등, Human Gene Therapy 3: 147-154(1992)]으로 세포내로 도입할 수 있다.

표적 세포는 직접 유전자 이전에 의해 본 발명의 유전자로 형질감염할 수 있다[참조: Wolff 등, "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247: 1465-68 (1990)]. 많은 경우, 벡터-매개된 형질감염이 바람직할 것이다. 벡터에 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992); 양자 모두 본 발명에 참고 인용함]. 프로모터 활성화는 조직 특이적이거나 대사 생성물 또는 투여된 물질에 의해 유도성일 수 있다. 이러한 프로모터/인핸서의 예로는 천연 c-ret 리간드 단백질 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인접 초기 프로모터/인핸서[참조: Karasuyama 등, J. Exp. Med., 169: 13 (1989)]; 인간 베타-액틴 프로모터[참조: Gunning 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 4831 (1987)]; 마우스 유방 종양 바이러스의 긴 말단 반복부(MMTV LTR)내에 존재하는 글루코코르티코이드-유도성 프로모터[참조: Klessing 등, Mol. Cell. Biol. 4: 1354 (1984)]; 몰로니 래트 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복 서열(MuLV LTR)[참조: Weiss 등, RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980)]; SV40 초기 영역 프로모터[참조: Bernoist와 Chambon, Nature 290: 304 (1981)]; 루이스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터[참조: Yamamoto 등, Cell 22: 787 (1980)]; 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제 프로모터[참조: Wagnar 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 1441 (1981)]; 아데노바이러스 프로모터[참조: Yamada 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567 (1985)]를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, KIM 유전자는 현재 잘 확립된 유전자 전달 시스템에 사용하기 위한 특정 바이러스 벡터에 의해 투입할 수도 있다. 그 예로는 파포바바이러스 SV40[참조: Madzak 등, J. Gen. Virol. 73: 1533-36 (1992)]; 아데노바이러스[참조: Berkner 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61 (1992)]; 바쿨로바이러스[참조: Hoffman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099-10103 (1995)]; 백시니아 바이러스[참조: Moss 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38 (1992)]; 아데노-관련 바이러스[참조: Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38 (1992)]; 단순 포진 바이러스(HSV)와 엡스타인 바 바이러스(HBV)[참조: Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123 (1992)]; 레트로바이러스[참조: Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24 (1992)]; 레트로바이러스[참조: Brandyopadhyay 등, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754 (1984)]; 레트로바이러스[참조: Miller 등, Nature, 357: 455-450 (1992)]; 레트로바이러스[참조: Anderson, Science 256: 808-813 (1992)]를 들 수 있으며, 기타 문헌으로 Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14(Ausubel 등 출판), Greene Publishing Associates (1989)를 참조할 수 있다. 상기 모든 문헌은 본 명세서에 참고 인용한 것이다.

바람직한 벡터는 아데노바이러스(바람직하게는 Ad-2 또는 Ad-5 기초한 벡터), 바쿨로바이러스, 포진 바이러스(바람직하게는 단순 포진 바이러스 기초한 벡터) 및 파르보바이러스(바람직하게는 "결함성" 또는 비자가 파르보바이러스 기초한 벡터, 더 바라직하게는 아데노-관련 바이러스 기초한 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2 기초한 벡터)를 포함하는 DNA 바이러스이다[참조: Ali 등, Gene Therapy 1: 367-384 (1994); 미국 특허 제4,797,368호와 제5,399,346호 및 하기 논의].

예를 들어, KIM 서열을 전달하기 위한 특정 벡터 시스템의 선택은 여러 가지 요인에 의존할 것이다. 한 가지 중요한 요인은 표적 세포 군집의 특성이다. 레트로바이러스 벡터는 광범위하게 연구되어 왔고 다수의 유전자 치료법에 적용되어 왔지만, 이들은 일반적으로 분열하지 않은 세포를 감염하기 위해서는 적합하지 않으나 암 치료에는 유용할 수 있는데, 그 이유는 이들이 복제하는 세포에서 그들의 유전자를 단지 통합하고 발현하기 때문이다. 이들은 생체외 방법에서 유용하며, 이러한 관점에서 매력적인데, 그 이유는 이들의 게놈이 표적 세포 게놈내로 안정하게 통합되기 때문이다.

아데노바이러스는 여러 가지 세포 타입에 치료성 트랜스 유전자 또는 리포터 트랜스 유전자를 효율적으로 전달하기 위해 변형할 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 인간에게 호흡기 질환을 유발시키는 일반적인 아데노바이러스 타입 2 및 5(각각 Ad2 및 Ad5)는 뒤센형 근 위축증(DMD) 및 낭포성 섬유증(CF)의 유전자 치료법을 위해 현재 개발되고 있다. Ad2와 Ad5는 둘 다 인간 악성 종양과는 무관한 아데노바이러스의 아강에 속한다. 아데노바이러스 벡터는 유사분열 상태에 관계없이 실질적으로 모든 세포 타입에 매우 높은 수준의 트랜스 유전자 전달을 제공할 수 있다. 재조합 바이러스의 높은 역가(10¹³ 플라크 형성 유니트/ml)는 293 세포(아데노바이러스-형질전환된 합식 인간 배 신장 세포주: ATCC CRL 1573) 내에서 용이하게 생성될 수 있으며, 약간의 손실도 없이 장기간 동안 냉동저장할 수 있다. 유전적 불균형을 보충하는 생체내에서 치료학적 트랜스 유전자를 전달하는 데 이 시스템의 효능은 여러 가지 장애의 동물 모델에서 입증되어 왔다[참조: Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); Tanzawa 등, FEBS Letters 118(1): 81-84 (1980); Golansten 등, New Engl. J. Med. 309: 288-296 (1983); Ishibashi 등, J. Clin. Invest. 92: 883-893 (1993); 및 Ishibashi 등, J. Clin. Invest. 93: 1889-1893 (1994); 모두 본 명세서에 참고로 인용함]. 실제로, 낭포성 섬유증 횡막 조절자(CFTR)를 위한 cDNA를 암호화하는 재조합 복제 결함성 아데노바이러스는 2개 이상의 인간 CF 임상 시도에 사용이 허용되어 왔다[참조: Wilson, Nature 365: 691-692 (1993)]. 유전자 치료법을 위한 재조합 아데노바이러스의 안전성에 대한 다른 지지는 인간 군집에서 생 아데노바이러스 백신의 광범위한 경험이다.

DMD 및 기타 유전적 장애의 유전자 치료법을 위해 개발되어온 1세대 재조합 복제-결함성 아데노바이러스는 전체 E1a 및 E1b 영역의 일부분의 결실을 포함하였다. 이 복제-결함성 바이러스는 트랜스작용성 E1a 단백질을 제공하는 기능적인 아데노바이러스 E1a 유전자를 함유하는 293 세포내에서 성장시켰다. E1-결실된 바이러스는 E1a 및 E1b 영역 유전자 생성물을 트랜스로 제공하는 293 세포 내에서 감염성 바이러스를 복제 및 생성할 수 있다. 결과적으로 생성되는 바이러스는 많은 세포 타입을 감염시킬 수 있고, 도입된 유전자(그 스스로의 프로모터를 보유하는 경우)를 발현시킬 수 있으나, 세포가 매우 높은 감염다중성으로 감염되지 않을 경우, E1 영역 DNA를 보유하지 않는 세포 내에서 복제할 수 없다. 숙주 범위가 넓다는 잇점을 가진 아데노바이러스는 정제 세포 또는 뉴우론과 같이 최종적으로 분화된 세포를 감염시킬 수 있으며, 본질적으로 발암성은 없는 것으로 생각된다. 아데노바이러스는 숙주 게놈 내로 통합하지는 않는 것으로 보인다. 이들은 염색체 외적으로 존재하기 때문에, 삽입 돌연변이 유발의 위험성은 크게 감소된다(Ali 등의 상기 문헌 373). 재조합 아데노바이러스(rAdV)는 매우 높은 역가를 생성하며, 바이러스 입자는 보통 안정하며, 발현 수준은 높으며, 넓은 범위의 세포를 감염시킬 수 있다. 이들의 천연 숙주는 기도 상피이며, 따라서 이들은 폐암 치료에 유용하다.

바쿨로바이러스-매개된 이전은 몇가지 장점을 보유한다. 바쿨로바이러스 유전자 전달은 복제 세포 및 비복제 세포에서 발생할 수 있으며, 신장 세포 뿐만 아니라 간 세포, 신경 세포, 비장, 피부 및 근육에서 발생할 수 있다. 바쿨로바이러스는 포유류 세포에서 비복제성이며, 비병원성이다. 인간은 감염을 차단할 수 있는 재조합 바쿨로바이러스에 대해 이미 존재하는 항체를 보유하고 있지 않다. 또한, 바쿨로바이러스는 매우 큰 DNA 삽입물을 혼입 및 형질도입할 수 있다.

또한, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 체세포 유전자 치료법을 위한 벡터로서 사용되어 왔다. AAV는 작은 1본쇄(ss) DNA 바이러스인데, 그를 유전공학용의 이상적인 기재로 만드는 단순한 게놈 조직(4-7kb)을 갖고 있다. 2개의 오픈 리딩 프레임은 일련의 rep 및 cap 폴리펩티드를 암호화한다. Rep 폴리펩티드(rep78, rep68, rep62 및 rep40)는 AAV 게놈의 복제, 구조 및 통합에 관련되어 있다. cap 단백질(VP1, VP2 및 VP3)은 비리온 캡시드를 생성한다. 5' 단부 및 3' 단부에 인접한 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임은 145bp의 역 말단 반복부(ITR)인데, 이중 처음 125bp는 Y- 및 T-형 이중나선 구조를 형성할 수 있다. AAV 벡터 개발을 위해 중요한 점은 전체 rep 및 cap 도메인이 절단되어 치료적 트랜스 유전자 또는 리포터 트랜스 유전자로 대체될 수 있다는 것이다[참조: B.J. Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990)]. ITR이 AAV 게놈의 복제, 구조, 팩케이징 및 통합을 위해 필요한 최소 서열이라는 것이 밝혀져 왔다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 유전자 치료법에서 중요한 능력을 보유한다. 이 바이러스 입자는 매우 안정하며, 재조합 AAV(rAAV)는 펠릿화 또는 CsCl 구배 밴딩에 의해 정제될 수 있다는 점에서 "약물-유사" 특성을 보유한다. 이들은 열 안정하며, 분말 형태로 동결건조할 수 있으며, 완전한 활성으로 재수화할 수도 있다. 이들의 DNA는 숙수 염색체 내에 안정하게 통합되고, 따라서 발현은 장기적이다. 이들의 숙주 범위는 광범위하며, AAV는 질병을 일으키지 않기 때문에 재조합 벡터는 비독성이다.

일단 표적 세포 내로 도입되면, 관심의 서열은 벡터의 삽입된 유전자 서열에 상동성/상보적인 서열을 포함하는 프로브를 이용하는 핵산 하이브리드화와 같은 통상적인 방법으로 확인할 수 있다. 다른 방법으로, 서열(들)은 표적 세포 내로 발현 벡터의 도입에 기인한 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성등)의 존재 또는 부재에 의해 확인할 수 있다.

제제화 및 투여

본 발명의 화합물은 담체 비히클내에 제조하는 것과 같은 표준 방법으로 제제화할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "약리학적으로 허용가능한 담체"는 하나 이상의 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 성분을 의미하는데, 적용을 용이하게 하기 위해 돌연변이성 원생종양유전자 또는 돌연변이성 종양단백질이 결합되어 있다. 기타 약학적으로 허용가능한 것으로 공지된 수성 및 비수성 등장 용액 및 멸균 현탁액이 당업자에게 공지되어 있음에도 불구하고 적합한 담체의 예로는 멸균 염수를 들 수 있다. 이러한 관점에서, 본 명세서에서 사용한 용어 "담체"는 리포좀과 HIV-1 tat 단백질[참조: Chen 등, Anal. BioChem. 227: 168-175 (1995)] 뿐만 아니라 임의의 플라즈미드 및 바이러스 벡터를 포함하는 의미이다.

본 발명의 신규 폴리펩티드중 임의의 것은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 염을 형성할 수 있는 적합한 산 및 염기는 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 무기 및 유기 산과 염기를 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 치료 유효량으로 환자에게 투여되는데, 이는 치료하려는 특정 증상에 대해 의학적으로 바람직한 결과 또는 영향을 나타내는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 화합물의 유효량은 병든 상태, 퇴화 상태 또는 손상된 상태를 경감시키거나 진전을 지연시킬 수 있다. 상기 유효량은 개인별로 결정할 수 있으나, 부분적으로 환자의 물리적 특성, 치료하려는 징후 및 추구하는 결과 등을 고려하여 결정한다. 유효량은 이러한 요인들을 고려하고, 단지 통상의 실험을 통해 당업자가 결정할 수 있다.

본 발명의 화합물을 위한 리포좀 전달 시스템은 여러 가지 일층 소포, 다층 소포 또는 안정한 다수층 소포중 하나일 수 있으며, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제5,169,637호, 제4,762,915호, 제5,000,958호 또는 제5,185,154호에 기재된 방법을 이용하여 제조하고 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 신규한 폴리펩티드 및 기타 선택된 폴리펩티드는 지질단백질로서 발현하는 것이 바람직한데, 이는 이들의 리포좀에 대한 결합을 증강시키기 위함이다. 예를 들어, 리포좀-캡슐화된 KIM 단백질을 이용한 인간 급성 신장 장애의 치료는 리포좀을 이용한 이러한 치료를 필요로하는 세포내로 KIM 단백질을 생체 내에서 도입하므로써 수행할 수 있다. 리포좀은 카테터를 이용하여 신장 동맥에 전달할 수 있다. 재조합 KIM 단백질은 예를 들어 면역친화성 크로마토그래피 또는 임의의 편리한 방법을 이용하여 CHO 세포로부터 정제한 후, 리포좀과 혼합하여 리포좀 내에 높은 효율로 혼입시킨다. 캡슐화된 단백질은 세포 성장을 자극하는 것에 대한 임의의 효과에 대해 시험관 내에서 테스트할 수 있다.

본 발명의 화합물은 의학적으로 허용되는 임의의 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 피하, 근육내, 종양내, 복막내, 도관내, 경막내와 같은 비경구 경로에 의한 주사 뿐만 아니라 입, 코, 눈, 직장으로 투여하거나 국소투여하는 하는 등의 기타 방법으로 투여할 수 있다. 또한, 저장소 주사 또는 침식성 이식물과 같은 방법을 이용한 서방 투여 방법도 본 발명의 투여 방법에 포함된다. 특히,국부화된 종양에 공급하는 신장 동맥 또는 혈관과 같은 하나 이상의 동맥에 카테터를 이용한 전달에 의해 국부 전달도 고려할 수 있다.

지금까지 본 발명의 명확한 이해를 목적으로 예시를 통해 일부 세세한 부분을 기술하였지만, 첨부한 특허청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위 내에서 실시할 수 있는 본 발명의 변경 실시는 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims (9)

1. 서열 번호 3 또는 서열 번호 7의 아미노산 21-290을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 3 또는 서열 번호 7의 아미노산 21-307을 포함하는 폴리펩티드,
3. 제1항에 있어서, 서열 번호 3 또는 서열 번호 7을 포함하는 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, 면역글로불린의 Fc 영역을 추가로 더 포함하는 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 서열 번호 3 또는 서열 번호 7로 구성되는 폴리펩티드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA.
7. 제6항의 DNA를 포함하는 벡터.
8. 제7항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
9. 제5항의 폴리펩티드에 결합하는 항체.